Summary
本文报告了一种简单的方法，用于分离鸡蛋的外层和内围线子层，同时最大限度地减少结构变化，并优化每个亚层的蛋白质溶解，以便进行蛋白质分析。
Abstract
蛋黄周围的近缘层在受精、卵防御和鸟类胚胎发育中起着至关重要的作用。它是由两个蛋白质分层形成的，它们由不同的女性生殖器官紧密相连并形成。这两种结构都假定它们有自己的功能特异性，仍有待确定。要描述构成每个子层的蛋白质的功能，第一个挑战是确定允许机械分离这两个复杂层的条件，同时限制任何结构损伤。第二步是优化实验条件，促进这两个子层的蛋白质溶解，以便随后进行生化分析。通过分析多德西勒硫酸钠-多利-丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）每个亚层的蛋白质特征，评估这种方法的效率，预计这两种结构之间将截然不同。这个两步程序仍然简单：它需要经典的生化设备和试剂：并与更深入的蛋白组学兼容。它也可能被转移到其他鸟类卵子进行比较生物学，因为知道围线层的结构和组成已被证明具有物种特异性特征。此外，为子层分离（步骤 1）开发的非脱色条件允许其通过扫描和传输电子显微镜进行结构分析。它也可能构成随后蛋白质纯化的第一步，以分析其各自的生物活动和3D结构，或进行进一步的免疫组织化学或功能分析。这些研究将有助于破译这两个子层的生理功能，其结构和功能整合是生殖成功的决定性标准。
Introduction
这种方法的目的是提供一个协议，允许随后的生化特征的围线层（PL），一个薄蛋白酶层包围蛋黄，并在鸟类物种的繁殖中发挥根本作用。PL在文献中也被称为"维他林膜"，是一个由多种糖蛋白组成的厚纤维的三维网络。它由内围线层（IPL）（与蛋黄接触）和外围线层（OPL，与白色接触）组成，位于IPL（图1），由内膜产生。后一种组织是排卵后接受成熟蛋黄卵泡的卵巢状上部，以及受精的部位。OPL的分泌发生在这两个事件后，随后在卵子的其他特定部分连续沉积蛋清和蛋壳。PL的生理功能不仅与胚胎的受精和早期发育有关，而且与胚胎的物理和分子保护有关。对整个PL进行的鸡蛋蛋白质分析显示存在137种不同的蛋白质1，但这些蛋白质在IPL和OPL之间的分布还有待阐明。文献报告中提供的数据量最少，IPL和OPL表现出非常不同的蛋白质特征2、3、4，这表明不同的结构和功能特性。OPL 和 IPL 之间蛋白质分布数据的相对稀缺可能是由于难以分离两个薄而嵌入的子层。
此处介绍的方法描述了用于分离对各自组织结构影响有限的两个子层，同时保留其蛋白质含量的条件，并提供允许蛋白质完全溶解的协议，供蛋白质组学随后分析。它包括两个主要步骤：1） PL 采样和 OPL/IPL 分离和 2） PL、OPL 和 IPL 治疗蛋白质溶解和电光度，用于质谱分析。工作流程以图 2表示。值得注意的是，虽然本方案已优化为蛋白质组分析（步骤2.2），但它可以在组织学（例如电子显微镜）、免疫组织化学分析、功能研究（第1步）和盐溶性蛋白的纯化等步骤停止，以描述其结构和生物活性（步骤2.1）。
第一步是从蛋黄中去除总PL（图2，步骤1.1）。所有已发布的方法均从手动将蛋清与蛋黄分离开始，或使用鸡蛋分离器。然后用钳子或吸附在滤纸5（图2A）上去除剩余的蛋清和厚厚的沙拉扎。接下来，选择对PL进行采样的技术是可变的，具体取决于已发表的文章。一些论文包括几洗蛋黄，在去离子化或蒸馏水1，5，6，在0.85至1%盐溶液2，7，8，在缓冲溶液，如0.15 M NaCl/N-[Tris（羟基甲基）甲基]-2-氨基硫化酸， pH 7.44，或在0.01N HCl （pH 2）3.这些程序适用于鸡，鸭，环颈野鸡，灰片，鹦鹉鹦鹉，家鸽，或老鼠蛋2，6，9。去除PL，而蛋黄保持在培养皿没有下液溶液可能非常费力，因为PL是脆弱的，蛋黄往往坚持PL1，5，因此仍然难以消除之后。在 37 °C3处使用酸性缓冲液或溶液一小时也是不宜的，因为这种情况可能会改变 PL 结构，并可能导致蛋白质损失。删除含有细菌盘的区域也很重要，因为该区域可能有一个独特的结构和分子模式，它不反映整个PL 4，6，10（图2B）。该方法利用一些已发表的文章强调的想法，并提出了一些改进，以方便PL采样，同时保持其完整性（图2C）。
