Summary
臨床文脈では、局所性膵臓癌の患者は汎膵切除術を受け、続いてアジュバント治療を受ける。ここで報告されるこのプロトコルは、膵臓癌の正体性移植を経て、遠位汎化切欠切術および脾臓摘出術を通じて、ヌードマウスでこの臨床シナリオをモデル化する安全で効果的な方法を確立することを目的としている。
Abstract
膵臓癌(PC)の手術を検討されている患者のアジュバントおよび/またはネオアジュバント療法を研究するための満足のいく動物モデルの欠如がある。この不全に対処するために、PCの異形移植を伴うマウスモデルを記述し、続いて遠位汎化切欠切および脾臓摘出術を行う。このモデルは、アジュバントおよびネオアジュバントの設定における様々な治療アプローチの研究に対して、安全かつ適切に柔軟であることが実証されています。
このモデルでは、膵臓腫瘍は、まず、ヒト膵臓癌細胞(ルシファーサタグ付きAsPC-1)とヒト癌関連膵星形細胞をBalb/cアチミックヌードマウスの遠位膵臓に移植することによって生成される。3週間後、癌は再ラパロトミー、遠位汎腎切除術および脾臓摘出術によって切除される。このモデルでは、生物発光イメージングを使用して、がんの発症の進行と切除/治療の効果に従うことができます。切除後、アジュバント療法を行うことができる。あるいは、切除前にネオアジュバント治療を施すことができる。
45匹のマウスからの代表的なデータが提示される。すべてのマウスは、止まり止めの問題のない遠位汎化切欠切術/脾臓摘出術に成功した。5mmを超える巨視近位膵臓マージンは43(96%)で達成されたマウス。膵切除の技術的成功率は100%で、早期死亡率と罹患率は0%であった。切除後の週に動物は誰も死ななかった。
要約すると、臨床シナリオを模倣したマウスにおける膵臓癌の外科的切除モデルに対する堅牢で再現可能な技術について述べた。このモデルは、アジュバントおよびネオアジュバントの両方の治療のテストに有用である可能性があります。
Introduction
膵管腺癌(膵癌[PC])は予後不良1と関連している。外科的切除は、PCの唯一の潜在的治癒的治療であり、早期疾患を呈する患者に対して考慮されるべきである。残念なことに、R0切除術(すなわち、腫瘍のない切除マージン)を有しても、再発率(局所または未検出の転移性疾患から)は2、3である。したがって、全身アジュバント療法は、切除4を受けるほぼすべての患者に示される。さらに、ネオアジュバント療法は現在、境界分化可能な癌に対してのみ推奨されているが、その徴候は、その日常的な使用が多くの臨床研究5、6、7、8の焦点となるほど拡大している。切除を伴うPCの新しい治療アプローチを開発するためには、これらのアプローチは、臨床現場を正確に再現する前臨床モデルで最初に評価される必要があります。
PCの異所性マウスモデルは、薬物治療9、10をテストするために過去に頻繁に使用されてきた。これらの多くは、マウス膵臓に癌細胞を単独で注入することによって産生され、PCの特徴である顕著な間質を欠いた腫瘍をもたらした。さらに最近では、ヒトPCとヒト膵星細胞(PSC、PC中のコラーゲン質素の主要な生産者)の混合物を注入して最初に開発したもののような共噴射装具モデルが、11,12で定期的に使用されるようになってきた。癌と間質細胞の併用による腫瘍は、(i)PCの癌元素と特徴的な間質(デスモプラスチック)成分の両方を示し、かつ(ii)癌細胞増殖および転移を増強した。したがって、このモデルは人間のPCによく似ています。多くの整形体PCの切除モデルは13、14、15、16と記載されているが、このモデルほど正確なヒトにおける膵切除の臨床的実態を反映するものは一切ないので、アジュバントまたはネオアジュバント治療の検査に最適ではない。
提示されたマウスモデルの目的は、(i)不注意な腹膜播種を最小限に抑えながら、正腸膵臓癌を移植することに成功し、(ii)その後癌を完全に切断する方法を実証することであった。この論文は、この技術のヒントと潜在的な落とし穴を強調しています。
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Protocol
すべての手続きは、ニューサウスウェールズ大学動物管理倫理委員会(17/109A)によって承認されました。雌の高胸腺Balb/cヌードマウスは、体重16〜19gの8〜10週齢、このプロトコルに使用された。マウスは、マイクロアイソレーターケージに収容され、市販のペレット化食品および水 のアドリビタムを供給した。
1. 正腸膵臓癌移植
- 細胞を移植のために準備します。まず、処置に必要な細胞数を計算します(1 x 106 ルシファーサタグ付きAsPC-1細胞と1 x 106 がん関連のヒト膵星細胞[CAhPSC]は各動物に必要です)。
- 加湿温度制御CO2 インキュベーターでこれらの細胞を維持し、定期的なマイコプラズマ試験を行います。AsPC-1およびCAhPSCに使用される培地は、RPMI 1640(300mg/L-L-グルタミン、20%v/v胎児ウシ血清、1%v/vペニシリン/ストレプトマイシン)およびIMDM(4 mM L-グルタミン、10%対/胎児ウシ血清、1%v/胎児ウシ血清、1%v/胎児胎児スイシン/ストリン/ストリン/スクレビン/ストリン)です。
- 標準的な細胞培養技術を用い、細胞を細胞懸濁液にトリプシン化する。使用するトリプシン溶液の2倍の体積でそれぞれの完全な培養培地を使用してトリプシンを中和する。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でこれらの細胞を2回洗浄し、50 μL細胞懸濁液中の1 x 106 AsPC-1細胞と1 x 106 CAhPSCを含む混合物に再懸濁します。
- 使用するまで氷の上にこの懸濁液を保管してください。
- 手順のためのクラスIIバイオセーフティキャビネットを準備します。無菌プラスチックドレープで重ねた加熱マットを使用してください。処置の間の拡大のために、2.5xから3.5倍の拡大の外科ルーペの対を使用する。
- 直径1cmの穴をガーゼスワブに切り取って、財布ひも綿棒を準備します。この穴を財布の糸縫い糸で固定します。これのために任意の細かい編み縫合糸(例えば、5/0ポリグリコール酸縫合糸)を使用することができます。編組縫合材料は、締め付けた後に緩い結び目を所定の位置に保ち続けることを可能にするので推奨される。この例を図 1aに示します。
- 腹腔内注射により80mg/kgのケタミンと10mg/kgのキシラジンでマウスを麻酔します。
- 5 mg/kg エンフロフロキサシン抗生物質予防、2.5 mg/kg フルニシン鎮痛、皮下0.9%の生理食前の1 mLを投与する。
- 麻酔をしたら、ステ無菌場にマウスを置き、ポビドンヨウ素を塗布し、続いて70%エタノールを皮膚調製に適用します。
- 腹部の左頭蓋象限の皮膚に縦切開を行い、鉗子の間に筋肉層を切開して腹部に入る。
- 29 G インシュリンシリンジを 50 μLの細胞懸濁液でロードし、これは1 x 106 の CAhPSC と 1 x 106 ルシメラーゼタグ付き AsPC-1 細胞を注射あたりに相当します。射出装置に取り付けます。この注入装置の設計および機能は 図1b およびその伝説で詳しく説明される。
- 財布ひも綿棒を開口切開部の上に置き、この綿棒の開口部を通して脾臓と膵臓の尾を外装します。財布の紐を締めて膵臓の体を優しく囲み、膵臓の尾を露出して注射します。ガーゼが膵臓を周回に接触すると同時に収縮しないように十分にタイトであることが重要です。
- 鉗子を使って、膵臓の尾を握り、横張り張りをそっと置きます。腹側腹膜表面を浅い角度で針で穿刺し、注射装置でゆっくりと制御された方法(10-15秒以上)で膵臓に細胞懸濁液を注入する。
- 射出プロセス中は、注入部位の周り(逆流から)と膵臓の反対側(貫通貫した浸透の場合)の両方で、漏れについて注意深く観察します。目に見える漏れが発生した場合は、注射を停止し、シリンジ内の残りの注射量を確認して漏出量を確認してください。漏れが少量(<10 μL)の場合は、ガーゼで漏れを吸収し、注射を完了するために針を別の膵臓の小葉に再配置します。
- 脾臓と膵臓を交換し、連続的な方法で5/0ポリグリコール酸縫合糸で腹壁を閉じます。クリップでスキンを閉じます。
- 麻酔薬から回復するまで、温めたケージの中でマウスを監視します。目を覚まして警告したら、マウスをケージに戻します。
2. がん切除手術:遠位膵切除術と脾臓摘出術
- 移植に関する切除のタイミングは、実験プロトコルによって異なる場合があります。一般に、腫瘍は切除前に少なくとも3週間は増殖するが、特定の移植癌細胞株に対して経験的に最適化する。
- 切除手術の前日に、動物に生物発光イメージングを行い、局在した原発性腫瘍の存在を確認する。このイメージング研究は、明らかな膵外疾患を有するマウスを切除から除外するために使用されることに注意してください。サイズも放射フラックスも、切除の適格性を決定するための閾値として使用されるべきではありません。
- マウスの重量を量り、腹腔内にD-ルシフェリンを注射する(150mg/kg)。
- ルシフェリン運動曲線の性能により、各実験のルシフェリン注入に関するイメージングステップのタイミングを決定する。放射束が最大の90%を超える期間は、生物発光イメージングに最適な時間を表します(この実験では、18〜26分の注射後)
- 麻酔を誘導し、イオブルラン(それぞれ酸素で4%と3%)を使用して維持し、生物発光イメージング装置(例えば、IVIS Lumina II)を用いてイメージングを行う。自動露出とビン分割の設定を使用します(ただし、これは予想される放射束に最適化することができます)。
