Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En orthotopic Resectional Mouse Model af kræft i bugspytkirtlen

Published: September 24, 2020 doi: 10.3791/61726
Automatic Translation
1,2,4,5, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Pancreatic Research Group, South Western Sydney Clinical School, University of New South Wales, 2Ingham Institute for Applied Medical Research, 3Centre for Circulating Tumour Cell Diagnostics and Research, Ingham Institute for Applied Medical Research, 4Surgical Innovations Unit, Westmead Hospital, 5Westmead Clinical School, University of Sydney

Summary

I den kliniske sammenhæng, patienter med lokaliseret kræft i bugspytkirtlen vil gennemgå pancreatectomy efterfulgt af adjuvans behandling. Denne protokol rapporteret her har til formål at etablere en sikker og effektiv metode til modellering dette kliniske scenario i nøgne mus, gennem orthotopic implantation af kræft i bugspytkirtlen efterfulgt af distal bugspytkirtelektomi og splenectomy.

Abstract

Der er mangel på tilfredsstillende dyremodeller til at studere adjuvans og / eller neoadjuvans behandling hos patienter, der overvejes til operation af kræft i bugspytkirtlen (PC). For at løse denne mangel, beskriver vi en mus model, der involverer orthotopic implantation af PC efterfulgt af distal pancreatectomy og splenectomy. Modellen har vist sig at være sikker og passende fleksibel til undersøgelse af forskellige terapeutiske tilgange i adjuvans og neo adjuvans indstillinger.

I denne model, en bugspytkirtel tumor er først genereret ved at implantere en blanding af humane kræftceller i bugspytkirtlen celler (luciferase-tagged AsPC-1) og human kræft forbundet bugspytkirtel stjernernes celler i distale bugspytkirtel af Balb / c athymisk nøgen mus. Efter tre uger, kræften er resected af re-laparotomi, distal pancreatectomy og splenectomy. I denne model, bioluminescens imaging kan bruges til at følge udviklingen i kræft udvikling og virkningerne af resektion / behandlinger. Efter resektion kan adjuvansbehandling gives. Alternativt kan neoadjuvansbehandling gives før resektion.

Repræsentative data fra 45 mus præsenteres. Alle mus gennemgik vellykket distal pancreatectomy / splenectomy uden problemer med hemostase. En makroskopisk proksimal pancreas margin større end 5 mm blev opnået i 43 (96%) Mus. Den tekniske succesrate for pancreas resektion var 100%, med 0% tidlig dødelighed og sygelighed. Ingen af dyrene døde i løbet af ugen efter resektion.

Sammenfattende beskriver vi en robust og reproducerbar teknik til en kirurgisk resektionsmodel af kræft i bugspytkirtlen hos mus, der efterligner det kliniske scenarie. Modellen kan være nyttig til testning af både adjuvans- og neoadjuvansbehandlinger.

Introduction

Bugspytkirtelkanalen adenocarcinoma (kræft i bugspytkirtlen [PC]) er forbundet med en dårlig prognose1. Kirurgisk resektion er fortsat den eneste potentielt helbredende behandling for PC og bør overvejes for patienter, der præsenterer med tidlig sygdom. Desværre, selv med R0 resektion (dvs. resektion margener fri for tumor), gentagelseshastigheden (lokal eller fra uopdaget metastatisk sygdom) er høj2,3. Derfor er systemisk adjuvansbehandling angivet hos næsten alle patienter, der gennemgår resektion4. Desuden, mens neoadjuvans terapi nu kun anbefales til borderline-resectable kræftformer, dens indikationer er ved at udvide sådan, at dens rutinemæssige brug er i fokus for meget klinisk forskning5,6,7,8. For at udvikle nye terapeutiske tilgange til pc,der involverer resektion, skal disse tilgange først vurderes i prækliniske modeller, der nøjagtigt opsummerer kliniske indstillinger.

Orthotopic mus modeller af PC er blevet ofte brugt i fortiden til at teste medicinske behandlinger9,10. Mange af disse blev produceret ved injektion af kræftceller alene i musen bugspytkirtel, hvilket resulterer i tumorer, der manglede den fremtrædende stroma, der er karakteristisk for PC. For nylig, co-injektion orthotopic modeller, som den, vi først udviklet ved at injicere en blanding af human pc og menneskelige bugspytkirtel stellate celler (PSC' er, de primære producenter af kollagen stroma i PC), er kommet i regelmæssig brug11,12. Tumorerne produceret af en sådan co-injektion af kræft og stromale celler udviser (i) både kræftelementer og den karakteristiske stromale (desmoplastiske) komponent af PC, og (ii) forbedret kræftcellespredning og metastase11. Således ligner denne model meget menneskelig pc. Mens en række resectional modeller af orthotopic PC er blevet beskrevet13,14,15,16, ingen har afspejlet de kliniske realiteter i bugspytkirtlen resektion hos mennesker så nøjagtige som denne model, og derfor har været suboptimal for test adjuvans eller neoadjuvans behandlinger.

Formålet med den fremlagte musemodel var at demonstrere, hvordan man: (i) med succes implanterer orthotopic kræft i bugspytkirtlen og samtidig minimere utilsigtet peritoneal formidling og (ii) efterfølgende helt resect kræften. Papiret fremhæve tips og potentielle faldgruber i denne teknik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af Animal Care and Ethics Committee ved University of New South Wales (17/109A). Kvindelige athymiske Balb/c nøgne mus i alderen 8-10 uger, der vejer 16-19 g, blev brugt til denne protokol. Mus blev anbragt i mikroisolatorbure og fodret kommercielt tilgængelige pelleted mad og vand ad libitum.