第二步包括分离两个子层（图2，步骤1.2）。这一步骤至关重要，因为 OPL 和 IPL 紧密相连。这一步骤应在双筒解剖显微镜下用钳子小心地进行。报告OPL/IPL分离的出版物是相当有限的2，3，7，11，其中一些使用特定的条件（酸性缓冲在37°C为1小时2，3），可能会影响分层的组织结构和/或导致蛋白质损失或蛋黄或白色污染。为了更好地区分 OPL 和 IPL，一些作者报告了使用托卢伊丁蓝色来稍微给 OPL 涂上颜色（内层保持无色）11。在开发的方法中，我们优化了条件，使分离很容易实现，不需要使用任何染料（图2D）。
第二个主要步骤是组成每个子层的蛋白质的溶解。经典地，它是通过混合干净的亲血友病1，干2，6，或新鲜准备的3，4，11 PL/子层直接与莱姆利缓冲用于电磷。其他作者喜欢在1%NaCl的层初步溶解，在1%的SDS缓冲溶液2，3，11或含有蛋白酶抑制剂和SDS6在室温或Triton的溶液中，然后孵育在45°C12，在不断的剧烈搅拌下。一些作者还描述了一个协议，其中PL在磷酸盐缓冲盐水或尿素中孵育，并受到声波13。这些处理方法之后，Laemmli 缓冲液中都进行了离心和稀释，并且都与从层中分离出不完整的蛋白质溶解的缺点，因为不可溶性物质（离心后获得的颗粒）被丢弃在要分析的样品中。
此外，某些作者使用脱尿条件（尿素、洗涤剂、高温等）进行蛋白质溶解与随后的蛋白质纯化不相容，因为它们可能不可逆转地使蛋白质灭活，干扰其生物活动，并损害其3D结构。对于此特定步骤 2， 该协议包括PL/OPL/IPL机械解构后，允许在非衰变条件下溶解最丰富的蛋白质的第一个子步骤，如果需要，该子步骤不会干扰进一步的蛋白质研究（图2，步骤2.1），以及第二个子步骤，允许电光和深度蛋白质组学蛋白质组学（图2，步骤2.2）的蛋白质完全溶解。它结合了从各种已发表的论文中获取的建议和实验研究验证的新想法所产生的调整。
Protocol
1.PL、IPL 和 OPL 样本
- PL 采样
- 手动拆开刚下的未受精蛋，用放在玻璃烧杯上的鸡蛋分离器将蛋黄与白色分离。用小剪刀取下粉笔，将蛋黄卷在滤纸上，以去除显示为透明可见结构的附体白蛋白（图2A）。
小心：小心不要用剪刀刺穿PL。使用钳子代替剪刀去除粉笔可能会引发 PL 破裂和随后的蛋黄泄漏。滤纸上的滚动步骤至关重要，由于可能触发 PL 破损的滤纸的吸水性能，因此应快速执行。从铺设之日起使用未受精的鸡蛋，以优化第一步和随后所有步骤的成功，也非常重要。或者，在冷却环境中储存不到 10 天的鸡蛋可以使用，但实验者必须考虑 PL 改变的潜在风险。 - 将蛋黄浸入含有 10 mM Tris-HCl pH 8 的结晶器中，该晶体冷却至 4 °C，并使用钝剪刀（图 2B）在 1 厘米区域内的萌盘上去除 PL 区域。
注：最初，PL浸入去离子化水中，但这种方法存在一些缺点，例如缺乏 pH 控制，以及事后难以分离子层（步骤 1.2）。因此，测试了几个条件，包括三叶草浓度（图3A）和pH（图3B）。在pH 8使用缓冲液，而不是去电化或去电化水，是符合鸡蛋生理学（蛋清的pH值约7.8在铺设的一天）14，并尽量减少蛋白质损失。相比之下，酸性或非常碱性pH被怀疑触发PL去结构化和早期蛋白质溶解（图3B）。由10m Tris-HCl pH 8组成的缓冲区被认为是最佳的，因为它尊重卵子生理学，不会引起显著的蛋白质溶解（工作缓冲区中的蛋白质浓度仍然很低，图3A，B）。 - 在缓冲区用小剪刀将PL破裂。用钳子抓住破裂的 PL 的两个边缘，将 PL 从蛋黄上剥下来。
- 用钳子保持 PL，并在 10 mTris-HCl、pH 8 的多个浴池中多次冲洗 PL，直到看不到任何蛋黄痕迹。在此阶段，确保 PL 清洁、白色且漂浮在缓冲区中。它可以在步骤 1.2 中处理，用于子层分离，也可以直接处理第 2.1 步进行生化分析。
