Summary
No contexto clínico, pacientes com câncer pancreático localizado serão submetidos à pancreatectomia seguida de tratamento adjuvante. Este protocolo aqui relatado visa estabelecer um método seguro e eficaz de modelagem deste cenário clínico em camundongos nus, através da implantação ortotópica de câncer pancreático seguido de pancreatectomia distal e esplenectomia.
Abstract
Faltam modelos animais satisfatórios para estudar terapia adjuvante e/ou neoadjuvante em pacientes que estão sendo considerados para cirurgia de câncer de pâncreas (PC). Para suprir essa deficiência, descrevemos um modelo de camundongos envolvendo implantação ortotópica de PC seguido de pancreatectomia distal e esplenectomia. O modelo demonstrou ser seguro e adequadamente flexível para o estudo de diversas abordagens terapêuticas em ambientes adjuvante e neo adjuvante.
Neste modelo, um tumor pancreático é gerado pela primeira vez pela implantação de uma mistura de células cancerígenas pancreáticas humanas (luciferase-tagged AsPC-1) e células estelares pancreáticas associadas ao câncer humano no pâncreas distal de ratos nus atímicos Balb/c. Após três semanas, o câncer é ressecado por re-laparotomia, pancreatectomia distal e esplenectomia. Neste modelo, a bioluminescência pode ser usada para acompanhar o progresso do desenvolvimento do câncer e os efeitos da ressecção/tratamentos. Após a ressecção, a terapia adjuvante pode ser dada. Alternativamente, o tratamento neoadjuvante pode ser dado antes da ressecção.
Dados representativos de 45 ratos são apresentados. Todos os camundongos foram submetidos a pancreatectomia distal bem sucedida/esplenectomia sem problemas de hemostasia. Uma margem pancreática proximal macroscópica maior que 5 mm foi alcançada em 43 (96%) mouses. A taxa de sucesso técnico da ressecção pancreática foi de 100%, com mortalidade e morbidade precoce de 0%. Nenhum dos animais morreu durante a semana após a ressecção.
Em resumo, descrevemos uma técnica robusta e reprodutível para um modelo de ressecção cirúrgica de câncer de pâncreas em camundongos que imita o cenário clínico. O modelo pode ser útil para o teste de tratamentos adjuvante e neoadjuvante.
Introduction
O adenocarcinoma ductal pancreático (câncer de pâncreas [PC]) está associado a um prognóstico ruim1. A ressecção cirúrgica continua sendo o único tratamento potencialmente curativo para PC e deve ser considerada para pacientes que apresentam doença em estágio inicial. Infelizmente, mesmo com ressecção de R0 (ou seja, margens de ressecção livres de tumor), a taxa de recidiva (doença metastática local ou não detectada) é alta2,3. Portanto, a terapia adjuvante sistêmica é indicada em quase todos os pacientes submetidos à ressecção4. Além disso, enquanto a terapia neoadjuvante é agora recomendada apenas para cânceres limítrofes ressecáveis, suas indicações estão se expandindo de modo que seu uso rotineiro é o foco de muita pesquisa clínica5,6,7,8. Para desenvolver novas abordagens terapêuticas para PC envolvendo ressecção, essas abordagens precisam ser primeiramente avaliadas em modelos pré-clínicos que recapitulem com precisão os cenários clínicos.
Modelos ortotópicos de camundongos de PC têm sido frequentemente usados no passado para testar tratamentos medicamentosos9,10. Muitas delas foram produzidas apenas pela injeção de células cancerígenas no pâncreas do rato, resultando em tumores que não tinham o estroma proeminente característico do PC. Mais recentemente, modelos ortotópicos co-injetores, como o que desenvolvemos pela primeira vez injetando uma mistura de PC humano e células estelares pancreáticas humanas (PSCs, os principais produtores do estroma colágeno em PC), entraram em uso regular11,12. Os tumores produzidos por essa co-injeção de câncer e células estrômicas exibem (i) tanto os elementos cancerígenos quanto o componente escrogórico característico (desmoplástico) do PC, e (ii) maior proliferação celular cancerígeno e metástase11. Assim, este modelo se assemelha muito ao PC humano. Embora uma série de modelos resseccionais de PC ortotópico tenham sido descritos13,14,15,16, nenhum refletiu as realidades clínicas da ressecção pancreática em humanos tão precisa quanto este modelo, e, portanto, têm sido subótimais para testar tratamentos adjuvante ou neoadjuvante.