- 手順のためにクラスIIバイオセーフティキャビネットを準備します。無菌プラスチックドレープで重ねた加熱マットを使用してください。解剖中の倍率については、2.5x〜3.5倍の拡大手術ルーペのペアを使用してください。
- 腹腔内注射により80mg/kgのケタミンと10mg/kgのキシラジンでマウスを麻酔します。
- 5 mg/kg エンフロフロキサシン抗生物質予防、2.5 mg/kg フルニシン鎮痛、皮下0.9%の生理食前の1 mLを投与する。
- ステ無菌場にマウスを置き、ポビドンヨウ素を塗布し、続いて70%エタノールを皮膚調製に適用します。
- 腹部の左頭蓋象限の皮膚に縦切開を行い、好ましくは前の切開部位を通して行う。
- 下の筋肉の腹壁から皮膚を鈍く解剖し、皮膚の傷を開いたままにするためにAlm自己保持レトラクターを置く。
- 前の操作の縫合線の片側に鉗子間の筋肉層を切開し、切開を延長して前の縫合線全体を切除する。
- 脾臓と遠位膵臓を外装し、目ざまにそれを引き込む。膵臓の尾大の側面では、結腸は、フィルム接着によって付着して見つかり得る。これが見つかった場合は、コロンをぶっきらぼうに解剖します。
- 慎重に膵臓と脾臓の容器の体に足を引く鉗子のペアを渡し、このスペースを開きます。これは、後の結紮のために膵臓のセグメントを解放します。
- 膵臓の体をチタン結紮クリップで腫瘍に近似させ、これに近い膵臓を焼灼で伝達する。膵切り株を制御する別の方法は、横断術前に5/0ポリグリコール酸縫合糸で連続性にそれを液化することです。
- 膵臓を引き込み、脾臓の頭蓋極と胃の間の胃血管を焼灼する。
- 標本を取り除き、血体止を確認します。
- 5/0ポリグリコール酸縫合糸で腹壁を閉じます。クリップでスキンを閉じます。
3. 術後管理
- 即時麻酔後期間(上記の両方の手順)で、麻酔薬から回復するまで温めたケージでマウスを監視します。目を覚まして警告したら、マウスをケージに戻します。術後の期間に、動物の痛みや苦痛の兆候を監視します。0.05 mg/kg ブプレノルフィンを皮下注射で投与し、動物を12時間注意深く観察する。
- その後、体重、食物摂取および活性について毎日マウスを監視する。腫瘍の大きさについて切開部位と触診部位を調べる。術後7日目にスキンクリップを取り外します。
- 人道的エンドポイントに到達した場合は、マウスを安楽死させる。これらの人道的エンドポイントには、体重>20%の喪失、治療不可能な苦痛の特徴(ハンチ姿勢、動きまたはグルーミングの欠如を含む)および外部触診によって推定される1cm3 を超える腫瘍サイズが含まれる。
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Representative Results
59匹の連続したマウスが移植手術を受けた。8件で発生した漏れ総件数(14%)マウス。注入時の漏出の程度は、プロトコルセクションで上述したように推定される。これらの移植された腫瘍が成長することを可能にする3週間後、切除前に大転移性疾患を有するマウスを除外するために前切除生物発光イメージングを行った。45人(76%)マウスは外科的切除を受けた。
全45(100%)マウスは、血栓症の問題なく遠位汎切剖/脾臓摘出術に成功した。5mmを超える巨視近位膵臓マージンは43(96%)で達成されたマウス。
切除時、9/45(20%)で局所転移が見つかった。マウス – 主に縫合線で (原発性腫瘍と不連続) 9 つのうちの 3 つは、胃の大きな曲線に追加の孤立した結節を示し、1 つは肝臓にサブカプセル状結節を示す。原発性膵腫瘍は縫合線に5個(11%)で付着したマウスと肝臓の1つに (2%)鼠。これらの付着構造は、 ブロックを切除した。
平均(SEM)手術時間(閉鎖への誘導)は22(0.9)分であった。切除後1週間以内に死亡した動物はいなかった。
切除後1週間、マウスは残留疾患を検出するために生物発光イメージングを受けた。マウスの腹側表面上の最大輝度の比を背景のそれと比較した。32 (71%)マウスは最大輝度比(マウス:バックグラウンド)が<10であり、最小または残留疾患がないことを示した。
図1:腫瘍移植を容易にするカスタムメイドの装置。(a)財布ひもガーゼ綿棒:(i)中央の穴、直径約1cm、注射時に膵尾部が配置される。(ii) 穴の周りの財布ひも縫合。(iii) 二重層ガーゼ(iv) シングルスローノット;(v) 縫合材料の 1 つの四肢は殺菌の指示テープが付いたガーゼに固定される;(vi) インジケーターテープから作られたハンドルは、縫合材の反対側で作られています。(b)注射装置: (I) 作動シリンジ。この注射器の本体を切断したスロットは、注射注射器(細胞懸濁液注射剤を使用して、示されていない)をこのシリンジ本体に取り付けることを可能にする。(II) コントローラーシリンジ。これは水で満たされています。手術助手による小さいコントローラーのシリンジのプランジャーのうつ病は、より大きな作動するシリンジプランジャーの変位を引き起こす。作動プランジャーの変位は小さいが、注射機機構に関連する抵抗を克服する注入を可能にする機械的な利点を有するだけでなく、注入によって膨張に対する組織の抵抗。これにより、10~15秒にわたって50μLの精密でスムーズな注入が可能になります。(III) ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)の内径0.5mmの接続チューブを使用して、この図の大きなバージョンをご覧ください。
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Discussion
膵臓癌の切除整形マウスモデルは、アジュバントおよびネオアジュバント治療の検査を可能にするため重要である。これは、手術が最も効果的な治療であり続けるが、再発のリスクが高いと関連している膵臓癌において特に重要である。本論文では、切除術で治癒可能な膵臓癌を確実に産生する方法について述べ、ネオアジュバント/アジュバント療法が必要な臨床シナリオを複製する。
既存の方法に関する意義
膵臓癌におけるアジュバントおよびネオアジュバント療法の重要性にもかかわらず、文献には十分に記述された直交性直交切除マウスモデルはほとんどない。これらの記述された切除モデルは、ヒトにおける臨床状況の複製の忠実度において様々であった。これらの以前のモデルは、蛍光ガイダンスを用いて、(i)腫瘍切除のみに大きく分類することができます。(ii) 脾摘出を伴う小膵切除術;(iii) 遠位汎化切欠切/脾臓摘出術。
蛍光誘導を伴う腫瘍切除は、15、17、18、19、20、21の報告の最大数に記載されている。これらの論文の多くは同じ研究グループから生まれました。残念なことに、ヒトでは、局所再発の可能性が高いために膵臓腺癌(PC)に対して腫瘍単独の局所切除(核摘出)が行われない、ならびにリンパ節の状態22、23を評価することができない。したがって、非臨床的に関連する比較子群(非蛍光誘導核)の使用は、この技術を説明する論文における腫瘍学的転帰の報告を曇らせる。当然のことながら、非蛍光性核分裂群は、局所再発の過剰な率を常に有していた15,20,21.これに対し、Torgensonら14は同様の蛍光誘導切除法を説明し、58%(切除後8週間)の再発率がかなり低いと報告した。全体として、これらの研究は、手術中の残留疾患の可視化のための蛍光誘導の有用性を示すように見える。しかし、これはまだヒトのケアの標準ではなく、臨床シナリオを再現することを目指すマウスモデルでの使用の面での制限である。もちろん、蛍光誘導手術が臨床現場で広く採用される場合、これは変わる可能性があります。
別の切除モデルは、膵臓13,24の体内に移植された腫瘍に対する脾切除術を伴わない小計汎膵切除術に基づいていた。この臨床的関連性は、説明された手術がヒトで行われる膵臓十二指腸切除術でも遠位膵切除術でもなかったため、問題にも問われる。当然のことながら、これらのマウスはまた、遠く離れた場所と局所的な両方の腫瘍再発率が高い。特に注意すべきは、脾再発が一般的であったということで、移植24で不十分な切除または腹膜腫瘍播種の可能性のいずれかを示唆している。
Ni et al.16は、蛍光イメージングガイダンスで行われる遠位汎切離/脾臓切法モデルについて説明した。残念なことに、臨床的に関連する手術(蛍光ガイダンス付き)を使用したにもかかわらず、遠位汎開剖学群においても生存率は非常に短く(平均生存率は18日)であった。この進行性疾患は緩和治療モデル25、26、27よりもさらに悪いように見え、切除後の総残留疾患の存在の可能性を示唆している。最近では、Giriらら28は遠位汎性汎化切欠術および部分脾臓摘出マウスモデルを報告した。この研究は、がんの免疫担当マウスモデルを表す点で注目に値する。しかし、この研究は、ほぼ普遍的な局所および他の腹腔内腫瘍再発を報告し、移植時に閉塞性の起発性転移を示す可能性がある。
アジュバント治療の検査に対して、総残留疾患が切除されているマウスモデルの使用は不適切である可能性がある。問題は、総残留疾患の治療は、真にアジュバント治療として分類することはできませんが、むしろ緩和的意図を持つ治療であると考えるべきであるということです。その場合、このようなマウスモデルは、少量の疾患を有する非切除モデルに比べて利点を提供しない。
重要なステップのヒントと落とし穴
腫瘍移植手順