1. Orthotopic kræft i bugspytkirtlen implantation

  1. Gør cellerne klar til implantation. Først skal du beregne antallet af celler, der kræves til proceduren (1 x10 6 luciferase-mærkede AsPC-1 celler og 1 x 106 kræft-associerede menneskelige bugspytkirtel stjernernes celler [CAhPSCs] er påkrævet for hvert dyr).
    1. Vedligehold disse celler i en befugtet temperaturstyret CO 2-inkubator, og udfør rutinemæssige mycoplasmatest. Kulturmedium, der anvendes til AsPC-1 og CAhPSCs, er RPMI 1640 (med 300 mg/L L-glutamin, 20% v/v føtalt kvægserum, 1% v/v penicillin/streptomycin) og IMDM (med 4 mM L-glutamin, 10% v/v føtalt kvægserum, 1% v/v penicillin/streptomycin).
    2. Brug standard cellekultur teknikker til at trypsinisere cellerne i en celle suspension. Forsøgsforsøgene neutraliseres ved hjælp af det respektive komplette kulturmedium ved et volumen, der er dobbelt så stort som den anvendte trypsinopløsning.
    3. Disse celler vaskes to gange med fosfatbufferet saltvand (PBS) og genbruges til en blanding, der indeholder 1 x 106 AsPC-1-celler og 1 x10 6 CAhPSC'er i en 50 μL cellesuspension.
    4. Hold denne suspension på is indtil brug.
  2. Forbered en klasse II biosikkerhed kabinet til proceduren. Brug en varmemåtte overlejret af en steril plast drapere. For forstørrelse under proceduren, skal du bruge et par 2,5 x til 3,5 x forstørrelse kirurgiske lup.
  3. Forbered pungstrengspinde ved at skære et hul, 1 cm i diameter, i en gasbindspinne. Fastgør dette hul med en pung-streng sutur. Enhver fin flettet sutur kan bruges til dette (f.eks. 5/0 polyglykolsyre sutur). Flettet suturmateriale anbefales, da det gør det muligt for den løse knude at forblive på plads efter stramning. Dette er illustreret i figur 1a.
  4. Bedøve musen med 80 mg/kg ketamin og 10 mg xylazin ved intraperitoneal injektion.
  5. 5 mg enrofloxacin antibiotisk profylakse, 2,5 mg/kg flunixin analgesi og 1 ml saltvand underkunøst.
  6. Når bedøvet, placere musen på det sterile felt i en liggende stilling og anvende povidone-jod efterfulgt af 70% ethanol til hud forberedelse.
  7. Lav et langsgående snit i huden på den venstre kraniekvadrant i maven, og kom derefter ind i maven ved at indsnitte det muskuløse lag mellem pincet.
  8. Lad en 29 G insulinsprøjte med 50 μL celleaffjedring– dette svarer til 1 x 106 CAhPSC'er og 1 x 106 luciferase-mærkede AsPC-1-celler pr. injicer. Monter den på injektionsenheden. Udformningen og funktionen af denne injektionsenhed er forklaret i detaljer i figur 1b og dens legende.
  9. Placer pung-strengen vatpind over laparotomi snit og derefter eksteriør milten og bugspytkirtlen hale gennem åbningen af denne vatpind. Stram pung-strengen til forsigtigt omkranse kroppen af bugspytkirtlen, udsætter bugspytkirtlen hale til injektion. Det er vigtigt at være stram nok, at gaze kontakter bugspytkirtlen omkredsende, mens på samme tid ikke snærende det.
  10. Ved hjælp af et par pincet, greb halen af bugspytkirtlen og forsigtigt placere lateral spænding på det. Punktere den ventrale peritoneal overflade med nålen i en lav vinkel og derefter injicere celle suspension i bugspytkirtlen i en langsom og kontrolleret måde (over 10−15 s) med injektion enhed.
  11. Under injektionsprocessen observeres omhyggeligt for lækage - både omkring injektionsstedet (fra refluks) og på den anden side af bugspytkirtellalen (i tilfælde af gennemtrængning). Hvis der opstår synlig lækage, skal injektionen standses, og lækagemængden noteres ved at kontrollere mængden af resterende injicer i sprøjten. Hvis lækagen er af lille volumen (< 10 μL), og derefter absorbere enhver lækage med gaze og flytte nålen i en anden pancreas lobule at fuldføre injektionen.
  12. Udskift milten og bugspytkirtlen og luk bugvæggen med 5/0 polyglykolsyre sutur på en kontinuerlig måde. Luk huden med klip.
  13. Overvåg musen i et opvarmet bur, indtil den er kommet sig efter bedøvelsen. Når du er vågen og opmærksom, skal du flytte musen tilbage til buret.