Os objetivos do modelo de camundongos apresentados foram demonstrar como: (i) implantar com sucesso câncer de pâncreas ortotópico, minimizando a disseminação peritoneal inadvertida e (ii) posteriormente resseccionar completamente o câncer. O trabalho destaca dicas e potenciais armadilhas dessa técnica.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Ética Animal da Universidade de Nova Gales do Sul (17/109A). Camundongos nus atímicos fêmeas, com idade entre 8 e 10 semanas pesando 16-19 g, foram usados para este protocolo. Os ratos estavam alojados em gaiolas micro-isoladores e alimentados comercialmente com alimentos e ad libitumde água.
1. Implantação de câncer pancreático ortotópico
- Prepare as células para implantação. Primeiro, calcule o número de células necessárias para o procedimento (1 x 106 células AsPC-1 com marca de luciferase e 1 x 106 células estelares pancreáticas humanas associadas ao câncer [CAhPSCs] são necessárias para cada animal).
- Mantenha essas células em uma incubadora de CO2 controlada pela temperatura umidificada e realize testes de mycoplasma rotineiros. O meio de cultura utilizado para AsPC-1 e CAhPSCs são RPMI 1640 (com 300 mg/L-glutamina, 20% v/v soro bovino fetal, 1% v/v penicilina/estreptomicina) e IMDM (com 4 mM L-glutamina, 10% v/v soro bovino fetal, 1% v/v penicilina/estreptomicina).
- Use técnicas padrão de cultura celular para tentarpsinizar as células em uma suspensão celular. Neutralizar a trippsina usando o respectivo meio de cultura completa em um volume duas vezes maior do que a solução de trippsina utilizada.
- Lave essas células duas vezes com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) e resuspend em uma mistura contendo 1 x 106 células AsPC-1 e 1 x 106 CAhPSCs em uma suspensão celular de 50 μL.
- Mantenha esta suspensão no gelo até usar.
- Prepare um armário de biossegurança classe II para o procedimento. Use um tapete de aquecimento sobreposto por uma cortina de plástico estéril. Para ampliação durante o procedimento, utilize um par de lupas cirúrgicas de ampliação de 2,5x a 3,5x.
- Prepare os cotonetes de corda da bolsa cortando um orifício de 1 cm de diâmetro, em um cotonete de gaze. Segure este orifício com uma sutura de corda de bolsa. Qualquer sutura trançada fina pode ser usada para isso (por exemplo, sutura de ácido poliglicóclico 5/0). O material de sutura trançada é recomendado, pois permite que o nó solto permaneça no lugar após o aperto. Isto é ilustrado na Figura 1a.
- Anestesiar o rato com 80 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina por injeção intraperitoneal.
- Administre 5 mg/kg de profilaxia antibiótico enrofloxacina, 2,5 mg/kg de analgesia flunixina e 1 mL de 0,9% de soro fisiológico subcutâneamente.
- Uma vez anestesiado, coloque o rato no campo estéril em uma posição supina e aplique povidone-iodo seguido de 70% de etanol para preparação da pele.
- Faça uma incisão longitudinal na pele do quadrante craniano esquerdo do abdômen, e depois entre no abdômen incisando a camada muscular entre fórceps.
- Carregue uma seringa de insulina de 29 G com 50 μL de suspensão celular – isso equivale a 1 x 106 CAhPSCs e 1 x 106 células AsPC-1 com marca de luciferase por injeção. Monte-o no dispositivo de injeção. O design e a função deste dispositivo de injeção são explicados em detalhes na Figura 1b e sua legenda.
- Coloque o cotonete de corda de bolsa sobre a incisão laparotomia e, em seguida, exteriorize o baço e a cauda pancreática através da abertura deste cotonete. Aperte a corda da bolsa para cercar suavemente o corpo do pâncreas, expondo a cauda pancreática para injeção. É importante estar apertado o suficiente para que a gaze entre em contato com o pâncreas circunferencialmente enquanto ao mesmo tempo não a constrita.
