Summary
A tecnologia MAPS foi desenvolvida para examinar o targetome de um RNA regulatório específico in vivo. O sRNA de interesse é marcado com um aptamer MS2 permitindo a co-purificação de seus parceiros RNA e sua identificação por sequenciamento de RNA. Este protocolo modificado é particularmente adequado para bactérias Gram-positivas.
Abstract
Embora os PEQUENOs RNAs regulatórios (sRNAs) sejam difundidos entre o domínio bacteriano da vida, as funções de muitos deles permanecem pouco caracterizadas notavelmente devido à dificuldade de identificar seus alvos de mRNA. Aqui, descrevemos um protocolo modificado da Purificação MS2-Affinity, juntamente com a tecnologia RNA Sequencing (MAPS), com o objetivo de revelar todos os parceiros de RNA de um sRNA in vivo específico. Em linhas gerais, o aptamer MS2 é fundido à extremidade de 5' do sRNA de interesse. Essa construção é então expressa in vivo, permitindo que o MS2-sRNA interaja com seus parceiros celulares. Após a colheita bacteriana, as células são mecanicamente cultivadas. O extrato bruto é carregado em uma coluna de cromatografia à base de amilolose previamente revestida com a proteína MS2 fundida à proteína de ligação maltosa. Isso permite a captura específica de MS2-sRNA e RNAs interagindo. Após a elução, os RNAs co-purificados são identificados por sequenciamento de RNA de alto rendimento e análise bioinformática subsequente. O protocolo a seguir foi implementado no Patógeno Humano Gram-positivo Staphylococcus aureus e é, em princípio, transposável para qualquer bactéria Gram-positiva. Resumindo, a tecnologia MAPS constitui um método eficiente para explorar profundamente a rede regulatória de um sRNA específico, oferecendo um instantâneo de todo o seu targetome. No entanto, é importante ter em mente que as metas putativas identificadas pelo MAPS ainda precisam ser validadas por abordagens experimentais complementares.
Introduction
Centenas, talvez até milhares de pequenas RNAs regulatórias (sRNAs) foram identificadas na maioria dos genomas bacterianos, mas as funções da grande maioria deles permanecem descaracterizadas. No geral, as sRNAs são moléculas curtas sem codificação, desempenhando papéis importantes na fisiologia bacteriana e adaptação a ambientes flutuantes1,2,3. De fato, essas macromoléculas estão no centro de inúmeras redes regulatórias intrincadas, impactando vias metabólicas, respostas ao estresse, mas também virulência e resistência a antibióticos. Logicamente, sua síntese é desencadeada por estímulos ambientais específicos (por exemplo, fome de nutrientes, estresse oxidativo ou membrana). A maioria dos sRNAs regulam mRNAs de alvo múltiplos no nível pós-transcrição através de emparelhamento de base curto e não contíguo. Eles geralmente impedem a iniciação da tradução competindo com ribossomos para as regiões de iniciação de tradução4. A formação de duplexes sRNA:mRNA também frequentemente resulta na degradação ativa do mRNA alvo por meio do recrutamento de RNases específicos.
A caracterização de um targetome sRNA (ou seja, todo o conjunto de suas RNAs alvo) permite a identificação das vias metabólicas nas quais ele intervém e o sinal potencial a que responde. Consequentemente, as funções de um sRNA específico geralmente podem ser inferidas a partir de seu targetome. Para isso, várias ferramentas de previsão de silico foram desenvolvidas, como IntaRNA e CopraRNA5,6,7. Eles notavelmente contam com complementaridade de sequência, emparelhamento de energia e acessibilidade do potencial local de interação para determinar parceiros de sRNA putativos. No entanto, os algoritmos de previsão não integram todos os fatores que influenciam o emparelhamento de base in vivo, como o envolvimento de acompanhantesrna 8 favorecendo interações sub-ideais ou a co-expressão de ambos os parceiros. Devido às suas limitações inerentes, a taxa falsa positiva de ferramentas de predição permanece alta. A maioria das abordagens experimentais em larga escala baseia-se na co-purificação de casais sRNA:mRNA interagindo com uma proteína de ligação de RNA (RBP)6,9. Por exemplo, o método RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) identificou duplexes RNA co-purificados com acompanhantes de RNA como Hfq e ProQ em Escherichia coli10,11. Uma tecnologia semelhante chamada UV-Crosslinking, Ligation and Sequencing of Hybrids (CLASH) foi aplicada aos SRNAs associados ao RNase E e Hfq em E. coli12,13. Apesar dos papéis bem descritos do Hfq e do ProQ na regulação mediada pelo SRNA em múltiplas bactérias8,14,15, a regulamentação baseada em sRNA parece ser independente de RNA em vários organismos como S. aureus16,17,18. Mesmo que a purificação dos duplexes de RNA em associação com rnases seja viável, como demonstrado por Waters e colegas de trabalho13,isso permanece complicado à medida que as RNases desencadeiam sua rápida degradação. Assim, a Purificação MS2-Affinity juntamente com a abordagem RNA Sequencing (MAPS)19,20 constitui uma alternativa sólida nesses organismos.
Ao contrário dos métodos acima mencionados, o MAPS usa um sRNA específico como isca para capturar todos os RNAs interagindos e, portanto, não depende do envolvimento de um RBP. Todo o processo é retratado na Figura 1. Resumindo, o sRNA é marcado no 5' com o aptamer MS2 RNA que é especificamente reconhecido pela proteína do casaco MS2. Esta proteína é fundida com a proteína de ligação maltosa (MBP) a ser imobilizada em uma resina de amilose. Portanto, o MS2-sRNA e seus parceiros RNA são mantidos na coluna de cromatografia de afinidade. Após a elução com maltose, os RNAs co-purificados são identificados utilizando-sequenciamento de RNA de alto rendimento seguido de análise bioinformática(Figura 2). A tecnologia MAPS acaba por desenhar um mapa interativo de todas as interações potenciais que ocorrem in vivo.