- 手动拆开刚下的未受精蛋，用放在玻璃烧杯上的鸡蛋分离器将蛋黄与白色分离。用小剪刀取下粉笔，将蛋黄卷在滤纸上，以去除显示为透明可见结构的附体白蛋白（图2A）。
- OPL 和 IPL 采样
- 通过将 OPL 向上放入塑料培养皿中并尽可能少皱纹将其保持平整，将整个 PL 样本分散开来。覆盖样品与10米特里斯-HCl pH 8，50 mM纳克。使用塑料培养皿（而不是玻璃）来限制PL运动，因为PL更好地粘在塑料上。
- 要查找 OPL 侧，请查看附着在 OPL 而不是 IPL 上的剩余查拉扎的位置。此步骤需要小型 NaCl 浓度 （50 mM） 以方便分层分离。
注：根据图3C和文献11中呈现的图形，这种浓度不应导致蛋白质的主要损失。最初，神化水被用来分离子层，如以前描述的1，5，6，但这种技术被发现是非常费力的，并导致结构PL完整性的改变。因此，不同的NaCl浓度（图3C）被测试为盐促进两个子层的分离。然而，值得注意的是，使用NaCl浓度 +100 mM 会增加 PL 的蛋白质溶解/释放，这不是这里的目标（这将是第 2 步的目标）（图 3C）。在 10 mM Tris-HCl pH 8 缓冲区中添加 50 mM NaCl 可促进两个子层的分离，并最大限度地减少蛋白质损失。
- 要查找 OPL 侧，请查看附着在 OPL 而不是 IPL 上的剩余查拉扎的位置。此步骤需要小型 NaCl 浓度 （50 mM） 以方便分层分离。
- 用小剪刀将总 PL 切成约 2 厘米 x 3 厘米的碎片。在双筒望远镜解剖显微镜下用超精确的尖钳机械地将每块PL片的两层分开（图4）。将生成的 IPL 和 OPL 样品单独存储在微管中-80 °C，直至进一步使用。
注：协议可在此处暂停。应当指出，两层分离的效率和设施在很大程度上取决于鸡蛋的新鲜度。事实上，由于蛋清pH值的迅速增加和随后由于PL松动（和减弱）而改变蛋黄指数，储存的鸡蛋显示出剧烈的内部变化。与OPL相比，IPL更脆弱。因此，最好将 OPL 的表面放在上面，并通过用钳子拉 OPL 来分离两个子层。两个子层都应该小心处理。
- 通过将 OPL 向上放入塑料培养皿中并尽可能少皱纹将其保持平整，将整个 PL 样本分散开来。覆盖样品与10米特里斯-HCl pH 8，50 mM纳克。使用塑料培养皿（而不是玻璃）来限制PL运动，因为PL更好地粘在塑料上。
2. 蛋白质溶解和SDS-PAGE分析的样本处理
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原蛋白溶解
- 单独冷冻干燥 IPL 和 OPL 样本。冷冻干燥完成后，在具有防漏螺丝帽的清洁微管中从每个样品中切出大约 1 毫克。将剩余样品存放在紧密封闭的管子中，以在 -80 °C 下长时间存放。
注：使用带有防漏螺丝帽的微管可确保气密和防漏闭合，以防止样品补液，并确保样品的安全。 - 混合 1 毫克每个亲血杆菌子层与 400μL 的 50 mm 特里斯 pH 7， 500 mm NaCl.在 30 Hz 下使用搅拌机磨机 2 次 5 分钟，以分解微粒中的 OPL 和 OPL 结构，促进蛋白质溶解。在两个干净的微管中收集包含 OPL 和 IPL 的样品的 400 μL。
注：此处使用的缓冲器已被选择以增加蛋白质溶解（与步骤 1 不同）。这种缓冲基于 图3中显示的结果，该结果显示蛋白质溶解在pH7（图3B）和使用0.5M NaCl（图3C）时增加。协议可在此处暂停。在此阶段，样品可用于主要PL蛋白的蛋白质纯化或加工成步骤2.2。
- 单独冷冻干燥 IPL 和 OPL 样本。冷冻干燥完成后，在具有防漏螺丝帽的清洁微管中从每个样品中切出大约 1 毫克。将剩余样品存放在紧密封闭的管子中，以在 -80 °C 下长时间存放。
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电磷的蛋白质溶解
