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Chemistry

परमाणु बल माइक्रोस्कोपी एक जीवाणु रसायन विज्ञान की जांच करने के लिए एक उपकरण के रूप में अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ संयुक्त

Published: September 15, 2020 doi: 10.3791/61728
Automatic Translation
1, 2,3, 1,2, 1
1Centre for Biospectroscopy and School of Chemistry, Monash University, 2Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute and Department of Microbiology, Monash University, 3Department of Infectious Diseases, The Alfred Hospital and Central Clinical School, Monash University

Summary

परमाणु बल माइक्रोस्कोपी-इन्फ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी (एएफएम-आईआर) बैक्टीरियल अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मंच प्रदान करता है, जिससे नैनोस्केल संकल्प प्राप्त किया जा सके। दोनों, उपकोशिकीय परिवर्तनों का मानचित्रण (उदाहरण के लिए, सेल डिवीजन पर) के साथ-साथ रासायनिक संरचना (उदाहरण के लिए, दवा प्रतिरोध से उत्पन्न होने वाले) के तुलनात्मक अध्ययन बैक्टीरिया में एकल कोशिका स्तर पर आयोजित किए जा सकते हैं।

Abstract

परमाणु बल माइक्रोस्कोपी-इन्फ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी (एएफएम-आईआर) एक उपन्यास संयोजन तकनीक है, जो भौतिक गुणों के एक साथ लक्षण वर्णन और नैनोस्केल संकल्प के साथ नमूने की रासायनिक संरचना को सक्षम करती है। आईआर के साथ एएफएम के संयोजन से, पारंपरिक आईआर की स्थानिक संकल्प सीमा को दूर किया जाता है, जिससे 20-100 एनएम का संकल्प प्राप्त किया जा सके। यह कई माइक्रोमीटर से छोटे नमूनों की जांच की ओर आईआर के नए अनुप्रयोगों की एक व्यापक सरणी के लिए दरवाजा खोलता है, पहले पारंपरिक आईआर माइक्रोस्कोपी के माध्यम से अप्राप्य । एएफएम-आईआर बैक्टीरियल अनुसंधान के लिए अत्यधिक अनुकूल है, जो एकल कोशिका और इंट्रासेलुलर स्तर पर स्पेक्ट्रल और स्थानिक दोनों जानकारी प्रदान करता है। बढ़ती वैश्विक स्वास्थ्य चिंताओं और जीवाणु संक्रमण के बारे में प्रतिकूल भविष्य की भविष्यवाणी, और विशेष रूप से, रोगाणुरोधी प्रतिरोध के तेजी से विकास, एक अनुसंधान एकल कोशिका और उपकोशिक स्तर पर जांच फेनोटाइपिक में सक्षम उपकरण के लिए एक तत्काल जरूरत पैदा की है । एएफएम-आईआर एक जीवाणु की रासायनिक संरचना के विस्तार लक्षण वर्णन को सक्षम करके, इस आवश्यकता को संबोधित करने की क्षमता प्रदान करता है। यहां, हम बैक्टीरियल अध्ययन की ओर एएफएम-आईआर के अनुप्रयोग के लिए नमूना तैयार करने और एकल स्पेक्ट्रा और मैपिंग मोडलि मोडलि के डेटा अधिग्रहण के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Introduction

बैक्टीरिया एकल कोशिका प्रोकैरियोटिक जीव होते हैं, जो विभिन्न आकारों और आकारों में होते हैं, आमतौर पर कई सौ नैनोमीटर से माइक्रोमीटर की सीमा में होते हैं। वे विभिन्न आवासों में मौजूद हैं और जीवन के अस्तित्व के लिए आवश्यक हैं। मानव शरीर के भीतर, पेट में मौजूद अधिकांश बैक्टीरिया हानिरहित होते हैं और कई वास्तव में फायदेमंद होते हैं1। हालांकि, कई जीवाणु प्रजातियां रोगजनक हैं और संक्रामक रोगों की एक श्रृंखला का कारण बनती हैं। बैक्टीरियल संक्रमण सेप्सिस और सेप्टिक शॉक के विकास का कारण बन सकता है: एक जीवन-धमकी वाली स्थिति, जिसके परिणामस्वरूप शरीर की प्रतिक्रिया संक्रमण2के लिए होती है। सेप्सिस एक वैश्विक प्रमुख स्वास्थ्य खतरा है, जिसमें दुनिया भर में उच्च व्यापकता और गंभीर मृत्यु दर है । अकेले 2017 में, दुनिया भर में सेप्सिस के अनुमानित 50 मिलियन मामले दर्ज किए गए थे, जिनमें से 11 मिलियन जिनके परिणामस्वरूप मृत्यु (लगभग 20%)2। इसके अलावा, रोगी के जीवित रहने की संभावना में कमी, देरी से चिकित्सा के कारण, प्रति घंटा तरीके से3,4में होने के लिए दिखाया गया था ।

बैक्टीरियल इन्फेक्शन का इलाज एंटीबायोटिक्स से किया जाता है। जीवाणु रक्तप्रवाह संक्रमण (BSIs) के संभावित परिणामों की गंभीरता, एक साथ रोगाणुरोधी चिकित्सा की त्वरित दीक्षा के स्पष्ट महत्व के साथ, तत्काल एंटीबायोटिक दवाओं प्रशासन की आवश्यकता का संकेत । हालांकि, नैदानिक अभ्यास (जैसे, रक्त संस्कृति) में उपयोग किए जाने वाले वर्तमान नैदानिक दृष्टिकोणों के लिए अपेक्षाकृत लंबे समय की आवश्यकता होती है, एंटीबायोटिक्स प्रशासन अक्सर सकारात्मक बीएसआई निदान5से पहले होता है। इस कारक से एंटीबायोटिक दवाओं का व्यापक उपयोग होता है, जो कृषि जैसे अन्य क्षेत्रों में अत्यधिक एंटीबायोटिक उपयोग के साथ-साथ एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध (एएमआर)6,7के विकास के प्रति गंभीर विकासवादी दबाव पैदा करता है। एएमआर वर्तमान में सबसे अहम वैश्विक स्वास्थ्य मुद्दों में से एक है7,8 और, 2050 तक, मृत्यु9का प्रमुख कारण बनने की भविष्यवाणी की गई है। प्रतिरोध का विकास, एएमआर उपभेदों के प्रसार के साथ एक खतरनाक गति से हो रहा है7,8,9 और अधिक, अब तक, नए एंटीबायोटिक दवाओं की खोज की दर10। नई प्रतिरोधी फेनोटाइप लगातार दुनिया भर में उभर रहे हैं, जबकि
एएमआर से संबंधित परिवर्तनों को समझने की दिशा में समर्पित अनुसंधान अक्सर धीमी गति से और उपलब्ध दृष्टिकोण11द्वारा सीमित है . इसके अलावा, आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले तरीके, जैसे पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) और पूरे जीन सीक्वेंसिंग (डब्ल्यूजीएस), केवल जीनोटाइपिक बदलावों पर ध्यान केंद्रित करते हैं। ये प्रतिरोध11के तंत्र को प्रकट करने के लिए पर्याप्त नहीं हैं, एक अनुसंधान उपकरण के लिए एक तत्काल आवश्यकता का संकेत बैक्टीरिया की रासायनिक संरचना को समझने के लिए सक्षम करने के लिए ।

इन्फ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईआर) नमूने का आणविक लक्षण वर्णन प्रदान करता है और इस प्रकार फेनोटाइपिक बैक्टीरियल जांच के लिए एक आशाजनक उम्मीदवार है। 12 शुरुआती अनुप्रयोगों के बाद सेइसकेउपयोग के बहुत से उदाहरण13,14साहित्य में प्रदर्शित किए गए थे । इनमें जीनस15, प्रजाति 16और स्ट्रेन 17,18 स्तर पर बैक्टीरिया की फेनोटाइपिक आधारित पहचान शामिल है। हालांकि, पारंपरिक आईआर का स्थानिक संकल्प तरंगदैर्ध्य विवर्तन स्थानिक संकल्प सीमा19के कारण कई माइक्रोन तक सीमित है। चूंकि अधिकांश बैक्टीरिया का आकार उस सीमा से नीचे है (उदाहरण के लिए, स्टेफिलोकोकस ऑरियस ≈ 400 एनएम व्यास में), पारंपरिक आईआर एकल-कोशिका या इंट्रासेलुलर स्तर पर जांच के लिए लागू नहीं होता है।