- Usando um par de fórceps, segure a cauda do pâncreas e coloque suavemente a tensão lateral sobre ele. Puna a superfície peritoneal ventral com a agulha em um ângulo raso e, em seguida, injete a suspensão celular no pâncreas de forma lenta e controlada (mais de 10-15 s) com o dispositivo de injeção.
- Durante o processo de injeção, observe cuidadosamente o vazamento — tanto ao redor do local da injeção (do refluxo) quanto do outro lado do lobule pancreático (em caso de penetração através e através). Se ocorrer vazamento visível, pare a injeção e observe o volume de vazamento verificando o volume de injeção restante na seringa. Se o vazamento for de pequeno volume (<10 μL), e então absorver qualquer vazamento com gaze e reposicionar a agulha em um lobule pancreático diferente para completar a injeção.
- Substitua o baço e o pâncreas e feche a parede abdominal com sutura de ácido poliglicólico 5/0 de forma contínua. Feche a pele com clipes.
- Monitore o rato em uma gaiola aquecida até se recuperar do anestésico. Uma vez acordado e alerta, mova o rato de volta para sua gaiola.
2. Cirurgia de ressecção do câncer: Pancreatectomia distal e esplenectomia
- O tempo de ressecção em relação à implantação pode variar dependendo do protocolo experimental. Em geral, permitem que os tumores cresçam pelo menos por 3 semanas antes da ressecção, mas otimizem isso empiricamente para a linha de células cancerígenas implantadas em particular.
- No dia anterior à cirurgia de ressecção, realize imagens de bioluminescência nos animais para confirmar a presença de um tumor primário localizado. Observe que este estudo de imagem é simplesmente usado para excluir camundongos com doença extra-pancreática óbvia da ressecção. Nem o tamanho nem o fluxo radiante devem ser usados como limiares para determinar a elegibilidade para a ressecção.
- Pese camundongos e injete com D-luciferin intraperitoneally (150 mg/kg).
- Determine o tempo da etapa de imagem em relação à injeção de luciferina para cada experimento pelo desempenho de uma curva cinética de luciferina. O período em que o fluxo radiante está acima de 90% do seu máximo representa o tempo ideal para a imagem de bioluminescência (neste experimento, 18 a 26 minutos após a injeção)
- Induzir anestesia e manter o uso de isoflurane (4% e 3% com oxigênio, respectivamente) e realizar imagens usando um dispositivo de imagem bioluminescente (por exemplo, IVIS Lumina II). Use configurações automáticas de exposição e binning (isso pode, no entanto, ser otimizado para o fluxo radiante esperado).
- Prepare o armário de biossegurança classe II para o procedimento. Use um tapete de aquecimento sobreposto por uma cortina de plástico estéril. Para ampliação durante a dissecção, use um par de lupas cirúrgicas de ampliação de 2,5x a 3,5x.
- Anestesiar o rato com 80 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina por injeção intraperitoneal.
- Administre 5 mg/kg de profilaxia antibiótico enrofloxacina, 2,5 mg/kg de analgesia flunixina e 1 mL de 0,9% de soro fisiológico subcutâneamente.
- Coloque o mouse no campo estéril em uma posição supina e aplique povidone-iodo seguido de 70% de etanol para preparação da pele.
- Faça uma incisão longitudinal na pele do quadrante craniano esquerdo do abdômen, de preferência através do local de incisão anterior.
- Dissecar sem rodeios a pele da parede abdominal muscular subjacente, e então coloque um retraínte auto-retentor de Alm para manter a ferida da pele aberta.
- Incisar a camada muscular entre fórceps apenas para um lado da linha de sutura da operação anterior, e, em seguida, estender a incisão para extirpara extirpara toda a linha de sutura anterior.
- Exteriorize o baço e o pâncreas distal e retraia-o cranialmente. No aspecto caudal do pâncreas, o cólon pode ser encontrado preso por aderências cinematográficas. Se isso for encontrado, disseca o cólon sem rodeios.
- Passe cuidadosamente um par de fórceps dorsais para o corpo do pâncreas e vasos esplênicos e abra este espaço. Isso libera um segmento de pâncreas para a ligadura subsequente.
- Ligate o corpo do pâncreas proximal ao tumor com um clipe de ligadura de titânio, e depois transecte o pâncreas distal para isso com cauteria. Uma maneira alternativa de controlar o toco pancreático é liga-lo em continuidade com sutura de ácido poliglicólico de 5/0 antes da transeção.