2. Kræft resektion kirurgi: Distal pancreatectomy og splenectomy

  1. Tidspunktet for resektion i forhold til implantation kan variere afhængigt af forsøgsprotokollen. Generelt tillader tumorer til at vokse i mindst 3 uger før resektion, men optimere dette empirisk for den særlige implanteret kræft celle linje.
  2. På dagen før resektionskirurgi skal du udføre bioluminescensbilleddannelse på dyrene for at bekræfte tilstedeværelsen af en lokaliseret primær tumor. Bemærk, at denne billeddiagnostiske undersøgelse simpelthen bruges til at udelukke mus med indlysende ekstra-bugspytkirtelsygdom fra resektion. Hverken størrelse eller stråleinfluenza bør anvendes som tærskler for bestemmelse af berettigelse til resektion.
    1. Veje mus og injicere med D-luciferin intraperitoneally (150 mg/kg).
    2. Det bestemmes, hvornår billedtrinnet skal udføres i forhold til luciferininindsprøjtningen for hvert forsøg ved hjælp af en luciferin kinetisk kurve. Den periode, hvor den strålestråleinfluenzaks er over 90% af sit maksimum repræsenterer den optimale tid for bioluminescens imaging (i dette eksperiment, 18 til 26 minutter efter injektion)
    3. Fremkalde anæstesi og opretholde ved hjælp af isofluran (henholdsvis 4% og 3% med ilt) og udføre billeddannelse ved hjælp af en bioluminescerende billeddannelse enhed (f.eks IVIS Lumina II). Brug indstillinger for automatisk eksponering og placering (dette kan dog optimeres til den forventede stråleflux).
  3. Forbered klasse II biosikkerhedsskabet til procedure. Brug en varmemåtte overlejret af en steril plast drapere. Til forstørrelse under dissektion, skal du bruge et par 2,5 x til 3,5 x forstørrelse kirurgiske lup.
  4. Bedøve musen med 80 mg/kg ketamin og 10 mg xylazin ved intraperitoneal injektion.
  5. 5 mg enrofloxacin antibiotisk profylakse, 2,5 mg/kg flunixin analgesi og 1 ml saltvand underkunøst.
  6. Placer musen på det sterile felt i en liggende stilling og påfør povidone-jod efterfulgt af 70% ethanol til hudforberedelse.
  7. Lav et langsgående snit i huden på den venstre kraniekvadrant i maven, helst gennem det tidligere snitsted.
  8. Disseker huden direkte fra den underliggende muskuløse mavevæg, og placer derefter en Alm selvbevarende retractor for at holde hudsåret åbent.
  9. Incise muskuløs lag mellem pincet lige til den ene side af sutur linje af den tidligere operation, og derefter udvide snittet til punktafgifter hele tidligere sutur linje.
  10. Udvendiggøre milten og distale bugspytkirtel og trække det kraniet. På kaudale aspekt af bugspytkirtlen, tyktarmen kan findes fastgjort af filmiske vedhæftninger. Hvis dette er fundet, stumpt dissekere tyktarmen off.
  11. Forsigtigt passere et par pincet dorsal til kroppen af bugspytkirtlen og milt fartøjer og åbne dette rum. Dette frigør et segment af bugspytkirtel til efterfølgende ligation.
  12. Ligate kroppen af bugspytkirtlen proksimale til tumor med en titanium ligation klip, og derefter transect bugspytkirtlen distal til dette med cautery. En alternativ måde at kontrollere bugspytkirtel stub er at ligate det i kontinuitet med 5 / 0 polyglykolsyre sutur før transsektion.
  13. Træk bugspytkirtlen caudally og ætse gastrosplenic fartøjer mellem kraniestang af milten og maven.
  14. Fjern prøven og bekræft haemostase.
  15. Luk bugvæggen med 5/0 polyglykolsyre sutur på en kontinuerlig måde. Luk huden med klip.

3. Forvaltning efter drift

  1. I den umiddelbare postbedøvelsesperiode (for begge ovennævnte procedurer) skal du overvåge musen i et opvarmet bur, indtil den er kommet sig efter bedøvelsen. Når du er vågen og opmærksom, skal du flytte musen tilbage til buret. I den postoperative periode skal dyrene overvåges for smerter og tegn på nød. 0,05 mg/kg buprenorphin ved subkutan injektion gives, og dyrene observeres nøje i 12 timer.
  2. Derefter skal du overvåge mus dagligt for vægt, fødeindtagelse og aktivitet. Undersøg snit steder og palpate for tumor størrelse. Fjern hudklemmer på den syvende postoperative dag.
  3. Aflive musen, hvis humane endpoints er nået. Disse humane endpoints omfatter: tab af kropsvægt > 20%, træk ved uhelbredelig nød (herunder krumme kropsholdning, manglende bevægelse eller grooming) og tumor størrelse større end 1 cm3 som anslået af ekstern palpation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

59 mus i træk blev opereret for implantation. Bruttolækage opstod i otte (14%) Mus. Lækagegraden på injektionstidspunktet anslås som beskrevet ovenfor i protokolafsnittet. Efter tre uger til at tillade disse implanterede tumorer til at vokse, præ-resektion bioluminescens imaging blev udført for at udelukke mus med brutto metastatisk sygdom før resektion. 45 år (76 %) mus gennemgik kirurgisk resektion.

Alle 45 (100%) mus gennemgik vellykket distal pancreatectomy / splenectomy uden problemer med haemostase. En makroskopisk proksimal pancreas margin større end 5 mm blev opnået i 43 (96%) Mus.

På tidspunktet for resektionen blev der fundet lokal metastase i 9/45 (20%) mus – for det meste i sutur linje (diskontinuerlig med den primære tumor) med tre af de ni viser yderligere isolerede knuder på den større kurve i maven og en viser en subcapsular knude på leveren. Den primære bugspytkirtel tumor blev overholdt sutur linje i fem (11%) mus og til leveren i en (2%) mus. Disse vedhængende strukturer blev fjernet en bloc.

Den gennemsnitlige (SEM) kirurgi tid (induktion til lukning) var 22 (0,9) minutter. Ingen af dyrene døde inden for 1 uge efter resektion.

En uge efter resektion gennemgik mus bioluminescensbilleddannelse for at opdage restsygdom. Forholdet mellem den maksimale udstråling over musens ventrale overflade blev sammenlignet med baggrundens. 32 (71 %) mus havde et maksimalt udstrålingsforhold (mus:baggrund) på <10, hvilket indikerer minimal eller ingen restsygdom.

Figure 1B
Figur 1: Specialfremstillede enheder til at lette tumorimplantation. a)Svaberprøver med snurrepung: i) central hul, ca. 1 cm i diameter, hvorigennem pancreashalen vil blive placeret på injektionstidspunktet; — pungstrengssting omkring hullet — Gaze med dobbelt lag — enkelt kastknude v) En del af suturmaterialet fastgøres til gasbindet med steriliseringsindikatortape. (vi) Et håndtag, lavet af indikatorbånd, er formet i den anden ende af suturmaterialet. b) Indsprøjtningsanordning: I ) Aktivering af sprøjten . Slots, der skæres gennem kroppen af denne sprøjte, gør det muligt at montere injektionssprøjten (med celleaffjedringsinjekt; ikke vist) på denne sprøjtekrop. (II) Controller sprøjte. Den er fyldt med vand. Fordybning af stemplet på den mindre controller sprøjte af den kirurgiske assistent forårsager forskydning af de større aktivering sprøjte stemplet. Forskydningen af det aktiverende stempel er mindre, men med en mekanisk fordel, som gør det muligt for injektionen at overvinde den modstand, der er forbundet med injektionssprøjtemekanismen samt vævets modstand mod ekspansion af injektet. Dette giver mulighed for præcis og jævn injektion på 50 μL over 10-15 sekunder. (III) Polytetrafluorethylen (PTFE) forbindelsesrør med en indvendig diameter på 0,5 mm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En resectional orthotopic mus model af kræft i bugspytkirtlen er vigtig, fordi det giver mulighed for test af adjuvans og neoadjuvan behandlinger. Dette er især vigtigt i kræft i bugspytkirtlen, hvor kirurgi er fortsat den mest effektive behandling, men er forbundet med høj risiko for tilbagefald. Dette papir beskriver en metode, som pålideligt vil producere en kræft i bugspytkirtlen, som potentielt kan helbredes med resektion, replikere det kliniske scenario, hvor neoadjuvans / adjuvans behandling er påkrævet.

Betydning for eksisterende metoder
På trods af betydningen af adjuvans og neoadjuvans behandlinger i kræft i bugspytkirtlen, der er få velbeskrevne orthotopic resectional mus modeller i litteraturen. Disse beskrevne resectional modeller varierede i deres troskab af replikation af den kliniske situation hos mennesker. Disse tidligere modeller kan groft klassificeres i: (i) tumor excision kun, med fluorescens vejledning; — subtotal resektion i bugspytkirtlen uden splenectomy — distal bugspytkirtelektomi/splenectomy.

Tumor excision med fluorescens vejledning er blevet beskrevet i det største antal rapporter15,17,18,19,20,21. Mange af disse papirer stammer fra den samme forskningsgruppe. Desværre, hos mennesker, lokal excision af tumoren alene (enucleation) udføres ikke for bugspytkirtel adenocarcinoma (PC) på grund af den høje sandsynlighed for lokal gentagelse, samt manglende evne til at vurdere lymfeknude status22,23. Derfor skyer brugen af en ikke-klinisk relevant sammenligningsgruppe (ikke-fluorescensstyret enucleation) rapporteringen af de onkologiske resultater i papirer, der beskriver denne teknik. Ikke overraskende havde ikke-fluorescensinducleationsgrupperne altid for store lokale gentagelsesrater15,20,21. I modsætning hertil beskrev Torgenson et al.14 en lignende fluorescensstyret resektionsteknik og rapporterede en rimelig lav gentagelsesrate på 58% (ved otte ugers resektion). Samlet set synes disse undersøgelser at demonstrere nytten af fluorescens vejledning for visualisering af resterende sygdom under operationen. Dette er dog endnu ikke standarden for pleje hos mennesker, hvilket er en begrænsning med hensyn til dets anvendelse i en musemodel, der sigter mod at gentage det kliniske scenario. Selvfølgelig kan dette ændre sig, hvis fluorescens-guidet kirurgi skulle være bredt vedtaget i klinisk praksis.

En anden resektion model var baseret på subtotal pancreatectomy uden splenectomy for en tumor implanteret i kroppen af bugspytkirtlen13,24. Den kliniske relevans af dette er også draget i tvivl, da operationen beskrevet var hverken en pancreaticoduodenectomy eller distal pancreatectomy som udføres hos mennesker. Ikke overraskende led disse mus også af høj tumorgentagelse, både fjernt og lokalt. Af særlig note er, at milt recurrence var almindelig, hvilket tyder på enten utilstrækkelig resektion eller mulig peritoneal tumor såning ved implantation24.

Ni et al.16 beskrev en distal pancreatectomy/splenectomy model udført med fluorescens imaging vejledning. Skuffende, på trods af brugen af en klinisk relevant operation (med fluorescens vejledning), overlevelsen var meget kort (gennemsnitlig overlevelse på 18 dage), selv i distale bugspytkirtel ectomy gruppe. Denne grad af progressiv sygdom synes at være endnu værre end palliativ behandling modeller25,26,27, tyder på den mulige tilstedeværelse af brutto resterende sygdom efter resektion. Senest, Giri et al.28 rapporterede en distal pancreatectomy og delvis splenectomy mus model. Denne undersøgelse er bemærkelsesværdig, fordi den repræsenterer en immunkompetent musemodel af kræft. Men, denne undersøgelse rapporterede næsten universelle lokale og andre intraperitoneal tumor tilbagefald, muligvis angiver okkulte iatrogen metastaser ved implantation.

Brugen af musemodeller, hvor der er grov restsygdom efter resektion til test af adjuvansbehandlinger, kan være uhensigtsmæssig. Problemet er, at behandling for brutto resterende sygdom ikke rigtig kan klassificeres som adjuvans behandling, men snarere bør betragtes som behandling med palliativ hensigt. I dette tilfælde giver sådanne musemodeller ingen fordel sammenlignet med ikke-resectional modeller med lavvolumensygdom.

Tips og faldgruber af kritiske skridt
Tumorimplantationsprocedure
For at gentage det kliniske scenarie er der tydelige udfordringer i denne model, som vedrører implantations- og resektionsprocedurerne. For implantationsproceduren er de største udfordringer, der skal overvindes, vellykket implantation og forebyggelse af lækage. Disse to spørgsmål er indbyrdes forbundne som svigt af injektion ville resultere i grov lækage af tumor celle suspension i bughulen. Dette ville producere en mus model med peritoneal metastase, som vil udvikle sig uanset bugspytkirtel resektion. Dette afspejler det velkendte kliniske scenarie hos mennesker, hvor bugspytkirtel resektion i metastatisk pc ikke påvirker patientens resultat. Dette er grundlaget for iscenesættelse laparoskopi hos mennesker29.

Succesen med implantation af tumoren kan ses intraoperatively som den vellykkede generation af en "boble" af celle suspension uden åbenlys lækage. Af største betydning for at opnå et godt resultat er den nøjagtige placering af nålen i bugspytkirtlen parenchyma. Dette kunne kun opnås ved at "strække ud" bugspytkirtlen, så peritoneal overflade er stram. Punktering skal forekomme med nålen skråt opad (ventrally). Når nålen punkterer peritonealoverfladen, skal den fremrykkes, mens nålespidsen løftes lidt op, så den skrå overflade glider lige under bughinden. Dette vil forhindre utilsigtet gennem-og-gennem punktering af bugspytkirtlen, en fælles faldgrube på grund af de små dimensioner af musen bugspytkirtel lobules. Når hele facet er inden for indholdet af bugspytkirtlen, celle suspensionen injiceres. Forstørrelse af synet med kirurgiske lup er meget ønskeligt at visualisere præcist dybden af nålen penetration.

En række teknikker kan bruges til yderligere at minimere risikoen for utilsigtet lækage.
Valg af en stor lobule til injektion. Små lobules kræver højere tryk for at puste (efter Laplaces lov), hvilket øger risikoen for lækage omkring nålen på punkteringsstedet.
Optimering af injektionshastigheden. Brugen af en injektionsanordning (Figur 1b), som gør det muligt at injicere celleaffjedringen over 10-15 sekunder, tjener tre formål. For det første reducerer det hastigheden af trykændring i bugspytkirtlen, hvilket giver vævene tid til at deformere og reducerer risikoen for tilbagesvaling af suspensionen. For det andet gør det det muligt at overvåge injektionsprocessen og om nødvendigt stoppe og nålen flyttet. Enhver lækage kan tørres op af en povidone-jod-gennemblødt gaze. For det tredje frigør det operatøren fra at skulle trykke stemplet, så operatøren kan fokusere på at holde nålespidsen i bugspytkirtlen, mens assistenten injicerer celleaffjedringen.
Brug af en dobbelt-lag pung-streng gaze. Denne gaze danner en krave omkring bugspytkirtlen hale, som vil absorbere enhver lækage af celle suspension og derfor minimere forurening i bughulen.

Nogle undersøgelser i litteraturen har brugt en ekstracellulær matrixblanding (Matrigel), som størkner med tiden efterinjektion 13,15,24. Dette kan reducere risikoen for lækage efter injektion. En potentiel ulempe ved denne strategi er imidlertid, at Matrigel eller andre lignende ekstracellulære matrixopløsninger kan have ikke-fysiologiske virkninger påPSC'er 30. For eksempel har Matrigel vist sig at gøre PSC'er hvilende dermed potentielt negere virkningerne af PSC'er i model31,32. Et alternativ til injektion af kræftceller er ortopisk implantation af tumorvæv (enten direkte fra patienter eller fra subkutane musemodeller). Disse tilgange har imidlertid deres egne ulemper. For det første kan heterogenitet opstå som følge af stikprøvefejl eller variationer i mængden af indopereret væv. En sådan heterogenitet kan reducere styrken af efterfølgende behandlingssammenligninger. For det andet, passaging af tumorvæv med en subkutan mus model kan føre til udvælgelse af sub-kloner, som har forskellige biologiske adfærd til den oprindelige patient tumor.

Tumor resektion procedure
I denne model, har vi udnyttet en distal pancreatectomy / splenectomy procedure beslægtet med den, der udføres hos mennesker. Udfordringerne i forbindelse med resectional kirurgi afhænger af patologiske og anatomiske faktorer.

Den vigtigste patologiske faktor er tumorformidling. Lav volumen lokal spredning kan resected på tidspunktet for pancreas resektion, selv om det kan indikere muligheden for mere fjern peritoneal og andre metastaser. Vi rutinemæssigt punktafgifter sutur linje fra den første operation, da det er et muligt område af lokal gentagelse. Hvis tumoren er fastgjort til de omkringliggende strukturer, såsom bugvæggen eller leverens venstre lap, kan disse resected en bloc. Anatomisk, det vigtigste skridt er dissekere flyet dorsal til kroppen af bugspytkirtlen. Milten vene kan ofte visualiseres bag bugspytkirtlen, når bugspytkirtlen er eksteriør. Dette er et vigtigt vartegn, da det embryologiske blodløse fly straks er dorsalt til dette.

Der er to andre potentielle anatomiske faldgruber i den model, der er beskrevet her. Tyktarmen kan være klæbende til kaudale aspekt af bugspytkirtlen kroppen. Undladelse af at mobilisere denne struktur væk kan føre til utilsigtet colon skade på tidspunktet for pancreas division eller ligation. Gastrosplenbeholderne er små og kan let bløde, hvis de avulseres eller ikke ætses tilstrækkeligt. Desuden, når avulsed, blødningspunktet ofte trækker dybt ind i maven bag større kurve i maven, hvilket gør efterfølgende kontrol af blødning mere udfordrende. Derfor kræves omhyggelig tilbagetrækning af milten og cautery af gastrosplenic fartøjerne. En tilgang til vellykket hemostasis er at ætse disse fartøjer på hilar aspekt af milten, som minimerer risikoen for utilsigtet termisk skade på omkringliggende hule indvolde.

Vi har konstateret, at ved hjælp af en titanium ligation klip, der i vid udstrækning anvendes i menneskelig kirurgi til ligation af fartøjer, er en hurtig og effektiv måde at kontrollere bugspytkirtel stub, med deraf følgende reduktion i den samlede operative tid i forhold til brugen af ligaturer. Dette blev også brugt af Giri et al.28.

Begrænsninger af teknikken
Der er begrænsninger for denne resectional model af bugspytkirtlen. En begrænsning vedrører den tid, der er afsat til at producere gentagelse/metastaser. På den ene side skal man maksimere udviklingen af metastatisk sygdom, men på den anden side skal man resect tumoren, før den blev lokalt avanceret. Perioden mellem implantation og resektion kan derfor være nødvendigt at justere for det særlige kliniske scenarie, man ønsker at gentage. En anden begrænsning vedrører utilsigtet spild og efterfølgende peritoneal metastaser af kræftceller, som diskuteres ovenfor.

En stor udfordring ved adjuvans behandlingsmodeller er dissekere adjuvans behandling virkning fra den kirurgiske behandling virkning. Det er klart, en veldesignet undersøgelse, som er randomiseret, med en kontrolgruppe gennemgår resektion kirurgi er påkrævet. For yderligere at forbedre vurderingen af de relative behandlingseffekter foreslår vi at vurdere tumorbyrden in vivo (for eksempel ved at bruge luciferase-mærkede kræftceller og udføre in vivo bioluminescensbilleddannelse). På trods af den semi-kvantitative karakter af denne vurdering i ortopiske modeller (som bioluminescens signalet er svækket ved passage gennem de overliggende væv), denne fremgangsmåde giver mulighed for langsgående vurdering af tumor byrde, herunder vurdering af post-kirurgiske resterende sygdom.

Ændringer og fremtidige applikationer
De implanterede cellelinje- og/eller cellenumre med eller uden stjerneceller i bugspytkirtlen kan ændres, så de afspejler det kliniske målscenario12. Varigheden mellem implantation og resektion kan også ændres for at ændre risikoen for metastasedannelse. Andre variationer kan omfatte implantation af patient- eller mus-afledte xenografter eller organoider33.

Neoadjuvans terapi kan også testes inden for de grundlæggende træk ved den model, der er beskrevet her. Det ville simpelthen kræve påbegyndelse af narkotikabehandling forud for kirurgisk resektion34. På samme måde kunne både neoadjuvans og adjuvansbehandling studeres hos de samme mus.

Endelig, mens vi har beskrevet brugen af athymiske Balb / c nøgen mus, som repræsenterer en immundefekt model, en alternativ immunocompetent model kan involvere KPC tumorceller implanteret i C57B6 mus28. Dette kan være et nyttigt alternativ til testning af adjuvans-/neoadjuvans immunterapier.

Sammenfattende beskriver vi en robust og reproducerbar teknik til en kirurgisk resektionsmodel af kræft i bugspytkirtlen hos mus, der efterligner det kliniske scenarie og ikke kræver specialiseret udstyr. Denne model kan være nyttig til testning af både adjuvans- og neoadjuvansbehandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre med hensyn til dette projekt.

Acknowledgments

Forfattere har modtaget støtte fra Avner Kræft i bugspytkirtlen Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animals, Materials and Equipment for Implantation Procedure
AsPC-1 human pancreatic cancer cell line, luciferase tagged (luc+ gene from Promega PGL3 Basic plasmid) American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA supplied by Professor Takashi Murakami, Saitama Medical University, Saitama, Japan
Autoclip wound clips, 9 mm Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW, Australia 500346
Basic Dressing Pack Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia
Cancer associated human pancreatic stellate cells Pancreatic Research Group cell bank In house cell bank
Cryogenic tubes, 1.0 mL Thermo Fisher Scientific Australia Pty Ltd, Scoresby, VIC, Australia 366656
Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 Livingstone International, Mascot, NSW, SCP15
Foetal bovine serum (FBS) Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia 16000044
Gilles fine tooth forceps 12 cm Generic stainless steel microsurgical instrument set
Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery Generic
Homozygous athymic nude mice: Strain BALB/c-Fox1nu/Ausb, female Australian Bioresources, Moss Vale, NSW, Australia
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) with 4mM L-glutamine and no phenol red Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia 21056023
Jewellers forceps 11.5 cm Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro needle holder (round handle) 15 cm straight Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro scissors (round handle) 15 cm straight Generic stainless steel microsurgical instrument set
Penicillin 10,000 U/mL, streptomycin 10,000 μg/mL Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia 15140122
Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia C1049407
Portable weighing scale Precision balances, Bradford, MA, USA
Reflex clip applier and clip remover World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA 500345
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 with phenol red and 300 mg/L Lglutamine Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia 11875085
Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip Generic stainless steel microsurgical instrument set
Trypsin 0.05%, EDTA 0.02% Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia 25300054 For pancreatic stellate cells
Trypsin 0.25%, EDTA 0.02% Life Technologies Corporation, Tullamarine, VIC, Australia 25200056 For ASPC-1 cells
U-100 insulin syringes, 0.5 mL with 29 G (0.33 mm) × 13 mm needle Terumo Medical Corporation, Elkton, MD, USA
Equipment for Resection Procedure
Alm self-retaining retractor Generic stainless steel microsurgical instrument set
Autoclip wound clips 9 mm Becton Dickson Pty Ltd, North Ryde, NSW 500346
Basic Dressing Pack Multigate Medical Products Pty Ltd, Villawood, NSW, Australia 08-559NP
Disposable stainless-steel scalpel blade with handle, size 15 Livingstone International, Mascot, NSW, SCP15
Gilles fine tooth forceps 12 cm Generic stainless steel microsurgical instrument set
Hand-held high temperature fine tip cautery Bovie Medical Corporation, Melville, NY, USA AA01
Heated mats to maintain body temperature during surgery and postoperative recovery Generic
IVIS Lumina II Bioluminescent Imaging Device Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA
Jewellers forceps 11.5 cm Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro needle holder (round handle) 15 cm straight Generic stainless steel microsurgical instrument set
Micro scissors (round handle) 15 cm straight Generic stainless steel microsurgical instrument set
Polyglycolic acid suture, size USP 5/0 on 13mm half-circle round-bodied needle Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia C1049407
Portable weighing scale Precision balances, Bradford, MA, USA
Reflex wound clip applier and clip remover World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA 500345
Round bodied vessel dilator 15 cm, 0.1 mm tip Generic stainless steel microsurgical instrument set
Titanium “Weck style” Ligaclip, small HZMIM, Hangzhou, China
Titanium Ligaclip applier for open surgery, small HZMIM, Hangzhou, China
Volatile anaesthetic machine, including vapouriser and induction chamber Generic Generic vapouriser and induction chamber
Drugs for Procedures
70% w/w ethanol solution Sigma-Aldrich Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia Applied topically as surgical skin preparation
Buprenorphine 0.3 mg/mL Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia Dose: 0.05 mg/kg s.c.
D-Luciferin (1 U/g) PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA 122799 diluted in PBS to 15 mg/mL. Dose: 150 mg/kg i.p
Enrofloxacin 50 mg/mL Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia Dose: 5 mg/kg s.c.
Flunixin 50 mg/mL Norbrook Laboratories Australia, Tullamarine, VIC, Australia Dose: 2.5 mg/kg s.c.
Isoflurane Zoetis Australia Pty Ltd., Rhodes, NSW, Australia Dose (vapourised with oxygen): 4% induction, 3% maintenance
Ketamine 100 mg/mL Maylab, Slacks Creek, QLD, Australia Dose: 80 mg/kg i.p.
Povidone-Iodine 10% w/v solution Perrigo Australia, Balcatta, WA, Australia RIO00802F Applied topically to the anterior abdomen as surgical skin preparation
Refresh eye ointment (liquid paraffin 42.5% w/w, soft white paraffin 57.3% w/w) Allergan Australia Pty Ltd, Gordon, NSW, Australia Applied to both eyes
Sodium chloride 0.9% w/v Braun Australia Pty Ltd, Bella Vista, NSW, Australia 9481P Dose: 900 μL s.c.
Water for injections BP Pfizer Australia, Sydney, NSW, Australia For dilution of drugs
Xylazine 20 mg/mL Troy Laboratories Pty Ltd, Glendenning, NSW, Australia Dose: 10 mg/kg i.p.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Noone, A. M., et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2015, National Cancer Institute. , Available from: https://seer.cancer.gov/csr/1975_2015/ (2018).
  2. Sugiura, T., et al. Margin status, recurrence pattern, and prognosis after resection of pancreatic cancer. Surgery. 154 (5), 1078-1086 (2013).
  3. Hishinuma, S., et al. Patterns of recurrence after curative resection of pancreatic cancer, based on autopsy findings. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (4), 511-518 (2006).
  4. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology - Pancreatic Adenocarcinoma (Version 3.2019). National Comprehensive Cancer Network. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/pancreatic.pdf (2019).