臨床シナリオを再現するために、このモデルには、移植および切除手順に関連する明確な課題があります。移植手順では、克服する必要がある主要な課題は、正常な移植と漏出の防止です。これら2つの問題は、注射の失敗が腹腔内への腫瘍細胞懸濁液の大きな漏出をもたらすので、相互に関連している。これは、膵切除に関係なく進行する腹膜転移を伴うマウスモデルを生成するであろう。これは、転移PCにおける膵切除が患者の転帰に影響を与えないヒトにおけるよく知られた臨床シナリオを反映している。これは、ヒト29における腹腔鏡検査の基礎である。
腫瘍の移植の成功は、明らかな漏れのない細胞懸濁液の「泡」の成功した生成として術中に見ることができる。良い結果を達成する上で最も重要なのは、膵臓のパンキマ内の針の正確な配置です。これは、腹膜表面が緊張するように膵臓を「伸ばす」ことによってのみ達成できる。穿刺は、針のベベルが上向き(腹側)で発生する必要があります。針が腹膜表面を穿刺したら、針の先端がわずかに持ち上げられる間に進む必要があります。これは、マウス膵臓の小さな寸法による一般的な落とし穴である膵臓の誤ってスルースルー穿刺を防ぎます。ベベル全体が膵臓の物質内に入ると、細胞懸濁液が注入される。手術ルーペによる視力の倍率は、針の浸透の深さを正確に可視化することが非常に望ましい。
不注意による漏洩のリスクをさらに最小限に抑えるために、数多くの手法を使用できます。
注射のための大きい小葉の選択。 小さな小葉は(ラプラスの法則に従って)膨張するためにより高い圧力を必要とし、それによって穿刺部位の針の周りの漏れのリスクを高める。
射出速度の最適化。 細胞懸濁液を10~15秒間注射できる注射装置(図1b)の使用は、3つの目的を果たす。まず、膵臓の圧力変化率を低下させ、組織に変形時間を与え、懸濁液の還流のリスクを低減する。第二に、注射プロセスを監視し、必要に応じて停止し、針を再配置することができます。任意の漏れは、ポビドネヨウ素浸漬ガーゼによってモップアップすることができます。第三に、それはオペレータがプランジャーを押し落とす必要から解放され、アシスタントが細胞懸濁液を注入している間、オペレータは膵臓内の針の先端を保つことに集中することを可能にする。
二重層の財布ストリングガーゼの使用。 このガーゼは、細胞懸濁液の漏れを吸収し、したがって腹腔内の汚染を最小限に抑える膵尾部の周りに首輪を形成する。
文献のいくつかの研究は、注射後の時間で固まる細胞外マトリックス混合物(Matrigel)を使用しています13,15,24.これは、漏出後の注射のリスクを減らすことができます。.しかし、この戦略の潜在的な欠点は、Matrigelまたは他の同様の細胞外マトリックス溶液がPSC30に非生理学的効果を発揮し得ることである。たとえば、Matrigel は PSC を静止させる結果として示されており、モデル31、32の PSC の影響を否定する可能性があります。がん細胞の注入に代わる方法は、腫瘍組織の正交性移植(患者から直接または皮下マウスモデルから)である。ただし、これらのアプローチには独自の欠点があります。第一に、不均一性は、サンプリング誤差から、または移植された組織の体積の変動から生じる可能性がある。このような異質性は、後続の治療比較の力を低下させる可能性がある。第二に、皮下マウスモデルによる腫瘍組織の通過は、元の患者腫瘍に異なる生物学的行動を有するサブクローンの選択につながる可能性がある。
腫瘍切除術
本モデルでは、ヒトで行われるのと同じ遠位汎切離/脾臓摘出術を利用しています。切除術に関する課題は、病理学的および解剖学的要因に依存する。
主な病理学的要因は腫瘍の播種である。少量の局所的な広がりは膵切除時に切除することができるが、それはより遠い腹膜および他の転移の可能性を示すかもしれない。局所再発の可能性のある領域であるため、最初の操作から縫合線を日常的に切除しています。腫瘍が周囲の構造に付着している場合、 例えば、腹壁や肝臓の左葉など, これらは ブロックを切除することができる。解剖学的に、重要なステップは、膵臓の体に後ろ面を解剖することです。脾静脈は、膵臓を外装すると、しばしば膵臓の後ろに視覚化することができる。これは、胚性無血平面がこれにすぐに後ろ劣であるため、重要なランドマークです。
ここで説明するモデルには、他に2つの潜在的な解剖学的落とし穴があります。結腸は膵臓の肉体の側面に付着してもよい。この構造を動員しないと、膵分裂または結紮時に不注意な大腸損傷を引き起こすことがある。胃の血管は小さく、腐食または不十分に焼灼した場合に出血しやすい。さらに、一度アウルスすると、出血点はしばしば胃のより大きな曲線の後ろの腹部の奥深くに引き込み、その後の出血の制御をより困難にする。したがって、胃血管の脾臓および焼灼の注意深い引き込みが必要とされる。止止めを成功させるための1つのアプローチは、脾臓のヒラル面でこれらの血管を焼灼し、周囲の中空内臓に不注意な熱傷害のリスクを最小限に抑える。
我々は、血管の結紮のためにヒト手術で広く使用されているチタンライゲーションクリップを使用することは、結紮の使用に比べて総手術時間の減少を伴う膵切り株を制御する迅速かつ効果的な方法であることを発見した。これは、Giriらら28によっても使用されました。
