Summary
La tecnología MAPS se ha desarrollado para escudriñar el targetome de un ARN regulador específico in vivo. El sRNA de interés está etiquetado con un aptámero MS2 que permite la co-purificación de sus socios de ARN y su identificación por secuenciación de ARN. Este protocolo modificado es particularmente adecuado para bacterias Gram-positivas.
Abstract
Aunque los pequeños ARN reguladores (ARNs) están muy extendidos entre el dominio bacteriano de la vida, las funciones de muchos de ellos siguen estando mal caracterizadas, en particular debido a la dificultad de identificar sus dianas de ARNm. Aquí, se describe un protocolo modificado de la purificación ms2-afinidad junto con la tecnología de secuenciación de ARN (MAPAS), con el objetivo de revelar todos los socios de ARN de un sRNA específico in vivo. En términos generales, el aptámero MS2 se fusiona con la extremidad 5' del sRNA de interés. Esta construcción se expresa entonces in vivo, permitiendo que el MS2-sRNA interactúe con sus socios celulares. Después de la recolección bacteriana, las células se lisan mecánicamente. El extracto crudo se carga en una columna de cromatografía a base de amilosa previamente recubierta con la proteína MS2 fusionada con la proteína de unión a la maltosa. Esto permite la captura específica de MS2-sRNA y de los ARN que obran recíprocamente. Después de la elución, los ARN co-purificados se identifican mediante la secuenciación de ARN de alto rendimiento y el posterior análisis bioinformático. El siguiente protocolo se ha implementado en el patógeno humano Gram-positivo Staphylococcus aureus y es, en principio, transponible a cualquier bacteria Gram-positiva. En resumen, la tecnología MAPS constituye un método eficiente para explorar profundamente la red reguladora de un sRNA en particular, ofreciendo una instantánea de todo su targetome. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los supuestos objetivos identificados por MAPS todavía necesitan ser validados por enfoques experimentales complementarios.
Introduction
Cientos, quizás incluso miles de pequeños ARN reguladores (ARNs) se han identificado en la mayoría de los genomas bacterianos, pero las funciones de la gran mayoría de ellos permanecen sin caracterizar. En general, los ARNs son moléculas cortas no codificantes, que desempeñan un papel importante en la fisiología bacteriana y la adaptación a entornos fluctuantes1,2,3. De hecho, estas macromoléculas están en el centro de numerosas redes reguladoras intrincadas, impactando las vías metabólicas, las respuestas al estrés, pero también la virulencia y la resistencia a los antibióticos. Lógicamente, su síntesis es desencadenada por estímulos ambientales específicos (por ejemplo, hambre de nutrientes, estrés oxidativo o de membrana). La mayoría de los sRNAs regulan múltiples ARNm diana a nivel post-transcripcional a través de emparejamiento de bases corto y no contiguo. Por lo general, impiden la iniciación de la traducción compitiendo con los ribosomas para las regiones de iniciación de la traducción4. La formación de sRNA: dúplex de ARNm también a menudo resulta en la degradación activa del ARNm objetivo mediante el reclutamiento de ARN específicas.
La caracterización de un sRNA targetome (es decir, el conjunto completo de sus ARN diana) permite la identificación de las vías metabólicas en las que interviene y la señal potencial a la que responde. En consecuencia, las funciones de un sRNA específico generalmente se pueden inferir de su targetoma. Para ello, se han desarrollado varias herramientas de predicción in silico como IntaRNA y CopraRNA5,6,7. En particular, se basan en la complementariedad de la secuencia, la energía de emparejamiento y la accesibilidad del sitio de interacción potencial para determinar los supuestos socios de sRNA. Sin embargo, los algoritmos de predicción no integran todos los factores que influyen en el emparejamiento de bases in vivo, como la implicación de las chaperonas de ARN8 favoreciendo interacciones subóptimas o la coexpresión de ambos socios. Debido a sus limitaciones inherentes, la tasa de falsos positivos de las herramientas de predicción sigue siendo alta. La mayoría de los enfoques experimentales a gran escala se basan en la co-purificación de las parejas de ARNm:ARNm que interactúan con una proteína de unión a ARN marcada (RBP)6,9. Por ejemplo, el método de interacción de ARN por ligadura y secuenciación (RIL-seq) identificó dúplex de ARN co-purificados con chaperonas de ARN como Hfq y ProQ en Escherichia coli10,11. Una tecnología similar llamada RETICULADO UV, Ligadura y Secuenciación de Híbridos (CLASH) se aplicó a la ARNasa E- y Hfq asociados a sRNAs en E. coli12,13. A pesar de los papeles bien descritos de Hfq y ProQ en la regulación mediada por sRNA en múltiples bacterias8,14,15,la regulación basada en ARN parece ser independiente de la chaperona de ARN en varios organismos como S. aureus16,17,18. Incluso si la purificación de los dúplex de ARN en asociación con RNases es factible como lo demuestran Waters y sus compañeros de trabajo13,esto sigue siendo complicado ya que las RNases desencadenan su rápida degradación. Por lo tanto, el enfoque de purificación de MS2-afinidad junto con la secuenciación de ARN (MAPS)19,20 constituye una alternativa sólida en tales organismos.
A diferencia de los métodos mencionados anteriormente, MAPS utiliza un sRNA específico como cebo para capturar todos los ARN que interactúan y, por lo tanto, no depende de la participación de un RBP. Todo el proceso se representa en la Figura 1. En resumen, el sRNA está etiquetado en el 5' con el aptámero de ARN MS2 que es específicamente reconocido por la proteína de la capa MS2. Esta proteína se fusiona con la proteína de unión a la maltosa (MBP) para ser inmovilizada en una resina de amilosa. Por lo tanto, MS2-sRNA y sus socios del ARN se conservan en la columna de la cromatografía de la afinidad. Después de la elución con maltosa, los ARN co-purificados se identifican mediante secuenciación de ARN de alto rendimiento seguida de análisis bioinformáticos (Figura 2). En última instancia, la tecnología MAPS dibuja un mapa de interacción de todas las interacciones potenciales que ocurren in vivo.
La tecnología MAPS se implementó originalmente en la bacteria Gram-negativa no patógena E. coli21. Cabe destacar que MAPS ayudó a identificar un fragmento derivado del ARNt que interactúa específicamente con los sRNAs de RyhB y RybB y previene cualquier ruido transcripcional de ARN para regular los objetivos de ARNm en condiciones no inductoras. A partir de entonces, MAPS se ha aplicado con éxito a otros ARNs de E. coli como DsrA22,RprA23,CyaR23 y GcvB24 (Tabla 1). Además de confirmar objetivos previamente conocidos, MAPS extendió el targetome de estos sRNAs bien conocidos. Recientemente, MAPS se ha realizado en Salmonella Typhimurium y reveló que el sRNA SraL se une al ARNm rho, codificando para un factor de terminación de la transcripción25. A través de este emparejamiento, SraL protege rho mRNA de la terminación prematura de la transcripción desencadenada por Rho sí mismo. Curiosamente, esta tecnología no se limita a los ARNs y se puede aplicar a cualquier tipo de ARN celulares como se ejemplifica mediante el uso de un fragmento derivado del ARNt26 y una región 5'-no traducida del ARNm22 (Tabla 1).
El método MAPS también se ha adaptado a la bacteria grampositiva patógena S. aureus19. Específicamente, el protocolo de lisis ha sido ampliamente modificado para romper eficientemente las células debido a una pared celular más gruesa que las bacterias Gram-negativas y para mantener la integridad del ARN. Este protocolo adaptado ya desentrañó el interactoma de RsaA27,RsaI28 y RsaC29. Este acercamiento dio penetraciones en el papel crucial de estos sRNAs en mecanismos reguladores de las propiedades de la superficie de la célula, de la absorción de la glucosa, y de las respuestas oxidativas de la tensión.
El protocolo desarrollado e implementado en E. coli en 2015 ha sido descrito recientemente con gran detalle30. Aquí, proporcionamos el protocolo MAPS modificado, que es particularmente adecuado para el estudio de redes reguladoras de ARN en bacterias Gram-positivas (pared celular más gruesa) ya sean no patógenas o patógenas (precauciones de seguridad).
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Protocol
1. Buffers y medios
- Para los experimentos MAPS, prepare los siguientes búferes y medios:
- Buffer A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 y 1 mM TDT)
- Buffer E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltosa, 0,1% Tritón, 1 mM MgCl2 y 1 mM TDT)
- Tampón de carga de ARN (0,025% de xileno de cianol y 0,025% de azul de bromofenol en urea de 8 M)
- Medio de infusión de corazón cerebral (BHI) (12,5 g de cerebro de ternero, 10 g de peptona, 5 g de corazón de res, 5 g de NaCl, 2,5 g de Na2HPO4 y 2 g de glucosa para 1 L)
- Caldo de Lisogenia (LB) medio (10 g de peptona, 5 g de extracto de levadura y 10 g de NaCl por 1 L) - Para los ensayos de Northern blot, prepare los siguientes búferes:
- Solución de bloqueo (1x ácido maleico y reactivo de bloqueo al 1%)
- Solución de hibridación (50% formamida, 5x SSC, 7% SDS, 1% solución de bloqueo y 0,2% N-lauril sarcosina, 50 mM de fosfato sódico). Calentar con agitación para disolverse.
PRECAUCIÓN: Siga cuidadosamente las precauciones de seguridad relacionadas con cada producto.
- 1 M de fosfato sódico (58 mM de fosfato sódico dibásico y 42 mM de fosfato sódico monobásico)
- Solución salina, tampón de citrato de sodio (SSC), concentrado de 20x (3 M NaCl y citrato trisódico de 300 mM)
2. Cuestiones de seguridad
- Lleve a cabo todos los pasos que involucran bacterias patógenas viables en un laboratorio de contención de nivel 2.
NOTA: Sólo los extractos de células se pueden tomar fuera después de la lisis (paso 5). - Póngase una bata de laboratorio y guantes.
- Asegúrese de que las muñecas estén cubiertas.
- Limpie el gabinete de seguridad biológica (Clase II) con una solución desinfectante.
- Deseche los desechos sólidos expuestos a bacterias en el contenedor biomédico apropiado.
- Trate los frascos que contengan líquidos contaminados con una solución desinfectante. A continuación, deséchelo en un fregadero.
- Lávese cuidadosamente las manos y las muñecas con jabón y retire la bata de laboratorio antes de salir del laboratorio de contención de nivel 2.
3. Construcción del plásmido
NOTA: Para fines de clonación, es crucial identificar primero los límites del ARN endógeno. Los plásmidos pCN51-P3 y pCN51-P3-MS2 se describen en Tomasini et al. (2017)27. El promotor P3 permite una alta expresión del sRNA de una manera dependiente de la densidad celular (es decir, cuando las bacterias entran en la fase estacionaria de crecimiento). Muchos sRNAs estafilocócicas se acumulan durante esta fase de crecimiento.
- Amplificar la secuencia de sRNA por PCR utilizando una ADN polimerasa de alta fidelidad y una máquina de PCR. Siga cuidadosamente las instrucciones del fabricante y lea Garibyan y Avashia (2013)31 para obtener más detalles.
- Utilice las siguientes plantillas para diseñar los cebadores específicos:
y 5'-CGCGGATCC(N)-3' para cebadores delanteros y inversos, respectivamente.
NOTA: Estos oligonucleótidos permiten fusionar la secuencia MS2 (en negrita) al extremo 5' del sRNA de interés. Archivo Pst Los sitios de restricción I y BamHI (subrayados) se agregan en las extremidades 5' y 3' de la construcción ms2-sRNA para clonar el amplicon en el plásmido pCN51-P327. (N) corresponde a la secuencia específica del gen (15-20 nucleótidos). - Digest 1 μg de plásmido pCN51-P3 y 1 μg del producto MS2-sRNA PCR con 2 U de PstI y 1 U de BamHI en el tampón apropiado según las recomendaciones del fabricante.
- Incubar 1 h a 37 °C y purificar el ADN utilizando un kit de purificación por PCR (ver Tabla de Materiales).
- Mezcle el plásmido pCN51-P3 digerido (300 ng) y el amplicon MS2-sRNA (relación molar para vector:insert = 1:3) en un tubo de 1,5 mL. Véase Revie y otros (1988)32 para maximizar la eficiencia de la ligadura. Añadir 1 μL del tampón de ligasa y 10 U de T4 Ligasa en cada tubo. Ajuste el volumen a 10 μL con agua ultrapura.
- Incubar a 22 °C durante al menos 2 h.
- Añadir 5 μL de mezcla de ligadura a 50 μL de células de E. coli congeladas DH5α químicamente competentes. Lea Seidman et al. (2001)33 para obtener más información sobre la transformación del plásmido y las células químicamente competentes.
- Incubar 30 min sobre hielo.
- Choque térmico (45 s a 42 °C) del tubo de transformación mediante un bloque de calor o baño de agua.
- Añadir 900 μL de medio LB e incubar a 37 °C durante 30 min.
- Placa 100 μL de la suspensión bacteriana en una placa de agar LB suplementada con ampicilina (100 μg/μL).
NOTA: el vector pCN51-P3 codifica un gen de resistencia a la ampicilina, que permite seleccionar sólo clones de E. coli portadores del plásmido pCN51-P3-MS2-sRNA. - Extraiga el plásmido pCN51-P3-MS2-sRNA de un cultivo bacteriano nocturno (5 mL) cultivado en presencia de ampicilina (100 μg/μL) utilizando un kit de miniprepación de ADN de plásmido (ver Tabla de Materiales).
- Verifique la construcción mediante la secuenciación de Sanger34 utilizando el siguiente cebador, 5'-TCTCGAAAATAATAGAGGG-3'.
- Transforme el plásmido pCN51-P3-MS2-sRNA en células dc10B químicamente competentes de E. coli. Repita los pasos 3.7 a 3.11.
- Extraiga el plásmido pCN51-P3-MS2-sRNA (ver paso 3.12) y transforme 1-5 μg de ADN del plásmido en células electrocompetentes de S. aureus HG001 ΔsRNA utilizando un aparato de electroporación. Siga cuidadosamente las instrucciones del fabricante. Lea Grosser y Richardson (2016)35 para obtener más información sobre los métodos para preparar S. aureuselectrocompetente.
PRECAUCIÓN: Este paso implica el manejo de bacterias patógenas (ver paso2). - Añadir 900 μL de medio BHI e incubar a 37 °C durante 3 h.
- Centrífuga 1 min a 16.000 x g. Deseche el sobrenadante.
- Resuspend el pellet en 100 μL de BHI y platear la suspensión bacteriana en placas de agar BHI suplementadas con eritromicina (10 μg/μL).
NOTA: El vector pCN51-P3 también codifica un gen de resistencia a la eritromicina, que permite seleccionar sólo los clones de S. aureus portadores del plásmido pCN51-P3-MS2-sRNA.
4. Recolección de bacterias
PRECAUCIÓN: Este paso implica el manejo de bacterias patógenas (ver paso 2).
- Cultivar una colonia de cepas portadoras de pCN51-P3-MS2-sRNA o pCN51-P3-MS227 plásmidos en 3 mL de medio BHI suplementados con eritromicina (10 μg/μL) en duplicados.
- Diluir cada cultivo nocturno en 50 mL (≈1/100) de medio fresco BHI suplementado con eritromicina (10 μg/μL) para alcanzar un OD600nm de 0,05. Utilice matrazes esterilizados de 250 ml (relación 5:1 entre matraz y medio).
NOTA: Las condiciones medias y de crecimiento deben establecerse de acuerdo con el patrón de expresión del sRNA estudiado. - Cultivar cultivos a 37 °C con agitación a 180 rpm durante 6 h.
- Transfiera cada cultivo a un tubo centrífugo de 50 mL.
- Centrífuga a 2.900 x g durante 15 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
- Mantenga los pellets en el hielo y realice directamente la lisis celular mecánica (paso 5) o congele y almacene los pellets a -80 °C.
5. Lisis celular mecánica
PRECAUCIÓN: Los siguientes pasos deben realizarse en el hielo y los tampones deben estar a 4 °C. Use guantes y tome todas las precauciones para proteger las muestras de RNases.
- Pellets de resuspend (paso 4.6) en 5 mL de Buffer A.
- Transferir las células resuspended en tubos centrífugos de 15 mL con 3,5 g de perlas de sílice (0,1 mm).
- Inserte tubos en un instrumento mecánico de lisis celular (ver Tabla de Materiales). Ejecutar un ciclo de 40 s a 4,0 m/s.
NOTA: Si un ciclo no es suficiente para romper las células, deje que el dispositivo se enfríe durante 5 minutos mientras mantiene las muestras en el hielo. Luego, repita otro ciclo de 40 s a 4,0 m/s. La eficacia de la lisis celular se puede probar enchapando el sobrenadante en la placa de agar BHI. - Centrífuga a 15.700 x g durante 15 min. Recuperar el sobrenadante y mantenerlo en hielo.
6. Preparación de la columna
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no dejar que la resina de amilosa se seque. Si es necesario, selle la columna con una tapa final. Prepare todas las soluciones antes de comenzar la purificación de afinidad.
- Coloque una columna de cromatografía en un estante de columnas (consulte Tabla de materiales).
- Retire la punta de la columna y lave la columna con agua ultrapura.
- Añadir 300 μL de resina de amilosa.
- Lave la columna con 10 mL de Buffer A.
- Diluir 1.200 pmol de proteína MBP-MS2 en 6 mL de Buffer A y cargarlo en la columna.
- Lave la columna con 10 mL de Buffer A.
7. Purificación de afinidad MS2 (Figura 1)
- Cargue el lysate de la celda en la columna.
NOTA: Mantenga 1 mL del lisato celular (extracto crudo, CE) para extraer el ARN total (paso 8) y realice análisis de Northern blot (paso 9) y transcriptómico (paso 10). - Recoja la fracción de flujo pasante (FT) en un tubo de recolección limpio.
- Lavar la columna 3 veces con 10 mL de Tampón A. Recoger la fracción de lavado (W).
- Eluir la columna con 1 mL de Buffer E y recoger la fracción de elución (E) en un microtubo de 2 mL.
- Mantenga todas las fracciones recolectadas en el hielo hasta la extracción de ARN (paso 8) o congele a -20 °C para su uso posterior.
8. Extracción de ARN de fracciones recogidas (CE, FT, W y E)
- Utilice 1 mL de cada fracción (incluyendo FT y W) para la extracción de ARN.
- Añadir 1 volumen de fenol. Mezclar vigorosamente.
PRECAUCIÓN: El fenol es volátil y corrosivo, preste atención y trabaje con seguridad bajo una campana extractora de humos. - Centrífuga a 16.000 x g durante 10 min a 20 °C.
- Transfiera la fase superior en un microtubo limpio de 2 mL.
- Añadir 1 volumen de cloroformo/alcohol isoamilo (24:1) y repetir los pasos 8.3 a 8.4.
PRECAUCIÓN: Trabaje de forma segura bajo el capó de los humos. - Añadir 2,5 volúmenes de etanol frío al 100% y 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M (NaOAc) pH 5,2.
- Precipitar durante la noche a -20 °C.
NOTA: La precipitación también se puede realizar en un baño de etanol /hielo seco durante 20 min o a -80 °C durante 2 h. - Centrífuga a 16.000 x g durante 15 min a 4 °C. Retire lentamente el etanol con una pipeta sin tener cuidado de no molestar el pellet.
PRECAUCIÓN: El pellet de ARN no siempre es visible y a veces está suelto en presencia de etanol. - Añadir 500 μL de etanol frío al 80%.
- Centrífuga a 16.000 x g durante 5 min a 4 °C.
- Deseche el etanol pipeteándolo lentamente. Seque el pellet con un concentrador de vacío, 5 min en modo de funcionamiento.
- Resuspend el pellet en un volumen apropiado (15-50 μL) de agua ultrapura. Congele el pellet a -20 °C para su uso posterior.
- Evaluar la cantidad de ARN (260 nm) y la calidad (relaciones de longitud de onda 260/280 y 260/230) utilizando un espectrofotómetro/fluorómetro (ver Tabla de Materiales). Siga cuidadosamente las instrucciones del fabricante.
NOTA: 3-4 μg se obtienen generalmente en la fracción de elución (E). Esto depende principalmente de las condiciones probadas.
9. Análisis de la purificación de la afinidad MS2 por northern blot36
- Diluir 5 μg de ARN de las fracciones CE, FT, W y 500 ng de fracción E en 10 μL de agua ultrapura y mezclar con 10 μL de tampón de carga de ARN.
- Incubar 3 min a 90 °C.
- Cargue muestras en pozos de un gel de agarosa al 1% complementado con 20 mM de tiocianato de guanidium y haga funcionar el gel a 100-150 V en TBE 1x tampón a 4 °C. Lea Koontz (2013)37 para más detalles.
- Transfiera RNAs en una membrana de nitrocelulosa por transferencia de vacío para 1h o transferencia de capilaridad durante la noche.
NOTA: El método de capilaridad es más eficaz para los RNAs grandes. - RNAs de reticulado UV en la membrana (120 mJ a 254 nm) utilizando un reticulador ultravioleta.
- Inserte la membrana en una botella de hibridación con el lado del ARN hacia arriba.
- Añadir 10-20 mL de solución de hibridación precalentada. Incubar 30 min a 68 °C.
- Deseche la solución y agregue 10-20 mL de solución de hibridación fresca complementada con 1 μL de la sonda específica de ARN. Incubar durante la noche a 68 °C.
NOTA: La sonda de ARN etiquetada con DIG se sintetiza utilizando un kit de etiquetado de ARN DIG y siguiendo las instrucciones del fabricante. Alternativamente, se puede utilizar una sonda radiomarcada. - Lavar la membrana con 10-20 mL de solución de lavado 1 (2x SSC y 0.1% SDS) durante 5 min a 20 °C. Repita una vez.
- Lavar la membrana con 10-20 mL de solución de lavado 2 (0.2x SSC y 0.1% SDS) durante 15 min a 68 °C. Repita una vez.
- Incubar con 10-20 mL de solución de bloqueo durante al menos 30 min a 20 °C.
- Deseche la solución y agregue 10-20 mL de la solución de bloqueo complementada con el anticuerpo policlono anti-digoxigenina (1/1000), conjugado con fosfatasa alcalina. Incubar 30 min a 20 °C.
- Lavar la membrana con 10-20 mL de la solución de lavado 3 (1x ácido maleico y 0,3% Tween 20) durante 15 min a 20 °C. Repita una vez.
- Incubar la membrana con 10-20 mL de la solución de detección (0,1 M Tris HCl y 0,1 M NaCl pH 9,5) 5 min a 20 °C.
- Coloque la membrana en una película de plástico y remoje con el sustrato (ver Tabla de Materiales). Incubar 5 min en la oscuridad.
- Selle la membrana en una película de plástico. Coloque la membrana en un casete de autorografía.
- Exponer la membrana a una película de autorografía en el cuarto oscuro dedicado.
NOTA: El tiempo de exposición depende de la intensidad de la señal, desde pocos segundos hasta minutos. - Revele la película expuesta en un dispositivo de desarrollo automático.
10. Preparación de las muestras para la secuenciación de ARN
Nota : este paso sólo se refiere a los RNA extraídos de las fracciones E y CE.
- Añadir a cada muestra 10 μL de tampón de 10x DNasa y DNasa I (1 U/μg de AR tratados). Añadir agua para un volumen final de 100 μL.
- Incubar 1 h a 37 °C.
- Extraiga y purifique los ENR como se describió anteriormente (pasos 8.2 a 8.11).
- Resuspend el pellet de ARN en 20 μL de agua ultrapura.
NOTA: La presencia de ADN restante se puede comprobar mediante PCR y cebadores específicos (por ejemplo, el gen 16S). - Evaluar la cantidad y calidad del ARN utilizando un sistema de análisis de electroforesis basado en microfluídica (ver Tabla de Materiales).
NOTA: 1 μg se obtiene generalmente en la fracción de elución (E) después del tratamiento con DNasa. - Retire los ARN ribosomales con un kit de agotamiento de ARNr bacteriano.
Nota: Los ARNs grandes y abundantes (es decir, ARNr) tienden a interactuar no específicamente con la columna de afinidad. Se requieren 500 ng de ARN extraído para realizar este paso. - Una vez más, evalúe la cantidad y la calidad del ARN utilizando un sistema de análisis de electroforesis basado en microfluídica.
- Prepare bibliotecas de ADNc con 10-20 ng de ARN ribodepleted usando un kit de preparación de la biblioteca de ADNc y siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Secuenciar las bibliotecas obtenidas utilizando un instrumento de secuenciación (por ejemplo, extremo único, 150 pb; ver Tabla de Materiales).
NOTA: 5-10 millones de lecturas por muestra son generalmente suficientes.
11. Análisis de datos de RNAseq (Figura 2)
- Descargue los archivos de secuenciación FastQ desde la plataforma de secuenciación.
- Acceso a la instancia galaxy de la estación biológica Roscoff (https://galaxy.sb-roscoff.fr/) e inicie sesión.
NOTA: Cada algoritmo mencionado se puede encontrar fácilmente utilizando la barra de búsqueda. Se proporciona una guía del usuario para cada herramienta.
PRECAUCIÓN: La versión de las herramientas necesarias puede diferir del servidor público Galaxy38. - Haga clic en el icono Obtener datos y luego cargue el archivo desde su computadora. Cargue el archivo de secuenciación FastQ de cada control MS2 y muestras de MS2-sRNA. Cargue también el archivo de genoma de referencia FASTA y el archivo de anotación GFF.
- Ejecute los informes de calidad de lectura fastqc (Galaxy versión 0.69).
NOTA: Esta herramienta proporciona una evaluación de la calidad de las secuencias sin procesar (por ejemplo, puntuación de calidad, presencia de secuencias de adaptador). - Ejecute la herramienta de recorte de lectura flexible Trimmomatic (Galaxy Versión 0.36.6) para eliminar notablemente las secuencias del adaptador y las lecturas de mala calidad. Indique las secuencias de adaptador utilizadas para la preparación de la biblioteca (por ejemplo, TruSeq 3, de un solo final). Agregue las siguientes operaciones Trimmomatic: SLIDINGWINDOW (Número de bases = 4; Calidad media=20) y MINLEN (Longitud mínima de lecturas=20).
- Ejecute de nuevo los informes de calidad de lectura fastqc (Galaxy versión 0.69).
- Run Bowtie2 - el mapa lee contra el genoma de referencia (Galaxy Version 2.3.2.2). Utilice el archivo FASTA de referencia del genoma del historial para asignar lecturas con la configuración predeterminada (local muy sensible).
NOTA: El archivo BAM generado por la herramienta Bowtie2 se puede visualizar mediante el Visor de genómica integrativa (IGV). También se requerirá el archivo BAI asociado. - Opcionalmente, ejecute Flagstat que compila estadísticas para el conjunto de datos de BAM (Galaxy versión 2.0).
- Ejecute htseq-count - Count (Galaxy Versión 0.6.1) que alinea las características superpuestas de lecturas en el archivo de anotación GFF. Utilice el modo Intersección (no vacío).
- Archive todos los archivos de recuento sin procesar del análisis htseq-count en un solo archivo Zip.
- Ejecute SARTools DESeq2 para comparar datos (Galaxy Versión 1.6.3.0). Proporcione el archivo Zip que contiene los archivos de recuento sin procesar y el archivo de diseño, un archivo delimitado por tabulaciones que describe el experimento. Siga cuidadosamente las instrucciones proporcionadas para generar el archivo de diseño.
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Representative Results
Los resultados representativos se originan en el estudio del targetome rsaC en S. aureus29. RsaC es un sRNA no convencional de 1.116 nt-long. Su extremo 5' contiene varias regiones repetidas, mientras que su extremo 3' (544 nt) es estructuralmente independiente y contiene todos los sitios de interacción predichos con sus objetivos de ARNm. La expresión de este sRNA se induce cuando el manganeso (manganeso) es escaso, que se encuentra a menudo en el contexto de la inmunorespuesta del anfitrión. Utilizando la tecnología MAPS, identificamos varios ARNm que interactúan directamente con RsaC, revelando su papel crucial en el estrés oxidativo(sodA, ldh1 y sarA)y las respuestas relacionadas con el metal(znuBC-zur y sufCDSUB).
Validación de la construcción ms2-sRNA y condiciones experimentales
Antes de realizar experimentos MAPS, es importante determinar las condiciones óptimas de expresión del sRNA estudiado. Si se utiliza un promotor no nativo, definitivamente ayudará a producir la construcción de MS2-sRNA cuando sus objetivos están presentes. Además, la construcción de MS2-sRNA debe validarse cuidadosamente con respecto al tamaño, la estabilidad, la expresión y la función. El aptámero MS2 se fusionó con el extremo 5' de la longitud completa RsaC (MS2-RsaC1116)o la forma más corta (MS2-RsaC544)correspondiente a la parte 3' de RsaC. Ambos constructos se expresaron in vivo bajo el control del promotor dependiente de detección de quórum P3 en S. aureus HG001 ΔrsaC. La deleción del gen rsaC evita una competencia entre el RsaC endógeno y ms2-RsaC. La cepa de tipo salvaje que contiene el mismo vector con la etiqueta MS2 solo se utilizó como control. Este control permite restar interacciones inespecíficas que se producen con la etiqueta MS2.
Para confirmar los constructos y visualizar su patrón de expresión, se cosecharon células bacterianas después de 2 h, 4 h y 6 h de crecimiento en medio BHI a 37 °C. Después de la extracción de ARN, el análisis de Northern blot se realizó utilizando la sonda DIG específica de RsaC(Figura 3A). El nivel de RsaC endógeno (carriles 1-3) aumentó significativamente después de 6 h de crecimiento, justificando la selección de este punto de tiempo para los experimentos MAPS. Importantemente, los niveles de MS2-RsaC544 (carriles 7-9) y MS2-RsaC1.116 (carriles 10-12) eran comparables a RsaC endógeno en 6 H. Por lo tanto, deben imitar el patrón de expresión endógena de RsaC. Una forma más grande pero menor de RsaC era distinguible y pudo ser debido a un extremo ineficaz de la transcripción. Este fenómeno se observa con frecuencia cuando un MS2-sRNA se expresa bajo el control de un fuerte promotor de un plásmido21. No se observó ningunas formas más cortas resultando de la terminación o de la degradación aberrante de la transcripción.
La adición del aptámero MS2 en el 5' de sRNAs también podría interrumpir su plegamiento adecuado y afectar sus funciones. Este paso es crítico para los sRNAs altamente estructurados como RsaC. Por lo tanto la actividad de MS2-sRNA se debe probar y comparar al sRNA endógeno cuando sea posible. Un objetivo previamente conocido o un fenotipo observable puede ayudar a monitorearlo. Por ejemplo, el impacto de RsaC en la acumulación intracelular de ROS se utilizó para validar las construcciones MS2-RsaC544 y MS2-RsaC1.116 29.
Análisis de fracciones recolectadas durante la purificación de afinidad
Los ARN se extrajeron de las fracciones CE, FT y E en la cepa WT que expresa la etiqueta MS2 sola y la cepa ΔrsaC que expresa la construcción MS2-RsaC544. Mostramos utilizando el análisis de Northern blot que el RsaC endógeno de 1.116 nt-long se enriqueció en la fracción de elución, pero resultó interactuar no específicamente con la columna de afinidad(Figura 3B,carriles 2-3). Observamos el mismo fenómeno con MS2-RsaC1.116 (datos no mostrados). Esto se debe sin duda a su longitud y compleja estructura secundaria. Por lo tanto, sólo una forma menos estructurada y más corta (544 nt) de RsaC correspondiente a su parte 3' se utilizó para realizar experimentos MAPS. En la Figura 3B,el MS2-RsaC544 fue altamente enriquecido en la fracción de elución demostrando que fue retenida con éxito por la proteína de fusión MS2-MBP (carril 6). Se observó una forma más grande pero menor de MS2-RsaC544 como en la Figura 3A. Aquí, la rigurosidad y el número de lavados se pueden ajustar a una unión no específica reducida o, por el contrario, para limitar la pérdida de verdaderos socios que interactúan.
Validación de supuestas dianas de ARNm tras el análisis MAPS
Tras el análisis bioinformático, las supuestas dianas de ARNm se enumeran de acuerdo con el cambio de pliegue entre MS2-sRNA y ms2 control, obtenido mediante DeSeq2 (Figura 2). Por ejemplo, ms2-RsaC544 MAPS datos29 sugirieron que sodA mRNA, codificación para una superóxido dismutasa en S. áureo, es un objetivo principal (mejor golpe, mayor cambio de pliegue). Un análisis de Northern blot, realizado con una sonda DIG específica de sodAdespués de la purificación de afinidad MS2, muestra que sodA se co-enriqueció eficientemente con MS2-RsaC544 en comparación con el control MS2 (Figura 3C).
Un análisis transcriptómico global se realiza sistemáticamente en la fracción CE. La comparación de los datos de MAPS y este análisis transcriptómico ayuda a ajustar la relación de enriquecimiento y revela una jerarquía de objetivos potenciales. De hecho, un ARNm mal expresado, que está altamente enriquecido después de la purificación de la afinidad de MS2, tiene ciertamente una mayor afinidad de unión que un ARNm altamente enriquecido y altamente expresado.
Es importante tener en cuenta que todos los candidatos identificados por MAPS deben ser validados individualmente utilizando experimentos in vitro y/o in vivo como los ensayos de desplazamiento de movilidad por electroforesis (EMSA) o los ensayos de genes reporteros (ver Jagodnik et al. (2017)39 para más detalles).
Figura 1. Ilustración esquemática del protocolo MAPS adaptado a S. aureus. De la construcción de plásmidos al análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2. Flujo de trabajo de análisis MAPS y datos procesados. Cada paso, punto de verificación y formato de archivo están representados (consulte también el paso 11). El formato FastQ es un archivo de texto que consiste en las secuencias de ADN y las puntuaciones de calidad correspondientes. El formato BAM es un archivo comprimido que contiene secuencias alineadas. El formato tabular es un archivo de texto delimitado por tabulaciones con recuentos para cada gen. La tabla de resultados ilustra el tipo de datos obtenidos después del análisis bioinformático. Los resultados presentados son ficticios y no se originan en ningún estudio. Para obtener más detalles, los tutoriales básicos están disponibles en el sitio web de Galaxy Project (https://galaxyproject.org/). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3: Construye la validación y los controles MAPS. A. Análisis de la mancha blanca /negra norteña del sRNA endógeno de RsaC y de las construcciones relacionadas MS2. La cepa WT lleva la cepa mutante pCN51-P3-MS2 (control) y la cepa mutante ΔrsaC lleva la pCN51-P3-MS2, pCN51-P3-MS2-RsaC544 o pCN51-P3-MS2-RsaC1,116. Las muestras se tomaron después de 2 h, 4 h y 6 h de crecimiento en IMC a 37 °C. Los análisis norteños de la mancha blanca /negra fueron realizados usando una punta de prueba RsaC-específica del DIG. B.Análisis de la mancha blanca /negra norteña de las fracciones de la purificación de MS2-affinity usando una punta de prueba RsaC-específica del DIG. La co-purificación se realizó utilizando la cepa WT + pCN51-P3-MS2 (control) y la cepa mutante ΔrsaC + pCN51-P3-MS2-RsaC544. Las células fueron cosechadas después de 6 h de crecimiento en BHI en el °C 37. Extracto crudo (CE), flujo (FT), elución (E). C. Análisis de la mancha blanca /negra norteña de las fracciones de la purificación de MS2-affinity (CE y E) usando un sodA-punta de prueba específica del DIG. Consulte (B) para más detalles. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
| ARN | tipo | referencia |
| Escherichia coli | ||
| RyhB | ARNs | Lalaouna et al. (2015)21 |
| RybB | ARNs | Lalaouna et al. (2015) 21. |
| 3'ETSleuZ | Fragmento derivado del ARNt | Lalaouna y Massé (2015)26 |
| DsrA | ARNs | Lalaouna et al. (2015) 22 |
| Snp | ARNm (5'UTR) | Lalaouna et al. (2015) 22 |
| CyaR | ARNs | Lalaouna et al. (2018) 23 |
| RprA | ARNs | Lalaouna et al. (2018) 23 |
| GcvB | ARNs | Lalaouna et al. (2019) 24. |
| Salmonela Typhimurium | ||
| SraL | ARNs | Silva et al. (2019) 25 |
| Staphylococcus aureus | ||
| RsaA | ARNs | Tomasini et al. (2017) 27 |
| RsaC | ARNs | Lalaouna et al. (2019) 29 |
| RsaI | ARNs | Bronesky et al. (2019) 28 |
Tabla 1. La tecnología de los MAPAS reveló el targetome de varios RNAs en varios organismos.
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Discussion
Un protocolo modificado para bacterias Gram-positivas
El protocolo inicial de MAPS se desarrolló para estudiar el sRNA interactoma en el organismo modelo E. coli20,30. Aquí, se describe un protocolo modificado que es adecuado para la caracterización de las redes reguladoras dependientes de ARN en el patógeno humano oportunista S. áureo y es ciertamente transponible a otras bacterias Gram-positivas, patógenos o no.
La atención particular fue prestada al paso de la lisis de la célula. La prensa francesa ha sido sustituida por un instrumento mecánico de lisis celular. Este método es eficaz para romper las células Gram-positivas y para limitar los riesgos asociados a la manipulación de cepas patógenas. Para mejorar el rendimiento de la purificación de afinidad MS2, la cantidad de MS2-MBP inmovilizado en la resina de amilosa se ha incrementado drásticamente. Esto ha requerido ajustar la rigurosidad y el número de lavados.
A diferencia del protocolo inicial, MAPS se realiza aquí por duplicado, a partir de dos réplicas biológicas. Se ha desarrollado un flujo de trabajo para implementar el análisis estadístico (Figura 2), que aumenta definitivamente la robustez de los datos obtenidos.
MS2 y su expresión
Este protocolo maps se estableció para identificar el targetome de sRNAs estafilocócicas. La construcción ms2-sRNA se expresa a partir de un plásmido de bajo número de copias (pCN51, 20 a 25 copias/célula) y bajo el control del promotor P3 dependiente de detección de quórum, principalmente inducida durante la fase estacionaria. Este patrón de expresión corresponde a los sRNAs estudiados en S. aureus (es decir, RsaA, RsaI y RsaC) y asegura una síntesis de MS2-sRNA bastante fuerte. Sin embargo, no podemos excluir que en otros casos, el promotor P3 puede no ser apropiado y no refleja el estado fisiológico natural de las bacterias cuando se induce el sRNA. Otra forma de controlar la producción de ARNM-MS2 es utilizar promotores químicamente inducibles (por ejemplo, promotores inducibles por tetraciclina). Estas herramientas permiten una expresión de pulso de la construcción ms2-sRNA, pero este ajuste no garantiza que las dianas de ARN se expresarán concomitantemente. Otro inconveniente es que la expresión de un plásmido puede conducir a la sobreproducción del ARN estudiado, aún más enfatizado con un vector de alto número de copias. Esto podría resultar potencialmente en interacciones artefactuales o la interrupción de las funciones asociadas de la chaperona de ARN. La alternativa más apropiada es insertar una etiqueta MS2 en el extremo 5' del gen endógeno del sRNA. Así, el MS2-sRNA sería codificado cromosómicamente y bajo el control de su promotor nativo. Esto debería imitar mejor la expresión endógena del sRNA estudiado y evitar el sesgo debido a la sobreproducción del sRNA estudiado. En cualquier caso, el paso crucial es verificar cuidadosamente la longitud, estabilidad y funcionalidad de la construcción de MS2-sRNA, en particular utilizando ensayos de Northern blot con ARN total extraído de cultivos cultivados en condiciones que desencadenan la producción y función endógena de sRNA. Innegablemente, el uso de una construcción impropia/no funcional de MS2-sRNA puede afectar drástico a resultados generados, apoyando la significación de los controles descritos arriba. Finalmente, el ARN-MS2 siempre se produce en un fondode ARNs Δ para maximizar el enriquecimiento de las dianas de ARNm. Por otra parte, los experimentos se pueden realizar en tensiones del anfitrión con mutaciones específicas en RNases (e.g., mutantes de la canceladura o mutantes sensibles a la temperatura) para evitar la degradación de las blancos del mRNA por el reclutamiento sRNA-dependiente de RNases.
La validación experimental de los candidatos identificados por MAPS sigue siendo necesaria
Un punto que necesita ser considerado es que los MAPAS proporcionan una lista de blancos supuestos del ARN. Sin embargo, algunos ARN pueden enriquecerse indirectamente a través de la interacción con un objetivo de ARNm compartido o una proteína de unión a ARN. En consecuencia, los candidatos revelados deben ser confirmados por otros enfoques experimentales. Emsa y experimentos de huella se utilizan comúnmente para visualizar la unión directa de un sRNA a supuestas dianas de ARN in vitro. Luego, los ensayos de huellas in vitro ayudan a monitorear el impacto de un sRNA en la iniciación de la traducción de su objetivo de ARNm. Por último, los ensayos de Northern blot y/o gene reporter(lacZ o gfp)complementan esta validación experimental in vivo. Todos estos enfoques se describen en Jagodnik et al. (2017)39.
A diferencia de las tecnologías RIL-seq y CLASH, MAPS no proporciona directamente información sobre los sitios de interacción. Sin embargo, un pico de lecturas mapeadas se observa con frecuencia en una región restringida de la diana de ARN (por ejemplo, el extremo 3' del operón glyW-cysT-leuZ 21),facilitando la identificación del sitio de emparejamiento. Alternativamente, se pueden utilizar varias herramientas de predicción para predecir el sitio de unión putativo en el objetivo identificado, como IntaRNA40.
MAPS examina el targetome de un sRNA particular
La tecnología MAPS es adecuada para el estudio del sRNA targetome en bacterias Gram-negativas como E. coli y S. Typhimurium, pero también ahora con este protocolo modificado en bacterias Gram-positivas como S. aureus. Básicamente, MAPS ofrece una instantánea de RNA:sRNA duplex formados en un momento dado y en condiciones de crecimiento específicas. Desafortunadamente, la lista de blancos del mRNA podría ser incompleta. Por ejemplo, una blanco cognada del mRNA se podía faltar debido a las condiciones experimentales inadecuadas, justificando las precauciones antedichos.
En comparación con otros métodos comúnmente utilizados como RIL-seq o CLASH, MAPS utiliza un sRNA específico para co-purificar todos los objetivos de ARN que interactúan. Aquí, la interacción sRNA:RNA no se diluye entre otros dúplex asociados a RBP, lo que permite teóricamente caracterizar su targetoma más profundamente. Sin embargo, parece que los métodos RIL-seq/CLASH y MAPS revelaron diferentes conjuntos de supuestas dianas de ARN12,41,lo que sugiere que estos enfoques experimentales son complementarios. Esta discrepancia podría explicarse por las variaciones en las condiciones de crecimiento y/o el sesgo generado por cada método.
En consecuencia, el propósito del estudio debe influir en la elección del método. Para un análisis global de los objetivos de sRNA y cuando un RBP está implicado en la regulación sRNA-mediada, los métodos de RIL-seq y del CHOQUE deben ser preferidos. Ambos enfoques proporcionan una visión general de las redes reguladoras que dependen de una RBP particular y, en consecuencia, descubren una amplia variedad de ARNs y objetivos asociados. Por el contrario, para el estudio de un sRNA específico o cuando no se conoce/implica RBP, MAPS representa una opción apropiada.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la "Agence Nationale de la Recherche" (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH, y ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, a PR). También se ha publicado en el marco del labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 y de ANR-17-EURE-0023 (a PR), como financiación del estado gestionado por ANR como parte de las inversiones para el futuro programa. DL recibió el apoyo del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del Acuerdo de Subvención Marie Skłodowska-Curie n.º 753137-SaRNAReg. El trabajo en E. Massé Lab ha sido apoyado por subvenciones operativas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR), el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) y la Subvención R01 GM092830-06A1 del Equipo de los Institutos Nacionales de Salud de los NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
| 250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
| Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
| Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
| Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
| Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
| BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
| CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
| Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
| DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
| DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
| Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
| FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
| Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
| Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
| Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
| Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
| LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
| Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
| Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
| Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
| Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
| Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
| RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
| ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
| Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
| SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
| TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
| X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
| X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
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