  5. Breslin, T. M., et al. Neoadjuvant chemoradiotherapy for adenocarcinoma of the pancreas: treatment variables and survival duration. Annals of Surgical Oncology. 8 (2), 123-132 (2001).
  6. Mokdad, A. A., et al. Neoadjuvant Therapy Followed by Resection Versus Upfront Resection for Resectable Pancreatic Cancer: A Propensity Score Matched Analysis. Journal of Clinical Oncology. 35 (5), 515-522 (2017).
  7. Tachezy, M., et al. Sequential neoadjuvant chemoradiotherapy (CRT) followed by curative surgery vs. primary surgery alone for resectable, non-metastasized pancreatic adenocarcinoma: NEOPA- a randomized multicenter phase III study (NCT01900327, DRKS00003893, ISRCTN82191749). BMC Cancer. 14, 411 (2014).
  8. Barbour, A. P., et al. The AGITG GAP Study: A Phase II Study of Perioperative Gemcitabine and Nab-Paclitaxel for Resectable Pancreas Cancer. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
  9. Fu, X., Guadagni, F., Hoffman, R. M. A metastatic nude-mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (12), 5645-5649 (1992).
  10. Marincola, F., Taylor-Edwards, C., Drucker, B., Holder, W. D. Orthotopic and heterotopic xenotransplantation of human pancreatic cancer in nude mice. Current Surgery. 44 (4), 294-297 (1987).
  11. Vonlaufen, A., et al. Pancreatic stellate cells: partners in crime with pancreatic cancer cells. Cancer Research. 68 (7), 2085-2093 (2008).
  12. Xu, Z., et al. Role of pancreatic stellate cells in pancreatic cancer metastasis. American Journal of Pathology. 177 (5), 2585-2596 (2010).
  13. Tepel, J., et al. Adjuvant treatment of pancreatic carcinoma in a clinically adapted mouse resection model. Pancreatology. 6 (3), 240-247 (2006).
  14. Torgenson, M. J., et al. Natural history of pancreatic cancer recurrence following "curative" resection in athymic mice. Journal Surgical Research. 149 (1), 57-61 (2008).
  15. Metildi, C. A., et al. Fluorescence-guided surgery allows for more complete resection of pancreatic cancer, resulting in longer disease-free survival compared with standard surgery in orthotopic mouse models. Journal of the American College of Surgeons. 215 (1), 126-135 (2012).
  16. Ni, X., Yang, J., Li, M. Imaging-guided curative surgical resection of pancreatic cancer in a xenograft mouse model. Cancer Letters. 324 (2), 179-185 (2012).
  17. Hiroshima, Y., et al. Hand-held high-resolution fluorescence imaging system for fluorescence-guided surgery of patient and cell-line pancreatic tumors growing orthotopically in nude mice. Journal of Surgical Research. 187 (2), 510-517 (2014).
  18. Hiroshima, Y., et al. Metastatic recurrence in a pancreatic cancer patient derived orthotopic xenograft (PDOX) nude mouse model is inhibited by neoadjuvant chemotherapy in combination with fluorescence-guided surgery with an anti-CA 19-9-conjugated fluorophore. PLoS One. 9 (12), 114310 (2014).
  19. Hiroshima, Y., et al. Fluorescence-guided surgery in combination with UVC irradiation cures metastatic human pancreatic cancer in orthotopic mouse models. PLoS One. 9 (6), 99977 (2014).
  20. Metildi, C. A., et al. Ratiometric activatable cell-penetrating peptides label pancreatic cancer, enabling fluorescence-guided surgery, which reduces metastases and recurrence in orthotopic mouse models. Annals of Surgical Oncology. 22 (6), 2082-2087 (2015).
  21. Metildi, C. A., et al. Fluorescence-guided surgery with a fluorophore-conjugated antibody to carcinoembryonic antigen (CEA), that highlights the tumor, improves surgical resection and increases survival in orthotopic mouse models of human pancreatic cancer. Annals of Surgical Oncology. 21 (4), 1405-1411 (2014).
  22. NCCN Guidelines: Pancreatic Adenocarcinoma. National Comprehensive Cancer Network. , Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/pancreatic.pdf (2019).
  23. Maithel, S. K., Allen, P. J. Blumgart's Surgery of the Liver, Biliary Tract and Pancreas, 2-Volume Set (Sixth Edition). Jarnagin, W. R. , Content Repository Only 1007-1023 (2017).
  24. Egberts, J. H., et al. Dexamethasone reduces tumor recurrence and metastasis after pancreatic tumor resection in SCID mice. Cancer Biology & Therapy. 7 (7), 1044-1050 (2008).
  25. Xu, Z. H., et al. Targeting the HGF/c-MET pathway in advanced pancreatic cancer: a key element of treatment that limits primary tumor growth and eliminates metastasis. British Journal of Cancer. , (2020).
  26. Pothula, S. P., et al. Targeting the HGF/c-MET pathway: stromal remodelling in pancreatic cancer. Oncotarget. 8 (44), 76722-76739 (2017).
  27. Pothula, S. P., et al. Hepatocyte growth factor inhibition: a novel therapeutic approach in pancreatic cancer. British Journal of Cancer. 114 (3), 269-280 (2016).
  28. Giri, B., et al. An Immunocompetent Model of Pancreatic Cancer Resection and Recurrence. Journal of Gastrointestinal Surgery. , (2020).
  29. Allen, V. B., Gurusamy, K. S., Takwoingi, Y., Kalia, A., Davidson, B. R. Diagnostic accuracy of laparoscopy following computed tomography (CT) scanning for assessing the resectability with curative intent in pancreatic and periampullary cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. (11), 009323 (2013).
  30. Vaillant, F., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. Jekyll or Hyde: does Matrigel provide a more or less physiological environment in mammary repopulating assays. Breast Cancer Research. 13 (3), 108 (2011).
  31. Jesnowski, R., et al. Immortalization of pancreatic stellate cells as an in vitro model of pancreatic fibrosis: deactivation is induced by matrigel and N-acetylcysteine. Laboratory Investigation. 85 (10), 1276-1291 (2005).
  32. Phillips, P. A., et al. Cell migration: a novel aspect of pancreatic stellate cell biology. Gut. 52 (5), 677-682 (2003).
  33. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  34. Egberts, J. H., et al. Superiority of extended neoadjuvant chemotherapy with gemcitabine in pancreatic cancer: a comparative analysis in a clinically adapted orthotopic xenotransplantation model in SCID beige mice. Cancer Biology & Therapy. 6 (8), 1227-1232 (2007).

Tags

Kræftforskning Problem 163 Bugspytkirtelkanalen adenocarcinoma (PDAC) Adjuvans terapi Neoadjuvansbehandling Pancreatectomy Orthotopic mus model Pancreas stellate celler
En orthotopic Resectional Mouse Model af kræft i bugspytkirtlen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pang, T. C. Y., Xu, Z., Mekapogu, A. … More

Pang, T. C. Y., Xu, Z., Mekapogu, A. R., Pothula, S., Becker, T. M., Goldstein, D., Pirola, R. C., Wilson, J. S., Apte, M. V. An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer. J. Vis. Exp. (163), e61726, doi:10.3791/61726 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter