Summary
Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) gir en kraftig plattform for bakteriestudier, noe som gjør det mulig å oppnå nanoskala oppløsning. Begge deler, kartlegging av subcellulære endringer (f.eks. ved celledeling) samt komparative studier av kjemisk sammensetning (f.eks. som følge av legemiddelresistens) kan utføres på et enkelt cellenivå i bakterier.
Abstract
Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) er en ny kombinatorisk teknikk som muliggjør samtidig karakterisering av fysiske egenskaper og kjemisk sammensetning av prøven med nanoskala oppløsning. Ved å kombinere AFM med IR, overvinnes den romlige oppløsningsbegrensningen til konvensjonell IR, slik at en oppløsning på 20-100 nm kan oppnås. Dette åpner døren for et bredt spekter av nye anvendelser av IR mot å undersøke prøver mindre enn flere mikrometer, tidligere uoppnåelige ved hjelp av konvensjonell IR-mikroskopi. AFM-IR er eminent egnet for bakterieforskning, og gir både spektral og romlig informasjon på enkeltcellet og intracellulært nivå. De økende globale helseproblemene og ugunstige fremtidige spådommer om bakterielle infeksjoner, og spesielt rask utvikling av antimikrobiell resistens, har skapt et presserende behov for et forskningsverktøy som er i stand til fenotypisk probing på enkeltcellet og subcellulært nivå. AFM-IR tilbyr potensialet til å møte dette behovet, ved å muliggjøre detaljkarakterisering av kjemisk sammensetning av en enkelt bakterie. Her gir vi en komplett protokoll for prøvepreparering og datainnsamling av enkeltspektra og kartlegging av modalitet, for anvendelse av AFM-IR mot bakteriestudier.
Introduction
Bakterier er encellede prokaryote organismer, som forekommer i forskjellige former og størrelser, vanligvis i området flere hundre nanometer til mikrometer. De eksisterer i en rekke habitater og er avgjørende for livets eksistens. Innenfor menneskekroppen er flertallet av bakteriene som er tilstede i tarmen ufarlige, og mange er faktisk gunstige1. Imidlertid er flere bakteriearter patogene og forårsaker en rekke smittsomme sykdommer. Bakterielle infeksjoner kan føre til utvikling av sepsis og septisk sjokk: en livstruende tilstand, som følge av kroppens respons på en infeksjon2. Sepsis er en global stor helsetrussel, med høy utbredelse over hele verden og alvorlig dødelighet. Bare i 2017 ble det registrert anslagsvis 50 millioner tilfeller av sepsis over hele verden, med 11 millioner av dem som resulterte i død (ca. 20%)2. Videre ble en nedgang i pasientens overlevelsessjanser, på grunn av forsinket behandling, vist å forekomme på en timebasert måte3,4.
Bakterielle infeksjoner behandles med antibiotika. Alvorlighetsgraden av potensielle konsekvenser av bakterielle blodstrømsinfeksjoner (BSIer), sammen med en klar betydning av rask initiering av antimikrobiell terapi, forårsaker behovet for umiddelbar antibiotikaadministrasjon. Men ettersom de nåværende diagnostiske tilnærmingene som brukes i klinisk praksis (f.eks. blodkulturering) krever relativt lang tid, oppstår antibiotikaadministrasjon ofte før positiv BSI-diagnose5. Denne faktoren fører til omfattende overforbruk av antibiotika, som sammen med overdreven antibiotikabruk i andre sektorer som landbruket - skaper et alvorlig evolusjonært press mot utviklingen av antimikrobiell resistens (AMR)6,7. AMR er for tiden et av de mest presserende globale helseproblemene7,8 og, innen 2050, er spådd å bli den ledende dødsårsaken9. Utviklingen av motstand, sammen med spredning av AMR-stammer, forekommer i et alarmerende tempo7,8,9 og overstiger, langt, graden av oppdagelse av nye antibiotika10. Nye resistente fenotyper dukker kontinuerlig opp over hele verden, mens
forskning dedikert til å forstå AMR-relaterte endringer er ofte treg og begrenset av tilgjengelige tilnærminger11. I tillegg fokuserer de ofte brukte metodene, som polymerasekjedereaksjon (PCR) og hele gensekvensering (WGS), bare på genotypiske endringer. Disse er ikke tilstrekkelige til å avsløre motstandsmekanismene11, noe som gir et presserende behov for et forskningsverktøy som gjør det mulig å forstå bakteriens kjemiske sammensetning.
Infrarød spektroskopi (IR) gir en molekylær karakterisering av prøven og er dermed en lovende kandidat for fenotypisk bakterieprobing. Siden de tidlige applikasjonene12, ble det demonstrert en stor størrelse på eksempler på bruken i litteraturen13,14. Disse inkluderer fenotypisk basert identifikasjon av bakterier på slekt15, art16og stamme17,18 nivå. Den romlige oppløsningen til konvensjonell IR er imidlertid begrenset til flere mikroner på grunn av bølgelengdediffraksjonens romlige oppløsningsgrense19. Siden størrelsen på de fleste bakterier ligger under denne grensen (f.eks. Staphylococcus aureus ≈ 400 nm i diameter), er konvensjonell IR ikke aktuelt for probing på encellet eller intracellulært nivå.
Den romlige oppløsningsbegrensningen ble nylig overvunnet ved å kombinere IR-spektroskopi med Atomic Force Microscopy (AFM-IR). I dette tilfellet oppdages IR-absorpsjonen indirekte, gjennom termisk utvidelse av materialet19,20,21,22. Kort sagt resulterer absorpsjonen av IR-stråling i en lokal temperaturøkning. Dette kan måles enten direkte23 eller gjennom måling av oscillasjon av AFM cantilever-sonden, som følge av kraftimpuls opprettet ved IR-absorpsjon20,21. Den kombinatoriske AFM-IR-teknikken gjør det mulig å oppnå romlig oppløsning som nærmer seg 20 nm, og gir samtidig informasjon om lokale fysiske egenskaper til en prøve (AFM) og dens kjemiske sammensetning (AFM-IR). Innsamling av begge deler, enkeltspektra fra utvalgte flekker og kartlegging av intensiteten til valgte bølgenummerverdier innenfor et valgt område er mulig.
Tatt i betraktning den oppnåelige romlige oppløsningen til AFM-IR, er det tydelig at teknikken åpner muligheten for kjemisk / fenotypisk probing av enkeltbakteriecelle og deres intracellulæresammensetning 24. Hittil ble flere eksempler på anvendelsen av AFM-IR for enkeltbakterier demonstrert i litteraturen19,20,21,22,25,26,27,28. Disse omfatter enkeltspektralanalyse19,21,22 og tilordning på undercellenivå19,22,25,26,27,28. For eksempel er evnen til å oppdage intracellulære lipid vesicles27 og virus28 innenfor en enkelt bakterie blitt beskrevet. Disse resultatene viser nytten av AFM-IR for nanoskalastudier av enkeltbakterier og klinisk relevante patogener19.
Derfor presenterer vi en prøvepreparerings- og innsamlingsmetode for AFM-IR-data av flerlags-, monolags- og enkeltcellebakterielle prøver. Protokollen beskrevet her ble brukt til å studere forskjellige arter av bakterier22 og endringene i deres kjemiske sammensetning. Spesielt ble in vivo-utviklingen av vancomycinresistens og daptomycin ikke-følsomhet undersøkt i kliniske par S. aureus19. Begge deler oppstod vancomycin intermitterende resistens og daptomycin ikke-følsomhet i S. aureus (VISA og DpR) relativt nylig, etter økt bruk og innføring av disse antibiotika til klinikker, som utgjør et betydelig medisinsk problem. Spesielt mekanismen for daptomycin ikke-mottakelighet forblir fortsatt unnvikende, noe som hindrer alternativ narkotikautvikling19,29. Den presenterte protokollen fokuserer på levering av pålitelig AFM-IR-spektra av enkeltbakterier, som videre kan analyseres ved hjelp av en rekke kjemometriske tilnærminger, i henhold til eksperimentelle mål. Det inkluderer i tillegg kartleggingsmetoden, som gjelder for intra-cellulære studier.
Protocol
Alt arbeid utført med patogene bakterier bør utføres med passende sikkerhetstiltak på plass. Disse inkluderer arbeid i et laboratorium med tilstrekkelig biosikkerhetsnivå og i en biosikkerhetshytte (PC2) samt forsiktig dekontaminering av arbeidsområdet med et passende desinfeksjonsmiddel, for eksempel 80% etanolløsning. Passende verneutstyr må brukes hele tiden.
1. Tilberedning av løsemidler og materialer
- Løsemidler: Bruk ultrarent vann som løsningsmiddel. Bruk renset vann, autoklavert før eksperimentet for å unngå potensiell krysskontaminering.
- Substrat: Bruk et av disse substratene for AFM-IR, for eksempel ZnSe, CaF2, BaF2osv. Siden AFM-IR i prinsippet er en ikke-destruktiv teknikk, kan man bruke en rekke andre forskningsverktøy på samme eksempelpost AFM-IR-analyse. For eksempel kan korrelasjon av resultatene med Raman spektroskopi utføres hvis Raman grad CaF2 eller BaF2 lysbilder brukes.
- Bruk hetteglass i glass i stedet for plastrør, da plast kan forurense prøven.
2. Prøvepreparering for AFM-IR
- Vekst/inkubasjon av prøve
- Vokse bakterier i flytende medier eller på faste plater. Velg type medium, vekstforhold (f.eks. temperatur, oksygentilgjengelighet) og veksttid i henhold til de spesifikke kravene til bakteriearter som undersøkes. For eksempel, for S. aureus Hjerteinfusjon (HI) kan agarplater brukes, med vekst i 16 timer i 37 °C under aerobe forhold.
MERK: For å oppnå de beste resultatene, bør veksten / inkubasjonen gi nok bakterier som vil tillate innsamling av en mikropellet av prøve. Det spesifikke antallet kolonidannende enheter eller bakterieceller avhenger av bakteriens type og størrelse.
- Vokse bakterier i flytende medier eller på faste plater. Velg type medium, vekstforhold (f.eks. temperatur, oksygentilgjengelighet) og veksttid i henhold til de spesifikke kravene til bakteriearter som undersøkes. For eksempel, for S. aureus Hjerteinfusjon (HI) kan agarplater brukes, med vekst i 16 timer i 37 °C under aerobe forhold.
- Eksempel på avsetning
- Bruk en steril sløyfe, samle forsiktig bakterier fra koloniene på agarplaten og overfør dem til et glassrør. Samle bakterier bare fra toppen av koloniene. Hvis du samler prøver fra en flytende kultur, ved hjelp av en pipette, overfør ca. 1 ml bakteriell suspensjon til et glassrør. Volumet kan endres avhengig av bakteriebelastningen.
MERK: Det er viktig å forsøke å ikke samle (eller minimalisere så mye som mulig samlingen av) noe medium fra under kolonien. De påfølgende trinnene for prøveforberedelse tar sikte på å fjerne potensiell rester av medier. Minimering av potensiell middels rest fra begynnelsen muliggjør spektral innsamling av data fra rensede bakterieceller. Trinn 2.2.2 og 2.2.3 gjelder for prøver fremstilt fra agarplater. For prøver fremstilt fra flytende medier, gå til trinn 2.2.4. - Tilsett 1 ml ultrarent vann til røret. Virvel til den oppsamlede bakteriepellet ikke lenger er synlige på bunnen av røret (vanligvis 1-2 min).
- Beregn løsningens grove turbiditet ved hjelp av for eksempel McFarland-standarder ved visuell sammenligning30 mellom den forberedte løsningen og McFarland-standardene. Hvis turbiditeten til bakteriell suspensjon ser ut til å være svært lav, legg til flere bakterier fra platen ved hjelp av en steril sløyfe og virvel igjen. Gjenta til den grove turbiditeten til løsningen er sammenlignbar med McFarland-standardene 0,5 og 1. Dette vil generelt gi en god mengde bakteriell pellet.
- Sentrifuger bakteriell suspensjon ved 3000 x g i 5 min for å få en pellets.
MERK: Sentrifugeringsparametere kan modifiseres for å oppnå bakteriell pellets. Forsiktighet bør tas hvis du øker g-kraften, for ikke å indusere brudd på bakterier (spesielt i tilfelle Gram-negative bakterier). - Bruk en pipette og fjern forsiktig supernatanten ovenfra pelletsen. Tilsett 1 ml ultrapure vann til røret og virvelen for å suspendere pelletsen igjen. Deretter sentrifugerer du utvalget slik det ble gjort i trinn 2.2.4.
- Gjenta vaskeprosedyren (trinn 2.2.2 og 2.2.4) minst tre ganger. Ved innsamling av den første prøven fra flytende medier, gjenta prosedyren minst fire ganger (mediefjerning etterfulgt av tre vasker).
- Etter den endelige vasken, fjern supernatanten, tilsett ultrapure vann og virvel i minst 2 minutter. Deretter deponeres 5 μL av prøven på substratet (f.eks.
- Hvis ønsket tykkelse på prøven er et flerlags bakterier, la prøven lufttørke.
- Hvis ønsket tykkelse er monolayer eller individuelle bakterier, umiddelbart etter deponering av prøven (trinn 2.2.7) tilsett mellom 20-100 μL ultrapure vann og bland forsiktig med en pipettespiss. La det lufttørke.
MERK: Det nøyaktige volumet av vann kan variere mellom eksperimenter, da det er avhengig av mange faktorer (f.eks. størrelsen på organismen, pelletstettheten, etc.) og er derfor best bestemt empirisk. Forberedelse av en serie prøver med varierende mengder ultrarent vann tilsatt gjør det mulig for en å velge en prøve med ønsket tykkelse / tetthet av bakterier. Tykkelsen/tettheten av bakterier kan enkelt visualiseres via AFM i de påfølgende stadiene. Eksempler på AFM-bilder fra monolag og enkeltcelleeksempler vises i Figur 1A–H. - Monter substratet på en AFM metallprøveskive ved hjelp av dobbeltsidig tape.
- Bruk en steril sløyfe, samle forsiktig bakterier fra koloniene på agarplaten og overfør dem til et glassrør. Samle bakterier bare fra toppen av koloniene. Hvis du samler prøver fra en flytende kultur, ved hjelp av en pipette, overfør ca. 1 ml bakteriell suspensjon til et glassrør. Volumet kan endres avhengig av bakteriebelastningen.
3. Instrument forberedelse
MERK: De instrumentelle prosedyrene som er beskrevet her, er for instrumentet som er oppført i Materiallisten. Den detaljerte instrumentprosedyren kan avvike noe fra den som er beskrevet her hvis du bruker en nyere modell av AFM-IR-instrumentet.
- Slå på og initialiser instrumentet ved å trykke på Initialize-knappen. Kontroller at laserlukkeren er i åpen stilling for lasertesten.
- Hvis et rensesystem er satt opp, renser du instrumentet med N2 ved å slå på strømmen av N2. Juster nitrogenrensingen for å oppnå et stabilt fuktighetsnivå (for eksempel 20%). Sørg for at fuktigheten ikke svinger under målinger og mellom bakgrunns- og prøvedatainnsamling. Det anbefales å la fuktighetsnivåene stabilisere seg i ca. 20 minutter.
- Legg prøven i prøvekammeret ved å trykke på Last inn-knappen. Prøvelasting utføres gjennom programvareveiviseren. Når du bruker programvareveiviseren, må du først fokusere på tipset ved hjelp av piler for å flytte mikroskopstadiet i Z-retningen og klikke på Neste. For det andre justerer du datainnsamlingsstedet ved hjelp av piler som styrer bevegelsen i flyet og justerer AFM-laseren og AFM-detektoren ved hjelp av knottene på toppen av AFM-hodet. Fokuser deretter på prøveoverflaten ved å flytte mikroskopstadiet i Z-retning.
MERK: Detaljerte illustrasjoner av hvert trinn i prøvelastingen finnes i programvarehåndboken31. Fokus på prøven bør utføres med forsiktighet. Når du nærmer deg prøveoverflaten i Z-retningen, bruk en langsom motorhastighet. - Tilnærm deg prøven uten å engasjere deg ved å klikke på Approach-knappen.
4. Datainnsamling
- Bakgrunn
- Før datainnsamlingen samler du inn bakgrunnen. For bakgrunnsinnsamling må du kontrollere at laserlukkeren er i åpen stilling. Velg spektralområdet og oppløsningen (avhengig av målet med analysen) og antall skanninger og antall medgjennomsnitt av bakgrunn. Disse anbefales vanligvis å være høye (f.eks. 1024 skanninger og 3 medgjennomsnitt).
MERK: Generelt anbefales spektraloppløsning på 4 cm-1 eller 8 cm-1 og spektralområder på 3200 cm-1–2800 cm-1 og 1800 cm-1–900 cm-1. - Etter oppkjøpet av bakgrunnen, lagre bakgrunnsfilen. Filen lagres ikke automatisk. Endre laserlukkerposisjonen til Lukk.
- Før datainnsamlingen samler du inn bakgrunnen. For bakgrunnsinnsamling må du kontrollere at laserlukkeren er i åpen stilling. Velg spektralområdet og oppløsningen (avhengig av målet med analysen) og antall skanninger og antall medgjennomsnitt av bakgrunn. Disse anbefales vanligvis å være høye (f.eks. 1024 skanninger og 3 medgjennomsnitt).
- Prøve – enkeltspektra
- Trykk på Engage-knappen for å gå inn i prøven. Systemet vil begynne å nærme seg prøveoverflaten, til direkte kontakt oppdages.
MERK: Settpunktet som brukes i dette arbeidet varierte mellom 0,15–2 V, og tilbakemeldingsgevinstene (I Gain og P Gain) vil vanligvis bli satt til 3 og 10. NIR2 kontaktsonder brukes ofte med nanoIR2-system (modell: PR-EX-nIR2-10, resonansfrekvens (kHz): 13 +/−4 kHz, fjærkonstant (N/m): 0,07−0,4 Nm-1). - Samle et AFM-bilde for å visualisere overflaten. I første omgang skanner du et større område (f.eks. 50 x 50 μm) med lavere romlig oppløsning (f.eks. 200 x 200 punkt) (Figur 1I).
MERK: AFM-IR-data samles alltid inn i kontaktmodus, men AFM-dataene kan samles inn i kontakt- eller tappemodus. - Velg et bestemt interesseområde fra BILDET for AFM-høyde/-avbøyning, og bilde det på nytt med høyere romlig oppløsning (Figur 1J–K). Forsikre deg om at hastigheten på datainnsamlingen er riktig, med sakte spissbevegelse (f.eks. skannehastighet 0,2–0,4 Hz).
- Velg målestedet (f.eks. enkeltbakterie) og flytt spissen til stedet.
- Juster IR-laseren. Til dette formål, bruk et bølgenummer der prøven vil absorbere. For biologiske materialer kan dette for eksempel være amide I (1655 cm-1). Kontroller at båndpassfilteret er slått av, og klikk Start IR. Den høyre grafen i nanoIR-måleren (FFT av avbøyningen vist som amplitude vs. frekvens) skal vise minst en klar topp og venstre graf (avbøyning vs. tid) bør ha en periodisk bølgeform. Hvis dette ikke er tilfelle, fortsetter du med å optimalisere IR-flekkene.
MERK: Selv om Fast Fourier Transform (FFT) og avbøyning viser forventet profil, anbefales det å utføre optimaliseringen av IR-flekker for minst flere bølgetall, der det forventes bånd. - Optimaliser aktiveringspunktene for IR-datainnsamlingen ved hjelp av de valgte bølgenummerverdiene. Det kan være nyttig å bruke et konvensjonelt IR-spekter av bakteriene (f.eks. ATR-spekter av bakteriell pellet) for å identifisere posisjonene til båndene og bruke dem til å optimalisere hot spots. Velg ulike bølgenummerverdier (f.eks. 8–10) fra ulike spektralområder.
MERK: Hvis det konvensjonelle IR-spekteret av bakterier av interesse ikke kunne samles inn før AFM-IR-datainnsamling, kan bakteriespektra tilgjengelig i litteraturen brukes som en grov veiledning. Resultatet av optimaliseringen av et IR-sted er et bilde, som presenterer et kart over FFT-størrelsessignalet på hvert x- og y-sted. Plasseringen med størst signal velges automatisk. Eksempler på slike bilder er gitt iprogramvarehåndboken 31. - Når du har optimalisering av IR-flekkene for valgte bølgenummerverdier, definerer du parametrene for spektral datainnsamling: spektralområde, spektraloppløsning, antall skanninger og brukte strøm- og inndatadata i de aktuelle vinduene i programvaren. Spektraloppløsningen bør samsvare med bakgrunnsoppløsningen, og spektralområdet bør være innenfor spektralområdet som bakgrunn ble samlet inn for.
MERK: Et generisk innledende sett med parametere kan være: spektral rekkevidde: 3200 cm-1-2800 cm-1 og 1800 cm-1–900 cm-1, spektral oppløsning: 4 cm-1 eller 8 cm-1, antall skanninger: 512–2048. - Juster om nødvendig lasereffekten avhengig av signalet. Generelt bør verdier mellom 8% -10% av laserkraften være tilstrekkelig for god signalkvalitet. Høyere verdier kan brukes med forsiktighet, da de kan føre til prøveskade.
MERK: Prosentandelen av laserkraften kan variere avhengig av type IR-laser. Prosentverdiene som er angitt her, er for OPO-laser. - Klikk på Acquire for å samle AFM-IR spektrum.
- Samle inn AFM-dataene på nytt fra samme område etter innsamling av AFM-IR-spekteret. Dette anbefales på det sterkeste, da det vil avsløre potensiell drift og / eller ødeleggende innflytelse på prøven.
- Hvis AFM-IR-spekteret er tilfredsstillende og ingen destruktiv påvirkning på prøven observeres, fortsett med datainnsamling. Definer om nødvendig en rekke punkter for datainnsamling ved hjelp av array-alternativet og samlet inn AFM-høyde eller avbøyningsbilde. Dette alternativet gjør det mulig å samle spektra fortløpende fra hvert punkt med de samme spektrale parametrene som definert for et enkelt spektrum.
- Hvis AFM-bildet som samles inn etter innsamling av AFM-IR-spekteret, avslører destruktiv påvirkning på prøven (vanligvis et brent sted), reduser kraften; Velg et annet sted, og gjenta trinn 4.3.8–4.3.11.
- Hvis signalet i AFM-IR-spekteret ikke er tilfredsstillende, må du kontrollere at IR-flekkene er riktig optimalisering (trinn 4.3.6). Hvis den er riktig, øker du lasereffekten litt og gjentar trinn 4.3.7–4.3.11. Dette kan gjentas til tilfredsstillende signal oppnås.
- Trykk på Engage-knappen for å gå inn i prøven. Systemet vil begynne å nærme seg prøveoverflaten, til direkte kontakt oppdages.
- Eksempel – bildemetode
MERK: Det anbefales på det sterkeste å registrere et enkelt AFM-IR-spektrum av bakterien før du samler et intensitetsfordelingsbilde for en valgt bølgenummerverdi.- Ta opp et AFM-bilde av det valgte prøveområdet. For å gjøre dette må du først samle inn AFM-bilde av et større område med lavere romlig oppløsning (f.eks. 50 x 50 μm, 200 x 200 punkt), velg deretter et interesseområde og samle inn et AFM-bilde med økt romlig oppløsning (som illustrert i figur 1I–K).
- Velg bølgenummerverdiene for AFM-IR-avbildning.
- Kontroller at IR-punktet på laseren er optimalisert for de valgte bølgenummerverdiene (trinn 4.3.6). Hvis IR-punktet ikke er optimalisert for enkelte bølgetall (ingen maksimumsklare), optimaliserer du det for dem.
- Definer parametrene for bildeområdet: bredde og høyde, antall datapunkt i X- og Y-retning.
MERK: Hvis det påfølgende utvalget av flekker fra de forrige AFM-bildene påføres (som vist i figur 1I–K), fylles bredde- og høydefeltene automatisk opp når området merkes. - Definer parametrene for spektralsignalanskaffelse: bølgelengden, antall skanninger og laserkraft.
MERK: Antallet skanninger må holdes innenfor grunnen. 64 eller 32 skanninger vil vanligvis tillate tilstrekkelig mengde signal. - Definer parameterne for AFM-spissbevegelse ved å klikke på skannehastigheten. Jo høyere antall skanninger i forrige trinn og antall datapunkter i X-retning, jo langsommere må spissbevegelsene være. Mangel på justering mellom disse parametrene vil resultere i for rask bevegelse av spissen, og forhindrer faktisk anskaffelse av definert antall skanninger fra hvert punkt.
MERK: For en passende samling av IR-signal med 64 tillegg og 200 poeng, sett for eksempel skannehastigheten som 0,07 kHz. - Kontroller at det er merket av for Aktiver IR-bildebehandling .
- Begynn å forestille deg. AFM-IR for signalintensiteten ved det valgte bølgetallet samles inn samtidig med AFM-dataene fra dette området.
MERK: Når OPO-laseren brukes, er det mulig å samle samtidig kontakt resonans peak frequency image. Dette kan brukes til å innhente informasjon om den relative stivheten til prøven på forskjellige steder. - Bruk vinduet Opptakssekvens til å angi en etterfølgende samling afm-IR-data fra samme område med de samme parameterne, men for forskjellige bølgenummerverdier. Dette gjør du ved å åpne Capture Sequence-vinduet, skrive inn hvert bølgenummer og definere den brukte lasereffekten (for hvert bølgenummer).
- Eksporter de innsamlede dataene (AFM og AFM-IR, enkeltspektra og bildebehandling) til ulike formater og analyser dem ved hjelp av metoder som er tilstrekkelige for spesifikke forskningsmål.
Representative Results
Den beskrevne protokollen gjør det mulig å oppnå en rekke typer cellefordelinger av bakterier på substratet, avhengig av den første konsentrasjonen av prøve og mengden vann som tilsettes. Figur 1 illustrerer eksemplene på AFM-bilder (høyde og avbøyning) som er tatt opp fra monolayers og encellede prøver utarbeidet ved hjelp av den beskrevne protokollen fra Gram-positive (S. aureus) og Gram-negative (Escherichia coli) bakterier.
Protokollen som er beskrevet her, kan brukes til AFM-IR-avbildning av intra- og ekstra cellulære strukturer av enkeltbakterier. Et eksempel på dette programmet er vist i figur 2, som viser resultatene av overvåking av de romlig lokaliserte kjemiske endringene som oppstår under oppdeling av en S. aureuscelle. Selv om lufttørking ofte betraktes som en fikseringstilnærming for bakteriell forberedelse, viser bakterier av natur svært høy motstand mot eksterne faktorer som temperatur og ble rapportert å overleve dehydrering32. Resultatene som presenteres her ble hentet fra en lufttørket prøve. Dannelsen av et septum, som fant sted før celledeling, ble observert og overvåket via AFM-avbildning (figur 2A–D) ved innsamling av 12 bilder av samme område etter hverandre (samling av et enkelt bilde ≈ 20 min). Figur 2A–D viser 4 valgte AFM-bilder, med tid mellom samling av hvert bilde på ca. 40 minutter. Den dannede strukturen (septum) er 45 nm høy. Det dannede septumet er tydelig synlig i AFM-høyde- og avbøyningsbilder (Figur 2E–F). AFM-IR-spektraet som ble registrert fra celle- og septumområdet (Figur 2G, opprinnelsespunkter merket i figur 2F) ble normalisert til midt i I-båndet før sammenligning, for å minimalisere påvirkningen av varierende utvalgstykkelse mellom punktene i datainnsamlingen. AFM-IR-spekteret av septumet er preget av høyere relativ intensitet av bånd ved 1240 og 1090 cm-1 sammenlignet med AFM-IR-spekter samlet fra celleområde. Disse tilskrives karbohydrat- og fosfodiestergrupper av celleveggkomponenter (inkludert f.eks. peptidoglykan og teichoinsyre)22.
Den beskrevne protokollen kan også brukes til sammenligning av en enkelt spektra mellom en rekke forskjellige prøver. Et eksempel på dette programmet sammen med resultatene vises i figur 3 og figur 4. Målet med studien er å bestemme de kjemiske endringene som skjer som følge av in vivo utvikling av vancomycin intermitterende motstand i S. aureus (VISA). Til dette formål ble kliniske par prøver samlet inn fra pasienter, med foreldrestammen isolert ved innleggelse på sykehuset og før antibiotikabehandling (vancomycin susceptible S. aureus, VSSA) og datterstammen isolert fra samme pasient etter innleggelse av antibiotika og klinisk svikt. Prøver ble videre dyrket på agarmedium og utarbeidet i henhold til protokollen (Figur 3A-B). AFM-IR-spektraet ble samlet inn fra flere enkeltbakterier (og flere prøver) for VSSA og VISA og deretter analysert ved hjelp av flere kjemometriske tilnærminger (figur 3C).
Det ble ikke observert morfologiske forskjeller mellom VSSA- og VISA-celler (figur 4A–C). AFM-IR-spektraet ( figur 4D,F) og deres andre derivater (figur 4E,G) viste imidlertid en klar forskjell i kjemisk sammensetning mellomresistenteog mottakelige stammer. Den relative intensiteten av båndene forbundet med karbohydrat- og fosfodiestergrupper fra celleveggkomponenter (spesielt båndet på 1088 cm-1) økte tydelig i den motstandsdyktige stammen, sammenlignet med den mottakelige motparten. Vær oppmerksom på at alt omkodet spektra (VISA: 81, VSSA: 88) viser et lite standardavvik. Dette viser god reproduserbarhet av data registrert fra ulike prøver utarbeidet fra samme stamme, da ingen diskriminering var mulig mellom spektra registrert fra ulike prøver av samme stamme. De observerte forskjellene indikerte en økt tykkelse på celleveggen i resistente stammer, sammenlignet med den mottakelige motparten, som forblir i samsvar med andre litteraturrapporter33,34.
Figur 1: Representative AFM-bilder av ulike bakterieprøver for AFM-IR-målinger. Avhengig av fortynning på substrat, tillater protokollen en å skaffe flerlags og monolayers av bakterier samt encellede prøver. Representative AFM-bilder av: (A–D) monolayer og (E–H) encellet prøve for (A,B,E,F) Gram-positive (S. aureus) og (C,D,G,H) Gram negative (E. coli) bakterier. (A,C,E,G) demonstrerer høydebilder og (B,D,F,H) viser tilsvarende avbøyningsbilder. Størrelse på bildeområder: (A-D,G,H) 20 x 20 μm, (E,F) 50 x 50 μm. (I–K) etterfølgende valg av et område for AFM-IR-tilordning. Dette oppnås ved hjelp av AFM-avbildning med økende romlig oppløsning i eksempelet på en enkelt S. aureuscelle. Hvert bilde samles inn ved å ta prøver av 200 x 200 punkt, med økende romlig oppløsning på grunn av reduksjonen i størrelsen på bildeområdet. Størrelse på bildeområder: (I) 40 x 40 μm, (J) 20 x 20 μm og (K) 2,24 x 2,24 μm. Den svarte firkanten i (I) markerer området som er avbildet i (J). Den svarte firkanten i (J) markerer området som er avbildet i (K). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Overvåke S. aureuscelledeling via AFM-IR. (A–D) AFM-bilder av S. aureuscelle som viser dannelsen av septum foregående celledeling. Størrelse på bildeområde: 2 x 2 μm. Bildene ble valgt fra en større serie (12 bilder tatt hver 20. min) og representerer data registrert hvert 40. (E-F) AFM-høyde og avbøyningsbilde registrert på slutten av celleseptumdannelse med markerte samlingspunkter av AFM-IR-spektra. Størrelsen på bildeområdet 1,17 x 1,15 μm. Høyden på den nyopprettede strukturen er 45 nm. (G) AFM-IR spektra registrert fra celleområde (svart) og septumområde (rødt) (merket i (F)), i området 1400-900 cm-1. Begge spektraene ble normalisert til amidE I-båndet og viser en økning i den relative intensiteten av celleveggkomponenter fra septumet. Denne figuren er endret fra K. Kochan et al.22. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: En oversikt over eksperimentell design for AFM-IR-studie av antimikrobiell resistens. (A) Prøveopprinnelse og første forberedelse: Mottakelig foreldrestamme ble samlet inn fra en pasient før antibiotikabehandling, og den datterresistente stammen ble hentet fra samme pasient etter antibiotikabehandling og klinisk svikt (in vivo resistensutvikling). Bakterier ble isolert og dyrket på hjerteinfusjon (HI) agar i 16 timer i 37 °C. (B) Påfølgende prøvepreparering for AFM-IR, inkludert innsamling av prøven etterfulgt av vask av bakteriell pall (3×) og prøveavsetning. (C) AFM-IR datainnsamling og analyse: AFM-høyde og AFM-IR-spektrum (1800–900 cm-1). Størrelsen på det avbildet AFM-området: 1,7 x 1,4 μm. AFM-IR-spekteret ble samlet inn fra midten av cellen. Dataene ble deretter analysert ved hjelp av kjemometriske tilnærminger, inkludert hierarkisk klyngeanalyse. Denne figuren er endret fra K. Kochan et al.19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: AFM- og AFM-IR-resultater fra studier av kjemiske endringer i vancomycin mellomliggende S. aureus (VISA) sammenlignet med vancomycin susceptible S. aureus (VSSA) i kliniske par. AFM-bilder av VISA og (C) VSSA-enkeltcelleeksempler (A–B). Størrelse på bildeområdene: (A,C) 40 x 40 μm, (B) 2,56 x 2,45 μm. (D–E) Gjennomsnittlig AFM-IR-spektra og deres (F–G) andre derivater for: (D,F) VISA og (E,G) VSSA-celler, i spektralområdet 1800–900 cm-1. Spektraet som presenteres er i gjennomsnitt 81 (VISA) og 88 (VSSA) individuelle spektra og presenteres sammen med standardavvik (SD). Gjennomsnittet ble utført etter normalisering av alle individuelle spektra sammen. De store båndene er merket i (F–G). Denne figuren er endret fra K. Kochan et al.19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bildet driver over påfølgende registrering av AFM-IR-kart ved utvalgte bølgenummerverdier for S. aureuscellen. (Øverste rad): AFM-bilder ble tatt opp samtidig med de tilsvarende (nederste raden) AFM-IR-kartene basert på intensiteten til IR-signalet ved valgte bølgenummerverdier. Bølgenummerverdiene (966, 1055, 1079, 1106, 1234, 1398, 1454, 1540, 1656, 1740 cm-1) er kommentert over den nederste raden. Hvert sett (AFM-bilde og AFM-IR-kart) ble tatt opp rett etter forrige bilde (ca. 40 minutter per sett). Størrelsen på det avbildede/tilordnede området: 1,54 x 1,57 μm. En klar drift er synlig mellom bildene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Nytten av IR-spektroskopi for karakterisering av et bredt spekter av biologiske prøver i sammenheng med deres kjemiske sammensetning er godt etablert. I løpet av det siste tiåret har IR-spektroskopi dukket opp som et lovende verktøy for bakteriestudier12,13,14,15,16,17. Det fortsetter å tiltrekke seg betydelig interesse for mikrobiologi, som en av de få teknikkene som muliggjør fenotypisk karakterisering gjennom kjemisk sammensetning. I denne sammenhengen ligger den største ulempen ved konvensjonell FTIR-mikroskopi i begrenset romlig oppløsning, og forhindrer enkeltcelle- og subcellulære studier av bakterier. Faktisk representerer den lille størrelsen på bakterier en hindring, ikke bare for IR, men for de aller fleste teknikker. Dermed er de tilgjengelige forskningsverktøyene for enkeltcelle- og subcellulære studier av bakterier betydelig begrenset. Kombinasjonen av AFM med IR gjør det mulig å overvinne den romlige oppløsningsbegrensningen av IR-spektroskopi, og gir et nytt verktøy for bakteriell forskning, som er i stand til nanoskala probing av kjemisk sammensetning.
Teknikken er ikke begrenset til enkeltcellestudier og gjør det mulig for en å sondere en rekke prøver, alt i tykkelse. Utvilsomt er ren og forsiktig prøveforberedelse avgjørende for å oppnå bilder av høy kvalitet. Protokollen heri gir en metode for å forberede flerlags-, monolags- og/eller encellede prøver av ulike bakterier (figur 1). Den forberedte prøven avhenger av flere faktorer, inkludert den første bakteriebelastningen, ettervaskfortynning samt ytterligere fortynning på substratet. Mengden prøve oppnådd etter fortynning av de vaskede pelletsene og før avsetning på substratet tillater vanligvis fremstilling av mange prøver. Derfor, for å oppnå ønsket fordeling av prøven på substratet, er det ofte gunstig å forberede en rekke prøver, alt i fortynning. For studier som tar sikte på innsamling av AFM-IR-spektra i stedet for subcellulær avbildning, kan det være gunstig å endre mengden prøve (f.eks. fra monolayer til flerlags) for å øke intensiteten av signalet.
Et annet kritisk aspekt ved prøvepreparering er riktig fjerning av middels rester. Avhengig av de valgte prøvekulturmetodene, samles prøven enten fra flytende medium eller fra en agarplate. I begge tilfeller er det sannsynlig at middels rest vil være til stede i prøven, men i mye mindre grad ved innsamling fra agarplater. Siden bakterievekstmedier inneholder en overflod av ulike biologiske komponenter, er det viktig å sikre riktig fjerning av medium. Vi anbefaler tre vasker med ultrarent vann til agarplateprøver og minst fire vasker for prøver samlet inn fra medium. Antall vasker kan økes, om nødvendig; For sammenligning mellom ulike prøver er det imidlertid viktig å holde det konsistent mellom prøver. Den demonstrerte protokollen bruker vann, i stedet for løsemidler som fosfatbufferløsning (PBS) eller saltvann. Både PBS og saltvann fører til dannelse av krystaller ved lufttørking, noe som kan skade bakteriene. I tillegg er begge en kilde til intense IR-bånd, spesielt med PBS, som inneholder flere bånd i fingeravtrykksregionen. Mangelen på evne til bruk av saltvann eller PBS, representerer for tiden en viktig begrensning for teknikken. Vanligvis forårsaker bruk av vann til vask ingen ødeleggende påvirkning på bakteriene; Forsiktighet bør imidlertid utvises, og om mulig bør eksponeringstiden for vann begrenses. Hvis prøveforberedelsesprotokollen må pauses på vaskestadiet, anbefales det å forlate prøven i pelletert form etter fjerning av vannet. Dette er spesielt viktig for Gram-negative bakterier, som inneholder en tynnere cellevegg, da de er mer utsatt for brudd.
For å sikre riktige AFM-IR-data av høy kvalitet er flere aspekter i datainnsamlingsprotokollen av avgjørende betydning. For det første er riktig innsamling av bakgrunn avgjørende for datainnsamling. Spesielt er vedlikehold av stabile fuktighetsnivåer gjennom bakgrunnsinnsamling samt mellom bakgrunn og prøveinnsamling nødvendig. For å sikre dette anbefaler vi å rense instrumentet med nitrogen og opprettholde fuktighetsnivåene ikke høyere enn 25%. Mangel på rensing kan pålegge en betydelig begrensning, spesielt på steder med høy luftfuktighet. For det andre bør viktigheten av riktig optimalisering av IR-flekker utheves. For best resultat kan en forkunnskap om posisjonen til band maxima være gunstig. For eksempel kan et konvensjonelt IR-spekter av bakteriell pellet brukes til å bestemme stillinger av bånd som forventes fra en prøve. Hvis det ikke er mulig å skaffe seg, som en alternativ tilnærming, kan brukeren bruke IR-spektra tilgjengelig i litteraturen eller begynne optimaliseringen ved hjelp av en båndposisjon som er rimelig å forvente i bakterien (f.eks. midt i I og amide II). For det tredje, for datainnsamling, er det viktig å fremheve betydningen av forsiktig kraftvalg (slik at man kan oppnå et godt S / N-forhold), da det kan ha en ødeleggende effekt. Den anbefalte effekten avhenger av tykkelsen på prøven, med grov veiledning tilgjengelig i instrumenthåndboken31. Vi anbefaler å empirisk teste tilstanden til prøven etter måling ved innsamling av et AFM-bilde, da det vil avsløre enhver ødeleggende innflytelse. Videre fungerer samlingen av AFM-bilder fra samme område før og etter innsamling av AFM-IR-spektra som en god bekreftelse på at ingen drift har skjedd, og spektraet stammer faktisk fra det valgte punktet i cellen. Muligheten for drift er spesielt viktig når du bruker bildemodaliteten, gjennom påfølgende avbildning av IR-intensitet ved utvalgte bølgenummerverdier. Et eksempel på dette er illustrert i Figur 5. Bildeområdet ble definert i begynnelsen av eksperimentet og er ment å være konsekvent for alle bølgenummerverdier. En klar drift er imidlertid synlig mellom hvert AFM-høydebilde (og det tilsvarende IR-bølgenummerintensitetsbildet), med anskaffelsestid for hvert kart på ca. 40 min. På grunn av dette, for brukere som samler inn bildedata, anbefaler vi at du alltid velger et område som er litt større enn utvalget av interesse, for å sikre at selv ved eksistens av drift, vil utvalget av interesse forbli innenfor det avbildede området.
De potensielle begrensningene i protokollen inkluderer mangelen på evne til å samle inn data i en hydrert tilstand i fysiologiske løsninger (f.eks. saltvann eller PBS) beskrevet ovenfor. Videre, spesielt i områder med høy luftfuktighet, er det ofte behov for nitrogenrensing. Videre gjør protokollen det mulig å sondere organismer ned til 100 nm i størrelse, unntatt muligheten for bruk for mindre strukturer. Selv om dette kan overvinnes ved hjelp av en annen laser (f.eks. kvantekaskadelaser som gjør det mulig å oppnå den romlige oppløsningen på 20 nm), er den også forbundet med begrenset spektral rekkevidde samt vanskeligheter med å oppnå et godt signal-til-støy-forhold. Til slutt kan probing av myke overflater utgjøre en utfordring med spissen som ikke oppdager overflaten riktig og fortsetter utover kontaktpunktet, til brudd. Selv om dette vanligvis ikke er et problem med bakterieprøver, kan det oppstå ved målinger av mykere prøver. I slike tilfeller anbefales det å forsøke å engasjere seg på ren overflate av substratet i nærheten av prøven.
Den beskrevne protokollen kan brukes til en rekke typer bakterieforskning, inkludert komparative studier mellom ulike prøver samt subcellulær undersøkelse. Dataene kan analyseres ved hjelp av kjemometriske tilnærminger for enkeltspektra og avbildningsmodaliteter35, avhengig av målet med forskningen. Videre kan protokollen også endres for påføring til annet biologisk materiale (som sopp, gjær, celler, etc.), gjennom tilsetning av fiksering.
Disclosures
Vi vil gjerne anerkjenne Bruker for betaling av publiseringsgebyr. KK, BRW, AP og PH er oppfinnere på et internasjonalt patent (PCTIB2020/052339), som beskriver noen av de grunnleggende aspektene ved tilnærmingen.
Acknowledgments
Vi vil gjerne anerkjenne Bruker for deres støtte. Dette arbeidet ble støttet av Monash University Advancing Women's Success Grant (K. Kochan). A.Y.P anerkjenner støtte fra australian National Health and Medical Research Council Practitioner Fellowship (APP1117940). Dette arbeidet ble finansiert av australian Research Council Discovery Project DP180103484. Vi vil takke Mr. Finlay Shanks for hans instrumentale støtte og Ms. Xenia Kostoulias for hennes tekniske hjelp med prøvene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM metal specimen disc | PST ProSciTech Pty Ltd | GA530-15 | Recommended 15 mm |
| Anasys AFM-IR nanoIR2 | Anaysys Instruments | model: nanoIR2 | |
| Contact mode NIR2 Probes for nanoIR 2 | Bruker / Anasys Instruments | - | Model: Model: PR-EX-NIR2 |
| Heraeus Pico 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | - | - |
| Matlab | Mathworks Inc | - | Multivariate data analysis software |
| Micro-centrifuge tubes, 1.5 mL | Heathrow Scientific | HEA4323 | Can be replaced with any other micro-centrifuge tube |
| NanoIR 2 instrument | Bruker / Anasys Instruments | - | - |
| PLS toolbox | Mathworks Inc | - | GUI for Matlab |
| Selected bacterial medium (e.g. HBA Columbia Plates) | Thermo Fisher | PP2001 | Provided type of medium is an example and can be replaced by others, depending on the type of experiment |
| Selected bacterial strain | - | - | The source depends on the aim of research (patient isolates, ATCC strains, etc.) |
| Substrate (e.g. Raman grade CaF2) | Crystran | CAFP13-2R | Recommended size: 13 mm Ø x 2.0 mm |
| Tip pipette 1000 µl | Axygen | T-1000-B | - |
| Tip pipette 200 µl | Axygen | T-200-C | - |
| Tip pipette 0.5-10 µl | Axygen | T-300-R | - |
| Ultrapure water | - | - | - |
References
- Sears, C. L. A dynamic partnership: celebrating our gut flora. Anaerobe. 11 (5), 247-251 (2005).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), London, England. 200-211 (2020).
- Seymour, C. W., et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. The New England Journal of Medicine. 376 (23), 2235-2244 (2017).
- Weiss, S. L., et al. Delayed antimicrobial therapy increases mortality and organ dysfunction duration in pediatric sepsis. Critical Care Medicine. 42 (11), 2409-2417 (2014).
- Peker, N., Couto, N., Sinha, B., Rossen, J. W. Diagnosis of bloodstream infections from positive blood cultures and directly from blood samples: recent developments in molecular approaches. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 24 (9), 944-955 (2018).
- Aminov, R. I. The role of antibiotics and antibiotic resistance in nature. Environmental Microbiology. 11 (12), 2970-2988 (2009).
- Levy, S. B., Marshall, B. Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses. Nature Medicine. 10 (12), Suppl 122-129 (2004).
- Roca, I., et al. The global threat of antimicrobial resistance: science for intervention. New Microbes and New Infections. 6, 22-29 (2015).
- O'Neill, J. The review on antimicrobial resistance. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. Wellcome Trust. , (2016).
- Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what's new. Current Opinion in Microbiology. 21, 45-50 (2014).
- Piddock, L. J. Assess drug-resistance phenotypes, not just genotypes. Nature Microbiology. 1 (8), 16120 (2016).
- Naumann, D., Helm, D., Labischinski, H. Microbiological characterizations by FT-IR spectroscopy. Nature. 351 (6321), 81-82 (1991).
- Zarnowiec, P., Lechowicz, L., Czerwonka, G., Kaca, W. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) as a tool for the identification and differentiation of pathogenic bacteria. Current Medicinal Chemistry. 22 (14), 1710-1718 (2015).
- Quintelas, C., Ferreira, E. C., Lopes, J. A., Sousa, C. An overview of the evolution of infrared spectroscopy applied to bacterial typing. Biotechnology Journal. 13 (1), 1700449 (2018).
- San-Blas, E., Cubillán, N., Guerra, M., Portillo, E., Esteves, I. Characterization of xenorhabdus and photorhabdus bacteria by Fourier transform mid-infrared spectroscopy with attenuated total reflection (FT-IR/ATR). Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 93, 58-62 (2012).
- Sousa, C., et al. Discrimination of the acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii complex species by Fourier transform infrared spectroscopy. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 33 (8), 1345-1353 (2014).
- Rodriguez-Saona, L. E., Khambaty, F. M., Fry, F. S., Calvey, E. M. Rapid detection and identification of bacterial strains by Fourier transform near-infrared spectroscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 49 (2), 574-579 (2001).
- Dawson, S. E., et al. Implementation of Fourier transform infrared spectroscopy for the rapid typing of uropathogenic Escherichia coli. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 33 (6), 983-988 (2014).
- Kochan, K., et al. Detection of Antimicrobial Resistance-Related Changes in Biochemical Composition of Staphylococcus aureus by Means of Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15397-15403 (2019).
- Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and Applications in Nanoscale Infrared Spectroscopy and Chemical Imaging. Chemical Reviews. 117 (7), 5146-5173 (2017).
- Dazzi, A., et al. AFM-IR: combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66 (12), 1365-1384 (2012).
- Kochan, K., et al. et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria. Journal of the Royal Society, Interface. 15 (140), (2018).
- Katzenmeyer, A. M., et al. Mid-infrared spectroscopy beyond the diffraction limit via direct measurement of the photothermal effect. Nanoscale. 7 (42), 17637-17641 (2015).
- Bruker Life Science Applications. , Available from: https://www.bruker.com/products/surface-and-dimensional-analysis/nanoscale-infrared-spectrometers/nanoscale-ir-spectroscopy-applications/life-sciences.html (2020).
- Mayet, C., Dazzi, A., Prazeres, R., Ortega, J. M., Jaillard, D. In situ identification and imaging of bacterial polymer nanogranules by infrared nanospectroscopy. Analyst. 135 (10), 2540-2545 (2010).
- Baldassarre, L., et al. Mapping the amide I absorption in single bacteria and mammalian cells with resonant infrared nanospectroscopy. Nanotechnology. 27 (7), 075101 (2016).
- Vitry, P., et al. Combining infrared and mode synthesizing atomic force microscopy: Application to the study of lipid vesicles inside Streptomyces bacteria. Nano Research. 9 (6), 1674-1681 (2016).
- Dazzi, A., et al. Chemical mapping of the distribution of viruses into infected bacteria with a photothermal method. Ultramicroscopy. 108 (7), 635-641 (2008).
- Steenbergen, J. N., Alder, J., Thorne, G. M., Tally, F. P. Daptomycin: a lipopeptide antibiotic for the treatment of serious Gram-positive infections. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 283-288 (2005).
- Garcia, L. S. MacFarlan Standards. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 3rd Edition. , American Society of Microbiology. (2010).
- NanolR-2 System Manual. Anasys Instruments. , Available from: https://www.anasysinstruments.com/downloadpr/nanoIR2_s_System_Manual.pdf (2020).
- Whelan, D. R., et al. Detection of an en masse and reversible B- to A-DNA conformational transition in prokaryotes in response to desiccation. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (97), 20140454 (2014).
- McGuinness, W. A., Malachowa, N., DeLeo, F. R. Vancomycin Resistance in Staphylococcus aureus. The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (2), 269-281 (2017).
- Howden, B. P., Peleg, A. Y., Stinear, T. P. The evolution of vancomycin intermediate Staphylococcus aureus (VISA) and heterogenous-VISA. Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 21, 575-582 (2014).
- Perez-Guaita, D., et al. Multispectral Atomic Force Microscopy-Infrared Nano-Imaging of Malaria Infected Red Blood Cells. Analytical Chemistry. 90 (5), 3140-3148 (2018).
