本文报告了一种简单的方法,用于分离鸡蛋的外层和内围线子层,同时最大限度地减少结构变化,并优化每个亚层的蛋白质溶解,以便进行蛋白质分析。
蛋黄周围的近缘层在受精、卵防御和鸟类胚胎发育中起着至关重要的作用。它是由两个蛋白质分层形成的,它们由不同的女性生殖器官紧密相连并形成。这两种结构都假定它们有自己的功能特异性,仍有待确定。要描述构成每个子层的蛋白质的功能,第一个挑战是确定允许机械分离这两个复杂层的条件,同时限制任何结构损伤。第二步是优化实验条件,促进这两个子层的蛋白质溶解,以便随后进行生化分析。通过分析多德西勒硫酸钠-多利-丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)每个亚层的蛋白质特征,评估这种方法的效率,预计这两种结构之间将截然不同。这个两步程序仍然简单:它需要经典的生化设备和试剂:并与更深入的蛋白组学兼容。它也可能被转移到其他鸟类卵子进行比较生物学,因为知道围线层的结构和组成已被证明具有物种特异性特征。此外,为子层分离(步骤 1)开发的非脱色条件允许其通过扫描和传输电子显微镜进行结构分析。它也可能构成随后蛋白质纯化的第一步,以分析其各自的生物活动和3D结构,或进行进一步的免疫组织化学或功能分析。这些研究将有助于破译这两个子层的生理功能,其结构和功能整合是生殖成功的决定性标准。
这种方法的目的是提供一个协议,允许随后的生化特征的围线层(PL),一个薄蛋白酶层包围蛋黄,并在鸟类物种的繁殖中发挥根本作用。PL在文献中也被称为”维他林膜”,是一个由多种糖蛋白组成的厚纤维的三维网络。它由内围线层(IPL)(与蛋黄接触)和外围线层(OPL,与白色接触)组成,位于IPL(图1),由内膜产生。后一种组织是排卵后接受成熟蛋黄卵泡的卵巢状上部,以及受精的部位。OPL的分泌发生在这两个事件后,随后在卵子的其他特定部分连续沉积蛋清和蛋壳。PL的生理功能不仅与胚胎的受精和早期发育有关,而且与胚胎的物理和分子保护有关。对整个PL进行的鸡蛋蛋白质分析显示存在137种不同的蛋白质1,但这些蛋白质在IPL和OPL之间的分布还有待阐明。文献报告中提供的数据量最少,IPL和OPL表现出非常不同的蛋白质特征2、3、4,这表明不同的结构和功能特性。OPL 和 IPL 之间蛋白质分布数据的相对稀缺可能是由于难以分离两个薄而嵌入的子层。
此处介绍的方法描述了用于分离对各自组织结构影响有限的两个子层,同时保留其蛋白质含量的条件,并提供允许蛋白质完全溶解的协议,供蛋白质组学随后分析。它包括两个主要步骤:1) PL 采样和 OPL/IPL 分离和 2) PL、OPL 和 IPL 治疗蛋白质溶解和电光度,用于质谱分析。工作流程以图 2表示。值得注意的是,虽然本方案已优化为蛋白质组分析(步骤2.2),但它可以在组织学(例如电子显微镜)、免疫组织化学分析、功能研究(第1步)和盐溶性蛋白的纯化等步骤停止,以描述其结构和生物活性(步骤2.1)。
第一步是从蛋黄中去除总PL(图2,步骤1.1)。所有已发布的方法均从手动将蛋清与蛋黄分离开始,或使用鸡蛋分离器。然后用钳子或吸附在滤纸5(图2A)上去除剩余的蛋清和厚厚的沙拉扎。接下来,选择对PL进行采样的技术是可变的,具体取决于已发表的文章。一些论文包括几洗蛋黄,在去离子化或蒸馏水1,5,6,在0.85至1%盐溶液2,7,8,在缓冲溶液,如0.15 M NaCl/N-[Tris(羟基甲基)甲基]-2-氨基硫化酸, pH 7.44,或在0.01N HCl (pH 2)3.这些程序适用于鸡,鸭,环颈野鸡,灰片,鹦鹉鹦鹉,家鸽,或老鼠蛋2,6,9。去除PL,而蛋黄保持在培养皿没有下液溶液可能非常费力,因为PL是脆弱的,蛋黄往往坚持PL1,5,因此仍然难以消除之后。在 37 °C3处使用酸性缓冲液或溶液一小时也是不宜的,因为这种情况可能会改变 PL 结构,并可能导致蛋白质损失。删除含有细菌盘的区域也很重要,因为该区域可能有一个独特的结构和分子模式,它不反映整个PL 4,6,10(图2B)。该方法利用一些已发表的文章强调的想法,并提出了一些改进,以方便PL采样,同时保持其完整性(图2C)。