स्थानिक संकल्प सीमा हाल ही में परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM-IR) के साथ आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के संयोजन से दूर किया गया था । इस उदाहरण में, 19,20, 21, 22सामग्री के थर्मल विस्तार के माध्यम से परोक्ष रूप से आईआर अवशोषण का पतालगाया जाताहै। संक्षेप में, आईआर विकिरण के अवशोषण के परिणामस्वरूप स्थानीय तापमान में वृद्धि होती है। इसे सीधे23 या एएफएम कैंटिलीवर जांच के दोलन के माप के माध्यम से मापा जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप आईआर अवशोषण20,21द्वारा बनाए गए बल आवेग के परिणामस्वरूप। संयोजन AFM-IR तकनीक 20 एनएम आ स्थानिक संकल्प प्राप्त करने के लिए सक्षम बनाता है, एक नमूना (AFM) और उसके रासायनिक संरचना (AFM-IR) के स्थानीय भौतिक गुणों के बारे में एक साथ जानकारी प्रदान करते हैं । दोनों का संग्रह, चयनित स्थानों से एकल स्पेक्ट्रा और एक चुने हुए क्षेत्र के भीतर चयनित तरंग मूल्यों की तीव्रता का मानचित्रण संभव है।

एएफएम-आईआर के प्राप्त स्थानिक संकल्प को ध्यान में रखते हुए, यह स्पष्ट है कि यह तकनीक एकल जीवाणु कोशिका और उनके इंट्रासेलुलर संरचना24की रासायनिक/फेनोटाइपिक जांच की संभावना को खोलती है । अब तक, एकल बैक्टीरियाके लिए एएफएम-आईआर के आवेदन के कई उदाहरण साहित्य19, 20, 21,22, 25,26,27,28में प्रदर्शित किए गए थे। इनमें एकल स्पेक्ट्रल विश्लेषण19,21,22 और उपकोशिकीय स्तर19, 22,25, 26,27,28पर मानचित्रण शामिल है । उदाहरण के लिए, इंट्रासेलुलर लिपिड वेसिकल्स27 और वायरस28 को एकल जीवाणु के भीतर पता लगाने की क्षमता का वर्णन किया गया है । ये परिणाम एकल बैक्टीरिया और चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक रोगजनकों19के नैनोस्केल अध्ययन के लिए एएफएम-आईआर की उपयोगिता प्रदर्शित करते हैं।

इसलिए, हम मल्टीलेयर, मोनोलेयर और सिंगल सेल बैक्टीरियल नमूनों के एएफएम-आईआर डेटा के लिए एक नमूना तैयारी और संग्रह विधि प्रस्तुत करते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल बैक्टीरिया22 की विभिन्न प्रजातियों और उनकी रासायनिक संरचना में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया था । विशेष रूप से, वैकोमाइसिन प्रतिरोध और डैप्टोमाइसिन गैर-संवेदनशीलता के वीवो विकास में एस ऑरियस19के नैदानिक जोड़े में जांच की गई थी। दोनों, वैनोमाइसिन आंतरायिक प्रतिरोध और डैप्टोमाइसिन गैर-संवेदनशीलता एस ऑरियस (वीज़ा और डीपीआर) में अपेक्षाकृत हाल ही में उभरा, बढ़ते उपयोग और क्लीनिकों के लिए इन एंटीबायोटिक दवाओं की शुरूआत के बाद, एक महत्वपूर्ण चिकित्सा समस्या का गठन। इसके अलावा, विशेष रूप से, डैप्टोमाइसिन गैर-संवेदनशीलता का तंत्र अभी भी मायावी बना हुआ है, जो वैकल्पिक दवा विकास19,29को बाधित करता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल एकल बैक्टीरिया के विश्वसनीय AFM-IR स्पेक्ट्रा के प्रावधान पर केंद्रित है, जो आगे केममेट्रिक दृष्टिकोण की एक किस्म का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है, प्रयोगात्मक उद्देश्यों के अनुसार । इसके अतिरिक्त इसमें मैपिंग दृष्टिकोण शामिल है, जो इंट्रा-सेलुलर अध्ययनों के लिए लागू होता है।

Protocol

रोगजनक बैक्टीरिया के साथ किए गए सभी कार्य उचित सुरक्षा उपायों के साथ किए जाने चाहिए । इनमें पर्याप्त जैव सुरक्षा स्तर के साथ एक प्रयोगशाला में काम करना और जैव सुरक्षा केबिन (पीसी 2) में साथ ही उचित कीटाणुनाशक के साथ कार्य क्षेत्र का सावधानीपूर्वक विसंदूषण करना शामिल है, उदाहरण के लिए, 80% इथेनॉल समाधान। उपयुक्त पीपीई हर समय पहना जाना चाहिए।

1. सॉल्वैंट्स और सामग्रियों की तैयारी

  1. सॉल्वेंट: अल्ट्रापुरे पानी को सॉल्वेंट के रूप में इस्तेमाल करें। किसी भी संभावित क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए प्रयोग से पहले शुद्ध पानी का उपयोग करें, ऑटोक्लेव किया जाए।
  2. सब्सट्रेट: एएफएम-आईआर, जैसे, जेडएनएसई, सीएएफ2,बीएएफ 2 आदि के लिएइनमेंसे किसी भी सब्सट्रेट्स का उपयोग करें। चूंकि एएफएम-आईआर सैद्धांतिक रूप से एक गैर-विनाशकारी तकनीक है, इसलिए एएफएम-आईआर विश्लेषण के बाद एक ही नमूना के लिए विभिन्न प्रकार के अन्य अनुसंधान उपकरण लागू हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ परिणामों का सहसंबंध किया जा सकता है यदि रमन ग्रेड CaF2 या BaF 2 स्लाइड का उपयोग कियाजाता है।
  3. प्लास्टिक ट्यूब के बजाय कांच की शीशियों का उपयोग करें क्योंकि प्लास्टिक नमूने को दूषित कर सकता है।

2. एएफएम-आईआर के लिए नमूना तैयारी

  1. नमूने की वृद्धि/इनक्यूबेशन
    1. तरल मीडिया में या ठोस प्लेटों पर बैक्टीरिया बढ़ना। जांच के तहत बैक्टीरिया की प्रजातियों की विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुसार मध्यम, विकास की स्थिति (जैसे, तापमान, ऑक्सीजन की उपलब्धता) और विकास समय के प्रकार का चयन करें। उदाहरण के लिए, एस ऑरियस हार्ट इन्फ्यूजन (एचआई) आगर प्लेटों का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें एरोबिक स्थितियों में 37 डिग्री सेल्सियस में 16 घंटे के लिए वृद्धि होती है।
      नोट: सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए, विकास/इनक्यूबेशन पर्याप्त बैक्टीरिया है कि नमूने के एक माइक्रो गोली के संग्रह की अनुमति होगी उपज चाहिए । कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों या बैक्टीरियल कोशिकाओं की विशिष्ट संख्या जीवाणु के प्रकार और आकार पर निर्भर करती है।
  2. नमूना जमा
    1. बाँझ लूप का उपयोग करके, सावधानी से आगर प्लेट पर उपनिवेशों से बैक्टीरिया एकत्र करें और उन्हें एक ग्लास ट्यूब में स्थानांतरित करें। केवल कालोनियों के ऊपर से बैक्टीरिया ले लीजिए। यदि तरल संस्कृति से नमूने एकत्र करते हैं, तो एक पिपेट का उपयोग करके, बैक्टीरियल सस्पेंशन के लगभग 1 एमएल को ग्लास ट्यूब में स्थानांतरित करें। बैक्टीरियल लोड के आधार पर वॉल्यूम को संशोधित किया जा सकता है।
      नोट: कॉलोनी के नीचे से किसी भी माध्यम को इकट्ठा (या जितना संभव हो उतना कम करने) का प्रयास नहीं करना महत्वपूर्ण है। नमूना तैयारी के बाद के चरणों का उद्देश्य मीडिया के किसी भी संभावित अवशिष्ट को दूर करना है। शुरुआत से संभावित मध्यम अवशिष्ट का न्यूनतमीकरण शुद्ध जीवाणु कोशिकाओं से डेटा के स्पेक्ट्रल अधिग्रहण को सक्षम बनाता है। कदम 2.2.2 और 2.2.3 आगर प्लेटों से तैयार नमूनों पर लागू होते हैं। तरल मीडिया से तैयार नमूनों के लिए, 2.2.4 कदम पर जाएं।
    2. ट्यूब में अल्ट्रापुरे पानी का 1 एमएल डालें। भंवर जब तक एकत्र बैक्टीरियल गोली अब ट्यूब के तल पर दिखाई नहीं दे रहे है (आम तौर पर 1-2 मिनट) ।
    3. तैयार समाधान और मैकफार्लैंड मानकों के बीच दृश्य तुलना30 द्वारा मैकफार्लैंड मानकों का उपयोग करके समाधान की किसी न किसी टर्बिडिटी का अनुमान लगाएं। यदि बैक्टीरियल सस्पेंशन की टर्बिडिटी बहुत कम प्रतीत होती है, तो फिर से बाँझ लूप और भंवर का उपयोग करके प्लेट से अधिक बैक्टीरिया जोड़ें। जब तक समाधान की किसी न किसी टर्बिडिटी मैकफार्लैंड मानकों 0.5 और 1 के बराबर है तब तक दोहराएं। इससे आम तौर पर बैक्टीरियल पेलेट की अच्छी मात्रा निकलेगी।
    4. एक गोली प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए 3, 000 x g पर बैक्टीरियल निलंबन अपकेंद्रित्र।
      नोट: जीवाणु गोली प्राप्त करने के लिए अपकेंद्रित्र मापदंडों को संशोधित किया जा सकता है। यदि जी-बल में वृद्धि की जाती है, तो सावधानी बरती जानी चाहिए, बैक्टीरिया के टूटने को प्रेरित न करने के लिए (विशेष रूप से ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के मामले में)।
    5. एक पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे गोली के ऊपर से सुपरनैट्ट को हटा दें। गोली को फिर से निलंबित करने के लिए ट्यूब और भंवर में अल्ट्रापुरे पानी का 1 एमएल जोड़ें। बाद में, नमूना अपकेंद्रित्र के रूप में चरण 2.2.4 में किया गया था।
    6. कम से कम तीन बार धोने की प्रक्रिया (चरण 2.2.2 और 2.2.4) दोहराएं। तरल मीडिया से प्रारंभिक नमूने के संग्रह के मामले में, प्रक्रिया को कम से कम चार बार दोहराएं (मीडिया हटाने के बाद तीन वॉश)।
    7. अंतिम धोने के बाद, सुपरनेट निकालें, कम से कम 2 मिनट के लिए अल्ट्रापुरे पानी और भंवर जोड़ें। इसके बाद, सब्सट्रेट (जैसे, रमन ग्रेड सीएएफ2)पर नमूने के 5 माइक्रोन जमा करें।
    8. यदि नमूने की वांछित मोटाई बैक्टीरिया का एक बहुस्तरीय है, तो नमूना को हवा-शुष्क छोड़ दें।
    9. यदि वांछित मोटाई मोनोलेयर या व्यक्तिगत बैक्टीरिया है, तो नमूना जमा करने के तुरंत बाद (चरण 2.2.7) अल्ट्रापुरे पानी के 20-100 माइक्रोन के बीच जोड़ें और धीरे-धीरे एक पिपेट टिप के साथ मिलाएं। हवा-सूखी तक छोड़ दें।
      नोट: पानी की सटीक मात्रा प्रयोगों के बीच भिन्न हो सकती है क्योंकि यह कई कारकों (उदाहरण के लिए, जीव का आकार, गोली का घनत्व, आदि) पर निर्भर है और इसलिए, अनुभवजन्य रूप से सबसे अच्छा निर्धारित किया जाता है। अल्ट्रापुरे जल की अलग-अलग मात्रा वाले नमूनों की एक श्रृंखला तैयार करने से किसी को बैक्टीरिया की वांछित मोटाई/घनत्व के साथ नमूने का चयन करने में सक्षम बनाता है । बैक्टीरिया की मोटाई/घनत्व को बाद के चरणों में एएफएम के माध्यम से आसानी से कल्पना की जा सकती है । मोनोलेयर और सिंगल सेल नमूनों से एएफएम छवियों के उदाहरण चित्र 1ए-एचमें दिखाए गए हैं।
    10. डबल-तरफा चिपकने वाले टेप का उपयोग करके एएफएम धातु नमूना डिस्क पर सब्सट्रेट माउंट करें।

3. साधन की तैयारी

नोट: यहां वर्णित वाद्य प्रक्रियाएं सामग्रीतालिका में सूचीबद्ध साधन के लिए हैं । विस्तार वाद्य प्रक्रिया एएफएम-आईआर उपकरण के एक नए मॉडल का उपयोग करते हुए यहां वर्णित एक से थोड़ा भिन्न हो सकती है।

  1. स्टार्टेयराइज बटन दबाकर इंस्ट्रूमेंट को स्विच ऑन करें और स्टार्ट करने की शुरुआत करें। सुनिश्चित करें कि लेजर शटर लेजर परीक्षण के लिए खुली स्थिति में है।
  2. यदि एक शुद्ध प्रणाली स्थापित की जाती है, तो एन2 के प्रवाह को चालू करके एन2के साथ उपकरण को शुद्ध करें। एक स्थिर आर्द्रता स्तर (उदाहरण के लिए, 20%) को प्राप्त करने के लिए नाइट्रोजन शुद्ध समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि आर्द्रता माप के दौरान और पृष्ठभूमि और नमूना डेटा संग्रह के बीच में उतार-चढ़ाव नहीं करती है। आर्द्रता के स्तर को स्थिर करने के लिए लगभग 20 मिनट की अनुमति देने की सिफारिश की जाती है।
  3. लोड बटन दबाकर सैंपल को सैंपल चैंबर में लोड करें। नमूना लोड सॉफ्टवेयर जादूगर के माध्यम से आयोजित किया जाता है। सॉफ्टवेयर जादूगर का संचालन करते समय, पहले टिप पर ध्यान केंद्रित करें, तीर का उपयोग करके जेड-दिशा में माइक्रोस्कोप चरण को स्थानांतरित करने और अगलेपर क्लिक करें। दूसरे, डेटा संग्रह स्थान को समायोजित करें, इन-प्लेन आंदोलन का मार्गदर्शन करने वाले तीरों का उपयोग करके और एएफएम सिर के शीर्ष पर घुंडी का उपयोग करके एएफएम लेजर और एएफएम डिटेक्टर को संरेखित करें। इसके बाद, जेड-दिशा में माइक्रोस्कोप चरण को स्थानांतरित करके नमूना सतह पर ध्यान केंद्रित करें।
    नोट: सॉफ्टवेयर मैनुअल31में नमूना लोडिंग के प्रत्येक चरण के विस्तृत चित्र प्रदान किए गए हैं। नमूने पर ध्यान केंद्रित देखभाल के साथ आयोजित किया जाना चाहिए। जेड-दिशा में नमूना सतह के पास पहुंचते समय, धीमी मोटर गति का उपयोग करें।
  4. एप्रोच बटन पर क्लिक करके संलग्न बिना नमूने से संपर्क करें।

4. डेटा संग्रह

  1. पृष्ठभूमि
    1. डेटा अधिग्रहण से पहले, पृष्ठभूमि एकत्र करें। पृष्ठभूमि संग्रह के लिए, सुनिश्चित करें कि लेजर शटर खुली स्थिति में है। स्पेक्ट्रल रेंज और रिज़ॉल्यूशन (विश्लेषण के उद्देश्य के आधार पर) और स्कैन की संख्या और पृष्ठभूमि के सह-औसत की संख्या का चयन करें। इन्हें आम तौर पर उच्च (उदाहरण के लिए, 1024 स्कैन और 3 सह-औसत) होने की सिफारिश की जाती है।
      नोट: सामान्य तौर पर, 4 सेमी-1 या 8 सेमी-1 और 3,200 सेमी-1 -2,800 सेमी -1और 1,800 सेमी-1 -900 सेमी-1 के स्पेक्ट्रल रेजोल्यूशन की सिफारिश की जाती है।
    2. पृष्ठभूमि के अधिग्रहण के बाद, पृष्ठभूमि फ़ाइल को सहेजें। फाइल अपने आप संग्रहीत नहीं है। बंदकरने के लिए लेजर शटर की स्थिति बदलें ।
  2. नमूना - एकल स्पेक्ट्रा
    1. नमूने में संलग्न करने के लिए संलग्न बटन दबाएं। सिस्टम नमूना सतह से संपर्क करना शुरू कर देगा, जब तक कि सीधे संपर्क का पता नहीं चल जाता।
      नोट: सेट बिंदु इस काम में इस्तेमाल किया 0.15-2 वी और प्रतिक्रिया लाभ (मैं लाभ और पी लाभ) के बीच आम तौर पर 3 और 10 के लिए सेट किया जाएगा । एनआईआर2 संपर्क जांच आमतौर पर nanoIR2 प्रणाली के साथ उपयोग किया जाता है (मॉडल: पीआर-EX-nIR2-10, अनुनाद आवृत्ति (kHz): 13 +/−4 kHz, स्प्रिंग कॉन्स्टेंट (N/m): 0.07−0.4एनएम-1)।
    2. सतह की कल्पना करने के लिए एक एएफएम छवि ले लीजिए। पहली बार में, कम स्थानिक संकल्प (जैसे, 200 x 200 अंक)(चित्र 1आई)के साथ एक बड़े क्षेत्र (उदाहरण के लिए, 50 x 50 माइक्रोन) स्कैन करें।
      नोट: एएफएम-आईआर डेटा हमेशा संपर्क मोड में एकत्र किया जाता है, हालांकि, एएफएम डेटा संपर्क या टैपिंग मोड में एकत्र किया जा सकता है।
    3. AFM ऊंचाई/विक्षेपण छवि से, ब्याज के एक विशिष्ट क्षेत्र का चयन करें और उच्च स्थानिक संकल्प(चित्रा 1जे-कश्मीर)के साथ इसे फिर से छवि । सुनिश्चित करें कि डेटा संग्रह की गति धीमी टिप आंदोलन (जैसे, स्कैन दर 0.2-0.4 हर्ट्ज) के साथ उपयुक्त है।
    4. माप स्थान (जैसे, एकल जीवाणु) का चयन करें और टिप को मौके पर ले जाएं।
    5. आईआर लेजर संरेखित करें। इस उद्देश्य के लिए, एक वेवरनंबर का उपयोग करें जिस पर नमूना अवशोषित होगा। जैविक सामग्रियों के लिए यह हो सकता है, उदाहरण के लिए, अमीड I (1655 सेमी-1)। सुनिश्चित करें कि बैंड पास फ़िल्टर बंद है और स्टार्ट आईआरपर क्लिक करें। नैनोआईआर मीटर (आयाम बनाम आवृत्ति के रूप में प्रदर्शित विक्षेप के एफएफटी) में सही ग्राफ कम से कम एक स्पष्ट चोटी दिखाना चाहिए और बाएं ग्राफ (विक्षेप बनाम समय) में आवधिक तरंग होना चाहिए। यदि ऐसा नहीं है, तो आईआर स्पॉट को अनुकूलित करने के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: भले ही फास्ट फोरियर ट्रांसफॉर्म (एफएफटी) और विक्षेप अपेक्षित प्रोफ़ाइल दिखाते हैं, तो कम से कम कई वेवनंबर के लिए आईआर स्पॉट के अनुकूलन का संचालन करने की सिफारिश की जाती है, जहां बैंड की उम्मीद की जाती है।
    6. चयनित तरंग मूल्यों का उपयोग करके आईआर डेटा संग्रह के लिए हॉट स्पॉट का अनुकूलन करें। यह बैंड की स्थिति की पहचान करने और हॉट स्पॉट को अनुकूलित करने के लिए उनका उपयोग करने के लिए बैक्टीरिया (उदाहरण के लिए, बैक्टीरियल पेलेट के एटीआर स्पेक्ट्रम) के पारंपरिक आईआर स्पेक्ट्रम का उपयोग करने में सहायक हो सकता है। विभिन्न स्पेक्ट्रल क्षेत्रों से विभिन्न तरंग मूल्यों (जैसे, 8-10) का चयन करें।
      नोट: यदि ब्याज के बैक्टीरिया के पारंपरिक आईआर स्पेक्ट्रम AFM-IR डेटा संग्रह से पहले एकत्र नहीं किया जा सकता है, तो साहित्य में उपलब्ध बैक्टीरिया स्पेक्ट्रा का उपयोग किसी न किसी मार्गदर्शन के रूप में किया जा सकता है। आईआर स्पॉट के अनुकूलन का परिणाम एक छवि है, जो प्रत्येक एक्स और वाई स्थान पर एफएफटी परिमाण संकेत का नक्शा प्रस्तुत करता है। सबसे बड़े सिग्नल वाले स्थान का चयन स्वचालित रूप से किया जाता है। ऐसी छवियों के उदाहरण सॉफ्टवेयर मैनुअल31में दिए गए हैं ।
    7. चयनित तरंग मूल्यों के लिए आईआर स्पॉट को अनुकूलित करने के बाद, स्पेक्ट्रल डेटा संग्रह के मापदंडों को परिभाषित करें: स्पेक्ट्रल क्षेत्र, स्पेक्ट्रल रिज़ॉल्यूशन, स्कैन की संख्या, और एप्लाइड पावर और सॉफ्टवेयर में उपयुक्त खिड़कियों में इन्हें इनपुट करें। स्पेक्ट्रल संकल्प पृष्ठभूमि संकल्प से मेल रौ ते होना चाहिए और स्पेक्ट्रल क्षेत्र वर्णक क्षेत्र के भीतर होना चाहिए जिसके लिए पृष्ठभूमि एकत्र की गई थी ।
      नोट: मापदंडों का एक सामान्य प्रारंभिक सेट हो सकता है: स्पेक्ट्रल रेंज: 3200 सेमी-1-2800 सेमी-1 और 1800 सेमी-1-900 सेमी-1,स्पेक्ट्रल संकल्प: 4 सेमी-1 या 8 सेमी-1,स्कैन की संख्या: 512-2048।
    8. यदि आवश्यक हो, तो सिग्नल के आधार पर लेजर पावर को समायोजित करें। सामान्य तौर पर, सिग्नल की अच्छी गुणवत्ता के लिए लेजर पावर के 8%-10% के बीच मूल्य पर्याप्त होने चाहिए। उच्च मूल्यों का उपयोग सावधानी के साथ किया जा सकता है, क्योंकि उनके परिणामस्वरूप नमूना क्षति हो सकती है।
      नोट: प्रतिशत लेजर शक्ति आईआर लेजर के प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। यहां दिए गए प्रतिशत मूल्य OPO लेजर के लिए हैं ।
    9. AFM-IR स्पेक्ट्रम इकट्ठा करने के लिए अधिग्रहण पर क्लिक करें ।
    10. एएफएम-आईआर स्पेक्ट्रम के संग्रह के बाद उसी क्षेत्र से एएफएम डेटा को फिर से एकत्र करें। यह अत्यधिक अनुशंसित है क्योंकि यह नमूने पर किसी भी संभावित बहाव और/या विनाशकारी प्रभाव को प्रकट करेगा ।
    11. यदि एएफएम-आईआर स्पेक्ट्रम संतोषजनक है और नमूने पर कोई विनाशकारी प्रभाव नहीं देखा जाता है, तो डेटा संग्रह के साथ आगे बढ़ें। यदि आवश्यक हो, तो ऐरे विकल्प का उपयोग करके डेटा संग्रह के लिए बिंदुओं की एक श्रृंखला को परिभाषित करें और एएफएम ऊंचाई या विक्षेप छवि एकत्र करें। यह विकल्प एक ही स्पेक्ट्रम के लिए परिभाषित समान स्पेक्ट्रल मापदंडों के साथ प्रत्येक बिंदु से लगातार स्पेक्ट्रा एकत्र करने की अनुमति देता है।
    12. यदि एएफएम-आईआर स्पेक्ट्रम के संग्रह के बाद एकत्र की गई एएफएम छवि नमूने (आमतौर पर एक जले हुए स्थान) पर विनाशकारी प्रभाव का पता चलता है, तो शक्ति को कम करें; एक अलग स्थान का चयन करें और चरण 4.3.8-4.3.11 दोहराएं।
    13. यदि एएफएम-आईआर स्पेक्ट्रम में सिग्नल संतोषजनक नहीं है, तो आईआर स्पॉट (चरण 4.3.6) के अनुकूलन की शुद्धता की जांच करें। यदि यह सही है, तो लेजर शक्ति को थोड़ा बढ़ाएं और चरण 4.3.7-4.3.11 दोहराएं। यह संतोषजनक संकेत प्राप्त होने तक दोहराया जा सकता है ।
  3. नमूना - इमेजिंग दृष्टिकोण
    नोट: चयनित वेवरनंबर मूल्य के लिए तीव्रता वितरण छवि एकत्र करने से पहले जीवाणु के एक भी एएफएम-आईआर स्पेक्ट्रम को रिकॉर्ड करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है।
    1. चुने हुए नमूना क्षेत्र की एएफएम छवि रिकॉर्ड करें। ऐसा करने के लिए, पहले कम स्थानिक संकल्प (जैसे, 50 x 50 माइक्रोन, 200 x 200 अंक) के साथ एक बड़े क्षेत्र की एएफएम छवि एकत्र करें, फिर रुचि के क्षेत्र का चयन करें और बढ़े हुए स्थानिक संकल्प के साथ एक एएफएम छवि एकत्र करें (जैसा कि चित्र 1I-Kमें सचित्र है)।
    2. एएफएम-आईआर इमेजिंग के लिए वेवरनंबर मानों का चयन करें।
    3. सुनिश्चित करें कि लेजर के आईआर स्पॉट चयनित तरंग मूल्यों (चरण 4.3.6) के लिए अनुकूलित है। यदि आईआर स्पॉट कुछ वेवरनंबर (कोई स्पष्ट अधिकतम) के लिए अनुकूलित नहीं है, तो इसे उनके लिए अनुकूलित करें।
    4. इमेज्ड क्षेत्र के मापदंडों को परिभाषित करें: चौड़ाई और ऊंचाई, एक्स और वाई दिशा में डेटा बिंदुओं की संख्या।
      नोट: यदि पिछले एएफएम छवियों से स्पॉट का लगातार चयन लागू किया जाता है (जैसा कि चित्रा 1I-Kमें प्रदर्शित किया गया है), तो क्षेत्र के अंकन पर चौड़ाई और ऊंचाई क्षेत्र स्वचालित रूप से भर जाएंगे।
    5. स्पेक्ट्रल सिग्नल अधिग्रहण के मापदंडों को परिभाषित करें: तरंगदैर्ध्य, स्कैन की संख्या और लेजर पावर।
      नोट: स्कैन की संख्या के कारण के भीतर रखा जाना चाहिए । 64 या 32 स्कैन आमतौर पर पर्याप्त मात्रा में सिग्नल की अनुमति देंगे।
    6. स्कैन रेटपर क्लिक करके एएफएम टिप मूवमेंट के मापदंडों को परिभाषित करें । पिछले चरण में स्कैन की संख्या और एक्स दिशा में डेटा बिंदुओं की संख्या जितनी अधिक होगी, टिप आंदोलनों की आवश्यकता होगी। इन मापदंडों के बीच समायोजन की कमी टिप के बहुत तेजी से आंदोलन में परिणाम होगा, प्रत्येक बिंदु से स्कैन की परिभाषित संख्या के वास्तविक अधिग्रहण को रोकने ।
      नोट: उदाहरण के लिए, 64 सह-परिवर्धन और 200 अंकों के साथ आईआर सिग्नल के उपयुक्त संग्रह के लिए, स्कैन दर को 0.07 किलोहर्ट्ज के रूप में निर्धारित करें।
    7. सुनिश्चित करें कि सक्षम आईआर इमेजिंग बॉक्स टिक गया है।
    8. इमेजिंग शुरू करें। चयनित तरंग संख्या में सिग्नल की तीव्रता के एएफएम-आईआर को उस क्षेत्र से एएफएम डेटा के साथ एक साथ एकत्र किया जाएगा।
      नोट: जब OPO लेजर का उपयोग किया जाता है, तो इसके अतिरिक्त संपर्क अनुनाद पीक फ्रीक्वेंसी छवि को इकट्ठा करना संभव है। इसका उपयोग विभिन्न स्थानों पर नमूने की सापेक्ष कठोरता के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है।
    9. एक ही मापदंडों के साथ एक ही क्षेत्र से AFM-IR डेटा का लगातार संग्रह सेट करने के लिए कैप्चर सीक्वेंस विंडो का उपयोग करें, लेकिन विभिन्न तरंग संख्या मूल्यों के लिए। ऐसा करने के लिए, कैप्चर सीक्वेंस विंडो खोलें, प्रत्येक वेवरनंबर में टाइप करें, और एप्लाइड लेजर पावर (प्रत्येक वेवरनंबर के लिए) को परिभाषित करें।
    10. एकत्रित डेटा (एएफएम और एएफएम-आईआर, एकल स्पेक्ट्रा और इमेजिंग) को विभिन्न प्रारूपों में निर्यात करें और विशिष्ट अनुसंधान उद्देश्यों के लिए पर्याप्त तरीकों का उपयोग करके इसका विश्लेषण करें।

Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल नमूने की प्रारंभिक एकाग्रता और पानी की मात्रा के आधार पर सब्सट्रेट पर बैक्टीरिया के प्रकार के प्रकारों की एक श्रृंखला प्राप्त करने में सक्षम बनाता है। चित्रा 1 ग्राम-सकारात्मक(एस ऑरियस)और ग्राम-नकारात्मक(एस्चेरिचिया कोलाई)बैक्टीरिया से वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार मोनोलेयर और एकल-सेल नमूनों से दर्ज एएफएम छवियों (ऊंचाई और विक्षेप) के उदाहरणों को दिखाता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग इंट्रा-और एकल बैक्टीरिया की अतिरिक्त सेलुलर संरचनाओं के एएफएम-आईआर इमेजिंग के लिए किया जा सकता है। इस एप्लिकेशन का एक उदाहरण चित्र 2में दिखाया गया है, जो एस ऑरियस सेल के विभाजन के दौरान होने वाले स्थानिक स्थानीयकृत रासायनिक परिवर्तनों की निगरानी के परिणामों को दर्शाता है। यद्यपि हवा सुखाने को आमतौर पर बैक्टीरिया की तैयारी के लिए एक निर्धारण दृष्टिकोण के रूप में माना जाता है, बैक्टीरिया, प्रकृति द्वारा, तापमान जैसे बाहरी कारकों के लिए बहुत अधिक प्रतिरोध दिखाते हैं और निर्जलीकरण32जीवित रहने की सूचना दी गई थी। यहां प्रस्तुत परिणाम एक हवा से सूखे नमूने से प्राप्त किए गए थे । सेल डिवीजन से पहले होने वाले एक पट का गठन एक ही क्षेत्र की 12 छवियों(20मिनट ≈ एक छवि का संग्रह) द्वारा एएफएम इमेजिंग (चित्रा 2ए-डी)के माध्यम से देखा और निगरानी की गई। चित्रा 2ए-डी लगभग 40 मिनट की प्रत्येक छवि के संग्रह के बीच समय के साथ 4 चयनित एएफएम छवियों को दिखाता है। गठित संरचना (पट) 45 एनएम ऊंची है। गठित पट एएफएम ऊंचाई और विक्षेप छवियों(चित्रा 2ई-एफ)में स्पष्ट रूप से दिखाई देता है। एएफएम-आईआर स्पेक्ट्रा सेल और पट क्षेत्र से दर्ज(चित्रा 2G, चित्रा 2Fमें चिह्नित मूल के अंक) की तुलना से पहले अमीद मैं बैंड को सामान्यीकृत किया गया था, ताकि डेटा संग्रह के बिंदुओं के बीच अलग-अलग नमूना मोटाईके प्रभाव को कम किया जा सके। पट के एएफएम-आईआर स्पेक्ट्रम को सेल क्षेत्र से एकत्र एएफएम-आईआर स्पेक्ट्रम की तुलना में 1240 और 1090 सेमी-1 पर बैंड की उच्च सापेक्ष तीव्रता की विशेषता है। इन्हें कोशिका दीवार घटकों (जैसे, पेप्टिडॉगलाइकन और टेकोइक एसिड सहित) के कार्बोहाइड्रेट और फॉस्फोडिटर समूहों के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है)22।

वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कई अलग-अलग नमूनों के बीच एक स्पेक्ट्रा की तुलना के लिए भी किया जा सकता है। परिणामों के साथ इस एप्लिकेशन का एक उदाहरण चित्र 3 और चित्रा 4 में दिखाया गयाहै । अध्ययन का उद्देश्य एस ऑरियस (वीज़ा) में वनकोमाइसिन आंतरायिक प्रतिरोध के वीवो विकास के परिणामस्वरूप होने वाले रासायनिक परिवर्तनों का निर्धारण करना है। इस उद्देश्य के लिए, नमूनों के नैदानिक जोड़े रोगियों से एकत्र किए गए थे, माता पिता के तनाव के साथ अस्पताल में प्रवेश पर अलग और एंटीबायोटिक चिकित्सा से पहले (vancomycin अतिसंवेदनशील एस ऑरियस,VSSA) और बेटी एंटीबायोटिक दवाओं और नैदानिक विफलता के प्रवेश के बाद एक ही रोगी से अलग तनाव । नमूने आगे आगर माध्यम पर उगाए गए और प्रोटोकॉल(चित्रा 3ए-बी)के अनुसार तैयार किए गए । एएफएम-आईआर स्पेक्ट्रा को वीएसएसए और वीज़ा के लिए कई एकल बैक्टीरिया (और कई नमूनों) से एकत्र किया गया था और बाद में कई केममेट्रिक दृष्टिकोण(चित्रा 3 सी)का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था।

वीएसएसए और वीज़ा कोशिकाओं(चित्रा 4ए-सी)के बीच कोई रूपात्मक अंतर नहीं देखा गया। हालांकि, एएफएम-आईआरस्पेक्ट्रा (चित्रा 4डी, एफ)और उनके दूसरे डेरिवेटिव(चित्रा 4ई, जी)ने प्रतिरोधी और अतिसंवेदनशील उपभेदों के बीच रासायनिक संरचना में स्पष्ट अंतर का प्रदर्शन किया। सेल वॉल घटकों (विशेष रूप से, 1088 सेमी-1पर बैंड) से कार्बोहाइड्रेट और फॉस्फोडिस्टर समूहों से जुड़े बैंड की सापेक्ष तीव्रता अतिसंवेदनशील समकक्ष की तुलना में प्रतिरोधी तनाव में स्पष्ट रूप से बढ़ी। नोट का तथ्य यह है कि सभी रीकोडेड स्पेक्ट्रा (वीज़ा: 81, वीएसएसए: 88) एक छोटे से मानक विचलन दिखाते हैं। यह एक ही तनाव से तैयार विभिन्न नमूनों से दर्ज किए गए आंकड़ों की अच्छी प्रजनन क्षमता को दर्शाता है, क्योंकि एक ही तनाव के विभिन्न नमूनों से दर्ज स्पेक्ट्रा के बीच कोई भेदभाव संभव नहीं था। देखे गए मतभेदों ने अतिसंवेदनशील समकक्ष की तुलना में प्रतिरोधी उपभेदों में सेल की दीवार की बढ़ी हुई मोटाई का संकेत दिया, जो अन्य साहित्य रिपोर्ट33,34के साथ समझौते में रहता है।

Figure 1
चित्रा 1: एएफएम-आईआर माप के लिए विभिन्न जीवाणु नमूनों की प्रतिनिधि एएफएम छवियां। सब्सट्रेट पर कमजोर पड़ने के आधार पर, प्रोटोकॉल एक बैक्टीरिया के मल्टीलेयर और मोनोलेयर के साथ-साथ एकल-कोशिका नमूनों को प्राप्त करने की अनुमति देता है। प्रतिनिधि एएफएम छवियां:(ए-डी)मोनोलेयर और(ई-एच)एकल-कोशिका नमूना(ए, बी, ई, एफ)ग्राम-पॉजिटिव(एस ऑरियस)और(सी, डी, जी, एच)ग्राम नकारात्मक(ई. कोलाई)बैक्टीरिया। (A, C, E, G)ऊंचाई छवियों का प्रदर्शन और(बी, डी, एफ, एच)इसी विक्षेप छवियों को दिखाते हैं । इमेज्ड क्षेत्रों का आकार:(ए-डी, जी, एच)20 x 20 माइक्रोन,(ई, एफ)50 x 50 माइक्रोन।(I-K) एएफएम-आईआरमैपिंग के लिए एक क्षेत्र का लगातार चयन। यह एक एकल एस ऑरियस सेल के उदाहरण में बढ़ते स्थानिक संकल्प के साथ एएफएम इमेजिंग का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। प्रत्येक छवि को चित्रित क्षेत्र के आकार में कमी के कारण स्थानिक संकल्प में वृद्धि के साथ 200 x 200 अंकों का नमूना द्वारा एकत्र किया जाता है। चित्रित क्षेत्रों का आकार:(I)40 x 40 माइक्रोन,(J)20 x 20 माइक्रोन और(K)2.24 x 2.24 माइक्रोन। में काले वर्ग(मैं)में छवि क्षेत्र(जम्मू)के निशान । (जम्मू)में ब्लैक स्क्वायर(कश्मीर)में छवि वाले क्षेत्र को चिह्नित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एएफएम-आईआर के माध्यम से एस ऑरियस सेल डिवीजन की निगरानी। (ए-डी) एस ऑरियस सेल की एएफएम छवियां जो सेल डिवीजन से पहले पट के गठन को दिखाती हैं। इमेज्ड क्षेत्र का आकार: 2 x 2 माइक्रोन। छवियों को एक बड़ी श्रृंखला (12 छवियों हर 20 मिनट दर्ज) से चुना गया था और हर ४० मिनट दर्ज डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं ।(ई-एफ)AFM ऊंचाई और विक्षेप छवि AFM-IR स्पेक्ट्रा के संग्रह के चिह्नित अंक के साथ सेल पट गठन के अंत में दर्ज की गई । चित्रित क्षेत्र का आकार 1.17 x 1.15 माइक्रोन। नवगठित ढांचे की ऊंचाई 45 एनएम है। (जी)AFM-IR स्पेक्ट्रा सेल क्षेत्र (काले) और पट क्षेत्र(लाल) (एफ में चिह्नित) से दर्ज की गई, रेंज 1400-900सेमी-1में । दोनों स्पेक्ट्रा को अमीड आई बैंड में सामान्यीकृत किया गया था और पट से सेल दीवार घटकों की सापेक्ष तीव्रता में वृद्धि प्रदर्शित की गई थी। इस आंकड़े को के कोचन एट अल22से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध के एएफएम-आईआर अध्ययन के लिए प्रायोगिक डिजाइन का अवलोकन। (ए)नमूना मूल और प्रारंभिक तैयारी: एंटीबायोटिक चिकित्सा से पहले एक रोगी से अतिसंवेदनशील माता-पिता का तनाव एकत्र किया गया था और एंटीबायोटिक चिकित्सा और नैदानिक विफलता (वीवो प्रतिरोध विकास में) के बाद एक ही रोगी से बेटी प्रतिरोधी तनाव प्राप्त किया गया था। बैक्टीरिया अलग और 37 डिग्री सेल्सियस में 16 घंटे के लिए दिल जलसेक (HI) आगर पर सुसंस्कृत थे। (ख)एएफएम-आईआर के लिए बाद में नमूना तैयार करना, जिसमें बैक्टीरियल पैलेट (3×) की धुलाई और नमूना जमाव के बाद नमूने का संग्रह शामिल है । (C)AFM-IR डेटा संग्रह और विश्लेषण: AFM ऊंचाई और AFM-IR स्पेक्ट्रम (1800-900सेमी-1)। एएफएम इमेज्ड क्षेत्र का आकार: 1.7 x 1.4 माइक्रोन। एएफएम-आईआर स्पेक्ट्रम सेल के बीच से एकत्र किया गया था। बाद में पदानुक्रमित क्लस्टर विश्लेषण सहित केममेट्रिक दृष्टिकोणों का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया। इस आंकड़े को के कोचन एट अल19से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एएफएम और एएफएम-आईआर नैदानिक जोड़े में वैनकोमाइसिन अतिसंवेदनशील एस ऑरियस (वीएसएसए) की तुलना में वैनकमाइसिन इंटरमीडिएट एस ऑरियस (वीज़ा) में रासायनिक परिवर्तनों के अध्ययन के परिणाम हैं। ए-बी)वीज़ा और(सी)वीएसएसए एकल-कोशिका नमूनों की एएफएम छवियां। चित्रित क्षेत्रों का आकार:(A,C)40 x 40μm,(B)2.56 x 2.45 माइक्रोन.(D-E)औसत AFM-IR स्पेक्ट्रा और उनके(एफ-जी)के लिए दूसरा डेरिवेटिव: (डी, एफ)वीज़ा और(ई, जी)वीएसएसए कोशिकाएं, स्पेक्ट्रल रेंज 1800-900सेमी-1में । प्रस्तुत स्पेक्ट्रा 81 (वीज़ा) और 88 (वीएसएसए) व्यक्तिगत स्पेक्ट्रा का औसत है और मानक विचलन (एसडी) के साथ प्रस्तुत किया जाता है। औसत सभी व्यक्तिगत स्पेक्ट्रा को एक साथ सामान्य करने के बाद आयोजित किया गया था। प्रमुख बैंड(एफ-जी)में चिह्नित हैं। इस आंकड़े को के कोचन एट अल19से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एस ऑरियस सेल के लिए चयनित वेवरनंबर मूल्यों पर AFM-IR नक्शे के लगातार पंजीकरण पर छवि बहाव । (शीर्षपंक्ति):एएफएम छवियों को चयनित वेवनंबर मूल्यों पर आईआर सिग्नल की तीव्रता के आधार पर संबंधित(नीचे पंक्ति)एएफएम-आईआर मानचित्रों के साथ एक साथ दर्ज किया गया था। तरंग मूल्य (966, 1055, 1079, 1106, 1234, 1398, 1454, 1540, 1656, 1740 सेमी-1)नीचे की पंक्ति से ऊपर एनोटेटेड हैं। प्रत्येक सेट (AFM छवि और AFM-IR नक्शा) सीधे पिछले छवि (लगभग ४० मिनट प्रति सेट) के बाद दर्ज किया गया था । इमेज/मैप किए गए क्षेत्र का आकार: 1.54 x 1.57 माइक्रोन। छवियों के बीच एक स्पष्ट बहाव दिखाई दे रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

उनकी रासायनिक संरचना के संदर्भ में जैविक नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लक्षण वर्णन के लिए आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी की उपयोगिता अच्छी तरह से स्थापित है। पिछले एक दशक में, आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी बैक्टीरियल अध्ययन 12 , 13 ,14,15,16,17के लिए एक आशाजनक उपकरण के रूप मेंउभराहै । यह माइक्रोबायोलॉजी के क्षेत्र में पर्याप्त रुचि को आकर्षित करने के लिए जारी है, कुछ तकनीकों में से एक के रूप में रासायनिक संरचना के माध्यम से एक फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन को सक्षम करने । इस संदर्भ में, पारंपरिक FTIR माइक्रोस्कोपी की प्रमुख खामी सीमित स्थानिक संकल्प में निहित है, एकल कोशिका और बैक्टीरिया के उपकोशिकीय अध्ययन को रोकने । वास्तव में, बैक्टीरिया का छोटा आकार न केवल आईआर के लिए, बल्कि अधिकांश तकनीकों के लिए एक बाधा का प्रतिनिधित्व करता है। इस प्रकार, बैक्टीरिया के एकल कोशिका और उपकोशिकीय अध्ययनों के लिए उपलब्ध अनुसंधान उपकरण काफी सीमित हैं। आईआर के साथ एएफएम का संयोजन आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी की स्थानिक संकल्प सीमा को दूर करने में सक्षम बनाता है, जो रासायनिक संरचना की नैनोस्केल जांच में सक्षम बैक्टीरियल अनुसंधान के लिए एक उपन्यास उपकरण प्रदान करता है।

तकनीक एकल सेल अध्ययन तक ही सीमित नहीं है और एक नमूनों की एक किस्म की जांच करने के लिए अनुमति देता है, मोटाई में लेकर । निस्संदेह, स्वच्छ, और सावधान नमूना तैयारी उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां प्रोटोकॉल विभिन्न बैक्टीरिया(चित्रा 1)के मल्टीलेयर, मोनोलेयर और/या एकल कोशिका नमूनों को तैयार करने की विधि प्रदान करता है । तैयार नमूना प्रारंभिक बैक्टीरियल लोड, धोने के बाद कमजोर पड़ने के साथ-साथ सब्सट्रेट पर और कमजोर पड़ने सहित कई कारकों पर निर्भर करता है। धुले हुए छर्रों को कमजोर करने के बाद प्राप्त नमूने की मात्रा और सब्सट्रेट पर बयान से पहले आम तौर पर कई नमूनों की तैयारी की अनुमति देता है। इसलिए, सब्सट्रेट पर नमूने का वांछित वितरण प्राप्त करने के लिए, अक्सर नमूनों की एक श्रृंखला तैयार करना फायदेमंद होता है, जिसमें उनके कमजोर पड़ने की कमी होती है। उपकोशिकीय इमेजिंग के बजाय एएफएम-आईआर स्पेक्ट्रा के संग्रह के उद्देश्य से अध्ययनों के लिए, सिग्नल की तीव्रता बढ़ाने के लिए नमूने की मात्रा (उदाहरण के लिए, मोनोलेयर से मल्टीलेयर तक) को संशोधित करना फायदेमंद हो सकता है।

नमूना तैयार करने में एक और महत्वपूर्ण पहलू मध्यम अवशिष्टों को उचित रूप से हटाना है। चयनित नमूना खेती विधियों के आधार पर, नमूना या तो तरल माध्यम से या एक आगर प्लेट से एकत्र किया जाता है। दोनों ही मामलों में, मध्यम अवशिष्ट नमूने में मौजूद होने की संभावना है, हालांकि आगर प्लेटों से संग्रह पर बहुत कम हद तक। चूंकि बैक्टीरियल ग्रोथ मीडिया में विभिन्न जैविक घटकों की बहुतायत होती है, इसलिए माध्यम को उचित रूप से हटाना सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। हम आगर प्लेट नमूनों के लिए अल्ट्रापुरे पानी के साथ तीन वॉश और मध्यम से एकत्र नमूनों के लिए कम से कम चार वॉश की सलाह देते हैं। यदि आवश्यक हो तो वॉश की संख्या बढ़ाई जा सकती है; हालांकि, विभिन्न नमूनों के बीच तुलना के लिए, इसे नमूनों के बीच सुसंगत रखना महत्वपूर्ण है। प्रदर्शित प्रोटोकॉल फॉस्फेट बफर सॉल्यूशन (पीबीएस) या नमकीन जैसे सॉल्वैंट्स के बजाय पानी का उपयोग करता है। पीबीएस और नमकीन दोनों ही हवा सुखाने पर क्रिस्टल के गठन के लिए नेतृत्व करते हैं, जो बैक्टीरिया को नुकसान पहुंचा सकते हैं । इसके अलावा, दोनों तीव्र आईआर बैंड का एक स्रोत हैं, PBS के साथ, विशेष रूप से, फिंगरप्रिंट क्षेत्र में कई बैंड युक्त । खारा या PBS के उपयोग के लिए क्षमता की कमी, वर्तमान में तकनीक के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा का प्रतिनिधित्व करता है । आमतौर पर, धोने के लिए पानी का उपयोग बैक्टीरिया पर कोई विनाशकारी प्रभाव नहीं डालता है; हालांकि, देखभाल की जानी चाहिए, और यदि संभव हो, तो पानी के संपर्क का समय सीमित होना चाहिए। यदि नमूना तैयारी प्रोटोकॉल को धोने के चरण में रोके जाने की आवश्यकता है, तो पानी को हटाने के बाद नमूना को पेलेटाइज्ड रूप में छोड़ने की सिफारिश की जाती है। यह चने-नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए विशेष महत्व रखता है, जिसमें पतले सेल की दीवार होती है क्योंकि वे टूटने की अधिक संभावना होती है।

उचित और उच्च गुणवत्ता वाले एएफएम-आईआर डेटा सुनिश्चित करने के लिए, डेटा संग्रह प्रोटोकॉल में कई पहलू महत्वपूर्ण महत्व के हैं। सबसे पहले, पृष्ठभूमि का सही संग्रह डेटा अधिग्रहण के लिए आवश्यक है । विशेष रूप से, पृष्ठभूमि संग्रह के साथ-साथ पृष्ठभूमि और नमूना संग्रह के बीच स्थिर आर्द्रता के स्तर का रखरखाव आवश्यक है। यह सुनिश्चित करने के लिए, हम नाइट्रोजन के साथ उपकरण मिटाने और आर्द्रता के स्तर को बनाए रखने की सलाह देते हैं जो 25% से अधिक नहीं है। मिटाने की कमी विशेष रूप से उच्च आर्द्रता वाले स्थानों में एक महत्वपूर्ण सीमा लागू कर सकती है। दूसरे, आईआर स्पॉट के उचित अनुकूलन के महत्व पर प्रकाश डाला जाना चाहिए । सर्वोत्तम परिणामों के लिए, बैंड मैक्सिमा की स्थिति के बारे में एक प्राथमिकताओं का ज्ञान फायदेमंद हो सकता है। उदाहरण के लिए, जीवाणु गोली के एक पारंपरिक आईआर स्पेक्ट्रम का उपयोग नमूने से अपेक्षित बैंड की स्थिति निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। यदि यह एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में प्राप्त करना संभव नहीं है, तो उपयोगकर्ता साहित्य में उपलब्ध आईआर स्पेक्ट्रा का उपयोग कर सकता है या एक बैंड स्थिति का उपयोग करके अनुकूलन शुरू कर सकता है जो जीवाणु में उम्मीद करना उचित है (उदाहरण के लिए, अमेद मैं और अमीद द्वितीय)। तीसरा, डेटा संग्रह के लिए, सावधान शक्ति चयन (एक अच्छा एस/एन अनुपात प्राप्त करने की अनुमति) के महत्व को उजागर करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि इसका विनाशकारी प्रभाव हो सकता है । सलाह दी शक्ति नमूना की मोटाई पर निर्भर करता है, किसी न किसी मार्गदर्शन के साथ साधन मैनुअल31में उपलब्ध है । हम एएफएम छवि के संग्रह द्वारा नमूना पोस्ट-माप की स्थिति का अनुभवजन्य रूप से परीक्षण करने की सलाह देते हैं, क्योंकि इससे किसी भी विनाशकारी प्रभाव का पता चलेगा। इसके अलावा, एएफएम-आईआर स्पेक्ट्रा के संग्रह से पहले और बाद में उसी क्षेत्र से एएफएम छवियों का संग्रह एक अच्छी पुष्टि के रूप में कार्य करता है कि कोई बहाव नहीं हुआ है और स्पेक्ट्रा वास्तव में सेल में चयनित बिंदु से उत्पन्न होता है। चयनित तरंगमान्य मूल्यों पर आईआर तीव्रता की लगातार इमेजिंग के माध्यम से इमेजिंग मोडलि को लागू करते समय बहाव की संभावना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। इसका एक उदाहरण चित्र 5में दर्शाया गया है . चित्रित क्षेत्र को प्रयोग की शुरुआत में परिभाषित किया गया था और सभी तरंगमान्य मूल्यों के अनुरूप होना चाहिए। हालांकि, लगभग 40 मिनट के प्रत्येक मानचित्र के अधिग्रहण समय के साथ प्रत्येक एएफएम ऊंचाई (और इसी आईआर वेवरनंबर तीव्रता) छवि के बीच एक स्पष्ट बहाव दिखाई देता है। इसके कारण, इमेजिंग डेटा एकत्र करने वाले उपयोगकर्ताओं के लिए, हम हमेशा ब्याज के नमूने से थोड़ा बड़ा क्षेत्र का चयन करने की सलाह देते हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए कि बहाव के अस्तित्व पर भी, ब्याज का नमूना छवि क्षेत्र के भीतर रहेगा।

प्रोटोकॉल की संभावित सीमाओं में ऊपर वर्णित शारीरिक समाधानों (जैसे, खारा या पीबीएस) में हाइड्रेटेड राज्य में डेटा एकत्र करने की क्षमता की कमी शामिल है। इसके अलावा, विशेष रूप से उच्च आर्द्रता क्षेत्रों में, अक्सर नाइट्रोजन शुद्ध की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल छोटे संरचनाओं के लिए इसके उपयोग की संभावना को छोड़कर, आकार में १०० एनएम तक जीवों की जांच करने में सक्षम बनाता है । हालांकि यह एक अलग लेजर का उपयोग कर दूर किया जा सकता है (जैसे, क्वांटम झरना लेजर 20 एनएम के स्थानिक संकल्प को प्राप्त करने की अनुमति), यह भी सीमित स्पेक्ट्रल रेंज के साथ जुड़ा हुआ है और साथ ही शोर अनुपात के लिए एक अच्छा संकेत प्राप्त करने में कठिनाइयों । अंत में, नरम सतहों की जांच करने से सतह का ठीक से पता नहीं लगाने और संपर्क के बिंदु से परे आगे बढ़ने के साथ एक चुनौती पेश हो सकती है, जब तक टूटना नहीं होता है। हालांकि यह आम तौर पर बैक्टीरियल नमूनों के साथ एक मुद्दा नहीं है, यह नरम नमूनों के माप पर हो सकता है । ऐसे मामलों में, नमूने के निकट सब्सट्रेट की साफ सतह पर संलग्न होने का प्रयास करने की सिफारिश की जाती है।

वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कई प्रकार के जीवाणु अनुसंधान के लिए किया जा सकता है, जिसमें विभिन्न नमूनों के साथ-साथ उपकोशिकीय परीक्षा के बीच तुलनात्मक अध्ययन शामिल हैं। अनुसंधान के उद्देश्य के आधार पर एकल स्पेक्ट्रा और इमेजिंग तौर-तरीकों35के लिए केमोमेट्रिक दृष्टिकोणों का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल को निर्धारण के अलावा अन्य जैविक सामग्री (जैसे कवक, खमीर, कोशिकाओं, आदि) में आवेदन के लिए भी संशोधित किया जा सकता है।

Disclosures

हम प्रकाशन शुल्क के भुगतान के लिए ब्रूकर को स्वीकार करना चाहते हैं । केकेआर, BRW, एपी, और पीएच एक अंतरराष्ट्रीय पेटेंट (PCTIB2020/052339) पर आविष्कारक हैं, जो दृष्टिकोण के कुछ बुनियादी पहलुओं का वर्णन करता है ।

Acknowledgments

हम उनके समर्थन के लिए ब्रूकर को स्वीकार करना चाहेंगे । इस काम को मोनाश यूनिवर्सिटी ने महिला सफलता अनुदान (के कोचन) को आगे बढ़ाने का समर्थन किया । A.Y.P एक ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद व्यवसायी फैलोशिप (APP1117940) से समर्थन स्वीकार करते हैं । यह काम एक ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद डिस्कवरी परियोजना DP180103484 द्वारा वित्त पोषित किया गया था । हम श्री फिनले शंक्स को उनके सहायक समर्थन और सुश्री ज़ेनिया कोस्तौलिया को नमूनों के साथ उनकी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM metal specimen disc PST ProSciTech Pty Ltd GA530-15 Recommended 15 mm
Anasys AFM-IR nanoIR2 Anaysys Instruments model: nanoIR2
Contact mode NIR2 Probes for nanoIR 2 Bruker / Anasys Instruments - Model: Model: PR-EX-NIR2
Heraeus Pico 17 Microcentrifuge Thermo Scientific - -
Matlab Mathworks Inc - Multivariate data analysis software
Micro-centrifuge tubes, 1.5 mL Heathrow Scientific  HEA4323 Can be replaced with any other micro-centrifuge tube
NanoIR 2 instrument Bruker / Anasys Instruments - -
PLS toolbox Mathworks Inc - GUI for Matlab
Selected bacterial medium (e.g. HBA Columbia Plates) Thermo Fisher PP2001 Provided type of medium is an example and can be replaced by others, depending on the type of experiment
Selected bacterial strain - - The source depends on the aim of research (patient isolates, ATCC strains, etc.)
Substrate (e.g. Raman grade CaF2) Crystran CAFP13-2R Recommended size: 13 mm Ø x 2.0 mm
Tip pipette 1000 µl Axygen T-1000-B -
Tip pipette 200 µl Axygen T-200-C -
Tip pipette 0.5-10 µl Axygen T-300-R -
Ultrapure water - - -

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References

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रसायन विज्ञान अंक 163 एएफएम-आईआर बैक्टीरिया एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध एएमआर बैक्टीरियल सेल वॉल इमेजिंग स्टेफिलोकोकस ऑरियस,मैथिसिलिन-प्रतिरोध एमआरएसए वैनकोमाइसिन प्रतिरोध वीज़ा डैप्टोमाइसिन गैर-संवेदनशीलता
परमाणु बल माइक्रोस्कोपी एक जीवाणु रसायन विज्ञान की जांच करने के लिए एक उपकरण के रूप में अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ संयुक्त
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Kochan, K., Peleg, A. Y., Heraud,… More

Kochan, K., Peleg, A. Y., Heraud, P., Wood, B. R. Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry. J. Vis. Exp. (163), e61728, doi:10.3791/61728 (2020).

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