テクニックの制限
膵臓のこの切除モデルには制限があります。1つの制限は、再発/転移を生み出すために許された時間に関する。一方で、転移性疾患の発症を最大化する必要がありますが、一方で、局所的に進行する前に腫瘍を切除する必要があります。したがって、移植と切除の間の期間は、複製したい特定の臨床シナリオのために調整する必要があります。もう一つの制限は、上記で議論されている癌細胞の不注意なこぼれとその後の腹膜転移に関する。
アジュバント治療モデルの主要な課題は、外科的治療効果からアジュバント治療効果を解剖することです。明らかに、切除手術を受けている対照群を有する無作為化された適切に設計された研究が必要である。相対的な治療効果の評価をさらに改善するために、 インビボにおける 腫瘍の負担を評価することを提案する(例えば、ルシファーゼタグ癌細胞を用いて、生体発光イメージングを行う)。この評価は、同一性の組織モデルにおける半定量的な性質にもかかわらず(生物発光シグナルは上層組織を通過することによって減衰される)、このアプローチは、手術後の残留疾患の評価を含む腫瘍負担の縦断評価を可能にする。
変更と将来のアプリケーション
膵星細胞の有無にかかわらず埋め込まれた細胞株および/または細胞数は、標的臨床シナリオ12を反映するように改変することができる。移植と切除の間の持続時間はまた転移形成の危険を変えるために変更することができる。他のバリエーションは、患者またはマウス由来の異種移植片またはオルガノイド33の移植を含むことができる。
ネオアジュバント療法は、ここで説明するモデルの基本的な特徴の中でも試験することができる。それは単に外科的切除34の前に薬物治療の開始を必要とするであろう。同様に、ネオアジュバントとアジュバント療法の両方を同じマウスで研究することができた。
最後に、免疫不全モデルを表すア胸腺Balb/cヌードマウスの使用について説明したが、代替免疫担当モデルは、C57B6マウス28に移植されたKPC腫瘍細胞を含み得る。これは、アジュバント/ネオアジュバント免疫療法のテストに有用な代替手段である可能性があります。
要約すると、臨床シナリオを模倣し、特殊な装置を必要としないマウスにおける膵臓癌の外科的切除モデルのための堅牢で再現可能な技術について述べた。このモデルは、アジュバントとネオアジュバントの両方の治療のテストに有用である可能性があります。
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Disclosures
著者らは、このプロジェクトに関して開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者は、アヴナー膵臓癌財団からの支援を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals, Materials and Equipment for Implantation Procedure | |||
| AsPC-1 human pancreatic cancer cell line, luciferase tagged (luc+ gene from Promega PGL3 Basic plasmid) | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | supplied by Professor Takashi Murakami, Saitama Medical University, Saitama, Japan | |
| Autoclip wound clips, 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW, Australia | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | ||
| Cancer associated human pancreatic stellate cells | Pancreatic Research Group cell bank | In house cell bank | |
| Cryogenic tubes, 1.0 mL | Thermo Fisher Scientific Australia Pty Ltd, Scoresby, VIC, Australia | 366656 | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Foetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 16000044 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| Homozygous athymic nude mice: Strain BALB/c-Fox1nu/Ausb, female | Australian Bioresources, Moss Vale, NSW, Australia | ||
