Summary
במאמר זה נתאר בידוד של תאי גזע שמקורם במקוק רזוס (ADSCs) באמצעות פרוטוקול עיכול רקמות אנזימטי. לאחר מכן, אנו מתארים התפשטות ADSC הכוללת ניתוק תאים, ספירה וציפוי. לבסוף, התמיינות ADSC מתוארת באמצעות סוכני גרימה אדיפוגניים ספציפיים. בנוסף, אנו מתארים טכניקות צביעה כדי לאשר את ההבחנה.
Abstract
רקמת השומן מספקת מקור עשיר ונגיש של תאי גזע רב-פוטנטיים, המסוגלים לחדש את עצמם. תאי גזע אלה שמקורם בשומן (ADSCs) מספקים מערכת תאי ex vivo עקבית הדומה מבחינה תפקודית לזו של אדיפוציטים in vivo. שימוש ב-ADSCs במחקר ביו-רפואי מאפשר חקירה תאית של ויסות ותפקוד מטבולי של רקמת השומן. התמיינות ADSC נחוצה להרחבת אדיפוציטים נאותה, והבחנה לא אופטימלית היא מנגנון מרכזי של תפקוד לקוי של השומן. הבנת השינויים בהתמיינות ADSC היא חיונית להבנת ההתפתחות של תפקוד מטבולי לקוי ומחלות. הפרוטוקולים המתוארים בכתב יד זה, כאשר עוקבים אחריהם, יניבו אדיפוציטים בוגרים שיכולים לשמש למספר בדיקות פונקציונליות במבחנה כדי להעריך את תפקוד חילוף החומרים של ADSC, כולל אך לא מוגבל למבחנים המודדים ספיגת גלוקוז, ליפוליזה, ליפוגנזה והפרשה. קופי מקוק רזוס (Macaca mulatta) דומים מבחינה פיזיולוגית, אנטומית ואבולוציונית לבני אדם וככאלה, רקמותיהם והתאים שלהם שימשו רבות במחקר ביו-רפואי ולפיתוח טיפולים. כאן אנו מתארים בידוד ADSC באמצעות רקמת שומן תת עורית ואומנטלית טרייה המתקבלת מקופי רזוס בני 4-9. דגימות רקמת שומן מתעכלות באופן אנזימטי בקולגנאז ואחריו סינון וצנטריפוגה כדי לבודד ADSCs מהחלק הסטרומלי של כלי הדם. ADSCs מבודדים מתרבים במדיה סטרומלית ולאחר מכן כ-14-21 ימים של התמיינות באמצעות קוקטייל של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל דקסמתזון, 0.5 mM איזובוטיל מתיל-קסנטין, ו-50 μM אינדומתצין במדיה סטרומלית. אדיפוציטים בוגרים נצפים בכ -14 יום של התמיינות. בכתב יד זה אנו מתארים פרוטוקולים לבידוד, התפשטות והבחנה במבחנה של ADSC. אמנם, התמקדנו ב-ADSCs מרקמת השומן של מקוק רזוס, אך ניתן להשתמש בפרוטוקולים אלה לרקמת שומן המתקבלת מבעלי חיים אחרים עם התאמות מינימליות.