- 将 5 倍 SDS-PAGE 样品缓冲区（100μL、0.25 M Tris-HCl、0.05% 溴酚蓝色、50% 甘油、5% SDS、5% β-甲醇、pH 6.8） 添加到每个 400μL 的样品中，并在 100 °C 下加热 5 分钟。
注：协议可在此处暂停，样品可存储在 -80 °C。 在协议的这一阶段，OPL和IPL被完全解散。样品溶解的效率可以通过离心样品在10，000 x g下进行5分钟的离心评估。完全溶解的特点是离心后缺乏可见颗粒。因此，在完全溶解后，这里认为 1 毫克的亲血糖亚层对应于 1 毫克蛋白质（500 μL 样本中的蛋白质浓度为 2 毫克/mL）。事实上，PL是由超过80%的蛋白质2，15。使用 5 倍样品缓冲区限制样品稀释，但也可以使用 1 倍或 2 倍样品缓冲区。 - 在 SDS 聚丙烯酰胺凝胶（4%-20% 梯度凝胶）上装载最多 20 μg 的蛋白质/lane，并使用垂直电泳系统在 120 V 下进行电光处理。
注：使用 4%-20% 梯度凝胶不是强制性的，但这里更可取，因为 OPL 和 IPL 显示的蛋白质的分子量从 +lt;10 kDa 到 + 250 kDa 不等。保持堆叠凝胶（通常被去除）可能也很有用，因为井底存在不溶性蛋白质或蛋白质聚合物，表明溶解不良，在样品准备过程中可能缺少步骤。 - 电磷化后，用库马西明亮的蓝色溶液（50% H2O、40% EtOH、10% 醋酸和 R250 库马西辉煌蓝色）从玻璃板上去除凝胶和污渍，持续 30 分钟。
- 去污与溶液包括50%H2O，40%EtOH，10%醋酸溶液，直到凝胶背景出现浅蓝色。
- 最后将含有去离子水的培养皿中的凝胶转移，实现聚丙烯酰胺凝胶的去污和补液。蛋白质应显示为透明背景的蓝色带。
- 将 5 倍 SDS-PAGE 样品缓冲区（100μL、0.25 M Tris-HCl、0.05% 溴酚蓝色、50% 甘油、5% SDS、5% β-甲醇、pH 6.8） 添加到每个 400μL 的样品中，并在 100 °C 下加热 5 分钟。
Representative Results
OPL 和 IPL 与刚下过的未受精卵的 PL 分离出来，通过 SDS-PAGE 分析其蛋白质配置文件。整个协议的实验工作流程用 图2来说明。 图3 显示不同三聚物浓度（图3A）、各种pH（图3B）和不同NaCl浓度（图3C）的蛋白质释放。由此产生的两个子层在双目解剖显微镜的照射下观察到，并显示在 图 4 中，其中 IPL 是半透明的，而 OPL 是密集的、多云的和白色的。这些功能可以部分证明子层分离的效率。
分离后，OPL和IPL被独立冻化，由于机械研磨、使用离子洗涤剂（SDS）和还原剂（β-甲醇），其蛋白质含量被完全溶解，随后沸腾。在聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE电泳）中迁移后，OPL和IPL样品如预期的那样表现出独特的电光剖面（图5）。
图1：刚下过的未受精卵的PL结构。横截面（个人数据、©显微镜电子学的图形表示和传输整个PL的电子显微镜，法国图尔大学和CHRU，乔治诺大学）。请注意，此图片是从本协议中显示的 PL 中获取的。OPL，外围线层;IPL，内围线层。黑色箭头表示分离两个子层的连续膜。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：工作流程，总结协议的两个主要步骤和应用程序示例。该协议已针对 PL 层的蛋白分析进行了优化，但在其他应用的某些步骤中可以停止。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图3：PL采样缓冲成分的优化。简言之，清洁PL（n = 4）在相同数量的各种缓冲溶液中孵育2小时.PL被移除，通过测量剩余缓冲区280nm的吸收量来估计蛋白质浓度。（A） 三聚氯浓度在pH 8的效果。（B） pH （7 至 9） 的影响。（C） 纳克浓度的影响。从这些结果中，我们得出结论，由10mTris-HCl、pH 8、50 mM NaCl组成的缓冲区是最合适的，因为它限制了蛋白质损失。结果表示为四种不同 PL 样本的平均±标准偏差。使用单向 ANOVA 进行统计分析，然后进行 Tukey 的多次比较测试。P值 =lt;0.05 被认为是显著的（ns，不显著;*p=lt;0.05，***p=0.001，***p=lt;0.001）。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图4：双筒解剖显微镜下的OPL和IPL功能。分离后，IPL（右侧）出现半透明，OPL（左侧）不透明。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图5：SDS-PAGE分析分离的OPL和IPL从新鲜奠定了未受精的鸡蛋。4%-20%丙烯酰胺凝胶，其次是库马西明亮的蓝色染色。分子量标准带的质量在kDa中表示。OPL 配置文件主要由分子质量 +gt;30 kDa 的蛋白质组成，而 IPL 配置文件上检测到的主要波段具有分子质量 +lt;30 kDa。 请点击这里查看此数字的较大版本。
Discussion
本协议的成功依赖于独立优化的两个关键步骤：OPL 和 IPL 的机械分离，这些步骤需要尽可能少地解构，然后是每个子层的完全蛋白质溶解，相反，即去结构化和脱解。它还强调了需要考虑的一些具体要点，以确保每一步骤的成功实现。
协议不取决于蛋壳的颜色，鸡蛋重量，生产类型，或母鸡的遗传菌株。然而，这取决于鸡蛋的新鲜度。事实上，卵子在下床后会迅速进行深刻的内部物理化学修饰，不过在冷藏条件下进行储存时，这些变化可能会延迟。储存期间通过蛋壳毛孔流失的二氧化碳导致蛋清 pH（从 7.8 增加到 9.5）增加，而整个 PL 的蛋黄和白色之间则发生一些水交换。这两种修饰都对PL的分子和组织结构产生了负面影响，这种结构在14、15日变得虚弱和不那么紧张，很可能是由于其蛋白质含量16、17、18的物理化学修饰。据推测，分层的分离将变得非常困难的存储鸡蛋，特别是如果存储在室温下进行很长一段时间。截至目前，该协议已使用在 4 °C 下储存不到 4 天的鸡蛋执行，目前尚不清楚鸡蛋有效采样 PL 子层的最大储存时间。此外，如果目标是分析每个子层，则使用未受精的鸡蛋至关重要。产卵当天，受精卵的胚胎有23小时大，如果卵子孵育的话，其发育非常迅速。事实上，胚胎发育和一些外在结构的生长扩大使用PL作为一个基质，这是因此迅速退化，并取代外生蛋黄囊19。
在手动分离蛋黄和蛋清后，蛋黄需要从蛋清痕迹和与 PL 紧密相连的沙拉扎中清洗。提示是小心地将蛋黄卷在滤纸上，并在缓冲溶液（10 mM Tris-HCl pH 8）中对蛋黄进行广泛清洗。用于缓冲的pH值与蛋清14的生理pH值一致，已被证明可以最大限度地减少蛋白质损失（图3）。然后，使用冷藏缓冲区将有助于从蛋黄中去除 PL，因为在 4 °C 时，缓冲液将促进 PL 去除，因为脂质蛋黄缩回，在此温度下变得不那么流体。额外的洗涤将允许去除从PL的蛋黄残留物。切除与胚芽盘相对应的区域也很重要，因为包含女性亲核的这种结构可能不代表PL。当卵子受精时，它是胚胎细胞受精和繁殖的部位。它应该有一个特定的组成，可能不能代表整个PL，这就是为什么它被删除的原因。当蛋黄浸入冷缓冲区时，这一特定步骤非常方便。虽然这种胚芽盘结构被丢弃在目前的协议（出目标），具体分析这一领域的受精卵可能是非常有用的科学家有兴趣研究的PL含量（蛋白和活性）和结构（电子显微镜）的演变，在胚胎生成的早期阶段19，20，21。在这个阶段，整个PL在结构上完好无损，可以通过电子显微镜（图2），步骤1.2或步骤2.1（如果目标是分析整个PL）进行进一步的结构分析。
第 1.2 步需要在双筒望远镜解剖显微镜下进行，因为 PL 非常薄且易碎（约 10μm 厚）。在水中或缺乏最少盐的缓冲区，子层的分离几乎是不可能的，最初使用这些选项的尝试已经导致严重的PL损坏。因此，为这一步骤选择的缓冲器保持在生理pH值（pH 8），包含50 mM NaCl。这一步是艰巨的，必须仔细和轻轻地执行，以防止PL撕裂。分离后，两个子层可以很容易地识别，因为它们表现出独特的物理特征（不透明与半透明）。在显微镜的照射下，IPL缺乏同质性，这应反映不完全分离，从而反映IPL上存在的OPL剩余斑点的存在。此外，很难治疗整个膜和使用2厘米×3厘米片大大增加了成功的机会。由此获得的子层适合电子显微镜（图1）进行组织学研究。值得注意的是，在显微图（图1）上可以看到名为连续膜（CM）的特定线性结构（0.05至1微米厚），并且在分离过程中通常仍附着在一个或另一个子层上。此前已经公布，当使用相对较高的盐摩尔分离（500 mM）时，CM仍附着在OPL7上，而水5的使用将有利于CM与IPL的依附。在此协议中，低盐摩尔度用于实现特定目标（PL 子层结构完整且蛋白质损失最小），这意味着此 CM 可能与 IPL 相关。然而，通过传输电子显微镜对IPL和OPL进行进一步分析，可以清楚地说明这一假设。在第1步结束时获得的PL、OPL或IPL层也可用于精子卵结合分析22的体外测定，或分析胚胎发育的早期步骤23、24。
第 2 步是指蛋白质含量的溶解，部分（步骤 2.1）或完全（步骤 2.2）。PL 和/或 OPL 首先进行亲血素化，以去除水分子并允许精确测量重量。事实上，PL主要由水（88%）7组成，而干物质主要含有蛋白质（80%至90%，取决于研究）、碳水化合物、脂肪和矿物质2、7、25。考虑到PL中所含的水通过冷冻干燥去除，碳水化合物基本上在PL糖蛋白中回收，而源自蛋黄的脂肪和矿物质基本上被大量洗涤丢弃，因此假定产生的PL几乎完全由蛋白质组成。因此，完全冻伤后获得的体重值应主要对应于蛋白质。然后，在包含 0.5 M NaCl 的缓冲区中稀释等量的 PL、OPL 和/或 IPL。高盐摩尔结合通过研磨对纤维网的机械破坏，大大促进了非衰变条件下的蛋白质溶解。在此步骤之后，使用沸腾、SDS 洗涤剂和还本剂β-甲醇（步骤 2.2）进行完全溶解。事实上，一些IPL蛋白是SDS溶性糖蛋白25，26，27和OPL的主要成分是NaCl溶性1，11。使用此协议，我们没有看到离心后剩余的不溶性蛋白质颗粒，这表明溶解可能已完成。然后由 SDS-PAGE 分析 PL、OPL 和/或 IPL 的蛋白质。由此产生的蛋白质特征与已发表的文献2、4、11、16一致，但信号的分辨率和强度得到高度提高，各种IPL和OPL独立取样之间的均匀性也更加均匀。
此外，OPL和IPL之间的定量比较是可能的，这要归功于我们推断的各子层2，7的权重的准确性。此外，OPL 和 IPL 配置文件都非常明显，除了 14 kDa 和 75 kDa 的微弱波段外，两个 PL 子层均不明显共享显示相同分子量的波段。这一观测证实了亚层分离的效率，没有明显的交叉污染。根据1日公布的唯一PL蛋白质分析，OPL（+lt：30 kDa）中最强烈的波段应对应溶酶（14kDa）、维他林膜外层蛋白1（17kDa）、禽流感β-防御素 11 （表面分子量 12 kDa）， 而 IPL （+30 kDa） 的强带可能是佐纳-佩卢西达蛋白 1 （102 kDa） 和佐纳-佩卢西达蛋白 3 （47 kDa）.非常丰富的PL蛋白卵巢转移素（78千达），椭圆形布明相关的蛋白质X（45千达），椭圆形布明（43千达）1在子层之间的分布还有待阐明。事实上，这些蛋白质的高分子量（+30 kDa）表明，它们是基于SDS-PAGE轮廓的IPL蛋白，但它们的组织特异性（卵磷表达蛋白）宁愿将这些蛋白质与OPL28，29联系起来。此外，一些人还认为，由于洗涤不足，蛋白和蛋黄蛋白可能会对PL样品造成污染。这种缺乏信息是制定本议定书的基础，该议定书将进一步用于PL、OPL和IPL的深入定量蛋白经济学。