- Retraia o pâncreas caudalmente e cauterize os vasos gastrospínicos entre o polo craniano do baço e o estômago.
- Remova a amostra e confirme a haemostasis.
- Feche a parede abdominal com sutura de ácido poliglicólico 5/0 de forma contínua. Feche a pele com clipes.
3. Gestão pós-operatória
- No período pós-anestésico imediato (para ambos os procedimentos acima), monitore o rato em uma gaiola aquecida até ser recuperado do anestésico. Uma vez acordado e alerta, mova o rato de volta para sua gaiola. No pós-operatório, monitore os animais em busca de dor e sinais de angústia. Administre 0,05 mg/kg de buprenorfina por injeção subcutânea e observe de perto os animais por 12 horas.
- Posteriormente, monitore os camundongos diariamente para o peso, a ingestão de alimentos e a atividade. Examine os locais de incisão e palpato para o tamanho do tumor. Remova os clipes de pele no sétimo dia pós-operatório.
- Eutanize o rato se os pontos finais humanos forem alcançados. Estes pontos finais humanos incluem: perda de peso corporal >20%, características de angústia intratável (incluindo postura curvada, falta de movimento ou preparo) e tamanho do tumor superior a 1 cm3, conforme estimado pela palpação externa.
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Representative Results
Cinquenta e nove camundongos consecutivos foram submetidos a cirurgia de implantação. Vazamento bruto ocorreu em oito (14%) mouses. O grau de vazamento no momento da injeção é estimado como descrito acima na seção de protocolo. Após três semanas para permitir que esses tumores implantados crescessem, a imagem de bioluminescência pré-ressecção foi realizada para excluir camundongos com doença metastática bruta antes da ressecção. Quarenta e cinco (76%) camundongos submetidos à ressecção cirúrgica.
Todos os 45 (100%) camundongos foram submetidos a pancreatectomia distal bem sucedida/esplenectomia sem problemas de haemostase. Uma margem pancreática proximal macroscópica maior que 5 mm foi alcançada em 43 (96%) mouses.
No momento da ressecção, a metástase local foi encontrada em 45/9 (20%) camundongos – principalmente na linha de sutura (descontínuo com o tumor primário) com três dos nove apresentando nódulos isolados adicionais na curva maior do estômago e um mostrando um nódulo subcapsular no fígado. O tumor pancreático primário foi aderido à linha de sutura em cinco (11%) camundongos e para o fígado em um (2%) rato. Essas estruturas aderentes foram extirpadas em bloco.
O tempo médio de cirurgia (SEM) (indução ao fechamento) foi de 22 (0,9) minutos. Nenhum dos animais morreu uma semana após a ressecção.
Após uma semana de ressecção, os camundongos foram submetidos a imagens de bioluminescência para detectar doenças residuais. A razão do brilho máximo sobre a superfície ventral do mouse foi comparada com a do fundo. Trinta e dois (71%) camundongos apresentaram uma relação de brilho máxima (mouse:background) de <10, indicando doença residual mínima ou não.
Figura 1: Dispositivos feitos sob medida para facilitar a implantação do tumor. (a) Swab de gaze de corda de bolsa: (i) Orifício central, aproximadamente 1 cm de diâmetro, através do qual a cauda pancreática será colocada no momento da injeção; (ii) Sutura de corda de bolsa ao redor do orifício; (iii) Gaze de camada dupla; (iv) Nó de arremesso único; v Um membro do material de sutura é fixado à gaze com fita indicadora de esterilização; (vi) Uma alça, feita de fita indicadora, é feita na outra extremidade do material de sutura. (b) Dispositivo de injeção: (I) Acionando a seringa. As ranhuras cortadas pelo corpo desta seringa permitem que a seringa de injeção (com o injetor de suspensão celular; não mostrada) seja montada neste corpo de seringa; (II) Seringa controladora. Isso está cheio de água. A depressão do êmbolo na seringa controladora menor pelo assistente cirúrgico causa o deslocamento do maior êmbolo da seringa atuante. O deslocamento do êmbolo atuante é menor, mas com uma vantagem mecânica que permite que a injeção supere a resistência associada ao mecanismo de injeção de seringa, bem como a resistência do tecido à expansão pelo injetado. Isso permite uma injeção precisa e suave de 50 μL ao longo de 10-15 segundos; (III) Tubo de conexão politetrafluoroetileno (PTFE) com diâmetro interno de 0,5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um modelo de camundongo ortotópico resectional de câncer de pâncreas é importante porque permite o teste de tratamentos adjuvantes e neoadjuvantes. Isso é particularmente importante no câncer de pâncreas, onde a cirurgia continua sendo o tratamento mais eficaz, mas está associada ao alto risco de recidiva. Este artigo descreve um método que produzirá de forma confiável um câncer pancreático potencialmente curável com ressecção, replicando o cenário clínico onde a terapia neoadjuvante/adjuvante é necessária.