Introduction
רקמת השומן מורכבת מתערובת הטרוגנית של תאים, בעיקר אדיפוציטים בוגרים וחלק כלי דם סטרומלי הכולל פיברובלסטים, תאי חיסון ותאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs)1,2,3. ניתן לבודד ADSCs ראשוניים ישירות מרקמת השומן הלבן ולעורר אותם להתמיין לאדיפוציטים, סחוס או תאי עצם4. ADSCs מציגים מאפיינים קלאסיים של תאי גזע כגון תחזוקה של מולטיפוטנטיות במבחנה והתחדשות עצמית; ודבקים בפלסטיק בתרבות 5,6. ADSCs הם בעלי עניין חשוב לשימוש ברפואה רגנרטיבית בשל הרב-תכליתיות שלהם ויכולתם להיקצר בקלות בכמויות גדולות באמצעות טכניקות לא פולשניות7. התמיינות אדיפוגנית של ADSCs מייצרת תאים המחקים באופן פונקציונלי אדיפוציטים בוגרים, כולל הצטברות שומנים, ספיגת גלוקוז מגורה על ידי אינסולין, ליפוליזה והפרשת אדיפוקין8. הדמיון שלהם לאדיפוציטים בוגרים הוביל לשימוש נרחב ב- ADSCs לחקירה פיזיולוגית של מאפייני התאים ותפקוד מטבולי של אדיפוציטים. ישנן ראיות הולכות וגוברות התומכות ברעיון כי התפתחות של תפקוד מטבולי לקוי והפרעות שמקורן ברמת התא או הרקמה 9,10,11,12. נדרשת התמיינות אופטימלית של ADSC להרחבת רקמת שומן מספקת, תפקוד תקין של אדיפוציטים וויסות מטבולי יעיל13.
הפרוטוקולים המתוארים בכתב יד זה הם טכניקות פשוטות המשתמשות בציוד מעבדה סטנדרטי וריאגנטים בסיסיים. כתב היד מתאר לראשונה את הפרוטוקול לבידוד ADSCs ראשוניים מרקמת שומן טרייה באמצעות עיכול מכני ואנזימטי. לאחר מכן, הפרוטוקול להתפשטות ומעבר של ADSCs במדיום סטרומלי מתואר. לבסוף, הפרוטוקול להבחנה אדיפוגנית של ADSCs מתואר. לאחר ההתמיינות, תאים אלה יכולים לשמש למחקרים כדי להבין טוב יותר את חילוף החומרים של אדיפוציטים ומנגנונים של תפקוד לקוי. כמו כן מתוארים הפרוטוקולים לאישור התמיינות אדיפוגנית וזיהוי טיפות שומנים באמצעות O אדום שמן וצביעת בורון-דיפרומיתן (BODIPY). הפרטים של פרוטוקולים אלה התמקדו ב- ADSCs ראשוניים שבודדו מרקמת שומן אומנטלית טרייה של קופי מקוק רזוס. אנו ואחרים השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לבודד בהצלחה ADSCs מרקמות שומן תת עוריות ואומנטליות של מקוק רזוס14,15. עבור אותה כמות של רקמה בשימוש, ראינו כי רקמת שומן תת עורית היא צפופה יותר, קשוחה יותר ומניבה פחות תאים מעיכול בהשוואה לרקמת שומן אומנטלית. פרוטוקול זה שימש גם לבידוד ADSCs מדגימות שומן אנושיות16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הרקמות וההליכים שהתקבלו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת לואיזיאנה ובוצעו בהתאם להנחיות המכון הלאומי לבריאות (פרסום NIH מס '85-12, מתוקן 1996).
1. הכנת מאגרים ופתרונות
- הכינו תמיסת מי מלח סטרילית עם מאגר 5-פוספטים (5-PBS) על ידי הוספת 5% פניצילין/סטרפטומיצין (עט/סטרפ) ו-0.25 מיקרוגרם/מ"ל של מעכב פטרייתי ל-PBS אחד. הכן תמיסת חיץ כביסה סטרילית של 2-PBS (2-PBS) על-ידי הוספת 2% עט/סטרפ ו-0.25 מיקרוגרם/מ"ל של מעכב פטרייתי ב-PBS אחד. ניתן לאחסן מאגרי כביסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי ויש להשתמש בהם תוך 4 שבועות.
הערה: חיץ 5-PBS משמש לאיסוף רקמת שומן ושטיפה ראשונית כדי למזער זיהום אפשרי מכיוון שדגימות רקמה המתקבלות בנמק נאספות בסביבה לא סטרילית. - הכינו חיץ קולגן סטרילי (CB) על ידי שילוב של 0.075% קולגן מסוג I (125 יחידות/מ"ג פעילות), 2% עט/סטרפ ו-0.25 מיקרוגרם/מ"ל של מעכב פטרייתי בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) עם אלבומין בסרום בקר 1%. יש להשתמש ב- CB תוך שעה.
- הכן מדיום גידול ADSC סטרילי באמצעות מאגר α-MEM. שלבו 100 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), 5 מ"ל של תמיסת L-גלוטמין של 200 מ"מ, 500 מיקרו-ליטר של 0.25 מיקרוגרם/מ"ל של מעכב פטרייתי ו-10 מ"ל של תמיסת עט/סטרפ ב-394 מ"ל של חיץ α-MEM. ניתן לאחסן מדיום גידול ADSC ב -4 מעלות צלזיוס ויש להשתמש בו תוך 4 שבועות.
הערה: אין צורך בהשבתת חום של FBS. - הכן מדיום התמיינות ADSC סטרילי על ידי שילוב מדיום צמיחה ADSC כפי שהוכן לעיל וחומרי אינדוקציה כדי להשיג ריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם / מ"ל דקסמתזון, 0.5 mM איזובוטיל מתיל-קסנטין ו- 50 μM אינדומתצין.
2. בידוד ADSC
- הכנת רקמות ועיכול
- פיפטה ~ 10 מ"ל של מאגר 5-PBS לתוך ארבע מנות תרבית תאים 100 מ"מ.
- העבר ~ 50 גרם של דגימת שומן לאחד הכלים 100 מ"מ המכילים 5-PBS. שטפו את דגימת רקמת השומן שנאספה ארבע פעמים על ידי העברתה ברצף על פני ארבעת כלי התרבית המכילים 5-PBS.
- העבירו דגימת שומן לצלחת תרבית נקייה בקוטר 100 מ"מ וטחנו ביסודיות רקמת שומן באמצעות מספריים או שני אזמלים סטריליים. הכרייה מאפשרת להגדיל את שטח הפנים לעיכול אנזימטי יעיל ומלא.
- מעבירים את רקמת השומן הטחון לצינור חרוטי פלסטי של 50 מ"ל המכיל 13 מ"ל של CB (מקטע רקמה של 1-3 ס"מ לכל 15 מ"ל של CB).
- שוטפים את צלחת התרבית עם 2 מ"ל של CB ומעבירים את המדיום לצינור חרוטי פלסטיק 50 מ"ל.
הערה: בשלב זה, צריך להיות סך של 15 מ"ל של CB עם רקמה בצינור חרוטי פלסטיק 50 מ"ל. - פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים באמצעות פיפטה סרולוגית של 25 מ"ל כדי להקל על עיכול רקמות מכניות.
- דגירה של צינור חרוטי פלסטיק 50 מ"ל המכיל רקמה ב- CB על נדנדה במהירות בינונית ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.
- ציפוי ADSC לתרבית
- הוסף 10 מ"ל של מדיום גדילה ADSC לצינור 50 מ"ל המכיל רקמה כדי לנטרל את פעילות האנזים. פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים באמצעות פיפטה סרולוגית של 25 מ"ל כדי להפריד כל אגרגטים של רקמת שומן.
- מעבירים את החלק הנוזלי לצינור חרוטי סטרילי חדש של 50 מ"ל שמשאיר את המוצקים מאחור. לשטוף את הצינור המקורי 50 מ"ל 3 פעמים עם ~ 7 מ"ל של 2-PBS חיץ ולהעביר את החלק הנוזלי לצינור 50 מ"ל.
- צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות כדי לקבל גלולה תא. הסר בזהירות כמה שיותר סופרנטנט באמצעות פיפטה סרולוגית מבלי להפריע לכדור התא. אין לדקור.