或者，从步骤2.1和离心后去除不溶性物质，有可能提取一些特定的蛋白质，以进一步生化和生物特征。这种方法最近被应用于描述OPL的两个主要组成部分的生物活动和/或3D结构，即维他林膜外层蛋白1（VMO1）和禽流感β-防御素11（AvBD11）30，31。这些蛋白质作为纯化分子的可用性也可能有助于产生特定的抗体，用于其他实验，如免疫化学或定量检测的发展，包括酶链接免疫素分析。
此协议的两个主要限制是：（1） 子层分离的挑战，特别是如果鸡蛋在 4°C 下储存超过 4 天，并且 （2） 完全蛋白质溶解需要减少和破坏缓冲，这损害了由此产生的样品的内在生物活性。关于第一个限制，机械分离需要技术技能，但在2或3次实验培训后很容易实现。某些 IPL 小件可能仍连接到 OPL，反之亦然，因为两个子层都紧密关联。但是，如果谨慎执行机械分离，则另一个子层的污染应最小。最佳分层分离后的典型 IPL 和 OPL SDS-PAGE 配置文件在 图 5中说明。关于第二个限制，本文中提出的实验步骤已优化为蛋白质分析，以便提供构成每个子层的蛋白质的详尽列表。为了进一步描述每种蛋白质的生物活性，有必要在步骤 2.1.2 停止，然后使用脱毒条件（步骤 2.2.1，使用含有 SDS 和β-甲醇的缓冲器，然后煮沸）。然而，值得注意的是，由步骤2.1.2产生的蛋白质只是盐溶性蛋白质，而盐溶性蛋白质形成聚合。进一步评估其各自活动的一个选择可能是使用异种系统（大肠杆菌、巴库洛病毒、酵母菌等）生产盐溶性蛋白质作为重组蛋白。
此协议可适应其他鸟类蛋进行比较研究，以更好地了解每个物种的独创性。事实上，PL在结构上和蛋白质组成方面都表现出一些鸟类特异性，这可能是由于适应了新的环境，但也适应了发育特异性2，6，9，32。这一需要适度技术和经典设备/材料的协议的发展为鸟类繁殖和物种研究领域开辟了新的研究途径。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢菲利普·迪迪埃和卡琳·安格（INRAE，PEAT，37380，法国努齐利，https://doi.org/10.15454/1.5572326250887292E12）提供未受精的伊萨棕色鸡蛋。我们还感谢法国图尔大学资助布雷贡博士。这项工作得到了法国国家研究机构（EQLIPSE，ANR-19-CE21-0006）的财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular dissecting microscope | Vision Engineering, France | Model Mantis Elite | |
| Lyophilizer | Cryotec, France | Model Cosmos 80 | |
| Mini-Protean II electrophoresis cell | Biorad, Hercules, USA | 1652960 | Any apparatus adapted for protein electrophoresis |
| Mixer Mill MM400 | Retsch, Hann, Germany | 20.745.0001 | Mixer mill adapted for for dry, wet, and cryogenic grinding of small amounts of sample |
| Ultra fine dissection scissors in stainless steel length 12 cm | Dutscher, Brumath | 5066 | |
| Ultra precise tip forceps anti-magnetic stainless steel 9.5x 109.3 mm | Dutscher, Brumath | 327005 |
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