Summary
MAPS 技术已开发出来,以仔细审查体内特定监管 RNA 的目标。感兴趣的 sRNA 标有 MS2 贴录器,通过 RNA 测序实现其 RNA 合作伙伴的共同纯化及其标识。此修改后的协议特别适合革兰氏阳性细菌。
Abstract
虽然小的调节RNA(SRNA)在生命的细菌领域很普遍,但由于难以确定其mRNA目标,其中许多RNA的功能仍然很差。在这里,我们描述了MS2亲和力纯化与RNA测序(MAPS)技术的修改协议,旨在揭示特定sRNA在体内的所有RNA合作伙伴。从广义上讲,MS2 的贴合器与感兴趣的 sRNA 的 5' 四肢融合在一起。然后,此构造以体内表示,允许 MS2-sRNA 与其细胞伙伴进行交互。细菌收获后,细胞被机械地解化。粗提取物被加载到以前涂有MS2蛋白的淀粉样色谱柱中,该色谱柱与麦芽糖结合蛋白融合。这能够对 MS2-sRNA 进行特定捕获并交互 RNA。洗净后,通过高通量RNA测序和随后的生物信息分析确定共同纯化RNA。以下协议已在Gram阳性人类病原体 金黄色葡萄球菌 中实施,原则上可转为任何革兰氏阳性细菌。综上所述,MAPS 技术是深入探索特定 sRNA 监管网络的有效方法,可提供其整个目标图的快照。然而,必须记住,MAPS 确定的假定目标仍需要通过补充实验方法进行验证。
Introduction
在大多数细菌基因组中,已经发现了数百种,甚至数千种小型调节RNA(SRNA),但其中绝大多数的功能仍然不寻常。总的来说,sRNA是短的非编码分子,在细菌生理学和适应波动环境1,2,3中起着主要作用。事实上,这些大分子是众多复杂监管网络的中心,影响代谢途径、应激反应,但也影响毒性和抗生素耐药性。从逻辑上讲,它们的合成是由特定的环境刺激(例如营养饥饿、氧化或膜应力)触发的。大多数 sRNA 通过短和非连续基配对在转录后级别调节多个目标 mRNA。他们通常通过与核糖体竞争翻译启动区域4来阻止翻译的启动。sRNA:mRNA复式的形成也常常导致目标mRNA通过招募特定的RNA而主动退化。
sRNA 靶点(即其目标 RNA 的整组)的定性允许识别其干预的代谢通路及其回答的潜在信号。因此,特定 sRNA 的功能通常可以从其目标中推断出。为此,已经开发了几个西里科预测工具,如因塔纳和科普拉纳5,6,7。它们特别依赖于序列互补性、配对能量和潜在交互站点的可访问性,以确定假定 sRNA 合作伙伴。但是,预测算法并不集成影响体内基础配对的所有因素,例如 RNA 陪护8的参与,这些因素有利于次优交互或双方的共同表达。由于其固有的局限性,预测工具的误报率仍然很高。大多数实验性的大规模方法是基于sRNA的共纯化:mRNA夫妇与标记RNA结合蛋白(RBP)6,9相互作用。例如,通过利格化和测序(RIL-seq)方法识别出RNA复式与RNA伴郎(如大肠杆菌10、11中的Hfq和ProQ)共同纯化。一种类似的技术称为紫外线交叉链接,利化和混合测序(CLASH)被应用到大肠杆菌12,13的RNA和Hfq相关sRNA。尽管Hfq和ProQ在多种细菌8、14、15的sRNA介介调节中的作用十分突出,但在像S.Aureus16、17、18这样的几个生物体中,基于sRNA的调节似乎与RNA无关。即使像沃特斯和同事13所证明的那样,与RNA关联的RNA复式净化是可行的,但这种情况仍然很棘手,因为RNA会引发它们的快速退化。因此,MS2-亲和力纯化加上RNA测序(MAPS)方法19,20构成了这种生物体的坚实替代品。
与上述方法不同,MAPS 使用特定的 sRNA 作为诱饵来捕获所有相互作用的RNA,因此不依赖于 RBP 的参与。整个过程在 图1中描述。简言之,sRNA 标记为 5' 与 MS2 RNA 贴机,该贴子由 MS2 涂层蛋白特别识别。这种蛋白质与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合,固定在淀粉酶树脂上。因此,MS2-sRNA 及其 RNA 合作伙伴保留在亲和力色谱列中。与麦芽糖分离后,使用高通量RNA测序进行联合纯化RNA识别,然后进行生物信息分析(图2)。MAPS 技术最终绘制了一张内部发生的所有潜在交互的交互映射图。
MAPS技术最初是在非致病性革兰阴性大肠杆菌21中实施的。值得注意的是,MAPS 帮助识别了一个 tRNA 衍生片段,该片段与 RyhB 和 Rybb sRNA 特别交互,并防止任何 sRNA 转录噪声在非诱导条件下调节 mRNA 目标。此后,MAPS 已成功应用于其他大肠杆菌sRNA,如 DsrA22、RprA23、CyaR23和 GcvB24(表 1)。除了确认以前已知的目标外,MAPS 还扩展了这些众所周知的 sRNA 的目标范围。最近,MAPS已经在沙门氏菌蒂菲穆里姆进行,并透露,SraL sRNA绑定到rho mRNA,编码转录终止因子25。通过这种配对,SraL 保护rho mRNA 免受由 Rho 本身触发的过早转录终止。有趣的是,该技术不限于 sRNA,可以应用于任何类型的蜂窝RNA,例如使用 tRNA 衍生的片段26和 mRNA22的 5'未翻译区域 (表 1)。
MAPS方法也已适应致病性革兰阳性细菌S.金黄色葡萄球菌19。具体来说,裂解协议已被广泛修改,以有效地打破细胞,由于比Gram阴性细菌更厚的细胞壁,并保持RNA完整性。这个经过调整的协议已经解开了RSA27、RsaI28和RSAC29的相互作用。这种方法深入了解了这些 sRNA 在细胞表面特性、葡萄糖吸收和氧化应激反应的调控机制中的关键作用。
2015年在 大肠杆菌 中制定和实施的协议最近被详细描述了30。在这里,我们提供修改后的 MAPS 协议,该协议特别适合研究革兰阳性(较厚的细胞壁)细菌中的 sRNA 监管网络,无论是非致病细菌还是致病菌(安全预防措施)。
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Protocol
1. 缓冲区和媒体
- 对于 MAPS 实验,请准备以下缓冲区和媒体:
- 缓冲区A(150毫克,20米三轮车-HCl pH 8,1毫米M毫克2 和1米DTT)
- 缓冲E(250毫克,20米三轮车-HCl pH 8,12米麦芽糖,0.1%特里顿,1毫克2 和1毫克DTT)
- RNA加载缓冲区(0.025%二甲苯氰醇和0.025%溴酚蓝色在8M尿素)
- 脑心输液 (BHI) 介质 (12.5 g 小牛脑, 10 克肽, 5 克牛肉心脏, 5 克 NaCl, 2.5 克纳2HPO4 和 2 克葡萄糖 1 L)
- 莱索根尼·布罗斯(LB)介质(10克肽,5克酵母提取物和10克纳克1升) - 对于北方污点检测,准备以下缓冲区:
- 阻塞溶液(1x 雄酸和 1% 阻塞试剂)
- 混合溶液(50% 表酰胺、5 倍 SSC、7% SDS、1% 阻塞溶液和 0.2% N-劳丽尔沙可辛、50m 磷酸钠)。随着激动而发热溶解。
注意:小心注意与每种产品相关的安全防范措施。
- 1 M 磷酸钠(58m 磷酸钠二面体和 42m 磷酸钠单巴酸)
- 盐酸钠柠檬酸钠(SSC)缓冲器,20倍浓缩物(3M纳克和300m柠檬酸三钠)
2. 安全问题
- 在 2 级遏制实验室中执行涉及可行致病菌的所有步骤。
注意:裂解后,只能在外部提取细胞提取物(第 5 步)。 - 穿上实验室外套和手套。
- 确保手腕被覆盖。
- 用消毒液清洁生物安全柜(II类)。
- 将暴露在细菌中的固体废物丢弃在适当的生物医学箱中。
- 用消毒液处理含有受污染液体的烧瓶。然后,将其丢弃在水槽中。
- 在离开 2 级密封实验室之前,用肥皂小心地洗手和手腕,并脱下实验室外套。
3. 普拉斯米德建筑
注意:为了克隆目的,首先确定内源性sRNA的边界至关重要。pCN51-P3 和 pCN51-P3-MS2 质粒在托马西尼等人(2017)27中描述。P3 促进器允许以细胞密度依赖的方式(即当细菌进入静止生长阶段时)高表达 sRNA。许多葡萄球菌SRNA在这个生长阶段积累。
- 使用高保真DNA聚合酶和PCR机,通过PCR放大sRNA序列。请仔细遵循制造商的说明,阅读加里比扬和阿瓦希亚 (2013)31 了解更多详情。
- 使用以下模板设计特定引物:
和 5 '- CGCGGATCC(N) -3' 分别为转发和反向引金。
注意:这些寡核苷酸能够将 MS2 序列(粗体)融合到感兴趣的 sRNA 的 5' 端。 普斯特I 和 BamHI 限制站点(下划线)在 MS2-sRNA 构造的 5' 和 3' 四肢添加,以克隆放大体到 pCN51-P3 质粒27中。(N) 对应于基因特异性序列(15-20 核苷酸)。 - 根据制造商的建议,在适当的缓冲区中,文摘 1μg pCN51-P3 质粒和 MS2-sRNA PCR 产品 1 μg,其中 2 U 的 PstI 和 1 U 的 BamHI。
- 在 37 °C 下孵化 1 小时,使用 PCR 净化套件净化 DNA(参见 材料表)。
- 将消化的 pCN51-P3 质粒 (300 ng) 和 MS2-sRNA 放大器(矢量的摩尔比:插入 = 1:3)混合在 1.5 mL 管中。见里维等人(1988年)32, 以最大限度地提高连带效率。在每个管中加入 1 μL 的连气缓冲器和 10 U 的 T4 升。用超纯水将体积调整到 10 μL。
- 在22°C孵育至少2小时。
- 将 5μL 的粘合混合物添加到 50 μL 的冷冻 DH5® 化学能力 大肠杆菌 细胞中。阅读塞德曼等人(2001年)33, 了解更多关于质粒转化和化学能力的细胞。
- 在冰上孵化30分钟。
- 使用热块或水浴的变换管(42 °C 处的 45°C)热冲击(45 s)。
- 添加 900 μL 的 LB 介质,在 37 °C 孵化 30 分钟。
- LB agar 板上的细菌悬浮板 100 μL 板,并辅以安培林 (100 μg/μL)。
注:pCN51-P3载体编码了一个抗胆碱基因,该基因只能选择携带pCN51-P3-MS2-sRNA质粒 的大肠杆菌 克隆。 - 使用质粒DNA迷你素套件(见 材料表)从在安非他明(100μg/μL)存在的情况下生长的隔夜细菌培养物(5 mL)中提取pCN51-P3-MS2-sRNA质粒。
- 使用以下引号 5'-TCTC 加塔塔加格-3'对 34 进行桑格测序来验证构造。
- 将 pCN51-P3-MS2-sRNA 质粒转换为 DC10B 化学能力 大肠杆菌 细胞。重复步骤 3.7 到 3.11。
- 提取 pCN51-P3-MS2-sRNA 质粒(参见步骤 3.12),使用电聚变装置将 1-5μg 的质粒DNA转化为 HG001 ΔsRNA电能的 S. aureus 细胞。请按照制造商的说明操作。阅读格罗瑟和理查森 (2016)35 了解更多关于准备电能 S. aureus 的方法。
注意:这一步骤涉及处理致病菌(见第2步)。 - 添加 900 μL 的 BHI 介质,在 37 °C 下孵化 3 小时。
- 离心机 1 分钟,16,000 x g。丢弃超自然人。
- 将颗粒重新喷入 100 μL 的 BHI 中,并将 BHI agar 板上的细菌悬浮板与红霉素 (10 μg/μL) 补充。
注:pCN51-P3载体还编码了红霉素耐药基因,该基因仅能选择携带pCN51-P3-MS2-sRNA质粒的 金黄色葡萄球菌 克隆。
4. 细菌收获
注意:此步骤涉及处理致病菌(参见第 2 步)。
- 在 3 mL 的 BHI 介质中生长一组携带 pCN51-P3-MS2-sRNA 或 pCN51-P3-MS227 质粒的菌株,并在重复中补充红霉素 (10μg/μL)。
- 将每个隔夜文化稀释在 50 mL(≈1/100)的新鲜 BHI 介质中,辅以红霉素 (10μg/μL),达到0.05 的 OD 600nm。 使用 250 mL 灭菌烧瓶(5:1 烧瓶与中等比例)。
注:应根据所研究的sRNA的表达模式设置中等和生长条件。 - 在 37 °C 下生长文化,在 180 rpm 时以 6 小时的速度摇晃。
- 将每个培养件转移到一个 50 mL 离心机管中。
- 离心机在 2,900 x g 在 15 分钟内在 4 °C. 丢弃超自然人。
- 将颗粒保持在冰上,直接执行机械细胞裂解(第 5 步)或在 -80 °C 下冻结和储存颗粒。
5. 机械细胞裂解
注意:以下步骤必须在冰上执行,缓冲器必须在 4 °C。 使用手套并采取所有预防措施,保护样品免受 RNases 的保护。
- 在缓冲区 A 的 5 mL 中重新喷射颗粒(步骤 4.6)。
- 将再悬浮的细胞转移到15mL离心管中,并带有3.5克二氧化硅珠(0.1毫米)。
- 将管插入机械单元解仪器中(参见 材料表)。以 4.0 m/s 的速度运行 40s 的循环。
注意:如果一个周期不足以破坏细胞,让设备冷却5分钟,同时将样品保持在冰上。然后,以 4.0 m/s 重复另一个 40s 周期。细胞裂解的效率可以通过在BHI-agar板上电镀超自然来测试。 - 离心机在15,700 x 克 15分钟。恢复超自然,并保持在冰上。
6. 列准备
注意:小心不要让淀粉样树脂干燥。如有必要,请用末端盖密封列。在开始亲和力纯化之前,先准备所有解决方案。
- 将色谱列放在柱架中(参见 材料表)。
- 取出柱尖,用超纯净水清洗柱子。
- 加入300微升淀粉样酶树脂。
- 用 10 mL 的缓冲区 A 清洗柱。
- 在缓冲区 A 的 6 mL 中稀释 MBP-MS2 蛋白质 1,200 pmol,并将其加载到列中。
- 用 10 mL 的缓冲区 A 清洗柱。
7. MS2亲和力纯化 (图1)
- 将细胞解体加载到列中。
注意:保持细胞核糖精(原油提取物,CE)的1mL提取总RNA(步骤8),并执行北斑(步骤9)和转录(步骤10)分析。 - 在干净的收集管中收集流过分数 (FT)。
- 用 10 mL 的缓冲区 A 洗柱 3 次。
- 用 1 mL 缓冲 E 将列进行,并在 2 mL 微管中收集 elution 分数( E )。
- 将所有收集的分数保留在冰上,直到RNA提取(第 8 步)或将其冻结在 -20 °C 以供以后使用。
8. 收集分数的RNA提取(CE、FT、W 和 E)
- 使用每个分数的 1 mL(包括 FT 和 W)进行 RNA 提取。
- 添加1卷酚。大力混合。
注意:酚是挥发性和腐蚀性的,注意并安全地在烟雾罩下工作。 - 离心机在16,000 x g 10分钟在20°C。
- 在干净的2mL微管中转移上一阶段。
- 加入 1 卷氯仿/异酰醇 (24:1),重复步骤 8.3 至 8.4。
注意:在烟雾罩下安全工作。 - 加入 2.5 卷冷乙醇 100% 和 1/10 卷 3 M 醋酸钠 (NaOAc) pH 5,2。
- 在 -20 °C 下过夜。
注意:降水也可以在20分钟内在乙醇/干冰浴中进行,或在2小时内在-80°C。 - 离心机在 16,000 x g 15 分钟在 4 °C。 用移液器慢慢去除乙醇,同时小心不要干扰颗粒。
注意:RNA颗粒并不总是可见的,有时在乙醇的存在下是松散的。 - 加入 500 μL 的 80% 冷乙醇。
- 离心机在16,000 x g 5分钟在4°C。
- 通过缓慢地输送乙醇来丢弃乙醇。使用真空浓缩器干燥颗粒,运行模式为 5 分钟。
- 将颗粒以适当的体积(15-50 μL)的超纯水中补充。将颗粒冻结在-20°C,供以后使用。
- 使用光谱仪/荧光计(参见 材料表)评估RNA数量(260纳米)和质量(260/280和260/230波长比)。请按照制造商的说明操作。
注:3-4μg 一般在弹性分数 (E) 中获得。这主要取决于测试条件。
9. 分析MS2亲和力纯化由北方污点36
- 在 10 μL 的超纯水中稀释 5 μg 的 CE、FT、W 分数和 500 ng E 分数,并与 10 μL 的 RNA 加载缓冲器混合。
- 在90°C孵育3分钟。
- 将样品放入含有 1% agarose 凝胶的井中,辅以 20 mM 的紫青酸瓜尼丁,并在 4 °C 的 TBE 1x 缓冲器中以 100-150 V 运行凝胶。 阅读孔茨 (2013)37 了解更多详情。
- 通过真空转移在硝基纤维素膜上转移RNA,进行1小时或毛细血管转移过夜。
注意:毛细血管方法对大型RNA更有效。 - 使用紫外线交叉链接器在膜上(120 mJ 在 254 nm 处)上进行紫外线交叉链接RNA。
- 将膜插入混合瓶中,RNA 侧朝上。
- 添加10-20 mL预热杂交解决方案。在 68 °C 孵化 30 分钟。
- 丢弃溶液,加入 10-20 mL 的新鲜杂交溶液,辅以 sRNA 特异性探针的 1μL。在 68 °C 的夜间孵化。
注:DIG 标签 RNA 探头使用 DIG RNA 标签套件合成,并遵循制造商的说明。或者,还可以使用带无线电标记的探头。 - 用10-20 mL的洗涤溶液1(2倍SSC和0.1%SDS)清洗膜5分钟,在20°C。 重复一次。
- 在 68 °C 时,用 10-20 mL 的洗涤溶液 2(0.2 倍 SSC 和 0.1% SDS)清洗膜 15 分钟。 重复一次。
- 在20°C下,用10-20 mL的阻塞解决方案孵化至少30分钟。
- 丢弃溶液,加入10-20 mL的阻塞溶液,辅以多克隆抗二恶英抗体(1/1000),与碱性磷酸结合。在20°C孵育30分钟。
- 用10-20 mL的洗涤溶液3(1x雄酸和0.3%补间20)清洗膜15分钟,在20°C。 重复一次。
- 在 20 °C 时,用 10-20 mL 的检测解决方案(0.1 M Tris HCl 和 0.1 M NaCl pH 9.5) 5 分钟孵化膜。
- 将膜放在塑料薄膜上,用基板浸泡(见 材料表)。在黑暗中孵育5分钟。
- 将膜密封在塑料薄膜中。将膜放入自传磁带中。
- 在专用的黑暗房间将膜暴露在自辐射胶片中。
注:阐述时间取决于信号强度,从几秒钟到几分钟。 - 在自动开发设备中显示暴露的薄膜。
10. 为RNA测序准备样品
注:此步骤仅涉及从 E 和 CE 分数中提取的 RNA。
- 添加到每个样本 10 μL 的 10 倍 DNase 缓冲器和 DNase I (1 U/μg 的处理RNA)。加入水,最终积100微l。
- 在37°C孵化1小时。
- 提取和净化 RNA,如前所述(步骤 8.2 至 8.11)。
- 将RNA颗粒在20微升的超纯水中补充。
注:剩余DNA的存在可以通过PCR和特定引物(例如16S基因)进行检查。 - 使用基于微流体的电泳电泳分析系统评估RNA的数量和质量(见 材料表)。
注:1μg 一般在 DNase 治疗后在洗脱分数 (E) 中获得。 - 使用细菌 rRNA 耗竭套件去除核糖核
注意:大而丰富的RNA(即rRNA)往往与亲和力列进行非具体交互。执行此步骤需要 500 ng 提取的 RNA。 - 再次使用基于微流体的电泳电泳分析系统评估RNA的数量和质量。
- 使用 cDNA 库准备套件并按照制造商的说明使用 10-20 ng 的核糖核素 RNA 编写 cDNA 库。
- 使用测序仪器对获得的库进行排序(例如,单端,150 bp;参见 材料表)。
注:每个样本的读数一般为 500 万至 1000 万次。
11. RNAseq 数据分析 (图 2)
- 从测序平台下载 FastQ 排序文件。
- 访问罗斯科夫生物站(https://galaxy.sb-roscoff.fr/)的银河实例并登录。
注意:使用搜索栏可以轻松找到每个上述算法。为每个工具提供用户指南。
注意:所需工具的版本可能不同于公共银河服务器38。 - 点击 获取数据 图标,然后 从您的计算机上传文件。上传每个 MS2 控制和 MS2-sRNA 样本的快速Q测序文件。还上传 FASTA 参考基因组文件和 GFF 注释文件。
- 运行快速QC阅读质量报告(银河版本0.69)。
注:此工具提供原始序列的质量评估(例如,质量评分、适配器序列的存在)。 - 运行修剪灵活读取修剪工具(银河版本 0.36.6),以显著删除适配器序列和劣质读数。指示用于库准备的适配器序列(例如,TruSeq 3,单端)。添加以下修剪操作:滑动窗口(基地数量=4;平均质量=20)和迷你(最小读数长度=20)。
- 再次运行 FastQC 读取质量报告(银河版本 0.69)。
- 运行 Bowtie2 - 地图读取参考基因组(银河版本 2.3.2.2)。使用历史记录中的基因组参考 FASTA 文件以默认设置(非常敏感的本地设置)映射读取。
注:Bowtie2 工具生成的 BAM 文件可以使用集成基因组学查看器 (IGV) 可视化。还需要关联 BAI 文件。 - 可选地运行用于编制 BAM 数据集统计数据的"运行旗杆"(银河版本 2.0)。
- 运行 htseq 计数 - 计数(银河版本 0.6.1),该版本对齐 GFF 注释文件中的读取重叠功能。使用交集(非空)模式。
- 将htseq计数分析中的所有原始计数文件存档为单个Zip文件。
- 运行 SARTools DESeq2 以比较数据(银河版本 1.6.3.0)。提供包含原始计数文件和设计文件的 Zip 文件,这是描述实验的选项卡划定文件。仔细遵循所提供的指示生成设计文件。
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Representative Results
具有代表性的结果源于对金黄色葡萄球菌29的RSAC靶点的研究。RsaC 是一种非常规的 1,116 nt 长 sRNA。其 5' 端包含多个重复区域,而其 3' 端 (544 nt) 在结构上是独立的,并包含与其 mRNA 目标的所有预测交互站点。当锰 (Mn) 稀缺时,就会诱导这种 sRNA 的表达,这通常在宿主免疫反应的背景下遇到。使用 MAPS 技术,我们识别了几个 mRNA 直接与 RsaC 相互作用,揭示了它在氧化应激 (草皮、ldh1和sarA)和金属相关(znuBC-zur和sufCDSUB)反应中的关键作用。
MS2-sRNA 构造和实验条件的验证
在进行 MAPS 实验之前,确定所研究的 sRNA 的最佳表达条件非常重要。如果使用非本地推广器,当存在目标时,它将最终帮助生成 MS2-sRNA 构造。此外,MS2-sRNA 结构应在大小、稳定性、表达和功能方面进行仔细验证。MS2 aptamer 融合到全长 RsaC (MS2-RsaC1116)的 5' 端,或与 RsaC 的 3' 部分对应的较短表单 (MS2-RsaC544)的末端。这两种构造都是在 S. aureus HG001 ΔrsaC 的法定传感依赖 P3 发起人的控制下以体内表示的。 rsaC 基因的删除避免了内源性RSAC和MS2-RsaC之间的竞争。仅使用带有 MS2 标签的相同向量的野生型菌株用作控制。此控制允许减去与 MS2 标签发生的非特定交互。
为了确认其表达模式的构造和可视化,细菌细胞在 BHI 介质在 37 °C 的 2 h、 4 h 和 6 h 生长后被收获。 RNA提取后,使用 RsaC 特异性 DIG 探头(图 3A)进行北斑分析。内源性 RsaC(车道 1-3)在生长 6 小时后显著增加,这证明选择这个时间点进行 MAPS 实验是合理的。重要的是,MS2-RsaC544( 车道7-9)和MS2-RsaC1,116( 车道10-12)的水平可与6小时内源性RSAC相媲美。因此,它们应该模仿RSAC的内生表达模式。更大但较小的 RsaC 形式是可区分的,可能是由于转录的低效端。当 MS2-sRNA 在质粒21的强促进器的控制下表达时,经常会观察到这种现象。未观察到由异常转录终止或降解导致的较短形式。
在 sRNA 的 5' 中添加 MS2 aptamer 也可能破坏其适当的折叠并影响其功能。这一步骤对于高度结构化的 SRNA 作为 RsaC 至关重要。因此,MS2-sRNA活动应进行测试,并在可能的情况下与内源性sRNA进行比较。先前已知的目标或可观察到的表型可以帮助监视它。例如,RsaC 对细胞内 ROS 积累的影响用于验证 MS2-RsaC544 和 MS2-RsaC1,116 构造29。
亲和力纯化过程中收集的分数分析
RNA 是从 WT 菌株中的 CE、FT 和 E 分数中提取的,仅表达 MS2 标签,并Δ表示 MS2-RsaC544构造的rsaC菌株。我们使用北方污点分析显示,1,116 nt 长的内源 RsaC 在弹性部分被丰富,但结果证明与亲和力列(图 3B,车道 2-3)非具体交互。我们观察到MS2-RsaC1,116(未显示数据)的相同现象。这当然是由于其长度和复杂的二级结构。因此,只有结构较差且较短的 RsaC 形式(544 nt)与其 3' 部分相对应,用于执行 MAPS 实验。在图3B中,MS2-RsaC544在浓缩分数中高度浓缩,表明它被MS2-MBP融合蛋白(第6车道)成功保留。在图3A中观察到一种更大但较小的MS2-RsaC544形式。在这里,可调整洗涤的细度和数量,以减少非特定绑定,或者相反,以限制真正交互伙伴的损失。
地图分析后对假定 mRNA 目标的验证
在生物信息分析之后,根据使用DeSeq2(图2)获得的MS2-sRNA和MS2控制之间的折叠变化列出假定mRNA目标。例如,MS2-RsaC544 MAPS 数据29表明,在金黄色葡萄球菌中编码超氧化物分解的草皮mRNA 是主要目标(最佳命中、更高折叠更改)。与 MS2 控制(图 3C)相比,在 MS2 亲和力纯化后,用针对湿度的DIG 探头进行的北方污点分析表明,与 MS2 控制(图 3C)相比,sodA与 MS2-RsaC544有效共丰富。
系统地对 CE 分数进行全球转录分析。MAPS 数据的比较和此转录分析有助于调整富集比率并揭示潜在的目标层次结构。事实上,表达不力的 mRNA,在 MS2 亲和力纯化后高度丰富,肯定比高度丰富和高度表达的 mRNA 具有更大的约束亲和力。
需要注意的是,MAPS 识别的所有候选者都必须使用体外和/或体内实验(如电泳移动移位测定 (EMSA) 或记者基因测定(参见 Jagodnik 等人(2017)39) 单独验证,以了解更多详细信息)。
图1。适用于 金黄色葡萄球菌的地图协议的示意图说明。 从质粒结构到数据分析。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2。地图分析工作流程和处理数据。 表示每个步骤、检查点和文件格式(另请参阅步骤 11)。FastQ 格式是一个文本文件,由 DNA 序列和相应的质量评分组成。BAM 格式是包含对齐序列的压缩文件。表格格式是一个标签划分的文本文件,每个基因的计数。结果图说明了生物信息分析后获得的数据类型。呈现的结果是虚构的,并非来自任何研究。有关更多详细信息,基本教程可在银河项目网站 (https://galaxyproject.org/) 上找到。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3:构造验证和地图控制。A.内源 RsaC sRNA 和相关 MS2 构造的北污点分析。WT 菌株携带 pCN51-P3-MS2 (控制) 和ΔrsaC突变菌株携带 pCN51-P3-MS2、pCN51-P3-MS2-RsaC544或 pCN51-P3-MS2-RsaC1,116。样本是在 BHI 在 37 °C 的 2 小时、4 小时和 6 小时增长后采集的。 使用 RsaC 特定的 DIG 探头执行了北污点检测。B.使用 RsaC 特定的 DIG 探头对 MS2 亲和力纯度分数进行北印分析。共纯化使用 WT 菌株 + pCN51-P3-MS2 (控制) 和ΔrsaC突变菌株 + pCN51-P3-MS2-RsaC544执行。在 BHI 中 6 小时的生长后,在 37 °C 时收获细胞。 粗提取物 (CE),流经 (FT),洗脱 (E)。C. 使用特定于sodA的 DIG 探头对 MS2 亲和力纯度分数 (CE 和 E) 进行北印分析。有关详细信息,请参阅 (B) 。请单击此处查看此图的较大版本。
核糖核酸 | 类型 | 参考 |
大肠杆菌 | ||
瑞布 | 斯纳 | 拉劳纳 等人 (2015)21 |
瑞布 | 斯纳 | 拉劳纳 等人。(2015)21 |
3'ETS卢兹 | tRNA衍生片段 | 拉劳纳和马塞 (2015)26 |
斯拉 | 斯纳 | 拉劳纳 等人。(2015)22 |
hns | 姆纳 (5'UTR) | 拉劳纳 等人。(2015)22 |
西亚尔 | 斯纳 | 拉劳纳 等人。(2018)23 |
Rpra | 斯纳 | 拉劳纳 等人。(2018)23 |
格茨布 | 斯纳 | 拉劳纳 等人。(2019)24 |
沙门氏菌 蒂菲穆里姆 | ||
斯拉尔 | 斯纳 | 席尔瓦 等人。(2019)25 |
金黄色葡萄球菌 | ||
拉萨 | 斯纳 | 托马西尼 等人。(2017)27 |
雷萨克 | 斯纳 | 拉劳纳 等人。(2019)29 |
雷赛 | 斯纳 | 布罗内斯基 等人。(2019)28 |
表1。MAPS技术揭示了各种生物体中几个RNA的目标。
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Discussion
革兰氏阳性细菌的修改协议
MAPS的初始协议是为了研究大肠杆菌20、30模型中的sRNA相互作用而开发的。在这里,我们描述了一个修改后的协议,它适用于机会性人类病原体金黄色葡萄球菌中依赖sRNA的监管网络的特征,并且肯定可转化为其他Gram阳性细菌,病原学与否。
特别注意细胞裂解步骤。法国的印刷机已被机械细胞裂解仪所取代。这种方法是有效的打破革兰阳性细胞和限制风险与处理致病菌株。为了提高MS2亲和力纯度的产量,淀粉酶树脂上固定的MS2-MBP数量大幅增加。这需要调整洗涤的细度和次数。
与最初的协议不同,MAPS 是在这里重复执行的,来自两个生物复制品。已开发出一个工作流程,以实施统计分析(图 2),这最终提高了获得数据的稳健性。
MS2 构造及其表达
此 MAPS 协议的建立旨在确定葡萄球菌 SRNA 的目标。MS2-sRNA 构造由低拷贝数质粒(pCN51、20 到 25 副本/单元)表示,并在法定人数感应依赖 P3 促进器的控制下表示,主要在静止阶段诱导。此表达模式与研究的 S. aureus(即 RsaA、RsaI 和 RsaC)中的 SRNA 相对应,并确保具有相当强大的 MS2-sRNA 合成。然而,我们不能排除,在其他情况下,P3促进剂可能不合适,不反映细菌的自然生理状态时,sRNA被诱导。控制 MS2-sRNA 生产的另一种方法是使用化学诱导促进剂(例如四环素不可诱导的促进剂)。这些工具允许 MS2-sRNA 构造的脉冲表达,但此设置并不保证 RNA 目标将同时表达。另一个缺点是,质粒中的表达可能导致研究的 sRNA 的过度生产,更强调与高拷贝数矢量。这可能导致人工交互或相关 RNA 陪护功能的中断。最合适的选择是在内源性sRNA基因的5'末端插入MS2标签。因此,MS2-sRNA 将被色谱编码,并在其原生发起人的控制下。这应该更好地模仿研究sRNA的内生表达,避免因研究的sRNA的过度生产而产生偏差。无论如何,关键步骤是仔细验证 MS2-sRNA 构造的长度、稳定性和功能,特别是使用从触发内源性 sRNA 生产和功能条件下生长的培养物中提取的全RNA的北方污点检测。不可否认,使用不当/不起作用的 MS2-sRNA 构造可能会极大地影响生成的结果,支持上述控制的重要性。最后,MS2-sRNA 始终在ΔsRNA 背景中生成,以最大限度地丰富 mRNA 目标。此外,可以在RNAses(例如,删除突变体或温度敏感突变体)中具有特定突变的宿主菌株中进行实验,以避免通过依赖RNA的RNA招募RNA来降低mRNA目标。
仍需要对 MAPS 识别的考生进行实验验证
需要考虑的一点是,MAPS 提供了一个假定 RNA 目标列表。然而,一些RNA可能通过与共享的mRNA靶点或RNA结合蛋白的相互作用间接丰富。因此,被披露的候选人必须通过其他实验方法予以确认。EMSA 和脚印实验通常用于可视化 sRNA 与体外假定 RNA 目标的直接结合。然后,体外脚趾打印分析有助于监测 sRNA 对其 mRNA 目标的翻译启动的影响。最后,北方污点和/或基因记者检测(lacZ 或 gfp)补充了这种实验验证在体内。所有这些方法都用贾戈德尼克等人(2017)39年描述。
与 RIL-seq 和 CLASH 技术不同,MAPS 不会直接提供交互站点的信息。然而,在RNA目标的禁区(例如 ,glyW-cysT-leuZ 21的3'结束)经常观察到映射读数的峰值,从而有助于对接站点的识别。或者,还可以使用多种预测工具来预测已确定目标(如 IntaRNA40)上的假定绑定位点。
地图仔细检查特定 sRNA 的目标
MAPS技术适用于研究大肠杆菌和S.Typhimurium等革兰阴性细菌中的sRNA靶点,但现在也适用于像金黄色葡萄球菌这样的革兰阳性细菌的这种修改协议。基本上,MAPS 提供了 RNA:sRNA 复式在给定时间和特定生长条件下形成的快照。不幸的是,mRNA目标列表可能不完整。例如,由于不适当的实验条件,可错过同质mRNA目标,从而证明上述预防措施是正当的。
与其他常用的方法(如 RIL-seq 或 CLASH)相比,MAPS 使用特定的 sRNA 共同净化所有相互作用的 RNA 目标。在这里,sRNA:RNA 相互作用不会在其他 RBP 相关复式中稀释,从而在理论上更深入地描述其目标。然而,似乎RIL-seq/CLASH和MAPS方法揭示了不同的一套假定sRNA目标12,41,这表明这些实验方法是互补的。这种差异可以通过每种方法产生的生长条件和/或偏差的变化来解释。
因此,研究的目的应影响方法的选择。对于 sRNA 目标群的全球分析,以及当 RBP 参与 sRNA 介质监管时,应首选 RIL-seq 和冲突方法。这两种方法都概述了依赖特定 RBP 的监管网络,从而发现了各种各样的 sRNA 和相关目标。相反,对于特定 sRNA 的研究或当已知/未涉及 RBP 时,MAPS 代表一个适当的选项。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了"国家重建联盟"(ANR,授予ANR-16-CE11-0007-01,RIBOSTAPH,和ANR-18-CE12-0025-04,科诺科,公关)的支持。它还在实验室交易所 NetRNA ANR-10-LABX-0036 和 ANR-17-EURE-0023(对 PR)的框架下发布,作为未来项目投资的一部分,由 ANR 管理的国家提供资金。DL得到了欧盟Horizna 2020研究和创新计划的支持,该计划是根据玛丽·斯考多斯卡-库里赠款协议第753137-萨纳雷格号。E. Massé实验室的工作得到了加拿大卫生研究所(CIHR)、加拿大自然科学和工程研究理事会(NSERC)和国家卫生研究院NIH团队赠款R01 GM092830-06A1的运营赠款的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
References
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