- יש להשעות את כדור התא ב-1 מ"ל של חיץ ליזיס של תאי דם אדומים (RBC) ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הוסף 5 מ"ל של מדיום גידול ADSC לצינור וצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר בזהירות ולהשליך את supernatant.
- הוסף 5 מ"ל של מדיום גידול ADSC וצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות כדי לשטוף את כדור התא. השליכו את הסופר-נטנט.
- יש להשעות את הכדור ב-2 מ"ל של מדיום גדילה ADSC ולסנן דרך מסננת תאים בקוטר 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי פלסטי סטרילי חדש בגודל 50 מ"ל.
- יש לשטוף את מסננת התאים בתוספת של 2 מ"ל של מדיום גדילת ADSC. העבר 4 מ"ל של המתלה המכיל ADSCs מצינור חרוטי 50 מ"ל לצלחת תרבית סטרילית 100 מ"מ.
- שטפו את הצינור החרוטי של 50 מ"ל פעמיים עם 3 מ"ל של מדיום גידול ADSC והעבירו את הנוזל לצלחת התרבית בקוטר 100 מ"מ המכילה ADSCs ובסך הכל 10 מ"ל של צלחת בינונית בתרבית.
- צפו בתאים תחת מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 10 כדי לבדוק אם יש תאים צפים במדיה, כפי שמוצג באיור 1A. תאים צריכים להישמר באינקובטור CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2 ו 100% לחות יחסית.
- לאחר 24 שעות, צפו בתאים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לבדוק את היצמדות התאים. שאפו מדיום צמיחה ADSC מהצלחת והחליפו ב-10 מ"ל של מדיה טרייה וחמה (37 מעלות צלזיוס). הסר והחלף מדיה כל 48 שעות עד שהתאים יהיו מחוברים ב-80%-90% (איור 1B).
הערה: לפחות 10-20% מהתאים יהיו דבקים ב-24 שעות. בדוק את תרבית התאים עבור סימנים של זיהום כגון גרעיניות התא, עכירות של המדיה, או צמיחה של נבגים. ברגע שהתאים נפגשים ב-80%, ניתן לקטוף אותם לצורך שגשוג ושימור בהקפאה או לגרום להם להתמיין. ניתן להרחיב את ה-ADSCs ל-4-6 מעברים לפני שהם מאבדים את יכולתם להתרבות או להבדיל ביעילות.
3. התפשטות ADSC
- ניתוק תא
- הסר את מדיום הצמיחה ADSC באמצעות אספירטור/פיפטה. יש לשטוף את ה-ADSCs המתמזגים פעמיים עם 2 מ"ל של PBS סטרילי בטמפרטורת החדר.
- שאפו PBS והוסיפו 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לכל צלחת תרבית 100 מ"מ. ודא כי כל שטח הפנים מכוסה טריפסין.
- צלחת דגירה במשך ~ 7 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2 עד ADSCs מנותקים. הסר צלחת מהאינקובטור ונתק תאים באופן מכני על ידי צינורית בכוח של תמיסת הטריפסין בצלחת.
- הוסיפו 2 מ"ל של מדיום גדילה ADSC לתאים המפורקים ופיפטה עדינה כדי לערבב. מעבירים תאים לצינור חרוטי פלסטי סטרילי של 50 מ"ל. כדי להבטיח התאוששות מרבית של התאים, יש לשטוף את צלחת התרבית עם עוד 2 מ"ל של מדיום גדילה ADSC, ולהעביר את המדיום לצינור החרוטי המכיל תאים מנותקים.
- צנטריפוגה של 50 מ"ל צינור חרוטי ב 500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל גלולה תא. בזהירות decant supernatant מבלי להפריע את כדור התא.
- יש להחזיר את גלולת התא ב-5-6 מ"ל של מדיום גדילת ADSC לכל 1 x 106 תאים .
- ספירת תאים וציפוי
- בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, יש לדלל 10 μL של תמיסת תאים מלמעלה ו-10 μL של תמיסה כחולה טריפאן של 0.04% (0.4% טריפאן כחול מדולל 1:10 ב-PBS) ולספור תאים באמצעות המוציטומטר.
- השהה את המספר הרצוי של ADSCs במדיום הצמיחה. עבור צלחת תרבית 100 מ"מ, צלחת ~ 3.0 x 105 תאים ב 10 מ"ל ADSC מדיה כדי לאפשר 80% מפגש ב 72 שעות או 100% מפגש ב 96 שעות.
- צפו בצלחת תחת מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 10 לפני הדגירה כדי להבטיח נוכחות של תאים מרחפים. שמור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 ו-100% לחות יחסית.
- כל 48 שעות שאפו את מדיום הגדילה והחליפו אותו במדיום חם (37 מעלות צלזיוס) עד שהתאים נפגשים ב-80% עד 90% כפי שמוצג באיור 1B.
- חזור על שלבים מקטעים 3.1 ו- 3.2 לקבלת מספר מתאים של קטעים כדי לקבל את מספר התא הרצוי.
הערה: לאחר מעברים 5 עד 6, נראה כי תאים ראשוניים עוברים סנסנציה; לכן, יש לשאוף להשיג את מספרי התאים הרצויים על ידי מעבר 4.
4. התמיינות אדיפוגנית ADSC
- שאף למדיום צמיחה של ADSC מ- ADSCs שהודבקו שהגיעו למפגש של 80% עד 90%.
- יש לשטוף במהירות את שכבת תאי ADSC עם PBS סטרילי בטמפרטורת החדר.
- הוסף מדיום בידול ADSC. עבור צלחת תרבית 100 מ"מ, להוסיף 10 מ"ל של מדיום הבחנה ADSC.
- יש להחליף בינוני כל 3 ימים למשך כ-14-21 ימים. אדיפוציטים בוגרים נצפים בדרך כלל לאחר 14 יום של הבחנה.
- בחנו תאים תחת מיקרוסקופ אור הפוך בהגדלה של פי 40 כדי לאשר את נוכחותן של טיפות שומנים כפי שמוצג באיור 2A.
5. זיהוי אדיפוציטים
הערה: סעיף זה יתאר פרוטוקולי צביעה המשמשים לזיהוי טיפות שומנים באדיפוציטים מובחנים, עם זאת, צביעה אימונופלואורסצנטית עבור CD105, סמן תאי גזע מזנכימליים, יכולה לשמש גם לאישור ADSC.
- שמן אדום O מכתים
- הכן 0.5% שמן אדום O פתרון מלאי איזופרופנול. עבור 20 מ"ל של תמיסת מלאי שמן O אדום, יש להמיס 100 מ"ג שמן O אדום ב-20 מ"ל של איזופרופנול. סנן את התמיסה דרך מסנן מזרק סטרילי עם קרום 0.2 מיקרומטר.
- שאפו בזהירות את מדיום ההתמיינות ושטפו את התאים פעמיים על ידי הוספת PBS לאורך צידי הבאר כדי לא להפריע למונולייר של התא.
- שאפו בזהירות PBS מתאים והוסיפו מספיק פורמלין נאגר נייטרלי (NBF, 10%) כדי לכסות את שכבת התא. לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30-60 דקות.
- במהלך שלב קיבוע הפורמלין, הכינו תמיסת עבודה של שמן אדום O על ידי דילול 3 חלקים של תמיסת מלאי O אדומה עם 2 חלקים של מים מזוקקים. מערבבים את התמיסה והמסנן דרך מסנן מזרק סטרילי עם קרום 0.2 מיקרומטר. פתרון העבודה יציב עד שעתיים.
- שאפו בזהירות NBF ושטפו במהירות (~ 15 שניות) את שכבת התא במים מזוקקים. יש להוסיף כמות מספקת של 60% איזופרופנול כדי לכסות את שכבת התא לאחר שאיפת מים ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- שאפו בזהירות איזופרופנול לאחר דגירה של 5 דקות והוסיפו מספיק תמיסת עבודה של שמן אדום O כדי לכסות את שכבת התא ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות.
- שאפו בזהירות את תמיסת העבודה Oil Red O ושטפו את שכבת התא מספר פעמים במים מזוקקים עד שהמים מתבהרים.
- הוסיפו PBS לצלחת תרבית התאים ובחנו תאים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לקבל אינדיקציה להתמיינות ולנוכחות של טיפות שומנים (איור 2B).
- מכתים BODIPY
- הכן תמיסת מלאי BODIPY של 5 mM על ידי המסת 1.3 גרם של BODIPY ב-1 מ"ל של DMSO. הכן 2 מיקרוגרם / מ"ל פתרון עבודה BODIPY על ידי דילול פתרון המלאי 1:25,000 פעמים ב- PBS.
- שאפו בזהירות את מדיום ההתמיינות ושטפו את התאים פעמיים על ידי הוספת PBS לאורך צידי הבאר כדי לא להפריע למונולייר של התא.
- שאפו בזהירות PBS והוסיפו מספיק פתרון עבודה BODIPY כדי לכסות את שכבת התא ולדגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
הערה: מנקודה זו, הגן על התאים מפני אור על ידי כיסוי צלחת בנייר כסף. - שאפו בזהירות את פתרון העבודה BODIPY ושטפו את שכבת התא 3 פעמים עם PBS.
- תקן תאים על ידי הוספת 4% paraformaldehyde ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
- שאפו בזהירות את מאגר הקיבוע ושטפו את התאים פעמיים על ידי הוספת PBS לאורך צידי הבאר כדי לא להפריע לתא מונולייר.
- הוסיפו PBS לתרביית תאים ובחנו תאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כדי למצוא עדויות להתמיינות ולנוכחות של טיפות שומנים (איור 2C). תאי תמונה באמצעות ערכת מסננים של FITC/EGFP/Bodipy Fl/Fluo3/DiO Chroma. אורך גל העירור הוא 480 ננומטר עם רוחב פס של 40 ננומטר ואורך גל הפליטה הוא 535 ננומטר עם רוחב פס של 50 ננומטר. ניתן להשתמש בערכת מסננים דומה או מתאימה, ובמיקרוסקופ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ה-ADSCs שבודדו מדגימות רקמת השומן של קופי מקוק רזוס נזרעו על צלחות תרבית ומוצגות באיור 1. ביום הציפוי, התאים אינם דבקים וצפים בצלחת התרבית כפי שמוצג באיור 1A. תוך 72 שעות, ADSCs יהפכו למפגש של 80% ויהיו מוכנים להתמיינות אדיפוציטים (איור 1B). ADSCs מפגינים תכונות אדיפוגניות חזקות לאחר אינדוקציה כימית. לאחר 14 ימים של התמיינות ניתן לצפות באדיפוציטים בוגרים באמצעות מיקרוסקופיית אור (איור 2A). כדי לאשר התמיינות אדיפוגנית של ADSC ניתן להשתמש בכתמים שונים כדי לדמיין טיפות שומנים של האדיפוציטים הבוגרים המובחנים. ביום ה-14 להתמיינות, התאים הוכתמו וקובעו באמצעות O אדום שמן (איור 2B) ו-BODIPY (איור 2C) להדמיית טיפות שומנים. החץ השחור מייצג אדיפוציט מובחן (איור 2B). נתונים אלה מצביעים על כך שבעקבות פרוטוקול זה, ADSCs נוצרו מרקמת שומן של מקוק רזוס והתמיינו לאדיפוציטים בוגרים.
איור 1: מיקרוגרפים קלים של ADSCs ביום הציפוי ובמפגש תאים של 80%. (A) מיקרוגרף אור מייצג של תאי כלי דם סטרומליים ביום הציפוי לאחר בידוד ADSC מרקמת שומן טרייה של מקוק רזוס (הגדלה של פי 10). (B) מיקרוגרף אור מייצג של ADSCs במפגש של 80% (הגדלה של 20x). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: מיקרוגרפים של ADSCs ביום 14 של ההבחנה. (A) מיקרוגרף אור מייצג המתקבל ביום 14 של הבחנה ADSC (הגדלה של 40x). (B) מיקרוגרף מייצג של כתם O אדום שמן ביום 14 של הבחנה ADSC (הגדלה של 20x). (C) מיקרוגרף מייצג של בורון-דיפירומתנן (BODIPY) מכתים ביום 14 של התמיינות ADSC (הגדלה של פי 20). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקולי בידוד, התפשטות והתמיינות של ADSC הם ישרים וניתנים לשחזור, אך הם דורשים טכניקה זהירה כדי להבטיח בידוד הולם, התרחבות בריאה ובידול יעיל. סביבת עבודה סטרילית היא קריטית לכל הניסויים בתרביות תאים. חיידקים או פטריות עשויים להיות מוחדרים לתרביות תאים באמצעות כלים מזוהמים, מדיה או סביבת עבודה. זיהום פטרייתי מסומן על ידי צמיחת נבגים בתרבית, בעוד זיהום חיידקי מסומן על ידי נוכחות של עכירות של התקשורת. אנו מציעים לחטא את ארון הביו-בטיחות ואת כל הפיפטות, הבקבוקים והכלים לפני השימוש, להפעיל את זרימת האוויר הלמינרית לפחות 15 דקות לפני השימוש בארון הביו-בטיחות ולחטא את הארון ואת כל הפיפטות לאחר השימוש כדי להפחית את הסיכון לזיהום. כמו כן, אנו מציעים אוטוקלב טיפים לפיפטה ללא פילטר לשאיפת ואקום ושטיפת השואף במים סטריליים ואחריהם 70% אתנול לאחר השימוש. צלחת תרבית עם מדיה בלבד ניתן להציב בחממה האדים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5 % CO2 במשך כמה ימים כדי לבדוק את הסטריליות של התקשורת. תרבויות מזוהמות יש להלבין במשך 30 דקות ולהשליך. יש לחטא גם את אינקובטור תרבית התאים.
הבדל משמעותי בין הפרוטוקולים בכתב יד זה לבין אלה שפורסמו בעבר הוא השימוש ב-BSA במאגר העיכול של קולגן ADSC שלנו, המאפשר בידוד של אדיפוציטים בוגרים ו-ADSCs. בנוסף, הפרוטוקול שלנו משתמש במדיום צמיחה ADSC בתוספת 20% FBS לעומת 10% FBS כפי שהוצע על ידי רוב הפרוטוקולים. שמנו לב כי ADSCs ראשוניים של מקוק רזוס מתרבים ומבדילים טוב יותר עם 20% FBS. התמיינות ADSC במבחנה מושרית על ידי סוכני אינדוקציה ספציפיים לשושלת. סוכני האינדוקציה המשמשים בפרוטוקול זה מקובלים באופן נרחב עבור הבחנה אדיפוגנית במבחנה של ADSCs. עם זאת, בניגוד לפרוטוקולים רבים שפורסמו בעבר, קוקטייל ההתמיינות האדיפוגנית אינו כולל אגוניסטים של אינסולין או PPARγ. אנו ואחרים השתמשנו בפרוטוקול זה כדי להבדיל בהצלחה הן בין מקוק רזוס והן בין ADSCs אנושיים14,15,16.
בפרוטוקול זה, התמיינות אדיפוגנית של ADSC מאושרת על ידי זיהוי טיפות שומנים באמצעות טכניקות צביעה של שמן אדום O ו- BODIPY. למרות שכתמים אלה מוכרים היטב בתחום, ישנן שיטות אחרות הנפוצות הכוללות ציטומטריה של זרימה לזיהוי CD105 לזיהוי ADSCs, או סמנים של תאי אנדותל ותאי מערכת החיסון כדי לקבוע טוהר של ADSCs17.
השימוש ב-ADSCs מספק כלי רב ערך לרפואה רגנרטיבית ולמחקר מטבולי. בידוד והתפשטות ADSC מייצרים מספר רב של תאי גזע שיכולים לשמש למספר יישומים במורד הזרם וטכניקות ניסיוניות, כולל אך לא מוגבל לאלה המתוארים בפרוטוקול זה. שימוש עיקרי המיועד לאדיפוציטים מובחנים בפרוטוקול זה כולל שימוש במבחנים מטבוליים כגון ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין, ליפוגנזה וליפוליזה מגורה18. בנוסף, ניתן להבדיל בין ADSCs לשושלת אוסטאוגנית וכונדרוגנית ולהשתמש בהם לניתוח במורד הזרם, כולל להנדסת רקמות7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לקרטיס ונדה סטווה על עזרתו הטכנית. המחקר שבבסיס הפיתוח של הפרוטוקולים נתמך על ידי מענקים מהמכון הלאומי להתמכרות לאלכוהול ואלכוהוליזם (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 ו- 1F31AA028459-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 % trypan blue | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1.5-ml microcentrifuge tube | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL plastic conical tube | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| Aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Collagenase, Type I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Distilled water | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Fetal Bovine Serum, USDA-approved | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacytometer with cover slip | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Inverted light microscope | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
| Neutral buffered formalin (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Paraformeldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Serological pipettes, 2 to 25 mL | Costar Stripettes | ||
| Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
References
- Fain, J. N. Release of interleukins and other inflammatory cytokines by human adipose tissue is enhanced in obesity and primarily due to the nonfat cells. Vitamins and Hormones. 74, 443-477 (2006).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
- Wang, P., Mariman, E., Renes, J., Keijer, J. The secretory function of adipocytes in the physiology of white adipose tissue. Journal of Cellular Physiology. 216 (1), 3-13 (2008).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Via, A. G., Frizziero, A., Oliva, F. Biological properties of mesenchymal Stem Cells from different sources. Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 154-162 (2012).
- Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).
- Zuk, P. Adipose-derived stem cells in tissue regeneration: A Review. International Scholarly Research Notices Stem Cells. 2013, 713959 (2013).
- Smith, U., Kahn, B. B. Adipose tissue regulates insulin sensitivity: role of adipogenesis, de novo lipogenesis and novel lipids. Journal of Internal Medicine. 280 (5), 465-475 (2016).
- Laclaustra, M., Corella, D., Ordovas, J. M. Metabolic syndrome pathophysiology: the role of adipose tissue. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Disease. 17 (2), 125-139 (2007).
- Grundy, S. M. Adipose tissue and metabolic syndrome: too much, too little or neither. European Journal of Clinical Investigation. 45 (11), 1209-1217 (2015).
- Neeland, I. J., et al. Dysfunctional adiposity and the risk of prediabetes and type 2 diabetes in obese adults. Journal of the American Medical Association. 308 (11), 1150-1159 (2012).
- Kahn, C. R., Wang, G., Lee, K. Y. Altered adipose tissue and adipocyte function in the pathogenesis of metabolic syndrome. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 3990-4000 (2019).
- Sarjeant, K., Stephens, J. M.
- Ford, S. M., et al. Differential contribution of chronic binge alcohol and antiretroviral therapy to metabolic dysregulation in SIV-infected male macaques. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 315 (5), 892-903 (2018).
- Gagliardi, C., Bunnell, B. A. Isolation and culture of rhesus adipose-derived stem cells. Methods in Molecular Biology. 702, 3-16 (2011).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead. Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).