Significância em relação aos métodos existentes
Apesar da importância das terapias adjuvantes e neoadjuvantes no câncer de pâncreas, existem poucos modelos de camundongos resseccionais ortotópicos bem descritos na literatura. Estes modelos resseccionais descritos variaram em sua fidelidade de replicação da situação clínica em humanos. Esses modelos anteriores podem ser amplamente classificados em: (i) excisão tumoral apenas, com orientação de fluorescência; (ii) ressecção pancreática subtotal sem esplenectomia; (iii) pancreatectomia/esplenectomia distal.
A excisão tumoral com orientação de fluorescência foi descrita no maior número de relatórios15,17,18,19,20,21. Muitos desses artigos se originaram do mesmo grupo de pesquisa. Infelizmente, em humanos, a excisão local do tumor sozinho (enucleação) não é realizada para adenocarcinoma pancreático (PC) devido à alta probabilidade de recidiva local, bem como a incapacidade de avaliar o estado do linfonodo22,23. Portanto, o uso de um grupo comparativo não clinicamente relevante (enucleação guiada por não fluorescência) ofusca o relato dos desfechos oncológicos em artigos que descrevem essa técnica. Não surpreendentemente, os grupos de enucleação de não fluorescência invariavelmente apresentaram taxas excessivas de recorrência local15,20,21. Em contraste, Torgenson et al.14 descreveram uma técnica de ressecção guiada pela fluorescência semelhante, e relataram uma taxa de recorrência razoavelmente baixa de 58% (em oito semanas após a ressecção). No geral, esses estudos parecem demonstrar a utilidade da orientação de fluorescência para visualização de doenças residuais durante a cirurgia. No entanto, este ainda não é o padrão de cuidado em humanos, o que é uma limitação em termos de seu uso em um modelo de camundongo com o objetivo de replicar o cenário clínico. É claro que isso pode mudar se a cirurgia guiada pela fluorescência for amplamente adotada na prática clínica.
Outro modelo de ressecção foi baseado na pancreatectomia subtotal sem esplenectomia para um tumor implantado no corpo do pâncreas13,24. A relevância clínica disso também é posta em causa, pois a operação descrita não foi nem pancreaticoduodenectomia nem pancreatectomia distal como realizada em humanos. Não surpreende que esses camundongos também sofreram de altas taxas de recidiva do tumor, tanto distantes quanto locais. Nota-se que a recidiva esplênica era comum, sugerindo ressecção inadequada ou possível semeadura de tumor peritoneal na implantação24.
Ni et al.16 descreveram um modelo de pancreatectomia/esplenectomia distal realizado com orientação de imagem de fluorescência. Decepcionantemente, apesar do uso de uma operação clinicamente relevante (com orientação de fluorescência), a sobrevida foi muito curta (sobrevida média de 18 dias), mesmo no grupo de pancreatectomia distal. Esse grau de doença progressiva parece ser ainda pior do que os modelos de tratamento paliativo25,26,27, sugerindo a possível presença de doença residual bruta após a ressecção. Mais recentemente, Giri et al.28 relataram uma pancreatectomia distal e modelo parcial de rato de esplenectomia. Este estudo é notável por representar um modelo de camundongo imunocompetente de câncer. No entanto, este estudo relatou uma recidiva tumoral local e outras apenas universais, possivelmente indicando metástase iatrogênica oculta na implantação.
O uso de modelos de camundongos onde há doença residual bruta pós-ressecção para testar tratamentos adjuvantes pode ser inadequado. A questão é que o tratamento para doença residual bruta não pode ser verdadeiramente classificado como tratamento adjuvante, mas deve ser considerado como tratamento com intenção paliativa. Nesse caso, tais modelos de mouse não oferecem nenhuma vantagem em comparação com modelos não resseccionais com doença de baixo volume.
Dicas e armadilhas de passos críticos
Procedimento de implantação de tumores
Para replicar o cenário clínico, há desafios distintos neste modelo que se relacionam com os procedimentos de implantação e ressecção. Para o procedimento de implantação, os principais desafios que precisam ser superados são a implantação bem sucedida e a prevenção de vazamentos. Essas duas questões estão interrelacionadas, pois a falha de injeção resultaria em vazamento bruto da suspensão da célula tumoral na cavidade abdominal. Isso produziria um modelo de camundongo com metástase peritoneal, que progredirá independentemente da ressecção pancreática. Isso reflete o conhecido cenário clínico em humanos onde a ressecção pancreática no PC metastático não afeta o desfecho do paciente. Esta é a base da laparoscopia de encenação em humanos29.
O sucesso da implantação do tumor pode ser visto intraoperatóriamente como a geração bem sucedida de uma "bolha" de suspensão celular sem vazamento óbvio. A maior importância para alcançar um bom resultado é a colocação precisa da agulha dentro do parênquim pancreático. Isso só poderia ser alcançado "esticando" o pâncreas para que a superfície peritoneal fosse esticada. A punção deve ocorrer com o bisel da agulha voltado para cima (ventrally). Uma vez que a agulha perfure a superfície peritônio, ela deve ser avançada enquanto a ponta da agulha é ligeiramente levantada para que a superfície chanfrada deslize logo abaixo do peritônio. Isso evitará punção inadvertida do pâncreas, uma armadilha comum devido às pequenas dimensões dos lobos pancreáticos do rato. Uma vez que todo o bisel esteja dentro da substância do pâncreas, a suspensão celular é injetada. A ampliação da visão com lupas cirúrgicas é altamente desejável visualizar com precisão a profundidade da penetração da agulha.
Uma série de técnicas podem ser usadas para minimizar ainda mais o risco de vazamentos inadvertidos.
Seleção de um grande lobule para injeção. Pequenos lobulos requerem pressões mais altas para inflar (seguindo a lei de Laplace), aumentando assim o risco de vazamento em torno da agulha no local da punção.
Otimização da velocidade da injeção. O uso de um dispositivo de injeção(Figura 1b)que permite que a suspensão celular seja injetada ao longo de 10-15 segundos serve a três propósitos. Primeiro, diminui a taxa de mudança de pressão no pâncreas, dando tempo aos tecidos para se deformarem e reduz o risco de refluxo da suspensão. Em segundo lugar, permite que o processo de injeção seja monitorado e, se necessário, parado e reposicionado da agulha. Qualquer vazamento pode ser limpo por uma gaze encharcada de povidone-iodo. Em terceiro lugar, libera o operador de precisar deprimir o êmbolo, permitindo que o operador se concentre em manter a ponta da agulha dentro do pâncreas enquanto o assistente injeta a suspensão da célula.
Uso de uma gaze de corda de bolsa de duas camadas. Esta gaze forma uma coleira ao redor da cauda pancreática que absorverá qualquer vazamento da suspensão celular e, portanto, minimizará a contaminação na cavidade abdominal.
Alguns estudos na literatura utilizaram uma mistura de matriz extracelular (Matrigel) que se solidifica com o tempo após a injeção13,15,24. Isso pode reduzir o risco de vazamento pós-injeção. No entanto, uma desvantagem potencial dessa estratégia é que a Matrigel ou outras soluções de matriz extracelular semelhantes podem exercer efeitos não fisiológicos nos PSCs30. Por exemplo, Matrigel tem sido mostrado para tornar os PSCs quiescentes, negando assim potencialmente os efeitos dos PSCs no modelo31,32. Uma alternativa à injeção de células cancerosas é a implantação ortotópica do tecido tumoral (diretamente de pacientes ou de modelos de camundongos subcutâneos). No entanto, essas abordagens têm suas próprias desvantagens. Em primeiro lugar, a heterogeneidade pode surgir de erro amostral ou de variações no volume de tecido implantado. Tal heterogeneidade pode reduzir o poder de comparações subsequentes de tratamento. Em segundo lugar, a passagem de tecido tumoral com um modelo de camundongo subcutâneo pode levar à seleção de sub clones que têm comportamentos biológicos diferentes do tumor original do paciente.
Procedimento de ressecção do tumor
Neste modelo, utilizamos um procedimento distal de pancreatectomia/esplenectomia semelhante ao realizado em humanos. Os desafios relativos à cirurgia resecional dependem de fatores patológicos e anatômicos.
O principal fator patológico é a disseminação do tumor. A propagação local de baixo volume pode ser resseccionada no momento da ressecção pancreática, embora possa indicar a possibilidade de peritoneal mais distante e outras metástases. Extiremos rotineiramente a linha de sutura desde a primeira operação, pois é uma possível área de recorrência local. Se o tumor estiver ligado a estruturas circundantes, como a parede abdominal ou o lobo esquerdo do fígado, estes podem ser ressecados em bloco. Anatomicamente, o passo chave é dissecar o plano dorsal para o corpo do pâncreas. A veia esplênica pode ser frequentemente visualizada atrás do pâncreas uma vez que o pâncreas é exteriorizado. Este é um marco fundamental, já que o plano sem sangue embriológico é imediatamente dorsal para isso.
Há duas outras potenciais armadilhas anatômicas no modelo descrito aqui. O cólon pode ser aderente ao aspecto caudal do corpo pancreático. A falta de mobilização dessa estrutura pode levar a lesões coloniais inadvertidas no momento da divisão pancreática ou ligadura. Os vasos gastrospínicos são pequenos e podem facilmente sangrar se avulsed ou inadequadamente cauterizado. Além disso, uma vez avulso, o ponto de sangramento muitas vezes se retrai profundamente no abdômen atrás da curva maior do estômago, tornando o controle subsequente do sangramento mais desafiador. Portanto, é necessária uma retração cuidadosa do baço e do cautery dos vasos gastrospínicos. Uma abordagem para hemostasia bem sucedida é cauterizar esses vasos no aspecto hilar do baço que minimiza o risco de lesão térmica inadvertida às vísceras ocas circundantes.
Descobrimos que o uso de um clipe de ligadura de titânio, amplamente utilizado na cirurgia humana para ligadura de vasos, é uma forma rápida e eficaz de controlar o toco pancreático, com consequente redução no tempo total de operação em comparação com o uso de ligaduras. Este também foi usado por Giri et al.28.
Limitações da técnica
Há limitações para este modelo resseccional do pâncreas. Uma limitação diz respeito ao tempo permitido para produzir recorrência/metástase. Por um lado, é preciso maximizar o desenvolvimento da doença metastática, mas, por outro lado, é preciso resseccionar o tumor antes que ele se torne localmente avançado. O período entre implantação e ressecção pode, portanto, precisar ser ajustado para o cenário clínico específico que se deseja replicar. Outra limitação diz respeito ao derramamento inadvertido e à subsequente metástase peritoneal das células cancerosas que se discute acima.
Um grande desafio dos modelos de tratamento adjuvante é dissecar o efeito de tratamento adjuvante a partir do efeito de tratamento cirúrgico. Claramente, é necessário um estudo bem desenhado, randomizado, com um grupo controle submetido a uma cirurgia de ressecção. Para melhorar ainda mais a avaliação dos efeitos relativos do tratamento, sugerimos avaliar a carga tumoral in vivo (por exemplo, usando células cancerígenas marcadas pela luciferase e realizando imagens de bioluminescência in vivo). Apesar da natureza semi-quantitativa dessa avaliação em modelos ortotópicos (uma vez que o sinal de bioluminescência é atenuado pela passagem pelos tecidos sobrepostos), essa abordagem permite a avaliação longitudinal da carga tumoral, incluindo a avaliação da doença residual pós-cirúrgica.
Modificações e aplicações futuras
A linha celular implantada e/ou os números de células com ou sem células estelares pancreáticas poderiam ser modificados para refletir o cenário clínico alvo12. A duração entre implantação e ressecção também pode ser modificada para alterar o risco de formação de metástase. Outras variações podem incluir a implantação de xenoenxertos ou organoides derivados de pacientes ou camundongos33.
A terapia neoadjuvante também pode ser testada dentro das características básicas do modelo descrito aqui. Bastaria simplesmente o início do tratamento medicamentoso antes da ressecção cirúrgica34. Da mesma forma, tanto a terapia neoadjuvante quanto a terapia adjuvante poderiam ser estudadas nos mesmos camundongos.
Finalmente, embora tenhamos descrito o uso de camundongos nus Balb/c atrímicos que representam um modelo imunodeficante, um modelo alternativo de imunocompetente pode envolver células tumorais KPC implantadas em camundongos C57B628. Esta pode ser uma alternativa útil para o teste de terapias imunológicas adjuvante/neoadjuvante.
Em resumo, descrevemos uma técnica robusta e reprodutível para um modelo de ressecção cirúrgica de câncer de pâncreas em camundongos que imita o cenário clínico e não requer equipamento especializado. Este modelo pode ser útil para o teste de tratamentos adjuvante e neoadjuvante.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar em relação a este projeto.
Acknowledgments
Os autores receberam apoio da Avner Pancreatic Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals, Materials and Equipment for Implantation Procedure | |||
| AsPC-1 human pancreatic cancer cell line, luciferase tagged (luc+ gene from Promega PGL3 Basic plasmid) | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | supplied by Professor Takashi Murakami, Saitama Medical University, Saitama, Japan | |
| Autoclip wound clips, 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW, Australia | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | ||
| Cancer associated human pancreatic stellate cells | Pancreatic Research Group cell bank | In house cell bank | |
| Cryogenic tubes, 1.0 mL | Thermo Fisher Scientific Australia Pty Ltd, Scoresby, VIC, Australia | 366656 | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Foetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 16000044 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| Homozygous athymic nude mice: Strain BALB/c-Fox1nu/Ausb, female | Australian Bioresources, Moss Vale, NSW, Australia | ||
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) with 4mM L-glutamine and no phenol red | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 21056023 | |
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Penicillin 10,000 U/mL, streptomycin 10,000 μg/mL | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 15140122 | |
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 with phenol red and 300 mg/L Lglutamine | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 11875085 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Trypsin 0.05%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25300054 | For pancreatic stellate cells |
| Trypsin 0.25%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25200056 | For ASPC-1 cells |
| U-100 insulin syringes, 0.5 mL with 29 G (0.33 mm) × 13 mm needle | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD, USA | ||
| Equipment for Resection Procedure | |||
| Alm self-retaining retractor | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Autoclip wound clips 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | 08-559NP | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Hand-held high temperature fine tip cautery | Bovie Medical Corporation, Melville, NY, USA | AA01 | |
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| IVIS Lumina II Bioluminescent Imaging Device | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA | ||
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex wound clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Titanium “Weck style” Ligaclip, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Titanium Ligaclip applier for open surgery, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Volatile anaesthetic machine, including vapouriser and induction chamber | Generic | Generic vapouriser and induction chamber | |
| Drugs for Procedures | |||
| 70% w/w ethanol solution | Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia | Applied topically as surgical skin preparation | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 0.05 mg/kg s.c. | |
| D-Luciferin (1 U/g) | PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA | 122799 | diluted in PBS to 15 mg/mL. Dose: 150 mg/kg i.p |
| Enrofloxacin 50 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 5 mg/kg s.c. | |
| Flunixin 50 mg/mL | Norbrook Laboratories Australia, Tullamarine, VIC, Australia | Dose: 2.5 mg/kg s.c. | |
| Isoflurane | Zoetis Australia Pty Ltd., Rhodes, NSW, Australia | Dose (vapourised with oxygen): 4% induction, 3% maintenance | |
| Ketamine 100 mg/mL | Maylab, Slacks Creek, QLD, Australia | Dose: 80 mg/kg i.p. | |
| Povidone-Iodine 10% w/v solution | Perrigo Australia, Balcatta, WA, Australia | RIO00802F | Applied topically to the anterior abdomen as surgical skin preparation |
| Refresh eye ointment (liquid paraffin 42.5% w/w, soft white paraffin 57.3% w/w) | Allergan Australia Pty Ltd, Gordon, NSW, Australia | Applied to both eyes | |
| Sodium chloride 0.9% w/v | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | 9481P | Dose: 900 μL s.c. |
| Water for injections BP | Pfizer Australia, Sydney, NSW, Australia | For dilution of drugs | |
| Xylazine 20 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 10 mg/kg i.p. |
References
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