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) with 4mM L-glutamine and no phenol red | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 21056023 | |
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Penicillin 10,000 U/mL, streptomycin 10,000 μg/mL | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 15140122 | |
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 with phenol red and 300 mg/L Lglutamine | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 11875085 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Trypsin 0.05%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25300054 | For pancreatic stellate cells |
| Trypsin 0.25%, EDTA 0.02% | Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia | 25200056 | For ASPC-1 cells |
| U-100 insulin syringes, 0.5 mL with 29 G (0.33 mm) × 13 mm needle | Terumo Medical Corporation, Elkton, MD, USA | ||
| Equipment for Resection Procedure | |||
| Alm self-retaining retractor | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Autoclip wound clips 9 mm | Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW | 500346 | |
| Basic Dressing Pack | Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia | 08-559NP | |
| Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 | Livingstone International, Mascot, NSW, | SCP15 | |
| Gilles fine tooth forceps 12 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Hand-held high temperature fine tip cautery | Bovie Medical Corporation, Melville, NY, USA | AA01 | |
| Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery | Generic | ||
| IVIS Lumina II Bioluminescent Imaging Device | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA | ||
| Jewellers forceps 11.5 cm | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro needle holder (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Micro scissors (round handle) 15 cm straight | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | C1049407 | |
| Portable weighing scale | Precision balances, Bradford, MA, USA | ||
| Reflex wound clip applier and clip remover | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500345 | |
| Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip | Generic stainless steel microsurgical instrument set | ||
| Titanium “Weck style” Ligaclip, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Titanium Ligaclip applier for open surgery, small | HZMIM, Hangzhou, China | ||
| Volatile anaesthetic machine, including vapouriser and induction chamber | Generic | Generic vapouriser and induction chamber | |
| Drugs for Procedures | |||
| 70% w/w ethanol solution | Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia | Applied topically as surgical skin preparation | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 0.05 mg/kg s.c. | |
| D-Luciferin (1 U/g) | PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA | 122799 | diluted in PBS to 15 mg/mL. Dose: 150 mg/kg i.p |
| Enrofloxacin 50 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 5 mg/kg s.c. | |
| Flunixin 50 mg/mL | Norbrook Laboratories Australia, Tullamarine, VIC, Australia | Dose: 2.5 mg/kg s.c. | |
| Isoflurane | Zoetis Australia Pty Ltd., Rhodes, NSW, Australia | Dose (vapourised with oxygen): 4% induction, 3% maintenance | |
| Ketamine 100 mg/mL | Maylab, Slacks Creek, QLD, Australia | Dose: 80 mg/kg i.p. | |
| Povidone-Iodine 10% w/v solution | Perrigo Australia, Balcatta, WA, Australia | RIO00802F | Applied topically to the anterior abdomen as surgical skin preparation |
| Refresh eye ointment (liquid paraffin 42.5% w/w, soft white paraffin 57.3% w/w) | Allergan Australia Pty Ltd, Gordon, NSW, Australia | Applied to both eyes | |
| Sodium chloride 0.9% w/v | Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia | 9481P | Dose: 900 μL s.c. |
| Water for injections BP | Pfizer Australia, Sydney, NSW, Australia | For dilution of drugs | |
| Xylazine 20 mg/mL | Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia | Dose: 10 mg/kg i.p. |
References
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