第二步包括分离两个子层(图2,步骤1.2)。这一步骤至关重要,因为 OPL 和 IPL 紧密相连。这一步骤应在双筒解剖显微镜下用钳子小心地进行。报告OPL/IPL分离的出版物是相当有限的2,3,7,11,其中一些使用特定的条件(酸性缓冲在37°C为1小时2,3),可能会影响分层的组织结构和/或导致蛋白质损失或蛋黄或白色污染。为了更好地区分 OPL 和 IPL,一些作者报告了使用托卢伊丁蓝色来稍微给 OPL 涂上颜色(内层保持无色)11。在开发的方法中,我们优化了条件,使分离很容易实现,不需要使用任何染料(图2D)。
第二个主要步骤是组成每个子层的蛋白质的溶解。经典地,它是通过混合干净的亲血友病1,干2,6,或新鲜准备的3,4,11 PL/子层直接与莱姆利缓冲用于电磷。其他作者喜欢在1%NaCl的层初步溶解,在1%的SDS缓冲溶液2,3,11或含有蛋白酶抑制剂和SDS6在室温或Triton的溶液中,然后孵育在45°C12,在不断的剧烈搅拌下。一些作者还描述了一个协议,其中PL在磷酸盐缓冲盐水或尿素中孵育,并受到声波13。这些处理方法之后,Laemmli 缓冲液中都进行了离心和稀释,并且都与从层中分离出不完整的蛋白质溶解的缺点,因为不可溶性物质(离心后获得的颗粒)被丢弃在要分析的样品中。
此外,某些作者使用脱尿条件(尿素、洗涤剂、高温等)进行蛋白质溶解与随后的蛋白质纯化不相容,因为它们可能不可逆转地使蛋白质灭活,干扰其生物活动,并损害其3D结构。对于此特定步骤 2, 该协议包括PL/OPL/IPL机械解构后,允许在非衰变条件下溶解最丰富的蛋白质的第一个子步骤,如果需要,该子步骤不会干扰进一步的蛋白质研究(图2,步骤2.1),以及第二个子步骤,允许电光和深度蛋白质组学蛋白质组学(图2,步骤2.2)的蛋白质完全溶解。它结合了从各种已发表的论文中获取的建议和实验研究验证的新想法所产生的调整。
本协议的成功依赖于独立优化的两个关键步骤:OPL 和 IPL 的机械分离,这些步骤需要尽可能少地解构,然后是每个子层的完全蛋白质溶解,相反,即去结构化和脱解。它还强调了需要考虑的一些具体要点,以确保每一步骤的成功实现。
协议不取决于蛋壳的颜色,鸡蛋重量,生产类型,或母鸡的遗传菌株。然而,这取决于鸡蛋的新鲜度。事实上,卵子在下床后会迅速进行深刻的内部物理化学修饰,不过在冷藏条件下进行储存时,这些变化可能会延迟。储存期间通过蛋壳毛孔流失的二氧化碳导致蛋清 pH(从 7.8 增加到 9.5)增加,而整个 PL 的蛋黄和白色之间则发生一些水交换。这两种修饰都对PL的分子和组织结构产生了负面影响,这种结构在14、15日变得虚弱和不那么紧张,很可能是由于其蛋白质含量16、17、18的物理化学修饰。据推测,分层的分离将变得非常困难的存储鸡蛋,特别是如果存储在室温下进行很长一段时间。截至目前,该协议已使用在 4 °C 下储存不到 4 天的鸡蛋执行,目前尚不清楚鸡蛋有效采样 PL 子层的最大储存时间。此外,如果目标是分析每个子层,则使用未受精的鸡蛋至关重要。产卵当天,受精卵的胚胎有23小时大,如果卵子孵育的话,其发育非常迅速。事实上,胚胎发育和一些外在结构的生长扩大使用PL作为一个基质,这是因此迅速退化,并取代外生蛋黄囊19。
在手动分离蛋黄和蛋清后,蛋黄需要从蛋清痕迹和与 PL 紧密相连的沙拉扎中清洗。提示是小心地将蛋黄卷在滤纸上,并在缓冲溶液(10 mM Tris-HCl pH 8)中对蛋黄进行广泛清洗。用于缓冲的pH值与蛋清14的生理pH值一致,已被证明可以最大限度地减少蛋白质损失(图3)。然后,使用冷藏缓冲区将有助于从蛋黄中去除 PL,因为在 4 °C 时,缓冲液将促进 PL 去除,因为脂质蛋黄缩回,在此温度下变得不那么流体。额外的洗涤将允许去除从PL的蛋黄残留物。切除与胚芽盘相对应的区域也很重要,因为包含女性亲核的这种结构可能不代表PL。当卵子受精时,它是胚胎细胞受精和繁殖的部位。它应该有一个特定的组成,可能不能代表整个PL,这就是为什么它被删除的原因。当蛋黄浸入冷缓冲区时,这一特定步骤非常方便。虽然这种胚芽盘结构被丢弃在目前的协议(出目标),具体分析这一领域的受精卵可能是非常有用的科学家有兴趣研究的PL含量(蛋白和活性)和结构(电子显微镜)的演变,在胚胎生成的早期阶段19,20,21。在这个阶段,整个PL在结构上完好无损,可以通过电子显微镜(图2),步骤1.2或步骤2.1(如果目标是分析整个PL)进行进一步的结构分析。
第 1.2 步需要在双筒望远镜解剖显微镜下进行,因为 PL 非常薄且易碎(约 10μm 厚)。在水中或缺乏最少盐的缓冲区,子层的分离几乎是不可能的,最初使用这些选项的尝试已经导致严重的PL损坏。因此,为这一步骤选择的缓冲器保持在生理pH值(pH 8),包含50 mM NaCl。这一步是艰巨的,必须仔细和轻轻地执行,以防止PL撕裂。分离后,两个子层可以很容易地识别,因为它们表现出独特的物理特征(不透明与半透明)。在显微镜的照射下,IPL缺乏同质性,这应反映不完全分离,从而反映IPL上存在的OPL剩余斑点的存在。此外,很难治疗整个膜和使用2厘米×3厘米片大大增加了成功的机会。由此获得的子层适合电子显微镜(图1)进行组织学研究。值得注意的是,在显微图(图1)上可以看到名为连续膜(CM)的特定线性结构(0.05至1微米厚),并且在分离过程中通常仍附着在一个或另一个子层上。此前已经公布,当使用相对较高的盐摩尔分离(500 mM)时,CM仍附着在OPL7上,而水5的使用将有利于CM与IPL的依附。在此协议中,低盐摩尔度用于实现特定目标(PL 子层结构完整且蛋白质损失最小),这意味着此 CM 可能与 IPL 相关。然而,通过传输电子显微镜对IPL和OPL进行进一步分析,可以清楚地说明这一假设。在第1步结束时获得的PL、OPL或IPL层也可用于精子卵结合分析22的体外测定,或分析胚胎发育的早期步骤23、24。
第 2 步是指蛋白质含量的溶解,部分(步骤 2.1)或完全(步骤 2.2)。PL 和/或 OPL 首先进行亲血素化,以去除水分子并允许精确测量重量。事实上,PL主要由水(88%)7组成,而干物质主要含有蛋白质(80%至90%,取决于研究)、碳水化合物、脂肪和矿物质2、7、25。考虑到PL中所含的水通过冷冻干燥去除,碳水化合物基本上在PL糖蛋白中回收,而源自蛋黄的脂肪和矿物质基本上被大量洗涤丢弃,因此假定产生的PL几乎完全由蛋白质组成。因此,完全冻伤后获得的体重值应主要对应于蛋白质。然后,在包含 0.5 M NaCl 的缓冲区中稀释等量的 PL、OPL 和/或 IPL。高盐摩尔结合通过研磨对纤维网的机械破坏,大大促进了非衰变条件下的蛋白质溶解。在此步骤之后,使用沸腾、SDS 洗涤剂和还本剂β-甲醇(步骤 2.2)进行完全溶解。事实上,一些IPL蛋白是SDS溶性糖蛋白25,26,27和OPL的主要成分是NaCl溶性1,11。使用此协议,我们没有看到离心后剩余的不溶性蛋白质颗粒,这表明溶解可能已完成。然后由 SDS-PAGE 分析 PL、OPL 和/或 IPL 的蛋白质。由此产生的蛋白质特征与已发表的文献2、4、11、16一致,但信号的分辨率和强度得到高度提高,各种IPL和OPL独立取样之间的均匀性也更加均匀。
此外,OPL和IPL之间的定量比较是可能的,这要归功于我们推断的各子层2,7的权重的准确性。此外,OPL 和 IPL 配置文件都非常明显,除了 14 kDa 和 75 kDa 的微弱波段外,两个 PL 子层均不明显共享显示相同分子量的波段。这一观测证实了亚层分离的效率,没有明显的交叉污染。根据1日公布的唯一PL蛋白质分析,OPL(+lt:30 kDa)中最强烈的波段应对应溶酶(14kDa)、维他林膜外层蛋白1(17kDa)、禽流感β-防御素 11 (表面分子量 12 kDa), 而 IPL (+30 kDa) 的强带可能是佐纳-佩卢西达蛋白 1 (102 kDa) 和佐纳-佩卢西达蛋白 3 (47 kDa).非常丰富的PL蛋白卵巢转移素(78千达),椭圆形布明相关的蛋白质X(45千达),椭圆形布明(43千达)1在子层之间的分布还有待阐明。事实上,这些蛋白质的高分子量(+30 kDa)表明,它们是基于SDS-PAGE轮廓的IPL蛋白,但它们的组织特异性(卵磷表达蛋白)宁愿将这些蛋白质与OPL28,29联系起来。此外,一些人还认为,由于洗涤不足,蛋白和蛋黄蛋白可能会对PL样品造成污染。这种缺乏信息是制定本议定书的基础,该议定书将进一步用于PL、OPL和IPL的深入定量蛋白经济学。
或者,从步骤2.1和离心后去除不溶性物质,有可能提取一些特定的蛋白质,以进一步生化和生物特征。这种方法最近被应用于描述OPL的两个主要组成部分的生物活动和/或3D结构,即维他林膜外层蛋白1(VMO1)和禽流感β-防御素11(AvBD11)30,31。这些蛋白质作为纯化分子的可用性也可能有助于产生特定的抗体,用于其他实验,如免疫化学或定量检测的发展,包括酶链接免疫素分析。
此协议的两个主要限制是:(1) 子层分离的挑战,特别是如果鸡蛋在 4°C 下储存超过 4 天,并且 (2) 完全蛋白质溶解需要减少和破坏缓冲,这损害了由此产生的样品的内在生物活性。关于第一个限制,机械分离需要技术技能,但在2或3次实验培训后很容易实现。某些 IPL 小件可能仍连接到 OPL,反之亦然,因为两个子层都紧密关联。但是,如果谨慎执行机械分离,则另一个子层的污染应最小。最佳分层分离后的典型 IPL 和 OPL SDS-PAGE 配置文件在 图 5中说明。关于第二个限制,本文中提出的实验步骤已优化为蛋白质分析,以便提供构成每个子层的蛋白质的详尽列表。为了进一步描述每种蛋白质的生物活性,有必要在步骤 2.1.2 停止,然后使用脱毒条件(步骤 2.2.1,使用含有 SDS 和β-甲醇的缓冲器,然后煮沸)。然而,值得注意的是,由步骤2.1.2产生的蛋白质只是盐溶性蛋白质,而盐溶性蛋白质形成聚合。进一步评估其各自活动的一个选择可能是使用异种系统(大肠杆菌、巴库洛病毒、酵母菌等)生产盐溶性蛋白质作为重组蛋白。
此协议可适应其他鸟类蛋进行比较研究,以更好地了解每个物种的独创性。事实上,PL在结构上和蛋白质组成方面都表现出一些鸟类特异性,这可能是由于适应了新的环境,但也适应了发育特异性2,6,9,32。这一需要适度技术和经典设备/材料的协议的发展为鸟类繁殖和物种研究领域开辟了新的研究途径。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢菲利普·迪迪埃和卡琳·安格(INRAE,PEAT,37380,法国努齐利,https://doi.org/10.15454/1.5572326250887292E12)提供未受精的伊萨棕色鸡蛋。我们还感谢法国图尔大学资助布雷贡博士。这项工作得到了法国国家研究机构(EQLIPSE,ANR-19-CE21-0006)的财政支持。
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