A tecnologia MAPS foi originalmente implementada na bactéria gram-negativa não patogênica E. coli21. Notavelmente, o MAPS ajudou a identificar um fragmento derivado de tRNA interagindo especificamente com os sRNAs ryhB e RybB e impedindo qualquer ruído transcricional sRNA para regular os alvos de mRNA em condições não indutoras. A partir daí, o MAPS foi aplicado com sucesso a outros E. coli sRNAs como DsrA22, RprA23, CyaR23 e GcvB24 (Tabela 1). Além de confirmar alvos previamente conhecidos, o MAPS estendeu o targetome desses sRNAs conhecidos. Recentemente, o MAPS foi realizado em Salmonella Typhimurium e revelou que o SRNA da SraL se liga ao rho mRNA, codificando para um fator de rescisão de transcrição25. Através deste emparelhamento, a SraL protege rho mRNA da rescisão de transcrição prematura desencadeada pela própria Rho. Curiosamente, essa tecnologia não se restringe aos sRNAs e pode ser aplicada a qualquer tipo de RNAs celular como exemplificado pelo uso de um fragmento derivado de tRNA26 e uma região não traduzida de 5'-untranslated de mRNA22 (Tabela 1).
O método MAPS também foi adaptado à bactéria gram-positiva patogênica S. aureus19. Especificamente, o protocolo de lise foi amplamente modificado para quebrar células eficientemente devido a uma parede celular mais espessa do que as bactérias Gram-negativas e para manter a integridade do RNA. Este protocolo adaptado já desvendou o interactome do RsaA27, RsaI28 e RsaC29. Essa abordagem deu insights sobre o papel crucial dessas sRNAs nos mecanismos regulatórios das propriedades da superfície celular, captação de glicose e respostas ao estresse oxidativo.
O protocolo desenvolvido e implementado em E. coli em 2015 foi recentemente descrito em grande detalhe30. Aqui, fornecemos o protocolo MAPS modificado, que é particularmente adequado para estudar redes reguladoras de sRNA em bactérias Gram-positivas (parede celular mais grossa), sejam elas não patogênicas ou patogênicas (precauções de segurança).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Buffers e mídia
- Para experimentos maps, prepare os seguintes buffers e mídia:
- Buffer A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 e 1 mM DTT)
- Buffer E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltose, 0,1% Triton, 1 mM MgCl2 e 1 mM DTT)
- Tampão de carregamento de RNA (0,025% cianol de xileno e 0,025% azul bromofenol em 8 M de ureia)
- Infundição do Coração Cerebral (BHI) médio (12,5 g de cérebro de bezerro, 10 g de peptone, 5 g de coração de carne bovina, 5 g de NaCl, 2,5 g de Na2HPO4 e 2 g de glicose para 1 L)
- Caldo de Lysogeny (LB) médio (10 g de peptone, 5 g de extrato de levedura e 10 g de NaCl para 1 L) - Para ensaios de manchas do Norte, prepare os seguintes buffers:
- Solução de bloqueio (1x ácido maleico e 1% de reagente de bloqueio)
- Solução de hibridização (50% formamida, 5x SSC, 7% SDS, solução de bloqueio de 1% e sarcosina N-lauryl de 0,2%, fosfato de sódio de 50 mM). Aqueça com agitação para dissolver.
ATENÇÃO: Siga cuidadosamente as precauções de segurança relacionadas a cada produto.
- 1 M fosfato de sódio (58 mM de fosfato de sódio dibásico e 42 mM monofasico de sódio)
- Soro fisiológico, fole de citrato de sódio (SSC), concentrado de 20x (3 M NaCl e 300 mM citrato de trissódico)
2. Questões de segurança
- Realize todas as etapas envolvendo bactérias patogênicas viáveis em um laboratório de contenção nível 2.
NOTA: Somente extratos celulares podem ser retirados após a lise (etapa 5). - Coloque um jaleco e luvas.
- Certifique-se de que os pulsos estão cobertos.
- Limpe o armário de segurança biológica (Classe II) com uma solução desinfetante.
- Descarte resíduos sólidos expostos a bactérias na lixeira biomédica apropriada.
- Trate frascos contendo líquidos contaminados com uma solução desinfetante. Então, descarte-o em uma pia.
- Lave cuidadosamente as mãos e pulsos com sabão e remova o jaleco antes de sair do laboratório de contenção nível 2.
3. Construção plasmid
NOTA: Para fins de clonagem, é crucial primeiro identificar os limites do sRNA endógeno. Os plasmídeos pCN51-P3 e pCN51-P3-MS2 são descritos em Tomasini et al. (2017)27. O promotor P3 permite a alta expressão do sRNA de forma dependente da densidade celular (ou seja, quando as bactérias entram na fase estacionária do crescimento). Muitas estafilocócicas se acumulam durante esta fase de crescimento.
- Amplie a sequência de sRNA por PCR usando uma polimerase de DNA de alta fidelidade e uma máquina PCR. Siga cuidadosamente as instruções do fabricante e leia Garibyan e Avashia (2013)31 para mais detalhes.
- Use os seguintes modelos para projetar os primers específicos:
e 5'-CGCGGATCC(N)-3' para primers dianteiros e invertidos, respectivamente.
NOTA: Estes oligonucleotídeos permitem fundir a sequência MS2 (em negrito) ao final de 5' do sRNA de interesse. Pst Os locais de restrição I e BamHI (sublinhados) são adicionados nas extremidades de 5' e 3' da construção MS2-sRNA para clonar o amplicon no plasmídeo pCN51-P327. (N) corresponde à sequência específica do gene (15-20 nucleotídeos). - Digerir 1 μg de plasmídeo pCN51-P3 e 1 μg do produto MS2-sRNA PCR com 2 U de PstI e 1 U de BamHI no buffer apropriado de acordo com as recomendações do fabricante.
- Incubar 1h a 37 °C e purificar o DNA usando um kit de purificação pcr (ver Tabela de Materiais).
- Misture o plasmídeo digerido pCN51-P3 (300 ng) e o amplicon MS2-sRNA (razão molar para vetor:insert = 1:3) em um tubo de 1,5 mL. Consulte Revie et al. (1988)32 para maximizar a eficiência da ligadura. Adicione 1 μL do Tampão ligase e 10 U de Ligase T4 em cada tubo. Ajuste o volume para 10 μL com água ultrapura.
- Incubar a 22 °C por pelo menos 2 h.
- Adicione 5 μL de mistura de ligadura a 50 μL de células E. coli congeladas quimicamente competentes. Leia Seidman et al. (2001)33 para saber mais sobre transformação plasmída e células quimicamente competentes.
- Incubar 30 minutos no gelo.
- Choque térmico (45 s a 42 °C) o tubo de transformação usando um bloco de calor ou banho de água.
- Adicione 900 μL de meio LB e incubar a 37 °C por 30 min.
- Placa 100 μL da suspensão bacteriana em uma placa de ágar LB suplementada com ampicillina (100 μg/μL).
NOTA: o vetor pCN51-P3 codifica um gene de resistência à ampicilina, que permite selecionar apenas clones E. coli carregando o plasmídeo pCN51-P3-MS2-sRNA. - Extrair o plasmídeo pCN51-P3-MS2-sRNA de uma cultura bacteriana durante a noite (5 mL) cultivada na presença de ampicillina (100 μg/μL) utilizando um kit de miniprep de DNA plasmídeo (ver Tabela de Materiais).
- Verifique a construção por Sanger sequenciamento34 usando o seguinte primer, 5'-TCTCGAAAATAGAGAGGG-3'.
- Transforme o plasmídeo pCN51-P3-MS2-sRNA em células E. coli quimicamente competentes. Repita as etapas 3.7 a 3.11.
- Extrair o plasmídeo pCN51-P3-MS2-sRNA (ver passo 3.12) e transformar 1-5 μg de DNA plasmídeo em células eletrocompetuntes HG001 ΔsRNA S. aureus usando um aparelho de eletroporação. Siga cuidadosamente as instruções do fabricante. Leia Grosser e Richardson (2016)35 para saber mais sobre métodos de preparação de eletrocompetente S. aureus.
ATENÇÃO: Esta etapa envolve o manuseio de bactérias patogênicas (ver passo 2). - Adicione 900 μL de bhi médio e incubar a 37 °C por 3 h.
- Centrífuga 1 min a 16.000 x g. Descarte o supernaspeso.
- Resuspenja a pelota em 100 μL de BHI e emplaque a suspensão bacteriana em placas de ágar BHI suplementadas com eritromicina (10 μg/μL).
NOTA: O vetor pCN51-P3 também codifica um gene de resistência à eritromicina, que permite selecionar apenas clones S. aureus carregando o plasmídeo pCN51-P3-MS2-sRNA.
4. Colheita de bactérias
ATENÇÃO: Esta etapa envolve o manuseio de bactérias patogênicas (ver passo 2).
- Cresça uma colônia de cepas que carregam pCN51-P3-MS2-sRNA ou pCN51-P3-MS227 plasmídeos em 3 mL de BHI médio suplementado com eritromicina (10 μg/μL) em duplicatas.
- Diluir cada cultura durante a noite em 50 mL (≈1/100) de meio BHI fresco suplementado com eritromicina (10 μg/μL) para atingir um OD600nm de 0,05. Use frascos esterilizados de 250 mL (proporção frasco de 5:1 frasco para médio).
NOTA: As condições médias e de crescimento devem ser definidas de acordo com o padrão de expressão do sRNA estudado. - Cresça culturas a 37 °C com agitação a 180 rpm por 6h.
- Transfira cada cultura para um tubo de centrífuga de 50 mL.
- Centrifugar a 2.900 x g durante 15 min a 4 °C. Descarte o supernaspeso.
- Mantenha pelotas no gelo e realize diretamente a lise celular mecânica (passo 5) ou congele e armazene pelotas a -80 °C.
5. Lise celular mecânica
ATENÇÃO: As seguintes etapas devem ser realizadas no gelo e os buffers devem estar a 4 °C. Use luvas e tome todas as precauções para proteger amostras de RNases.
- Pelotas resuspend (passo 4.6) em 5 mL de Buffer A.
- Transfira as células resuspended em tubos centrífugas de 15 mL com 3,5 g de contas de sílica (0,1 mm).
- Inserir tubos em um instrumento de lise celular mecânica (ver Tabela de Materiais). Executar um ciclo de 40 s a 4,0 m/s.
NOTA: Se um ciclo não for suficiente para quebrar células, deixe o dispositivo esfriar por 5 minutos enquanto mantém amostras no gelo. Em seguida, repita outro ciclo de 40 s a 4,0 m/s. A eficiência da lise celular pode ser testada emplacando o supernascido na placa BHI-ágar. - Centrifugar a 15.700 x g por 15 min. Recupere o supernaspe e mantenha-o no gelo.
6. Preparação da coluna
ATENÇÃO: Tenha cuidado para não permitir que a resina de amilolose seque. Se necessário, sele a coluna com uma tampa final. Prepare todas as soluções antes de iniciar a purificação de afinidade.
- Coloque uma coluna de cromatografia em um rack de coluna (ver Tabela de Materiais).
- Retire a ponta da coluna e lave a coluna com água ultrapura.
- Adicione 300 μL de resina de amilolose.
- Lave a coluna com 10 mL de Buffer A.
- Diluir 1.200 pmol de proteína MBP-MS2 em 6 mL de Buffer A e carregá-lo na coluna.
- Lave a coluna com 10 mL de Buffer A.
7. Purificação de afinidade MS2 (Figura1)
- Coloque a célula na coluna.
NOTA: Mantenha 1 mL do lysato celular (Extrato bruto, CE) para extrair RNA total (etapa 8) e realizar a análise da mancha norte (etapa 9) e transcriômica (etapa 10). - Colete a fração de fluxo (FT) em um tubo de coleta limpo.
- Lave a coluna 3 vezes com 10 mL de Buffer A. Colete a fração de lavagem (W).
- Elute a coluna com 1 mL de Buffer E e colete a fração de eluição (E) em um microtubo de 2 mL.
- Mantenha todas as frações coletadas no gelo até a extração de RNA (etapa 8) ou congele-as a -20 °C para uso posterior.
8. Extração de RNA de frações coletadas (CE, FT, W e E)
- Use 1 mL de cada fração (incluindo FT e W) para extração de RNA.
- Adicione 1 volume de fenol. Misture vigorosamente.
ATENÇÃO: O fenol é volátil e corrosivo, presta atenção e trabalha com segurança sob um capô de fumaça. - Centrifugar a 16.000 x g por 10 min a 20 °C.
- Transfira a fase superior em um microtubo limpo de 2 mL.
- Adicione 1 volume de clorofórmio/isoamílico (24:1) e repita as etapas 8,3 a 8,4.
ATENÇÃO: Trabalhe com segurança sob um capô de fumaça. - Adicione 2,5 volumes de etanol frio 100% e 1/10 de volume de acetato de sódio de 3 M (NaOAc) pH 5,2.
- Precipitar durante a noite a -20 °C.
NOTA: A precipitação também pode ser realizada em um banho de gelo seco/etanol durante 20 min ou a -80 °C durante 2 h. - Centrifugar a 16.000 x g para 15 min a 4 °C. Retire lentamente o etanol com uma pipeta enquanto tome cuidado para não perturbar a pelota.
ATENÇÃO: A pelota de RNA nem sempre é visível e às vezes é solta na presença de etanol. - Adicione 500 μL de 80% de etanol frio.
- Centrifugar a 16.000 x g por 5 min a 4 °C.
- Descarte o etanol tubondo-o lentamente. Seque a pelota usando um concentrador de vácuo, 5 min no modo de execução.
- Resuspenque a pelota em um volume apropriado (15-50 μL) de água ultrapura. Congele a pelota a -20 °C para uso posterior.
- Avalie a quantidade de RNA (260 nm) e a qualidade (260/280 e 260/230 taxas de comprimento de onda) utilizando um espectrofotômetro/fluorômetro (ver Tabela de Materiais). Siga cuidadosamente as instruções do fabricante.
NOTA: 3-4 μg são geralmente obtidos na fração de elução (E). Isso depende principalmente das condições testadas.
9. Análise da purificação de afinidade MS2 pela mancha norte36
- Diluir 5 μg de RNA de CE, FT, frações W e 500 ng de fração E em 10 μL de água ultrauso e misturar com 10 μL de tampão de carregamento de RNA.
- Incubar 3 min a 90 °C.
- Carregue amostras em poços de um gel de 1% de agarose suplementado com 20 mM de tiocianato de guanidium e execute o gel a 100-150 V no tampão TBE 1x a 4 °C. Leia Koontz (2013)37 para mais detalhes.
- Transfira RNAs em uma membrana de nitrocelulose por transferência de vácuo para 1h ou transferência de capilaridade durante a noite.
NOTA: O método de capilaridade é mais eficiente para grandes RNAs. - UV cross-link RNAs na membrana (120 mJ a 254 nm) usando um crosslinker ultravioleta.
- Insira a membrana em uma garrafa de hibridização com o lado RNA voltado para cima.
- Adicione 10-20 mL de solução de hibridização pré-aquecido. Incubar 30 min a 68 °C.
- Descarte a solução e adicione 10-20 mL de solução de hibridização fresca complementada com 1 μL da sonda específica sRNA. Incubar durante a noite a 68 °C.
NOTA: A sonda RNA com etiqueta DIG é sintetizada usando um kit de rotulagem DIG RNA e seguindo as instruções do fabricante. Alternativamente, uma sonda radiolabelled pode ser usada. - Lave a membrana com 10-20 mL de solução de lavagem 1 (2x SSC e 0,1% SDS) por 5 min a 20 °C. Repita uma vez.
- Lave a membrana com 10-20 mL de solução de lavagem 2 (0,2x SSC e 0,1% SDS) por 15 min a 68 °C. Repita uma vez.
- Incubar com 10-20 mL de solução de bloqueio por pelo menos 30 min a 20 °C.
- Descarte a solução e adicione 10-20 mL da solução de bloqueio suplementada com o anticorpo anti-digoxigenina policalinha (1/1000), conjugado à fosfatase alcalina. Incubar 30 min a 20 °C.
- Lave a membrana com 10-20 mL da solução de lavagem 3 (1x ácido maleico e 0,3% Tween 20) por 15 min a 20 °C. Repita uma vez.
- Incubar a membrana com 10-20 mL da solução de detecção (0,1 M Tris HCl e 0,1 M NaCl pH 9,5) 5 min a 20 °C.
- Coloque a membrana em uma película plástica e mergulhe-a com o substrato (ver Tabela de Materiais). Incubar 5 min no escuro.
- Sele a membrana em um filme plástico. Coloque a membrana em um autordiografia.
- Exponha a membrana a um filme autordiografia na sala escura dedicada.
NOTA: O tempo de exposição depende da força do sinal, de poucos segundos a minutos. - Revele o filme exposto em um dispositivo de desenvolvimento automático.
10. Preparação das amostras para sequenciamento de RNA
NOTA: Esta etapa diz respeito apenas às RNAs extraídas das frações E e CE.
- Adicione a cada amostra 10 μL de tampão DNase 10x e DNase I (1 U/μg de RNAs tratadas). Adicione água para um volume final de 100 μL.
- Incubar 1 h a 37 °C.
- Extrair e purificar RNAs como descrito anteriormente (etapas 8.2 a 8.11).
- Resuspenque a pelota de RNA em 20 μL de água ultrapura.
NOTA: A presença de DNA restante pode ser verificada usando PCR e primers específicos (por exemplo, gene 16S). - Avalie a quantidade e a qualidade do RNA utilizando um sistema de análise de eletroforese à base de microfluidos (ver Tabela de Materiais).
NOTA: 1 μg é geralmente obtido na fração de eluição (E) após o tratamento DNase. - Remova as RNAs ribossômicas com um kit de esgotamento de rRNA bacteriano.
NOTA: As RNAs grandes e abundantes (ou seja, rRNAs) tendem a interagir não especificamente com a coluna de afinidade. 500 ng de RNA extraído são necessários para executar esta etapa. - Avalie novamente a quantidade e a qualidade do RNA usando um sistema de análise de eletroforese baseado em microfluidos.
- Prepare bibliotecas cDNA com 10-20 ng de RNA ribodepleted usando um kit de preparação da biblioteca cDNA e seguindo as instruções do fabricante.
- Sequencia as bibliotecas obtidas utilizando um instrumento de sequenciamento (por exemplo, single-end, 150 bp; ver Tabela de Materiais).
NOTA: 5-10 milhões de leituras por amostra são geralmente suficientes.
11. Análise de dados rnaseq (Figura 2)
- Baixe os arquivos de sequenciamento FastQ da plataforma de sequenciamento.
- Acesso à instância galaxy da estação biológica Roscoff (https://galaxy.sb-roscoff.fr/) e login.
NOTA: Cada algoritmo mencionado pode ser facilmente encontrado usando a barra de pesquisa. Um guia de usuário é fornecido para cada ferramenta.
ATENÇÃO: A versão das ferramentas necessárias pode diferir do servidor galaxy38público . - Clique no ícone Obter dados e, em seguida, faça upload de arquivo do seu computador. Carregue o arquivo de sequenciamento FastQ de cada controle MS2 e amostras de MS2-sRNA. Faça upload também do arquivo de genoma de referência FASTA e arquivo de anotação GFF.
- Execute os relatórios fastqc read quality (Galaxy Versão 0.69).
NOTA: Esta ferramenta fornece uma avaliação de qualidade de sequências brutas (por exemplo, pontuação de qualidade, presença de sequências de adaptador). - Execute a ferramenta de corte flexível Trimmomatic (Galaxy Version 0.36.6) para remover notavelmente sequências de adaptadores e leituras de má qualidade. Indicar sequências de adaptador usadas para preparação da biblioteca (por exemplo, TruSeq 3, single-ended). Adicionar as seguintes operações trimmomáticas: SLIDINGWINDOW (Número de bases=4; Qualidade média=20) e MINLEN (comprimento min de leituras=20).
- Execute novamente os relatórios fastqc read quality (Galaxy Versão 0.69).
- Run Bowtie2 - mapa lê contra genoma de referência (Galaxy Versão 2.3.2.2). Use o arquivo FASTA de referência de genoma do histórico para mapear leituras com configurações padrão (local muito sensível).
NOTA: O arquivo BAM gerado pela ferramenta Bowtie2 pode ser visualizado usando o Visualizador de Genômica Integrativa (IGV). O arquivo BAI associado também será necessário. - Opcionalmente, execute o Flagstat que compila estatísticas para o conjunto de dados BAM (Galaxy Version 2.0).
- Execute a contagem de htseq - Count (Galaxy Versão 0.6.1) que alinha leituras de recursos sobrepostos no arquivo de anotação GFF. Use o modo Intersecção (não vazio).
- Arquive todos os arquivos de contagem bruta da análise de contagem de htseq em um único arquivo Zip.
- Execute o SARTools DESeq2 para comparar dados (Galaxy Versão 1.6.3.0). Forneça o arquivo Zip contendo arquivos de contagem bruta e o arquivo de design, um arquivo delimitado de guia descrevendo o experimento. Siga cuidadosamente as instruções fornecidas para gerar o arquivo de design.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Os resultados representativos são originários do estudo do RsaC targetome em S. aureus29. RsaC é um sRNA não convencional de 1.116 nt-long. Seu final de 5' contém várias regiões repetidas, enquanto seu final de 3' (544 nt) é estruturalmente independente e contém todos os locais de interação previstos com seus alvos mRNA. A expressão deste sRNA é induzida quando o manganês (Mn) é escasso, o que é frequentemente encontrado no contexto da resposta imune hospedeira. Utilizando a tecnologia MAPS, identificamos várias mRNAs interagindo diretamente com o RsaC, revelando seu papel crucial no estresse oxidativo(sodA, ldh1 e sarA) e respostas relacionadas ao metal(znuBC-zur e sufCDSUB).
Validação das condições experimentais e de construção do MS2-sRNA
Antes de realizar experimentos maps, é importante determinar as condições ideais de expressão do sRNA estudado. Se um promotor não nativo for usado, ele definitivamente ajudará a produzir a construção ms2-sRNA quando seus alvos estiverem presentes. Além disso, o construto MS2-sRNA deve ser cuidadosamente validado no que diz respeito ao tamanho, estabilidade, expressão e função. O aptamer MS2 foi fundido ao final de 5' do RsaC de comprimento completo (MS2-RsaC1116) ou da forma mais curta (MS2-RsaC544) correspondente à parte de 3' do RsaC. Ambas as construções foram expressas in vivo sob o controle do quórum detectando o promotor P3 dependente em S. aureus HG001 ΔrsaC. A exclusão do gene rsaC evita uma competição entre o RsaC endógeno e o MS2-RsaC. A cepa do tipo selvagem contendo o mesmo vetor apenas com a etiqueta MS2 foi usada como controle. Este controle permite subtrair interações inespecíficas ocorrendo com a tag MS2.
Para confirmar os construtos e visualizar seu padrão de expressão, as células bacterianas foram colhidas após 2h, 4h e 6h de crescimento em média BHI a 37 °C. Após a extração do RNA, a análise da mancha norte foi realizada utilizando-se uma sonda DIG específica do RsaC(Figura 3A). O nível de RsaC endógeno (faixas 1-3) aumentou significativamente após 6 horas de crescimento, justificando a seleção deste ponto de tempo para experimentos MAPS. É importante ressaltar que os níveis de MS2-RsaC544 (faixas 7-9) e MS2-RsaC1.116 (pistas 10-12) foram comparáveis ao RsaC endógeno às 6h. Assim, eles devem imitar o padrão de expressão endógena do RsaC. Uma forma maior, mas menor de RsaC era distinguível e poderia ser devido a um fim ineficiente da transcrição. Este fenômeno é frequentemente observado quando um MS2-sRNA é expresso sob o controle de um forte promotor de um plasmídeo21. Não foram observados formulários mais curtos resultantes de rescisão ou degradação aberrante.
A adição do aptamer MS2 no 5' de sRNAs também poderia interromper sua dobra adequada e afetar suas funções. Este passo é fundamental para sRNAs altamente estruturados como RsaC. Portanto, a atividade MS2-sRNA deve ser testada e comparada com o sRNA endógeno quando possível. Um alvo anteriormente conhecido ou um fenótipo observável pode ajudar a monitorá-lo. Por exemplo, o impacto do RsaC no acúmulo de ROS intracelular foi usado para validar o MS2-RsaC544 e o MS2-RsaC1.116 construções29.
Análise de frações coletadas durante a purificação de afinidade
Os RNAs foram extraídos das frações CE, FT e E em cepa WT expressando apenas a tag MS2 e a cepaΔ rsaC expressando a construção MS2-RsaC544. Mostramos usando a análise de manchas do Norte que o RsaC endógeno de 1.116 anos foi enriquecido na fração de elução, mas acabou por interagir não especificamente com a coluna de afinidade(Figura 3B, faixas 2-3). Observou-se o mesmo fenômeno com MS2-RsaC1.116 (dados não apresentados). Isso certamente se deve ao seu comprimento e estrutura secundária complexa. Portanto, apenas uma forma menos estruturada e mais curta (544 nt) de RsaC correspondente à sua parte de 3' foi usada para realizar experimentos MAPS. Na Figura 3B,o MS2-RsaC544 foi altamente enriquecido na fração de elução demonstrando que foi retido com sucesso pela proteína de fusão MS2-MBP (pista 6). Uma forma maior, mas menor, de MS2-RsaC544 foi observada como na Figura 3A. Aqui, a stringency e o número de lavagens podem ser ajustados para reduzir a vinculação não específica ou, pelo contrário, limitar a perda de verdadeiros parceiros interagidores.
Validação de metas putativas de mRNA após análise do MAPS
Após análise bioinformática, as metas putativas de mRNA são listadas de acordo com a mudança do Fold entre o controle MS2-sRNA e MS2, obtidos por meio do DeSeq2 (Figura 2). Por exemplo, os dados29 do MS2-RsaC544 MAPS sugeriram que o sodA mRNA, codificando para uma dismutase de superóxido em S. aureus,é um alvo principal (melhor acerto, maior mudança do Fold). Uma análise de manchas do Norte, realizada com uma sonda DIG específica para SODAapós a purificação da afinidade MS2, mostra que o sodA foi eficientemente co-enriquecido com MS2-RsaC544 em comparação com o controle MS2(Figura 3C).
Uma análise transcriômica global é realizada sistematicamente na fração CE. A comparação dos dados do MAPS e essa análise transcriptômica ajuda a ajustar a razão de enriquecimento e revela uma hierarquia de alvo potencial. De fato, um mRNA mal expresso, que é altamente enriquecido após a purificação de afinidade ms2 tem certamente uma afinidade vinculante maior do que um mRNA altamente enriquecido e altamente expresso.
É importante notar que todos os candidatos identificados pelo MAPS devem ser validados individualmente usando experimentos in vitro e/ou in vivo, como ensaios de mudança de mobilidade de eletroforese (EMSA) ou ensaios genéticos de repórteres (ver Jagodnik et al. (2017)39 para mais detalhes).
Figura 1. Ilustração esquemática do protocolo MAPS adaptado ao S. aureus. Da construção plasmid à análise de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Mapas análise fluxo de trabalho e dados processados. Cada etapa, o check point e o formato do arquivo são representados (veja também o passo 11). O formato FastQ é um arquivo de texto composto pelas sequências de DNA e pontuações de qualidade correspondentes. O formato BAM é um arquivo comprimido contendo sequências alinhadas. O formato tabular é um arquivo de texto delimitado por guias com contagens para cada gene. O gráfico de resultados ilustra o tipo de dados obtidos após análise bioinformática. Os resultados apresentados são fictícios e não são originários de nenhum estudo. Para maiores detalhes, tutoriais básicos estão disponíveis no site do Galaxy Project (https://galaxyproject.org/). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Construitos de validação e controles MAPS. A. Análise de manchas do norte de construções endógenas RsaC sRNA e MS2 relacionadas. A cepa WT carrega a cepa mutante pCN51-P3-MS2 (controle) e ΔrsaC carregam o pCN51-P3-MS2, pCN51-P3-MS2-RsaC544 ou pCN51-P3-MS2-RsaC1.116. As amostras foram colhidas após 2h, 4h e 6h de crescimento em BHI a 37 °C. Os ensaios de manchas do norte foram realizados usando uma sonda DIG específica do RsaC. B. Análise de manchas do norte de frações de purificação de afinidade MS2 usando uma sonda DIG específica do RsaC. A co-purificação foi realizada utilizando-se cepa WT + pCN51-P3-MS2 (controle) e cepa mutante ΔrsaC + pCN51-P3-MS2-RsaC544. As células foram colhidas após 6h de crescimento em BHI a 37 °C. Extrato bruto (CE), fluxo-through (FT), elução (E). C. Análise de manchas do norte das frações de purificação de afinidade MS2 (CE e E) usando uma sonda DIG específica para sodA. Consulte(B)para obter detalhes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| RNA | tipo | referência |
| Escherichia coli | ||
| RyhB | sRNA | Lalaouna et al. (2015)21 |
| RybB | sRNA | Lalaouna et al. (2015) 21 |
| 3'ETSleuz | fragmento derivado do tRNA | Lalaouna e Massé (2015)26 |
| DsrA | sRNA | Lalaouna et al. (2015) 22 |
| Hns | mRNA (5'UTR) | Lalaouna et al. (2015) 22 |
| CyaR | sRNA | Lalaouna et al. (2018) 23 |
| RprA | sRNA | Lalaouna et al. (2018) 23 |
| GcvB | sRNA | Lalaouna et al. (2019) 24 |
| Salmonela Titririum | ||
| SraL | sRNA | Silva et al. (2019) 25 |
| Staphylococcus aureus | ||
| RsaA | sRNA | Tomasini et al. (2017) 27 |
| RsaC | sRNA | Lalaouna et al. (2019) 29 |
| Rsai | sRNA | Bronesky et al. (2019) 28 |
Mesa 1. A tecnologia MAPS revelou o alvo de vários RNAs em diversos organismos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Um protocolo modificado para bactérias Gram-positivas
O protocolo inicial do MAPS foi desenvolvido para estudar o sRNA interactome no organismo modelo E. coli20,30. Aqui, descrevemos um protocolo modificado que é adequado para a caracterização de redes regulatórias dependentes de sRNA no patógeno humano oportunista S. aureus e é certamente transposável para outras bactérias Gram-positivas, patogênicas ou não.
Atenção especial foi dada ao passo de lise celular. A imprensa francesa foi substituída por um instrumento de lise celular mecânica. Este método é eficaz para quebrar células Gram-positivas e limitar os riscos associados ao manuseio de cepas patogênicas. Para melhorar o rendimento da purificação de afinidade MS2, a quantidade de MS2-MBP imobilizada na resina de amilose foi drasticamente aumentada. Isso exigiu ajustar a stringency e o número de lavagens.
Ao contrário do protocolo inicial, o MAPS é aqui realizado em duplicata, a partir de duas réplicas biológicas. Foi desenvolvido um fluxo de trabalho para implementar a análise estatística (Figura 2),que aumenta definitivamente a robustez dos dados obtidos.
Construção MS2 e sua expressão
Este protocolo MAPS foi estabelecido para identificar o targetome de staphylococcal sRNAs. A construção ms2-sRNA é expressa a partir de um número de cópia baixa plasmid (pCN51, 20 a 25 cópias/célula) e sob o controle do promotor P3 dependente de quórum, induzido principalmente durante a fase estacionária. Este padrão de expressão corresponde aos sRNAs estudados em S. aureus (ou seja, RsaA, RsaI e RsaC) e garante uma síntese MS2-sRNA bastante forte. No entanto, não podemos excluir que, em outros casos, o promotor P3 pode não ser apropriado e não reflete o estado fisiológico natural das bactérias quando o sRNA é induzido. Outra forma de controlar a produção de MS2-sRNA é usar promotores quimicamente induíveis (por exemplo, promotores indutíveis de tetraciclina). Essas ferramentas permitem uma expressão de pulso da construção ms2-sRNA, mas esta configuração não garante que as metas de RNA serão expressas concomitantemente. Outra desvantagem é que a expressão de um plasmídeo pode levar à superprodução do sRNA estudado, ainda mais enfatizado com vetor de número de cópia elevado. Isso pode potencialmente resultar em interações artefatos ou na interrupção das funções associadas de acompanhantes de RNA. A alternativa mais apropriada é inserir uma tag MS2 na extremidade de 5' do gene sRNA endógeno. Assim, o MS2-sRNA seria codificado cromossomicamente e sob o controle de seu promotor nativo. Isso deve imitar melhor a expressão endógena do sRNA estudado e evitar viés devido à superprodução do sRNA estudado. De qualquer forma, o passo crucial é verificar cuidadosamente o comprimento, estabilidade e funcionalidade do construto MS2-sRNA, notadamente usando ensaios de manchas do Norte com RNA total extraído de culturas cultivadas em condições que desencadeiam a produção e função endógena do sRNA. Inegavelmente, o uso de um construto de MS2-sRNA inadequado/não funcional pode afetar drasticamente os resultados gerados, apoiando a significância dos controles descritos acima. Finalmente, o MS2-sRNA é sempre produzido em um fundoΔ sRNA para maximizar o enriquecimento de alvos mRNA. Além disso, experimentos podem ser realizados em cepas hospedeiras com mutações específicas em RNases (por exemplo, mutantes de exclusão ou mutantes sensíveis à temperatura) para evitar a degradação de alvos mRNA pelo recrutamento dependente de RNases por SRNA.
A validação experimental dos candidatos identificados pelo MAPS ainda é necessária
Um ponto que precisa ser considerado é que o MAPS fornece uma lista de metas putativas de RNA. No entanto, alguns RNAs podem ser indiretamente enriquecidos através da interação com um alvo mRNA compartilhado ou uma proteína de ligação de RNA. Consequentemente, os candidatos revelados devem ser confirmados por outras abordagens experimentais. Experimentos emsa e footprinting são comumente usados para visualizar a ligação direta de um sRNA para alvos putativos de RNA in vitro. Em seguida, ensaios in vitro de impressão de toeprint ajudam a monitorar o impacto de um sRNA na iniciação da tradução de seu alvo mRNA. Finalmente, os ensaios de blot e/ou repórter genético do Norte(lacZ ou gfp) complementam esta validação experimental in vivo. Todas essas abordagens são descritas em Jagodnik et al. (2017)39.
Ao contrário das tecnologias RIL-seq e CLASH, o MAPS não fornece diretamente informações sobre os sites de interação. No entanto, um pico de leituras mapeadas é frequentemente observado em uma região restrita do alvo RNA (por exemplo, a extremidade de 3' do operon glyW-cysT-leuZ 21), facilitando a identificação do local de pareamento. Alternativamente, várias ferramentas de previsão podem ser usadas para prever o local de ligação putativa no alvo identificado, como o IntaRNA40.
MAPS examina o targetome de um sRNA específico
A tecnologia MAPS é adequada para o estudo do sRNA targetome em bactérias Gram-negativas como E. coli e S. Typhimurium, mas também agora com este protocolo modificado em bactérias Gram-positivas como s. aureus. Basicamente, o MAPS oferece um instantâneo de duplexes RNA:sRNA formados em um determinado momento e em condições específicas de crescimento. Infelizmente, a lista de alvos mRNA pode estar incompleta. Por exemplo, um alvo mRNA cognato pode ser perdido devido a condições experimentais inadequadas, justificando as precauções acima mencionadas.
Em comparação com outros métodos comumente usados, como RIL-seq ou CLASH, o MAPS usa um sRNA específico para co-purificar todos os alvos de RNA interagindo. Aqui, a interação sRNA:RNA não é diluída entre outros duplexes associados ao RBP, permitindo teoricamente caracterizar seu targetome mais profundamente. No entanto, parece que os métodos RIL-seq/CLASH e MAPS revelaram diferentes conjuntos de metas de sRNA putativa12,41, sugerindo que essas abordagens experimentais são complementares. Essa discrepância pode ser explicada por variações nas condições de crescimento e/ou viés gerados por cada método.
Assim, o propósito do estudo deve influenciar a escolha do método. Para uma análise global dos targetomes sRNA e quando um RBP está envolvido na regulação mediada pelo SRNA, devem ser preferidos os métodos RIL-seq e CLASH. Ambas as abordagens fornecem uma visão geral das redes reguladoras que dependem de um DETERMINADO RBP e, consequentemente, descobrem uma grande variedade de sRNAs e alvos associados. Pelo contrário, para o estudo de um sRNA específico ou quando nenhum RBP é conhecido/envolvido, o MAPS representa uma opção apropriada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela "Agence Nationale de la Recherche" (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH, e ANR-18-CE12-0025-04, CoNoCo, to PR). Também foi publicado sob o âmbito do laboratórioEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 e do ANR-17-EURE-0023 (para RP), como financiamento do Estado administrado pela ANR como parte dos investimentos para o futuro programa. A DL foi apoiada pelo programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o Acordo de Subvenção Marie Skłodowska-Curie nº 753137-SaRNAReg. O trabalho no E. Massé Lab tem sido apoiado por subvenções operacionais dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR), do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) e dos Institutos Nacionais de Saúde NIH Team Grant R01 GM092830-06A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
| 250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
| Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
| Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
| Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
| Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
| BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
| CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
| Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
| DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
| DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
| Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
| FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
| Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
| Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
| Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
| Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
| LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
| Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
| Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
| Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
| Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
| Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
| RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
| ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
| Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
| SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
| TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
| X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
| X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
References
- Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action. Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).
- Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica. EcoSal Plus. 9 (1), (2020).
- Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I.
- Adams, P. P., Storz, G. Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524 (2020).
- Pain, A., et al. An assessment of bacterial small RNA target prediction programs. RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).
- Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. , 194506 (2020).
- Wright, P. R., et al. CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 119-123 (2014).
- Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins. Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).
- Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).
- Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles. Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).
- Melamed, S., et al. Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria. Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).
- Iosub, I. A., et al. Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation. Elife. 9, (2020).
- Waters, S. A., et al. Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E. The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).
- Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq. Current Genetics. , (2019).
- Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs. Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).
- Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus. BMC Microbiology. 7, 10 (2007).
- Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq. Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).
- Olejniczak, M., Storz, G. ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers. Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).
- Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. Chapter Sixteen - MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus. Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. Identification of unknown RNA partners using MAPS. Methods. 117, 28-34 (2017).
- Lalaouna, D., et al. A 3' external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise. Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).
- Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli. Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).
- Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome. Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).
- Silva, I. J., et al. SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).
- Lalaouna, D., Masse, E. Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology. Genomics Data. 5, 136-138 (2015).
- Tomasini, A., et al. The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).
- Bronesky, D., et al. A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus. The EMBO Journal. 38 (6), (2019).
- Lalaouna, D., et al. RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation. Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).
- Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).
- Garibyan, L., Avashia, N.
- Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions. Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 Unit 1.8 (2001).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).
- Krumlauf, R.
- Koontz, L.
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).
- Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria. Methods. 117, 67-76 (2017).
- Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions. Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).
- Georg, J., et al. The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs. Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).
