Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

MS2-Affinitätsreinigung gekoppelt mit RNA-Sequenzierung in grampositiven Bakterien

Published: February 23, 2021 doi: 10.3791/61731
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 1
1Université de Strasbourg, CNRS, 2Department of Biochemistry, Université de Sherbrooke

Summary

Die MAPS-Technologie wurde entwickelt, um das Targetom einer bestimmten regulatorischen RNA in vivo zu untersuchen. Die sRNA von Interesse ist mit einem MS2-Aptamer gekennzeichnet, das die Co-Reinigung ihrer RNA-Partner und deren Identifizierung durch RNA-Sequenzierung ermöglicht. Dieses modifizierte Protokoll eignet sich besonders für grampositive Bakterien.

Abstract

Obwohl kleine regulatorische RNAs (sRNAs) im bakteriellen Bereich des Lebens weit verbreitet sind, sind die Funktionen vieler von ihnen nach wie vor schlecht charakterisiert, insbesondere aufgrund der Schwierigkeit, ihre mRNA-Ziele zu identifizieren. Hier beschrieben wir ein modifiziertes Protokoll der MS2-Affinity Purification in Verbindung mit RNA Sequencing (MAPS) Technologie, mit dem Ziel, alle RNA-Partner einer spezifischen sRNA in vivo aufzudecken. Im Großen und Ganzen ist das MS2-Aptamer mit der 5'-Extremität der interessierenden sRNA verschmolzen. Dieses Konstrukt wird dann in vivo exprimiert, so dass die MS2-sRNA mit ihren zellulären Partnern interagieren kann. Nach der Bakterienernte werden die Zellen mechanisch lysiert. Der Rohextrakt wird in eine Amylose-basierte Chromatographiesäule geladen, die zuvor mit dem MS2-Protein beschichtet ist, das mit dem Maltose-bindenden Protein verschmolzen ist. Dies ermöglicht die spezifische Erfassung von MS2-sRNA und interagierenden RNAs. Nach der Elution werden co-gereinigte RNAs durch Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung und anschließende bioinformatische Analyse identifiziert. Das folgende Protokoll wurde im grampositiven Humanpathogen Staphylococcus aureus implementiert und ist prinzipiell auf alle grampositiven Bakterien übertragbar. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die MAPS-Technologie eine effiziente Methode darstellt, um das regulatorische Netzwerk einer bestimmten sRNA gründlich zu erforschen und eine Momentaufnahme ihres gesamten Targetoms zu bieten. Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass die von MAPS identifizierten mutmaßlichen Ziele noch durch komplementäre experimentelle Ansätze validiert werden müssen.

Introduction

Hunderte, vielleicht sogar Tausende von kleinen regulatorischen RNAs (sRNAs) wurden in den meisten bakteriellen Genomen identifiziert, aber die Funktionen der überwiegenden Mehrheit von ihnen bleiben uncharakterisiert. Insgesamt sind sRNAs kurze nicht-kodierende Moleküle, die eine wichtige Rolle in der bakteriellen Physiologie und Anpassung an schwankende Umgebungen spielen1,2,3. Tatsächlich stehen diese Makromoleküle im Zentrum zahlreicher komplizierter regulatorischer Netzwerke, die Stoffwechselwege, Stressreaktionen, aber auch Virulenz und Antibiotikaresistenz beeinflussen. Logischerweise wird ihre Synthese durch spezifische Umweltreize (z.B. Nährstoffmangel, oxidativer oder Membranstress) ausgelöst. Die meisten sRNAs regulieren mehrere Ziel-mRNAs auf posttranskriptioneller Ebene durch kurze und nicht zusammenhängende Basenpaarung. Sie verhindern in der Regel die Translationsinitiierung, indem sie mit Ribosomen um Translationsinitiierungsbereiche konkurrieren4. Die Bildung von sRNA:mRNA-Duplexen führt häufig auch zum aktiven Abbau der Ziel-mRNA durch Rekrutierung spezifischer RNasen.

Die Charakterisierung eines sRNA-Targetoms (d.h. des gesamten Satzes seiner Ziel-RNAs) ermöglicht die Identifizierung der Stoffwechselwege, in die es eingreift, und des potenziellen Signals, auf das es antwortet. Folglich können die Funktionen einer spezifischen sRNA im Allgemeinen aus ihrem Targetom abgeleitet werden. Zu diesem Zweck wurden mehrere in silico Vorhersagewerkzeuge wie IntaRNA und CopraRNA5,6,7entwickelt. Sie stützen sich insbesondere auf Sequenz-Komplementarität, Paarungsenergie und Zugänglichkeit der potenziellen Interaktionsstelle, um mutmaßliche sRNA-Partner zu bestimmen. Vorhersagealgorithmen integrieren jedoch nicht alle Faktoren, die die Basenpaarung in vivo beeinflussen, wie die Beteiligung von RNA-Chaperonen8, die suboptimale Interaktionen begünstigen, oder die Co-Expression beider Partner. Aufgrund ihrer inhärenten Einschränkungen bleibt die Falsch-Positiv-Rate von Vorhersagewerkzeugen hoch. Die meisten experimentellen groß angelegten Ansätze basieren auf der Co-Aufreinigung von sRNA:mRNA-Paaren, die mit einem markierten RNA-bindenden Protein (RBP)interagieren 6,9. Zum Beispiel identifizierte die RIL-seq-Methode (RNA Interaction by Ligation and Sequencing) RNA-Duplexe, die mit RNA-Chaperonen wie Hfq und ProQ in Escherichia coli10,11co-gereinigt wurden. Eine ähnliche Technologie namens UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) wurde auf RNase E- und Hfq-assoziierte sRNAs in E. coli12,13angewendet. Trotz der gut beschriebenen Rolle von Hfq und ProQ bei der sRNA-vermittelten Regulation inmehrerenBakterien8,14,15scheint die sRNA-basierte Regulation in mehreren Organismen wie S. aureus16 , 17,18RNA-Chaperon-unabhängig zu sein . Auch wenn die Aufreinigung von RNA-Duplexen in Verbindung mit RNasen machbar ist, wie Waters und Mitarbeiter13gezeigt haben, bleibt dies schwierig, da RNasen ihren schnellen Abbau auslösen. Daher stellt der MS2-Affinity Purification gekoppelt mit RNA Sequencing (MAPS) Ansatz19,20 eine solide Alternative in solchen Organismen dar.

Im Gegensatz zu den oben genannten Methoden verwendet MAPS eine spezifische sRNA als Köder, um alle interagierenden RNAs zu erfassen, und ist daher nicht auf die Beteiligung eines RBP angewiesen. Der gesamte Prozess ist in Abbildung 1dargestellt. Kurz gesagt, die sRNA wird an der 5' mit dem MS2-RNA-Aptamer markiert, das spezifisch vom MS2-Mantelprotein erkannt wird. Dieses Protein wird mit dem Maltose-bindenden Protein (MBP) verschmolzen, um auf einem Amyloseharz immobilisiert zu werden. Daher bleiben MS2-sRNA und ihre RNA-Partner auf der Affinitätschromatographiesäule erhalten. Nach der Elution mit Maltose werden co-gereinigte RNAs mittels Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung identifiziert, gefolgt von einer bioinformatischen Analyse (Abbildung 2). Die MAPS-Technologie zeichnet letztendlich eine interagierende Karte aller potenziellen Wechselwirkungen, die in vivo auftreten.

Die MAPS-Technologie wurde ursprünglich im nicht-pathogenen gramnegativen Bakterium E. coli21 implementiert. Bemerkenswerterweise half MAPS dabei, ein tRNA-abgeleitetes Fragment zu identifizieren, das spezifisch mit RyhB- und RybB-sRNAs interagiert und jegliches sRNA-Transkriptionsrauschen verhindert, um mRNA-Ziele unter nicht induzierenden Bedingungen zu regulieren. Danach wurde MAPS erfolgreich auf andere E. coli sRNAs wie DsrA22, RprA23, CyaR23 und GcvB24 angewendet (Tabelle 1). Neben der Bestätigung bisher bekannter Ziele erweiterte MAPS das Targetom dieser bekannten sRNAs. Vor kurzem wurde MAPS in Salmonella Typhimurium durchgeführt und zeigte, dass SraL sRNA an Rho mRNA bindet und für einen Transkriptionsabschlussfaktor25kodiert. Durch diese Paarung schützt SraL rho mRNA vor dem vorzeitigen Transkriptionsabschluss, der durch Rho selbst ausgelöst wird. Interessanterweise ist diese Technologie nicht auf sRNAs beschränkt und kann auf jede Art von zellulären RNAs angewendet werden, wie durch die Verwendung eines tRNA-abgeleiteten Fragments26 und einer 5'-unübersetzten Region von mRNA22 veranschaulicht wird (Tabelle 1).

Die MAPS-Methode wurde auch an das pathogene grampositive Bakterium S. aureus19angepasst. Insbesondere wurde das Lyseprotokoll umfassend modifiziert, um Zellen aufgrund einer dickeren Zellwand als gramnegative Bakterien effizient zu brechen und die RNA-Integrität aufrechtzuerhalten. Dieses angepasste Protokoll entwirrte bereits das Interaktom von RsaA27, RsaI28 und RsaC29. Dieser Ansatz gab Einblicke in die entscheidende Rolle dieser sRNAs bei den Regulationsmechanismen der Zelloberflächeneigenschaften, der Glukoseaufnahme und der oxidativen Stressreaktionen.

Das Protokoll, das 2015 in E. coli entwickelt und implementiert wurde, wurde kürzlich sehr detailliert beschrieben30. Hier stellen wir das modifizierte MAPS-Protokoll zur Verfügung, das sich besonders für die Untersuchung von sRNA-regulatorischen Netzwerken in grampositiven (dickeren Zellwand) Bakterien eignet, ob nicht pathogen oder pathogen (Sicherheitsvorkehrungen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Puffer und Medien

  1. Bereiten Sie für MAPS-Experimente die folgenden Puffer und Medien vor:
    - Puffer A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 und 1 mM DTT)
    - Puffer E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM Maltose, 0,1% Triton, 1 mM MgCl2 und 1 mM DTT)
    - RNA-Ladepuffer (0,025% Xylol cyanol und 0,025% Bromphenolblau in 8 M Harnstoff)
    - Brain Heart Infusion (BHI) Medium (12,5 g Kälbergehirn, 10 g Pepton, 5 g Rinderherz, 5 g NaCl, 2,5 gNa2HPO4 und 2 g Glukose für 1 L)
    - Lysogeniebrühe (LB) Medium (10 g Pepton, 5 g Hefeextrakt und 10 g NaCl für 1 L)
  2. Bereiten Sie für Northern Blot Assays die folgenden Puffer vor:
    - Blockierungslösung (1x Maleinsäure und 1% blockierendes Reagenz)
    - Hybridisierungslösung (50% Formamid, 5x SSC, 7% SDS, 1% blockierende Lösung und 0,2% N-Laurylsarcosin, 50 mM Natriumphosphat). Erhitzen mit Rühren, um sich aufzulösen.
    ACHTUNG: Befolgen Sie sorgfältig die Sicherheitsvorkehrungen für jedes Produkt.
    - 1 M Natriumphosphat (58 mM Natriumphosphat-Dibasis und 42 mM Natriumphosphat-Monobasis)
    - Kochsalzlösung, Natriumcitrat (SSC)-Puffer, 20x Konzentrat (3 M NaCl und 300 mM Trinatriumcitrat)

2. Sicherheitsfragen

  1. Führen Sie alle Schritte mit lebensfähigen pathogenen Bakterien in einem Level-2-Containment-Labor durch.
    HINWEIS: Nur Zellextrakte können nach der Lyse nach draußen genommen werden (Schritt 5).
  2. Legen Sie einen Laborkittel und Handschuhe an.
  3. Stellen Sie sicher, dass die Handgelenke bedeckt sind.
  4. Reinigen Sie die biologische Sicherheitswerkbank (Klasse II) mit einer Desinfektionslösung.
  5. Entsorgen Sie feste Abfälle, die Bakterien ausgesetzt sind, in der entsprechenden biomedizinischen Tonne.
  6. Kolben, die kontaminierte Flüssigkeiten enthalten, mit einer Desinfektionslösung behandeln. Dann entsorgen Sie es in einer Spüle.
  7. Hände und Handgelenke vorsichtig mit Seife waschen und den Laborkittel entfernen, bevor Sie das Containment-Labor der Stufe 2 verlassen.

3. Plasmidkonstruktion

HINWEIS: Für Klonzwecke ist es wichtig, zuerst die Grenzen der endogenen sRNA zu identifizieren. Die Plasmide pCN51-P3 und pCN51-P3-MS2 sind in Tomasini et al. (2017)27beschrieben. Der P3-Promotor ermöglicht eine hohe Expression der sRNA in zelldichteabhängiger Weise (d.h. wenn Bakterien in die stationäre Wachstumsphase eintreten). Viele Staphylokokken-sRNAs reichern sich während dieser Wachstumsphase an.

  1. Amplifizieren Sie die sRNA-Sequenz mittels PCR mit einer High-Fidelity-DNA-Polymerase und einer PCR-Maschine. Befolgen Sie sorgfältig die Anweisungen des Herstellers und lesen Sie Garibyan und Avashia (2013)31 für weitere Details.
  2. Verwenden Sie die folgenden Vorlagen, um die spezifischen Primer zu entwerfen:
    Equation 1
    und 5'-CGCGGATCC(N)-3' für Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimer.
    HINWEIS: Diese Oligonukleotide ermöglichen es, die MS2-Sequenz (fett gedruckt) mit dem 5'-Ende der interessierenden sRNA zu verschmelzen. Pst I- und BamHI-Restriktionsstellen (unterstrichen) werden an den 5'- und 3'-Extremitäten des MS2-sRNA-Konstrukts hinzugefügt, um das Amplicon in das pCN51-P3-Plasmid27zu klonen. (N) entspricht der genspezifischen Sequenz (15-20 Nukleotide).
  3. Verdauen Sie 1 μg pCN51-P3-Plasmid und 1 μg des MS2-sRNA-PCR-Produkts mit 2 HE PstI und 1 HE BamHI im entsprechenden Puffer gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
  4. 1 h bei 37 °C inkubieren und DNA mit einem PCR-Reinigungskit reinigen (siehe Materialtabelle).
  5. Mischen Sie das verdaute pCN51-P3-Plasmid (300 ng) und das MS2-sRNA-Amplicon (molares Verhältnis für Vektor:Insert = 1:3) in einem 1,5-ml-Röhrchen. Siehe Revie et al. (1988)32 zur Maximierung der Ligationseffizienz. Fügen Sie 1 μL des Ligase Buffer und 10 U T4 Ligase in jedem Rohr hinzu. Stellen Sie die Lautstärke mit Reinstwasser auf 10 μL ein.
  6. Bei 22 °C mindestens 2 h inkubieren.
  7. 5 μL Ligationsmischung zu 50 μL gefrorenem DH5α chemisch kompetenten E. coli-Zellen hinzufügen. Lesen Sie Seidman et al. (2001)33, um mehr über Plasmidtransformation und chemisch kompetente Zellen zu erfahren.
  8. Inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis.
  9. Hitzeschock (45 s bei 42 °C) das Umwandlungsrohr mit einem Wärmeblock oder Wasserbad.
  10. 900 μL LB-Medium fügen und bei 37 °C 30 min inkubieren.
  11. Platte 100 μL der Bakteriensuspension auf einer lb-Agarplatte ergänzt mit Ampicillin (100 μg/μL).
    HINWEIS: Der pCN51-P3-Vektor kodiert für ein Ampicillin-Resistenzgen, das es ermöglicht, nur E. coli-Klone auszuwählen, die das pCN51-P3-MS2-sRNA-Plasmid tragen.
  12. Extrahieren Sie das pCN51-P3-MS2-sRNA-Plasmid aus einer bakterienartigen Kultur über Nacht (5 ml), die in Gegenwart von Ampicillin (100 μg/ μL) unter Verwendung eines Plasmid-DNA-Miniprep-Kits gezüchtet wurde (siehe Materialtabelle).
  13. Überprüfen Sie das Konstrukt durch Sanger-Sequenzierung34 mit dem folgenden Primer, 5'-TCTCGAAAATAATAGAGGG-3'.
  14. Wandeln Sie das pCN51-P3-MS2-sRNA-Plasmid in CHEMISCH kompetente DC10B E. coli-Zellen um. Wiederholen Sie die Schritte 3.7 bis 3.11.
  15. Extrahieren Sie das pCN51-P3-MS2-sRNA-Plasmid (siehe Schritt 3.12) und wandeln Sie 1-5 μg Plasmid-DNA mit einem Elektroporationsapparat in HG001 ΔsRNA-elektrokompetente S. aureus-Zellen um. Befolgen Sie sorgfältig die Anweisungen des Herstellers. Lesen Sie Grosser und Richardson (2016)35, um mehr über Methoden zur Herstellung von elektrokompetenten S. aureuszuerfahren.
    ACHTUNG: Dieser Schritt beinhaltet den Umgang mit pathogenen Bakterien (siehe Schritt 2).
  16. 900 μL BHI-Medium fünden und bei 37 °C für 3 h inkubieren.
  17. Zentrifuge 1 min bei 16.000 x g. Verwerfen Sie den Überstand.
  18. Das Pellet in 100 μL BHI resuspendieren und die Bakteriensuspension auf BHI-Agarplatten mit Erythromycin (10 μg/μL) plattieren.
    HINWEIS: Der pCN51-P3-Vektor kodiert auch für ein Erythromycin-Resistenzgen, das es ermöglicht, nur S. aureus-Klone auszuwählen, die das pCN51-P3-MS2-sRNA-Plasmid tragen.

4. Bakterienernte

ACHTUNG: Dieser Schritt beinhaltet den Umgang mit pathogenen Bakterien (siehe Schritt 2).

  1. Züchten Sie eine Kolonie von Stämmen, die entweder pCN51-P3-MS2-sRNA oder pCN51-P3-MS227 Plasmide in 3 ml BHI-Medium tragen, ergänzt mit Erythromycin (10 μg / μL) in Duplikaten.
  2. Verdünnen Sie jede Nachtkultur in 50 ml (≈1/100) frischem BHI-Medium, ergänzt mit Erythromycin (10 μg/μL), um einen OD600nm von 0,05 zu erreichen. Verwenden Sie 250 ml sterilisierte Kolben (5:1 Kolben-zu-Medium-Verhältnis).
    HINWEIS: Mediums- und Wachstumsbedingungen sollten entsprechend dem Expressionsmuster der untersuchten sRNA eingestellt werden.
  3. Kulturen bei 37 °C mit Schütteln bei 180 U/min für 6 h anbauen.
  4. Jede Kultur wird in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überführen.
  5. Zentrifuge bei 2.900 x g während 15 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand.
  6. Bewahren Sie Pellets auf Eis auf und führen Sie direkt eine mechanische Zelllyse durch (Schritt 5) oder frieren und lagern Sie Pellets bei -80 °C.

5. Mechanische Zelllyse

ACHTUNG: Folgende Schritte müssen auf Eis durchgeführt werden und puffer müssen bei 4 °C sein. Verwenden Sie Handschuhe und treffen Sie alle Vorsichtsmaßnahmen, um Proben vor RNases zu schützen.

  1. Pellets (Schritt 4.6) in 5 ml Puffer A wiederverwenden.
  2. Die resuspendierten Zellen in 15 mL Zentrifugenröhrchen mit 3,5 g Kieselsäureperlen (0,1 mm) überführen.
  3. Einsetzen von Rohren in ein mechanisches Zelllysegerät (siehe Materialtabelle). Führen Sie einen Zyklus von 40 s bei 4,0 m/s durch.
    HINWEIS: Wenn ein Zyklus nicht ausreicht, um Zellen zu brechen, lassen Sie das Gerät 5 Minuten abkühlen, während Sie die Proben auf Eis halten. Wiederholen Sie dann einen weiteren Zyklus von 40 s bei 4,0 m/s. Die Effizienz der Zelllyse kann durch Beschichtung des Überstands auf BHI-Agarplatte getestet werden.
  4. Zentrifuge bei 15.700 x g für 15 min. Stellen Sie den Überstand wieder her und halten Sie ihn auf Eis.

6. Säulenvorbereitung

ACHTUNG: Achten Sie darauf, das Amyloseharz nicht trocknen zu lassen. Versiegeln Sie die Säule bei Bedarf mit einer Endkappe. Bereiten Sie alle Lösungen vor, bevor Sie mit der Affinitätsreinigung beginnen.

  1. Legen Sie eine Chromatographiesäule in ein Säulengestell (siehe Materialtabelle).
  2. Entfernen Sie die Säulenspitze und waschen Sie die Säule mit Reinstwasser.
  3. Fügen Sie 300 μL Amyloseharz hinzu.
  4. Waschen Sie die Säule mit 10 ml Puffer A.
  5. 1.200 pmol MBP-MS2-Protein in 6 ml Puffer A verdünnen und in die Säule laden.
  6. Waschen Sie die Säule mit 10 ml Puffer A.

7. MS2-Affinitätsreinigung (Abbildung1)

  1. Laden Sie das Zelllysat in die Spalte.
    HINWEIS: Halten Sie 1 ml des Zelllysats (Rohextrakt, CE) bereit, um die Gesamt-RNA (Schritt 8) zu extrahieren und eine Northern Blot ( Schritt 9) und transkriptomische (Schritt 10) Analyse durchzuführen.
  2. Sammeln Sie die Durchflussfraktion (FT) in einem sauberen Sammelrohr.
  3. Waschen Sie die Säule 3 mal mit 10 ml Puffer A. Sammeln Sie die Waschfraktion (W).
  4. Eluieren Sie die Säule mit 1 ml Puffer E und sammeln Sie die Elutionsfraktion (E) in einem 2 mL Mikroröhrchen.
  5. Halten Sie alle gesammelten Fraktionen bis zur RNA-Extraktion (Schritt 8) auf Eis oder frieren Sie sie bei -20 °C für die spätere Verwendung ein.

8. RNA-Extraktion von gesammelten Fraktionen (CE, FT, W und E)

  1. Verwenden Sie 1 ml jeder Fraktion (einschließlich FT und W) für die RNA-Extraktion.
  2. Fügen Sie 1 Volumen Phenol hinzu. Kräftig mischen.
    ACHTUNG: Phenol ist flüchtig und korrosiv, achten Sie darauf und arbeiten Sie sicher unter einem Abzug.
  3. Zentrifuge bei 16.000 x g für 10 min bei 20 °C.
  4. Übertragen Sie die obere Phase in ein sauberes 2 ml Mikroröhrchen.
  5. Fügen Sie 1 Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) hinzu und wiederholen Sie die Schritte 8.3 bis 8.4.
    ACHTUNG: Arbeiten Sie sicher unter einem Abzug.
  6. Fügen Sie 2,5 Volumen kaltes Ethanol 100% und 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (NaOAc) pH 5,2 hinzu.
  7. Über Nacht bei -20 °C ausfällungen.
    HINWEIS: Die Ausfällung kann auch in einem Ethanol-/Trockeneisbad während 20 minuten oder bei -80 °C während 2 h durchgeführt werden.
  8. Zentrifuge bei 16.000 x g für 15 min bei 4 °C. Ethanol langsam mit einer Pipette entfernen, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht zu stören.
    ACHTUNG: Das RNA-Pellet ist nicht immer sichtbar und in Gegenwart von Ethanol manchmal locker.
  9. Fügen Sie 500 μL 80% kaltes Ethanol hinzu.
  10. Zentrifuge bei 16.000 x g für 5 min bei 4 °C.
  11. Entsorgen Sie Ethanol, indem Sie es langsam pipettieren. Trocknen Sie das Pellet mit einem Vakuumkonzentrator, 5 minuten im Laufmodus.
  12. Das Pellet wird in einem geeigneten Volumen (15-50 μL) Reinstwasser wieder aufgebraucht. Das Pellet für die spätere Verwendung bei -20 °C einfrieren.
  13. Beurteilen Sie die RNA-Quantität (260 nm) und -qualität (Wellenlängenverhältnisse 260/280 und 260/230) mit einem Spektralphotometer/Fluorometer (siehe Materialtabelle). Befolgen Sie sorgfältig die Anweisungen des Herstellers.
    HINWEIS: 3-4 μg werden im Allgemeinen in der Elutionsfraktion (E) erhalten. Dies hängt hauptsächlich von den getesteten Bedingungen ab.

9. Analyse der MS2-Affinitätsreinigung durch Northern Blot36

  1. 5 μg RNA aus CE-, FT-, W-Fraktionen und 500 ng E-Fraktion in 10 μL Reinstwasser verdünnen und mit 10 μL RNA-Ladepuffer mischen.
  2. 3 min bei 90 °C inkubieren.
  3. Laden Sie Proben in Vertiefungen eines 1% igen Agarosegels, das mit 20 mM Guanidiumthiocyanat ergänzt ist, und lassen Sie das Gel mit 100-150 V in TBE 1x Puffer bei 4 °C laufen. Lesen Sie Koontz (2013)37 für weitere Details.
  4. Transfer-RNAs auf einer Nitrocellulosemembran durch Vakuumtransfer für 1h oder Kapillaritätstransfer über Nacht.
    HINWEIS: Die Kapillaritätsmethode ist bei großen RNAs effizienter.
  5. UV-Vernetzungs-RNAs auf der Membran (120 mJ bei 254 nm) mit einem ULTRAVIOLETT-Vernetzer.
  6. Führen Sie die Membran in eine Hybridisierungsflasche mit der RNA-Seite nach oben ein.
  7. Fügen Sie 10-20 ml vorgewärmte Hybridisierungslösung hinzu. 30 min bei 68 °C inkubieren.
  8. Entsorgen Sie die Lösung und fügen Sie 10-20 ml frische Hybridisierungslösung hinzu, die mit 1 μL der sRNA-spezifischen Sonde ergänzt wird. Über Nacht bei 68 °C inkubieren.
    HINWEIS: Die DIG-markierte RNA-Sonde wird mit einem DIG-RNA-Markierungskit und gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Alternativ kann eine radioaktiv markierte Sonde verwendet werden.
  9. Waschen Sie die Membran mit 10-20 mL Waschlösung 1 (2x SSC und 0,1% SDS) für 5 min bei 20 °C. Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal.
  10. Waschen Sie die Membran mit 10-20 ml Waschlösung 2 (0,2x SSC und 0,1% SDS) für 15 min bei 68 °C. Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal.
  11. Mit 10-20 ml Blocklösung für mindestens 30 min bei 20 °C inkubieren.
  12. Entsorgen Sie die Lösung und fügen Sie 10-20 ml der Blockierungslösung hinzu, ergänzt mit dem polyklonalen Anti-Digoxigenin-Antikörper (1/1000), konjugiert mit alkalischer Phosphatase. 30 min bei 20 °C inkubieren.
  13. Waschen Sie die Membran mit 10-20 ml der Waschlösung 3 (1x Maleinsäure und 0,3% Tween 20) für 15 min bei 20 °C. Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal.
  14. Inkubieren Sie die Membran mit 10-20 mL der Detektionslösung (0,1 M Tris HCl und 0,1 M NaCl pH 9,5) 5 min bei 20 °C.
  15. Legen Sie die Membran auf eine Kunststofffolie und tränken Sie sie mit dem Substrat (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie 5 Minuten im Dunkeln.
  16. Versiegeln Sie die Membran in einer Kunststofffolie. Legen Sie die Membran in eine Autoradiographiekassette.
  17. Setzen Sie die Membran einem Autoradiographiefilm im dafür vorgesehenen dunklen Raum aus.
    HINWEIS: Die Belichtungszeit hängt von der Signalstärke ab, von wenigen Sekunden bis zu Minuten.
  18. Zeigen Sie den belichteten Film in einem automatischen Entwicklungsgerät auf.

10. Vorbereitung der Proben für die RNA-Sequenzierung

HINWEIS: Dieser Schritt betrifft nur RNAs, die aus E- und CE-Fraktionen extrahiert wurden.

  1. Zu jeder Probe werden 10 μL 10x DNase-Puffer und DNase I (1 U/μg behandelte RNAs) hinzugefügt. Fügen Sie Wasser für ein Endvolumen von 100 μL hinzu.
  2. 1 h bei 37 °C inkubieren.
  3. Extrahieren und reinigen Sie RNAs wie zuvor beschrieben (Schritte 8.2 bis 8.11).
  4. Resuspend das RNA-Pellet in 20 μL Reinstwasser.
    HINWEIS: Das Vorhandensein der verbleibenden DNA kann mit PCR und spezifischen Primern (z. B. 16S-Gen) überprüft werden.
  5. Bewerten Sie die RNA-Quantität und -Qualität mit einem mikrofluidikbasierten Elektrophorese-Analysesystem (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: 1 μg wird im Allgemeinen in der Elutionsfraktion (E) nach DNase-Behandlung erhalten.
  6. Entfernen Sie ribosomale RNAs mit einem bakteriellen rRNA-Depletion-Kit.
    HINWEIS: Große und reichlich vorhandene RNAs (d. H. rRNAs) neigen dazu, unspezifisch mit der Affinitätsspalte zu interagieren. 500 ng extrahierte RNA sind erforderlich, um diesen Schritt durchzuführen.
  7. Bewerten Sie erneut die RNA-Quantität und -Qualität mit einem mikrofluidikbasierten Elektrophorese-Analysesystem.
  8. Bereiten Sie cDNA-Bibliotheken mit 10-20 ng ribodepleted RNA mit einem cDNA-Bibliotheksvorbereitungskit und gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
  9. Sequenzieren Sie die erhaltenen Bibliotheken mit einem Sequenzierungsinstrument (z. B. Single-End, 150 bp; siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: 5-10 Millionen Lesevorgänge pro Stichprobe sind im Allgemeinen ausreichend.

11. RNAseq-Datenanalyse (Abbildung 2)

  1. Laden Sie die FastQ-Sequenzierungsdateien von der Sequenzierungsplattform herunter.
  2. Zugriff auf die Galaxy-Instanz der biologischen Station Roscoff (https://galaxy.sb-roscoff.fr/) und Einloggen.
    HINWEIS: Jeder erwähnte Algorithmus kann leicht über die Suchleiste gefunden werden. Für jedes Tool wird ein Benutzerhandbuch bereitgestellt.
    ACHTUNG: Die Version der erforderlichen Tools kann vom öffentlichen Galaxy Server38abweichen.
  3. Klicken Sie auf das Symbol Daten abrufen und dann auf Datei von Ihrem Computer hochladen. Laden Sie die FastQ-Sequenzierungsdatei jeder MS2-Kontroll- und MS2-sRNA-Proben hoch. Laden Sie auch FASTA-Referenzgenomdatei und GFF-Annotationsdatei hoch.
  4. Führen Sie FastQC Read Quality Reports (Galaxy Version 0.69) aus.
    HINWEIS: Dieses Tool bietet eine Qualitätsbewertung von Rohsequenzen (z. B. Qualitätsfaktor, Vorhandensein von Adaptersequenzen).
  5. Führen Sie das Trimmomatic Flexible Read Trimming Tool (Galaxy Version 0.36.6) aus, um insbesondere Adaptersequenzen und Lesevorgänge von schlechter Qualität zu entfernen. Geben Sie Adaptersequenzen an, die für die Bibliotheksvorbereitung verwendet werden (z. B. TruSeq 3, single-ended). Fügen Sie die folgenden trimmomatischen Operationen hinzu: SLIDINGWINDOW (Anzahl der Basen=4; Durchschnittliche Qualität=20) und MINLEN (Mindestlänge der Lesevorgänge=20).
  6. Führen Sie fastQC Read Quality Reports (Galaxy Version 0.69) erneut aus.
  7. Run Bowtie2 - Karte liest gegen Referenzgenom (Galaxy Version 2.3.2.2). Verwenden Sie die Genome Reference FASTA-Datei aus dem Verlauf, um Lesevorgänge mit Standardeinstellungen (sehr empfindlich lokal) zuzuordnen.
    HINWEIS: Die vom Bowtie2-Tool generierte BAM-Datei kann mit dem Integrative Genomics Viewer (IGV) visualisiert werden. Die zugehörige BAI-Datei ist ebenfalls erforderlich.
  8. Optional flagstat ausführen, das Statistiken für BAM-Datasets (Galaxy Version 2.0) kompiliert.
  9. Führen Sie htseq-count - Count (Galaxy Version 0.6.1) aus, das leseüberlappende Features in der GFF-Anmerkungsdatei ausrichtet. Verwenden Sie den Schnittpunktmodus (nicht leer).
  10. Archivieren Sie alle Raw-Counts-Dateien aus der htseq-count-Analyse in einer einzigen Zip-Datei.
  11. Führen Sie SARTools DESeq2 aus, um Daten zu vergleichen (Galaxy Version 1.6.3.0). Geben Sie die Zip-Datei mit Rohanzahldateien und die Designdatei an, eine tabulatorgetrennte Datei, die das Experiment beschreibt. Befolgen Sie sorgfältig die bereitgestellten Anweisungen, um die Designdatei zu generieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Die repräsentativen Ergebnisse stammen aus der Untersuchung des RsaC-Targetoms in S. aureus29. RsaC ist eine unkonventionelle 1.116 nt-lange sRNA. Sein 5'-Ende enthält mehrere sich wiederholende Regionen, während sein 3'-Ende (544 nt) strukturell unabhängig ist und alle vorhergesagten Interaktionsstellen mit seinen mRNA-Zielen enthält. Die Expression dieser sRNA wird induziert, wenn Mangan (Mn) knapp ist, was häufig im Zusammenhang mit der Immunantwort des Wirts auftritt. Mit hilfe der MAPS-Technologie identifizierten wir mehrere mRNAs, die direkt mit RsaC interagieren, was ihre entscheidende Rolle bei oxidativen Stress- (sodA, ldh1 und sarA) und metallbezogenen (znuBC-zur und sufCDSUB) Reaktionen aufdeckt.

Validierung des MS2-sRNA-Konstrukts und experimenteller Bedingungen
Vor der Durchführung von MAPS-Experimenten ist es wichtig, die optimalen Expressionsbedingungen der untersuchten sRNA zu bestimmen. Wenn ein nicht-nativer Promotor verwendet wird, wird er definitiv dazu beitragen, das MS2-sRNA-Konstrukt zu produzieren, wenn seine Ziele vorhanden sind. Darüber hinaus sollte das MS2-sRNA-Konstrukt hinsichtlich Größe, Stabilität, Expression und Funktion sorgfältig validiert werden. Das MS2-Aptamer wurde entweder mit dem 5'-Ende des RsaC in voller Länge (MS2-RsaC1116)oder der kürzeren Form (MS2-RsaC544)verschmolzen, was dem 3'-Teil von RsaC entspricht. Beide Konstrukte wurden in vivo unter der Kontrolle des quorum sensing abhängigen P3-Promotors in S. aureus HG001 ΔrsaC exprimiert. Die Deletion des rsaC-Gens vermeidet einen Wettbewerb zwischen dem endogenen RsaC und MS2-RsaC. Der Wildtypstamm, der den gleichen Vektor mit dem MS2-Tag allein enthielt, wurde als Kontrolle verwendet. Dieses Steuerelement ermöglicht das Subtrahieren unspezifischer Interaktionen, die mit dem MS2-Tag auftreten.

Um die Konstrukte zu bestätigen und ihr Expressionsmuster zu visualisieren, wurden Bakterienzellen nach 2 h, 4 h und 6 h Wachstum in BHI-Medium bei 37 °C geerntet. Nach der RNA-Extraktion wurde die Northern Blot-Analyse mit rsaC-spezifischer DIG-Sonde durchgeführt (Abbildung 3A). Der Gehalt an endogenem RsaC (Bahnen 1-3) stieg nach 6 Stunden Wachstum signifikant an, was die Auswahl dieses Zeitpunkts für MAPS-Experimente rechtfertigte. Wichtig ist, dass die Werte von MS2-RsaC544 (Lanes 7-9) und MS2-RsaC1.116 (Lanes 10-12) mit endogenem RsaC bei 6 h vergleichbar waren. Daher sollten sie das endogene Expressionsmuster von RsaC nachahmen. Eine größere, aber kleinere Form von RsaC war unterscheidbar und könnte auf ein ineffizientes Ende der Transkription zurückzuführen sein. Dieses Phänomen wird häufig beobachtet, wenn eine MS2-sRNA unter der Kontrolle eines starken Promotors aus einem Plasmid21exprimiert wird. Es wurden keine kürzeren Formen beobachtet, die sich aus einer aberranten Transkriptionsbeendigung oder -degradation ergaben.

Die Zugabe des MS2-Aptamers an den 5' von sRNAs könnte auch ihre ordnungsgemäße Faltung stören und ihre Funktionen beeinträchtigen. Dieser Schritt ist entscheidend für hochstrukturierte sRNAs wie RsaC. Daher sollte die MS2-sRNA-Aktivität getestet und nach Möglichkeit mit endogener sRNA verglichen werden. Ein zuvor bekanntes Ziel oder ein beobachtbarer Phänotyp kann helfen, es zu überwachen. Zum Beispiel wurde der Einfluss von RsaC auf die intrazelluläre ROS-Akkumulation verwendet, um MS2-RsaC544 und MS2-RsaC1.116 Konstrukte 29zu validieren.

Analyse der gesammelten Fraktionen während der Affinitätsreinigung
RNAs wurden aus CE-, FT- und E-Fraktionen in WT-Stämmen extrahiert, die ms2-Tag allein exprimieren, und ΔrsaC-Stämmen, die MS2-RsaC544-Konstrukt exprimieren. Wir zeigten mit Hilfe der Northern Blot-Analyse, dass der 1.116 nt lange endogene RsaC in der Elutionsfraktion angereichert war, sich aber als unspezifisch mit der Affinitätssäule herausstellte (Abbildung 3B,Bahnen 2-3). Wir beobachteten das gleiche Phänomen mit MS2-RsaC1.116 (Daten nicht gezeigt). Dies liegt sicherlich an seiner Länge und komplexen Sekundärstruktur. Daher wurde nur eine weniger strukturierte und kürzere Form (544 nt) von RsaC verwendet, die seinem 3'-Teil entspricht, um MAPS-Experimente durchzuführen. In Abbildung 3Bwurde das MS2-RsaC544 in der Elutionsfraktion stark angereichert, was zeigt, dass es erfolgreich vom MS2-MBP-Fusionsprotein (Lane 6) zurückgehalten wurde. Eine größere, aber kleinere Form von MS2-RsaC544 wurde wie in Abbildung 3Abeobachtet. Hier kann die Stringenz und Anzahl der Waschungen angepasst werden, um entweder die unspezifische Bindung zu reduzieren oder im Gegenteil den Verlust echter Interaktionspartner zu begrenzen.

Validierung mutmaßlicher mRNA-Targets nach MAPS-Analyse
Nach bioinformatischer Analyse werden mutmaßliche mRNA-Targets nach der Fold-Change zwischen MS2-sRNA und MS2-Kontrolle aufgelistet, die mit DeSeq2 erhalten wurde (Abbildung 2). Zum Beispiel deuteten MS2-RsaC544 MAPS-Daten29 darauf hin, dass sodA mRNA, die für eine Superoxiddismutase in S. aureuskodiert, ein Hauptziel ist (bester Treffer, höhere Faltenänderung). Eine Northern Blot-Analyse, die mit einer sodA-spezifischenDIG-Sonde nach MS2-Affinitätsreinigung durchgeführt wurde, zeigt, dass sodA im Vergleich zur MS2-Kontrolle effizient mit MS2-RsaC544 co-angereichert wurde (Abbildung 3C).

Eine globale transkriptomische Analyse wird systematisch an der CE-Fraktion durchgeführt. Der Vergleich von MAPS-Daten und diese transkriptomische Analyse hilft, das Anreicherungsverhältnis anzupassen und zeigt eine potenzielle Zielhierarchie auf. Tatsächlich hat eine schlecht exprimierte mRNA, die nach ms2-Affinitätsreinigung stark angereichert wird, sicherlich eine größere Bindungsaffinität als eine hochangereicherte und hoch exprimierte mRNA.

Es ist wichtig zu beachten, dass alle von MAPS identifizierten Kandidaten einzeln mit In-vitro- und/oder In-vivo-Experimenten wie Electrophoresis Mobility Shift Assays (EMSA) oder Reporter-Genassays validiert werden müssen (siehe Jagodnik et al. (2017)39 für weitere Details).

Figure 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung des an S. aureusangepassten MAPS-Protokolls . Von der Plasmidkonstruktion bis zur Datenanalyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2. MAPS-Analyse-Workflow und verarbeitete Daten. Jeder Schritt, Prüfpunkt und Dateiformat werden dargestellt (siehe auch Schritt 11). Das FastQ-Format ist eine Textdatei, die aus den DNA-Sequenzen und den entsprechenden Qualitätswerten besteht. Das BAM-Format ist eine komprimierte Datei, die ausgerichtete Sequenzen enthält. Tabular Format ist eine tabulatorgetrennte Textdatei mit Zählungen für jedes Gen. Das Ergebnisdiagramm veranschaulicht die Art der Daten, die nach der bioinformatischen Analyse erhalten wurden. Die präsentierten Ergebnisse sind fiktiv und stammen nicht aus einer Studie. Für weitere Details sind grundlegende Tutorials auf der Galaxy Project-Website (https://galaxyproject.org/) verfügbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Erstellt Validierungs- und MAPS-Steuerelemente. A. Northern Blot Analyse von endogener RsaC sRNA und verwandten MS2-Konstrukten. WT-Stamm trägt den pCN51-P3-MS2 (Kontrolle) und ΔrsaC-Mutantenstamm tragen entweder den pCN51-P3-MS2, pCN51-P3-MS2-RsaC544 oder pCN51-P3-MS2-RsaC1.116. Die Proben wurden nach 2 h, 4 h und 6 h Wachstum in BHI bei 37 °C entnommen. Northern Blot Assays wurden mit einer RsaC-spezifischen DIG-Sonde durchgeführt. B.Northern Blot-Analyse von MS2-Affinitätsreinigungsfraktionen mit einer RsaC-spezifischen DIG-Sonde. Die Co-Reinigung wurde mit WT-Stamm + pCN51-P3-MS2 (Kontrolle) und ΔrsaC-Mutantenstamm + pCN51-P3-MS2-RsaC544durchgeführt. Die Zellen wurden nach 6 Stunden Wachstum in BHI bei 37 °C geerntet. Rohextrakt (CE), Durchfluss (FT), Elution (E). C. Northern Blot-Analyse von MS2-Affinitätsreinigungsfraktionen (CE und E) mit einer sodA-spezifischenDIG-Sonde. Siehe (B) für Details. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

RNS Art Referenz
Escherichia Coli
RyhB sRNA Lalaouna et al. (2015)21
RybB sRNA Lalaouna et al. (2015) 21
3'ETSleuZ tRNA-abgeleitetes Fragment Lalaouna und Massé (2015)26
DsrA sRNA Lalaouna et al. (2015) 22
Hns mRNA (5'UTR) Lalaouna et al. (2015) 22
CyaR sRNA Lalaouna et al. (2018) 23
RprA sRNA Lalaouna et al. (2018) 23
GcvB sRNA Lalaouna et al. (2019) 24
Salmonellen Typhimurium
SraL sRNA Silva et al. (2019) 25
Staphylococcus aureus
RsaA sRNA Tomasini et al. (2017) 27
RsaC sRNA Lalaouna et al. (2019) 29
RsaI sRNA Bronesky et al. (2019) 28

Tabelle 1. Die MAPS-Technologie zeigte das Targetom mehrerer RNAs in verschiedenen Organismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ein modifiziertes Protokoll für grampositive Bakterien
Das ursprüngliche Protokoll von MAPS wurde entwickelt, um das sRNA-Interkotom im Modellorganismus E. coli20,30zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll, das sich zur Charakterisierung von sRNA-abhängigen regulatorischen Netzwerken im opportunistischen Humanpathogen S. aureus eignet und durchaus auf andere grampositive Bakterien, pathogen oder nicht, übertragbar ist.

Besonderes Augenmerk wurde auf den Zelllyseschritt gelegt. Die französische Presse wurde durch ein mechanisches Zelllyseinstrument ersetzt. Diese Methode ist wirksam, um grampositive Zellen zu brechen und Risiken im Zusammenhang mit dem Umgang mit pathogenen Stämmen zu begrenzen. Um die Ausbeute der MS2-Affinitätsreinigung zu verbessern, wurde die Menge an MS2-MBP, die auf dem Amyloseharz immobilisiert wurde, drastisch erhöht. Dies erforderte, die Stringenz und anzahl der Waschungen anzupassen.

Im Gegensatz zum ursprünglichen Protokoll wird MAPS hier dupliziert aus zwei biologischen Replikaten durchgeführt. Zur Implementierung statistischer Analysen (Abbildung 2) wurde ein Workflow entwickelt, der die Robustheit der erhaltenen Daten definitiv erhöht.

MS2-Konstrukt und sein Ausdruck
Dieses MAPS-Protokoll wurde eingerichtet, um das Targetom von Staphylokokken-sRNAs zu identifizieren. Das MS2-sRNA-Konstrukt wird aus einem Plasmid mit niedriger Kopienzahl (pCN51, 20 bis 25 Kopien/Zelle) und unter der Kontrolle des quorum-sensing-abhängigen P3-Promotors exprimiert, der hauptsächlich während der stationären Phase induziert wird. Dieses Expressionsmuster entspricht den untersuchten sRNAs in S. aureus (d.h. RsaA, RsaI und RsaC) und sorgt für eine recht starke MS2-sRNA-Synthese. Wir können jedoch nicht ausschließen, dass in anderen Fällen der P3-Promotor möglicherweise nicht geeignet ist und nicht den natürlichen physiologischen Zustand von Bakterien widerspiegelt, wenn die sRNA induziert wird. Eine weitere Möglichkeit, die MS2-sRNA-Produktion zu kontrollieren, ist die Verwendung chemisch induzierbarer Promotoren (z. B. Tetracyclin-induzierbare Promotoren). Diese Werkzeuge ermöglichen eine Pulsexpression des MS2-sRNA-Konstrukts, aber diese Einstellung garantiert nicht, dass RNA-Ziele gleichzeitig exprimiert werden. Ein weiterer Nachteil ist, dass die Expression aus einem Plasmid zur Überproduktion der untersuchten sRNA führen kann, die bei einem Vektor mit hoher Kopienzahl noch stärker betont wird. Dies könnte möglicherweise zu artefaktischen Interaktionen oder zur Störung der damit verbundenen RNA-Chaperonfunktionen führen. Die am besten geeignete Alternative besteht darin, ein MS2-Tag am 5'-Ende des endogenen sRNA-Gens einzufügen. Somit wäre die MS2-sRNA chromosomal kodiert und unter der Kontrolle ihres nativen Promotors. Dies sollte die endogene Expression der untersuchten sRNA besser nachahmen und Verzerrungen aufgrund der Überproduktion der untersuchten sRNA vermeiden. In jedem Fall besteht der entscheidende Schritt darin, die Länge, Stabilität und Funktionalität des MS2-sRNA-Konstrukts sorgfältig zu überprüfen, insbesondere unter Verwendung von Northern Blot-Assays mit Gesamt-RNA, die aus Kulturen extrahiert wurde, die unter Bedingungen gezüchtet wurden, die die endogene sRNA-Produktion und -Funktion auslösen. Unbestreitbar kann die Verwendung eines unsachgemäßen/unfunktionalen MS2-sRNA-Konstrukts die generierten Ergebnisse drastisch beeinflussen und die Bedeutung der oben beschriebenen Kontrollen unterstützen. Schließlich wird die MS2-sRNA immer in einemΔ-sRNA-Hintergrund produziert, um die Anreicherung von mRNA-Targets zu maximieren. Darüber hinaus können Experimente in Wirtsstämmen mit spezifischen Mutationen in RNasen (z. B. Deletionsmutanten oder temperaturempfindliche Mutanten) durchgeführt werden, um den Abbau von mRNA-Targets durch sRNA-abhängige Rekrutierung von RNasen zu vermeiden.

Die experimentelle Validierung der von MAPS identifizierten Kandidaten ist weiterhin erforderlich
Ein Punkt, der berücksichtigt werden muss, ist, dass MAPS eine Liste von mutmaßlichen RNA-Zielen bietet. Einige RNAs können jedoch indirekt durch Interaktion mit einem gemeinsamen mRNA-Target oder einem RNA-bindenden Protein angereichert werden. Folglich müssen aufgedeckte Kandidaten durch andere experimentelle Ansätze bestätigt werden. EMSA- und Footprinting-Experimente werden häufig verwendet, um die direkte Bindung einer sRNA an mutmaßliche RNA-Ziele in vitro zu visualisieren. Dann helfen In-vitro-Toeprinting-Assays, den Einfluss einer sRNA auf die Translationsinitiierung ihres mRNA-Ziels zu überwachen. Schließlich ergänzen Northern Blot und/oder Genreporter-Assays (lacZ oder gfp) diese experimentelle Validierung in vivo. Alle diese Ansätze sind in Jagodnik et al. (2017)39beschrieben.

Im Gegensatz zu den Technologien RIL-seq und CLASH liefert MAPS keine direkten Informationen zu den Interaktionsseiten. Dennoch wird häufig ein Peak der kartierten Lesevorgänge in einer eingeschränkten Region des RNA-Ziels beobachtet (z. B. das 3'-Ende des glyW-cysT-leuZ-Operons 21),was die Identifizierung der Paarungsstelle erleichtert. Alternativ können mehrere Vorhersagewerkzeuge verwendet werden, um die mutmaßliche Bindungsstelle auf dem identifizierten Ziel vorherzusagen, wie z.B. IntaRNA40.

MAPS untersucht das Targetom einer bestimmten sRNA
Die MAPS-Technologie eignet sich für die Untersuchung von sRNA-Targetomen in gramnegativen Bakterien wie E. coli und S. Typhimurium, aber auch jetzt mit diesem modifizierten Protokoll in grampositiven Bakterien wie S. aureus. Grundsätzlich bietet MAPS eine Momentaufnahme von RNA:sRNA-Duplexen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt und unter bestimmten Wachstumsbedingungen gebildet werden. Leider könnte die Liste der mRNA-Targets unvollständig sein. Zum Beispiel könnte ein verwandtes mRNA-Ziel aufgrund unangemessener experimenteller Bedingungen verfehlt werden, was die oben genannten Vorsichtsmaßnahmen rechtfertigt.

Im Vergleich zu anderen häufig verwendeten Methoden wie RIL-seq oder CLASH verwendet MAPS eine spezifische sRNA, um alle interagierenden RNA-Ziele gemeinsam zu reinigen. Hier wird die sRNA:RNA-Interaktion unter anderen RBP-assoziierten Duplexen nicht verdünnt, so dass theoretisch ihr Targetom tiefer charakterisiert werden kann. Es scheint jedoch, dass RIL-seq/CLASH- und MAPS-Methoden unterschiedliche Sätze von mutmaßlichen sRNA-Zielen12,41enthüllten, was darauf hindeutet, dass diese experimentellen Ansätze komplementär sind. Diese Diskrepanz könnte durch Variationen der Wachstumsbedingungen und/oder Verzerrungen erklärt werden, die von jeder Methode erzeugt werden.

Dementsprechend sollte der Zweck der Studie die Wahl der Methode beeinflussen. Für eine globale Analyse von sRNA-Targetomen und wenn ein RBP an der sRNA-vermittelten Regulation beteiligt ist, sollten RIL-seq- und CLASH-Methoden bevorzugt werden. Beide Ansätze bieten einen Überblick über Regulierungsnetzwerke, die sich auf ein bestimmtes RBP stützen, und decken folglich eine Vielzahl von sRNAs und damit verbundenen Zielen auf. Im Gegenteil, für die Untersuchung einer bestimmten sRNA oder wenn kein RBP bekannt/beteiligt ist, stellt MAPS eine geeignete Option dar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der "Agence Nationale de la Recherche" (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH und ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, to PR) unterstützt. Es wurde auch im Rahmen der labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 und von ANR-17-EURE-0023 (to PR) als Finanzierung durch den von ANR verwalteten Staat im Rahmen der Investitionen für das Zukunftsprogramm veröffentlicht. DL wurde durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung Nr. 753137-SaRNAReg unterstützt. Die Arbeit im E. Massé Lab wurde durch Betriebskostenzuschüsse der Canadian Institutes of Health Research (CIHR), des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) und des National Institutes of Health NIH Team Grant R01 GM092830-06A1 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt 72.690.001
15 mL centrifuge tubes Falcon 352070
2 mL microcentrifuge tube Starstedt 72.691
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA RNA quantity and quality
250 mL culture flask Dominique Dutscher 2515074 Bacterial cultures
50 mL centrifuge tubes Falcon 352051 Culture centrifugation
Absolute ethanol VWR Chemicals 20821.321 RNA extraction and purification
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter Bacterial pelleting
Ampicilin (amp) Sigma-Aldrich A9518-5G Growth medium
Amylose resin New England BioLabs E8021S MS2-affinity purification
Anti-dioxigenin AP Fab fragment Sigma Aldrich 11093274910 Northern blot assays
Autoradiography cassette ThermoFisher Scientific 50-212-726 Northern blot assays
BamHI ThermoFisher Scientific ER0051 Plasmid construction
BHI (Brain Heart Infusion) Broth Sigma-Aldrich 53286 Growth medium
Blocking reagent Sigma Aldrich 11096176001 Northern blot assays
CDP-Star Sigma Aldrich 11759051001 Northern blot assays (substrate)
Centrifuge 5415 R Eppendorf RNA extraction and purification
Chloroform Dominique Dutscher 508320-CER RNA extraction and purification
DIG-RNA labelling mix Sigma-Aldrich 11277073910 Northern blot assays
DNase I Roche 4716728001 DNase treatment
Erythromycin (ery) Sigma-Aldrich Fluka 45673 Growth medium
FastPrep device MP Biomedicals 116004500 Mechanical lysis
Guanidium Thiocyanate Sigma-Aldrich G9277-250G Northern blot assays
Hybridization Hoven Hybrigene Techne FHB4DD Northern blot assays
Hybridization tubes Techne FHB16 Northern blot assays
Isoamyl alcohol Fisher Scientific A/6960/08 RNA extraction and purification
LB (Lysogeny Broth) Sigma-Aldrich L3022 Growth medium
Lysing Matrix B Bulk MP Biomedicals 6540-428 Mechanical lysis
MicroPulser Electroporator BioRad 1652100 Plasmid construction
Milli-Q water device Millipore Z00QSV0WW Ultrapure water
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific RNA/DNA quantity and quality
Nitrocellulose membrane Dominique Dutsher 10600002 Northern blot assays
Phembact Neutre PHEM Technologies BAC03-5-11205 Cleaning and decontamination
Phenol Carl Roth 38.2 RNA extraction and purification
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530 Plasmid construction
pMBP-MS2 Addgene 65104 MS2-MBP production
Poly-Prep chromatography column BioRad 7311550 MS2-affinity purification
PstI ThermoFisher Scientific ER0615 Plasmid construction
Qubit 3 Fluorometer Invitrogen 15387293 RNA quantity
RNAPro Solution MP Biomedicals 6055050 Mechanical lysis
ScriptSeq Complete Kit Illumina BB1224 Preparation of cDNA librairies
Spectrophotometer Genesys 20 ThermoFisher Scientific 11972278 Bacterial cultures
SpeedVac Savant vacuum device ThermoFisher Scientific DNA120 RNA extraction and purification
Stratalinker UV Crosslinker 1800 Stratagene 400672 Northern blot assays
T4 DNA ligase ThermoFisher Scientific EL0014 Plasmid construction
TBE (Tris-Borate-EDTA) Euromedex ET020-C Northern blot assays
ThermalCycler T100 BioRad 1861096 Plasmid construction
Tween 20 Sigma Aldrich P9416-100ML Northern blot assays
X-ray film processor hu.q HQ-350XT Northern blot assays
X-ray films Super RX-N FujiFilm 4741019318 Northern blot assays

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action. Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).
  2. Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica. EcoSal Plus. 9 (1), (2020).
  3. Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I. Noncoding RNA. Microbiology Spectrum. 7 (2), (2019).
  4. Adams, P. P., Storz, G. Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524 (2020).
  5. Pain, A., et al. An assessment of bacterial small RNA target prediction programs. RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).
  6. Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. , 194506 (2020).
  7. Wright, P. R., et al. CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 119-123 (2014).
  8. Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins. Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).
  9. Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).
  10. Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles. Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).
  11. Melamed, S., et al. Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria. Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).
  12. Iosub, I. A., et al. Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation. Elife. 9, (2020).
  13. Waters, S. A., et al. Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E. The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).
  14. Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq. Current Genetics. , (2019).
  15. Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs. Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).
  16. Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus. BMC Microbiology. 7, 10 (2007).
  17. Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq. Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).
  18. Olejniczak, M., Storz, G. ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers. Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).
  19. Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. Chapter Sixteen - MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus. Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).
  20. Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. Identification of unknown RNA partners using MAPS. Methods. 117, 28-34 (2017).
  21. Lalaouna, D., et al. A 3' external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise. Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).
  22. Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli. Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).
  23. Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).
  24. Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome. Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).
  25. Silva, I. J., et al. SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).
  26. Lalaouna, D., Masse, E. Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology. Genomics Data. 5, 136-138 (2015).
  27. Tomasini, A., et al. The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).
  28. Bronesky, D., et al. A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus. The EMBO Journal. 38 (6), (2019).
  29. Lalaouna, D., et al. RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation. Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).
  30. Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).
  31. Garibyan, L., Avashia, N. Polymerase chain reaction. Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).
  32. Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions. Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).
  33. Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 Unit 1.8 (2001).
  34. Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
  35. Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).
  36. Krumlauf, R. Northern blot analysis. Methods in Molecular Biology. 58, 113-128 (1996).
  37. Koontz, L. Agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).
  38. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).
  39. Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria. Methods. 117, 67-76 (2017).
  40. Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions. Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).
  41. Georg, J., et al. The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs. Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).

Tags

Retraction MAPS Regulatory RNA RNA sequencing Targetome Regulatory network Co-purification MS2 aptamer Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus
MS2-Affinitätsreinigung gekoppelt mit RNA-Sequenzierung in grampositiven Bakterien
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mercier, N., Prévost, K.,… More

Mercier, N., Prévost, K., Massé, E., Romby, P., Caldelari, I., Lalaouna, D. MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria. J. Vis. Exp. (168), e61731, doi:10.3791/61731 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter