यह लेख संरचनात्मक परिवर्तन को कम करते हुए और प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए प्रत्येक उपलेयर के प्रोटीन घुलनशीलता को अनुकूलित करने के लिए चिकन अंडे के बाहरी और आंतरिक पेरिविटेललाइन सबलेयर को अलग करने के लिए एक सरल विधि की रिपोर्ट करता है।
अंडे की जर्दी को घेरे हुए पेरिविटेललाइन परत निषेचन में, अंडे की रक्षा में, और एवियन भ्रूण के विकास में एक मौलिक भूमिका निभाती है। यह दो प्रोटीनसियस सबलेयर द्वारा बनता है जो कसकर जुड़े होते हैं और अलग-अलग महिला प्रजनन अंगों द्वारा बनते हैं। दोनों संरचनाओं को अपनी कार्यात्मक विशिष्टताएं माना जाता है, जिन्हें परिभाषित किया जाना बाकी है। प्रत्येक सबलेयर रचना प्रोटीन के कार्य की विशेषता के लिए, पहली चुनौती उन स्थितियों को स्थापित करना है जो किसी भी संरचनात्मक क्षति को सीमित करते हुए इन दो जटिल परतों के यांत्रिक पृथक्करण के लिए अनुमति देंगे। दूसरा कदम बाद के जैव रासायनिक विश्लेषणों के लिए इन दो उपलेयरों से प्रोटीन घुलनशीलता की सुविधा के लिए प्रायोगिक स्थितियों का अनुकूलन करना है । सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉली-एक्रिलमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) द्वारा प्रत्येक उपलेयर के प्रोटीन प्रोफाइल का विश्लेषण करके इस दृष्टिकोण की दक्षता का आकलन किया जाता है, जो दोनों संरचनाओं के बीच अलग होने की उम्मीद है। यह दो कदम की प्रक्रिया सरल बनी हुई है; इसके लिए शास्त्रीय जैव रासायनिक उपकरण और अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है; और आगे में गहराई से प्रोटेओमिक्स के साथ संगत है। यह तुलनात्मक जीव विज्ञान के लिए अन्य एवियन अंडों में भी स्थानांतरित किया जा सकता है, यह जानते हुए कि पेरिविटेललाइन परत की संरचना और संरचना में प्रजातियों की विशिष्ट विशेषताएं दिखाई गई हैं। इसके अलावा, सबलेयर्स सेपरेशन (स्टेप 1) के लिए विकसित गैर-डेनाचरिंग स्थितियां स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा उनके संरचनात्मक विश्लेषणों की अनुमति देती हैं। यह बाद में प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए प्रारंभिक कदम भी अपनी संबंधित जैविक गतिविधियों और 3 डी संरचना का विश्लेषण करने के लिए, या आगे इम्यूनोहिस्टोकेमिकल या कार्यात्मक विश्लेषण करने के लिए गठन कर सकता है। इस तरह के अध्ययनों से इन दो उपलेयरों के शारीरिक कार्य को समझने में मदद मिलेगी, जिनकी संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता प्रजनन सफलता के निर्धारक मानदंड हैं।
इस विधि का उद्देश्य एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है जो पेरिविटेललाइन परत (पीएल) के बाद के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन की अनुमति देता है, जो अंडे की जर्दी को घेरने वाली एक पतली प्रोटीनसियस परत है और एवियन प्रजातियों के प्रजनन में एक मौलिक भूमिका निभा रहा है। पीएल, जिसे साहित्य में “विटेललाइन झिल्ली” भी कहा जाता है, कई प्रकार के ग्लाइकोप्रोटीन से बने मोटे फाइबर का एक त्रि-आयामी नेटवर्क है। इसमें एक आंतरिक पेरिविटेललाइन परत (आईपीएल) (जर्दी के संपर्क में) होती है जो अंडाशय में इकट्ठा होती है, और एक बाहरी पेरिविटेललाइन परत (ओपीएल, सफेद के संपर्क में), आईपीएल(चित्रा 1)पर झूठ बोल रही है और इनफंडीबुलम द्वारा उत्पादित होती है। यह उत्तरार्द्ध ऊतक ओव्यूलेशन के बाद परिपक्व जर्दी कूप प्राप्त करने वाले अंडाशय के कीप की तरह ऊपरी खंड है, और वह साइट जहां निषेचन होता है। ओपीएल का स्राव इन दो घटनाओं के बाद होता है और इसके बाद अंडाशय के अन्य विशिष्ट खंडों में अंडे के सफेद और अंडे के ढलने का लगातार जमा होता है। पीएल के शारीरिक कार्य न केवल निषेचन और भ्रूण के प्रारंभिक चरणों से संबंधित हैं, बल्कि भ्रूण के शारीरिक और आणविक संरक्षण के लिए भी हैं। पूरे पीएल पर किए गए चिकन अंडे के प्रोटेओमिक विश्लेषण से १३७ विभिन्न प्रोटीन1की उपस्थिति का पता चला, लेकिन आईपीएल और ओपीएल के बीच इनमें से अधिकांश प्रोटीन का वितरण स्पष्ट होना बाकी है । साहित्य रिपोर्ट में उपलब्ध डेटा की न्यूनतम मात्रा कि आईपीएल और ओपीएल बहुतअलग प्रोटीन प्रोफाइल2,3,4प्रदर्शित करते हैं, जो विभिन्न संरचनात्मक और कार्यात्मक गुणों का सुझाव देता है। ओपीएल और आईपीएल के बीच प्रोटीन के वितरण के बारे में डेटा की सापेक्ष कमी पतली और एम्बेडेड दोनों उपलेयरों को अलग करने की कठिनाई के कारण होने की संभावना है ।
यहां प्रस्तुत की गई विधि उन स्थितियों का वर्णन करती है जो उनकी प्रोटीन सामग्री को संरक्षित करते हुए अपने संबंधित हिस्टोलॉजिकल संरचना पर सीमित प्रभाव के साथ दो उपलेयरों को अलग करने के लिए उपयोग की जाने वाली हैं, और प्रोटेओमिक्स द्वारा बाद के विश्लेषण के लिए प्रोटीन के पूर्ण घुलनशीलता की अनुमति देने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करती हैं। इसमें दो मुख्य चरण शामिल हैं- 1) पीएल सैंपलिंग और ओपीएल/आईपीएल सेपरेशन और 2) पीएल, ओपीएल, और आईपीएल ट्रीटमेंट फॉर प्रोटीन घुलनशीलता और इलेक्ट्रोफोरेसिस मास स्पेक्ट्रोमेट्री एनालिसिस के लिए। वर्कफ्लो को चित्र 2में प्रस्तुत किया गया है । उल्लेखनीय है, हालांकि वर्तमान प्रोटोकॉल को प्रोटेओमिक विश्लेषण (चरण 2.2) के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन इसे हिस्टोलॉजिकल (जैसे, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी), इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण, कार्यात्मक अध्ययन (चरण 1) और नमक-घुलनशील प्रोटीन के शुद्धिकरण के लिए कुछ चरणों में रोका जा सकता है ताकि उनकी संरचना और जैविक गतिविधि (चरण 2.1)(चित्रा 2) कीविशेषता हो सके।
पहला कदम अंडे की जर्दी(चित्रा 2, चरण 1.1)से कुल पीएल को हटाना है। सभी प्रकाशित तरीके अंडे के सफेद को मैन्युअल रूप से जर्दी से अलग करने या अंडे के विभाजक का उपयोग करने के साथ शुरू करते हैं। इसके बाद शेष अंडे के सफेद और मोटी चालाज़ी को संदंश का उपयोग करके या फिल्टर पेपर 5(चित्रा 2 ए)पर सोखने के द्वारा हटायाजाता है। इसके बाद, नमूना पीएल के लिए चयनित तकनीकें प्रकाशित लेखों के आधार पर परिवर्तनशील हैं। कुछ कागजात में जर्दी के कई वॉश शामिल हैं, डिओनाइज्ड या आसुत पानी में1,5,6,0.85 से 1% खारा समाधान2,7,8,बफरिंग समाधानों में जैसे 0.15 एम एनएसीएल/एन-[ट्रिस (हाइड्रोक्सीमिथाइल) मिथाइल]-2-अमीनोएथेन्सुएल्फियोल, एसिडफ्फ, पीएच 7.44,या 0.01N एचसीएल (पीएच 2)3में। इन प्रक्रियाओं को चिकन, बतख, अंगूठी गर्दन वाले तीतर, ग्रे तीतर, कॉकटील तोता, घरेलू कबूतर, या रैटीज अंडे2,6,9पर लागू किया गया था। पीएल को हटाने जबकि अंडे की जर्दी जलीय समाधान के बिना एक पेट्री डिश में बनाए रखा जाता है बहुत श्रमसाध्य हो सकता है के रूप में पीएल नाजुक है और अंडे की जर्दी पीएल1, 5के लिएछड़ी की आदत है और इसलिए बाद में खत्म करने के लिए मुश्किल रहता है । 37 डिग्री सेल्सियस 3 पर एक घंटे के लिए अम्लीय बफर या समाधान का उपयोग भी पसंद नहीं कियाजाता है क्योंकि ऐसी स्थितियों से पीएल संरचना में परिवर्तन हो सकता है और प्रोटीन की हानि हो सकती है। अंकुरित डिस्क वाले क्षेत्र को हटाना भी महत्वपूर्ण है क्योंकि इस क्षेत्र में एक अलग संरचनात्मक और आणविक पैटर्न होने की संभावना है, जो पूरेपीएल 4,6,10 (चित्रा 2B) कोप्रतिबिंबित नहीं करता है। यह विधि कुछ प्रकाशित लेखों द्वारा हाइलाइट किए गए विचारों का लाभ उठाती है और इसकी अखंडता(चित्रा 2 सी)को संरक्षित करते हुए पीएल नमूने की सुविधा के लिए कुछ सुधारों का प्रस्ताव करती है।
दूसरे चरण में दो उपलेयरों(चित्रा 2,चरण 1.2) को अलग करना शामिल है। यह कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि ओपीएल और आईपीएल एक दूसरे से कसकर बंधे हुए हैं । यह कदम दूरबीन विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे संदंश के साथ सावधानी से आयोजित किया जाना चाहिए। ओपीएल/आईपीएल पृथक्करण की रिपोर्ट करने वाले प्रकाशन काफी सीमित हैं2,3,7,11 और उनमें से कुछ विशिष्ट शर्तों (1 घंटे2,3 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अम्लीयबफर)का उपयोग करते हैं जो उपलेरियों की हिस्टोलॉजिकल संरचना को प्रभावित करने की संभावना है और/या प्रोटीन हानि या जर्दी या सफेद संदूषण में योगदान देते हैं । आईपीएल से ओपीएल को बेहतर ढंग से अलग करने के लिए, कुछ लेखकों ने ओपीएल (आंतरिक परत बेरंग रहती है)11को थोड़ा रंग करने के लिए टोलुइडीन नीले रंग के उपयोग की सूचना दी । विकसित विधि में, हमने शर्तों को अनुकूलित किया ताकि अलगाव आसानी से प्राप्त हो सके और किसी भी डाई(चित्रा 2डी)के उपयोग की आवश्यकता न हो।
दूसरा मुख्य चरण प्रत्येक सबलेयर की रचना करने वाले प्रोटीन का घुलनशीलता है। शास्त्रीय रूप से, यह इलेक्ट्रोफोरेसिस के लिए उपयोग किए जाने वाले लेमलीबफर के साथ सीधे तैयार किए गए3, 4,11 पीएल/उपलेयरों को स्वच्छ लिओफिलाइज्ड1,सूखे2,6,या ताजा तैयार करके प्राप्त कियाजाता है। अन्य लेखकों ने 1% एसडीएस बफरिंग समाधान2,3,11 या कमरे के तापमान पर प्रोटीज अवरोधकों और एसडीएस 6 वाले समाधान में1% एनएसीएल में परतों के प्रारंभिक घुलनशीलीकरण को प्राथमिकता दी, जिसके बाद लगातार जोरदार सरगर्मी के तहत 45 डिग्री सेल्सियस12पर इनक्यूबेशन। कुछ लेखकों ने एक प्रोटोकॉल का भी वर्णन किया जहां पीएल को फॉस्फेट बफर नमकीन या यूरिया में इनक्यूबेटेड किया गया था और13को सोनिकेशन के अधीन किया गया था । इन उपचारों के बाद लाममली बफर में एक अपकेंद्रित्र और कमजोर पड़ने और सभी परतों से अधूरे प्रोटीन घुलनशीलता के नुकसान को साझा करते हैं क्योंकि अघुलनशील पदार्थ (अपकेंद्री के बाद प्राप्त गोली) का विश्लेषण करने के लिए नमूने से त्याग दिया जाता है।
इसके अलावा, प्रोटीन घुलनशीलता के लिए कुछ लेखकों द्वारा विकृत स्थितियों (यूरिया, डिटर्जेंट, उच्च तापमान, आदि) का उपयोग लक्षण वर्णन के लिए बाद में प्रोटीन शुद्धिकरण के साथ संगत नहीं है क्योंकि वे अपरिवर्तनीय रूप से प्रोटीन को निष्क्रिय करने, उनकी जैविक गतिविधियों में हस्तक्षेप करने और उनकी 3 डी संरचना को भी ख़राब करने की संभावना है। इस विशिष्ट चरण 2 के लिए, प्रोटोकॉल में पीएल/ओपीएल/आईपीएल मैकेनिकल डी-स्ट्रक्चरिंग के बाद गैर-denaturing स्थितियों के तहत सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन के घुलनशीलता के लिए अनुमति देने वाला पहला उपस्तर शामिल है, जो आगे प्रोटीन अध्ययन के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा, अगर जरूरत है(चित्रा 2,चरण 2.1), और एक दूसरा उप कदम है कि इलेक्ट्रोफोरेसिस और गहराई से प्रोटेओमिक्स(चित्रा 2,चरण 2.2) के लिए प्रोटीन के पूर्ण घुलनशीलता के लिए अनुमति देता है । यह प्रायोगिक अध्ययनों द्वारा मान्य नए विचारों के परिणामस्वरूप विभिन्न प्रकाशित पत्रों और समायोजनों से लिए गए सुझावों को जोड़ती है ।
वर्तमान प्रोटोकॉल की सफलता दो महत्वपूर्ण चरणों पर निर्भर करती है जो स्वतंत्र रूप से अनुकूलित थे: ओपीएल और आईपीएल का यांत्रिक पृथक्करण जिसे यथासंभव कम डी-स्ट्रक्चरिंग करने की आवश्यकता होती है, जिसके बाद प्रत्येक सबलेयर का पूर्ण प्रोटीन घुलनशीलता होता है, जो इसके विपरीत, डी-स्ट्रक्चरिंग और डेन्चरिंग होता है। इसमें कुछ विशिष्ट बिंदुओं पर भी प्रकाश डाला गया है जिन पर प्रत्येक चरण की सफल उपलब्धि सुनिश्चित करने के लिए विचार किए जाने की आवश्यकता है ।
प्रोटोकॉल अंडे के रंग, अंडे के वजन, उत्पादन के प्रकार, या मुर्गी के आनुवंशिक तनाव पर निर्भर नहीं करता है। हालांकि यह अंडे की ताजगी पर निर्भर करता है। दरअसल, अंडे में रखे जाने के बाद जल्दी ही गहन आंतरिक भौतिक रसायन संशोधनों से गुजरना पड़ता है, हालांकि इन परिवर्तनों को देरी हो सकती है जब भंडारण14, 15के रेफ्रिजरेटेड परिस्थितियों में कियाजाताहै। भंडारण के दौरान अंडे के छिद्रों के माध्यम से कार्बन डाइऑक्साइड की हानि अंडे सफेद पीएच (७.८ से ९.५) की वृद्धि हुई है जबकि कुछ पानी के आदान-प्रदान जर्दी और सफेद के बीच होते हैं, पीएल भर में । दोनों संशोधन पीएल की आणविक और हिस्टोलॉजिकल संरचना को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं जो कमजोर होजाता है और14,15कम तनावपूर्ण हो जाता है , इसकी प्रोटीन सामग्री 16 ,17,18के भौतिक रसायन संशोधनों के कारण होने की संभावना है । यह माना जाता है कि संग्रहीत अंडों के साथ सबलेयर का पृथक्करण बहुत मुश्किल हो जाएगा, खासकर यदि भंडारण कमरे के तापमान पर लंबी अवधि के लिए आयोजित किया जाता है। आज तक, प्रोटोकॉल 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों से कम समय के लिए संग्रहीत अंडों का उपयोग करके किया गया है और अंडे के लिए कुशलतापूर्वक नमूना पीएल सबलेयर के लिए भंडारण की अधिकतम अवधि अभी तक ज्ञात नहीं है। इसके अलावा, यदि उद्देश्य प्रत्येक उपलेयर का विश्लेषण है, तो अनिषेचित अंडों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। वट के दिन, एक निषेचित अंडे का भ्रूण 23 घंटे पुराना है और इसके विकास के बाद बहुत तेजी से है, अगर अंडा इनक्यूबेटेड है । दरअसल, भ्रूणीय विकास और कुछ असाधारण संरचनाओं का विकास एक उप-कलाकार के रूप में पीएल का उपयोग करके विस्तारित होता है, जो इस प्रकार तेजी से अपमानित होता है, और19को एक्स्ट्रामब्रियोनिक जर्दी सैक द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है।
जर्दी और अंडे के सफेद के मैनुअल जुदाई के बाद, जर्दी को अंडे के सफेद निशान से और चालाज़ी से साफ करने की आवश्यकता होती है जो पीएल से कसकर जुड़ी हुई थी। टिप एक फिल्टर पेपर पर सावधानी से जर्दी रोल करने के लिए और बफर समाधान (10 mM Tris-HCl पीएच 8) में जर्दी के व्यापक वॉश प्रदर्शन करने के लिए है । बफर के लिए उपयोग किया जाने वाला पीएच अंडे के सफेद14 के शारीरिक पीएच के अनुरूप है और इसे प्रोटीन हानि(चित्र 3)को कम करने के लिए दिखाया गया है। एक रेफ्रिजरेटेड बफर का उपयोग तब जर्दी से पीएल को हटाने में मदद करेगा क्योंकि 4 डिग्री सेल्सियस पर, बफर पीएल हटाने की सुविधा देगा क्योंकि लिपिडिक जर्दी वापस ले लेता है और इस तापमान पर कम तरल पदार्थ बन जाता है। अतिरिक्त वॉश पीएल से जर्दी अवशेषों को हटाने के लिए अनुमति देगा। अंकुरित डिस्क के अनुरूप क्षेत्र को काटना भी महत्वपूर्ण है क्योंकि इस संरचना में महिला प्रोन्यूक्लियस शामिल है, पीएल का प्रतिनिधि नहीं हो सकता है। यह निषेचन और भ्रूण कोशिकाओं के गुणा की साइट है जब अंडा निषेचित है । यह एक विशेष संरचना है कि पूरे PL के प्रतिनिधि नहीं हो सकता है माना जाता है, जो कारण है कि यह हटा दिया गया था । इस विशिष्ट कदम को दृढ़ता से सुविधा होती है जब जर्दी ठंडे बफर में डूब जाती है। यद्यपि इस अंकुरित डिस्क संरचना को वर्तमान प्रोटोकॉल (उद्देश्यों में से) में छोड़ दिया जाता है, लेकिन निषेचित अंडों में इस क्षेत्र के विशिष्ट विश्लेषण पीएल सामग्री (प्रोटेओमिक्स और गतिविधि) और संरचना (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी) के विकास का अध्ययन करने में रुचि रखने वाले वैज्ञानिकों केलिए भ्रूणजीन19,20,21के प्रारंभिक चरणों के दौरान बहुत उपयोगी हो सकते हैं। इस स्तर पर, पूरे पीएल संरचनात्मक रूप से बरकरार है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी(चित्रा 2)द्वारा आगे संरचनात्मक विश्लेषण के लिए संसाधित किया जा सकता है, 1.2 कदम या चरण 2.1 (यदि उद्देश्य पूरे पीएल का विश्लेषण करना है)।
चरण 1.2 को दूरबीन विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत आयोजित करने की आवश्यकता है, क्योंकि पीएल बहुत पतला और नाजुक (लगभग 10 माइक्रोन मोटी) है। सबलेयर्स का पृथक्करण पानी में या न्यूनतम नमक की कमी वाले बफर में लगभग असंभव है, और इन विकल्पों का उपयोग करने के प्रारंभिक प्रयासों के परिणामस्वरूप गंभीर पीएल क्षति हुई है। इस प्रकार, इस चरण के लिए चयनित बफर शारीरिक पीएच (पीएच 8) पर रहता है और इसमें 50 mm NaCl होते हैं। यह कदम दुरूह है और पीएल फाड़ को रोकने के लिए ध्यान से और धीरे से प्रदर्शन किया जाना चाहिए । एक बार अलग होने के बाद, दो उपलेयरों को आसानी से पहचाना जा सकता है क्योंकि वे विशिष्ट भौतिक विशेषताओं (अपारदर्शी बनाम पारदर्शी) का प्रदर्शन करते हैं। माइक्रोस्कोप के आलोक में आईपीएल की एकरूपता की कमी एक अधूरी जुदाई को प्रतिबिंबित करना चाहिए और इस तरह आईपीएल पर मौजूद ओपीएल के शेष स्थानों की उपस्थिति । इसके अलावा, पूरी झिल्ली का इलाज करना बहुत मुश्किल है और 2 सेमी x 3 सेमी टुकड़ों का उपयोग सफलता की संभावना को बहुत बढ़ाता है। परिणामस्वरूप प्राप्त सबलेयर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी(चित्र 1)द्वारा हिस्टोलॉजिकल अध्ययन के लिए उपयुक्त है। यह उल्लेखनीय है कि एक विशिष्ट रैखिक संरचना (0.05 से 1 माइक्रोम मोटी) जिसका नाम निरंतर झिल्ली (सीएम) माइक्रोग्राफ(चित्रा 1)पर दिखाई देता है और आमतौर पर अलगाव की प्रक्रिया के दौरान एक या अन्य उपलेयर से जुड़ा रहता है। यह पहले प्रकाशित किया गया है कि जब जुदाई (५०० mm) के लिए एक अपेक्षाकृत उच्च नमक मोलेरिटी का उपयोग कर, मुख्यमंत्री OPL7 से जुड़े रहे, जबकि पानी5 का उपयोग आईपीएल के लिए सीएम के लगाव एहसान होगा । इस प्रोटोकॉल में, विशिष्ट उद्देश्यों (पीएल सबलेयर संरचनात्मक रूप से अक्षुण्ण और प्रोटीन की न्यूनतम हानि) को प्राप्त करने के लिए कम नमक मोलेरिटी का उपयोग किया जाता है, जिसका अर्थ है कि यह सीएम आईपीएल से जुड़े होने की संभावना है। हालांकि, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा आईपीएल और ओपीएल का अतिरिक्त विश्लेषण इस परिकल्पना पर स्पष्ट रूप से राज्य करेगा । पीएल, ओपीएल, या आईपीएल की परतों को चरण 1 के अंत में प्राप्त शुक्राणु-अंडा बाध्यकारी विश्लेषण22 के लिए इन विट्रो परख के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है या भ्रूण विकास23,24के शुरुआती चरणों का विश्लेषण करने के लिए।
चरण 2 प्रोटीन सामग्री के घुलनशीलता को संदर्भित करता है, आंशिक रूप से (चरण 2.1) या पूरी तरह से (चरण 2.2)। पीएल और/या ओपीएल को सबसे पहले पानी के अणुओं को हटाने और सटीक वजन मापन के लिए अनुमति देने के लिए lyophilized किया जाता है । दरअसल, पीएल मुख्य रूप से पानी (88%)7से बना है, जबकि शुष्क पदार्थ में अनिवार्य रूप से प्रोटीन (अध्ययन के आधार पर 80% से 90%), कार्बोहाइड्रेट, वसा और खनिज2,7,25होते हैं। यह देखते हुए कि पीएल में निहित पानी को फ्रीज-सुखाने से हटा दिया जाता है, कि कार्बोहाइड्रेट अनिवार्य रूप से पीएल ग्लाइकोप्रोटीन में बरामद होते हैं, और जर्दी से उत्पन्न वसा और खनिजों को अनिवार्य रूप से व्यापक वॉश द्वारा खारिज कर दिया जाता है, यह माना जाता है कि परिणामस्वरूप पीएल लगभग विशेष रूप से प्रोटीन से बना है। इस प्रकार, पूर्ण रूप से लियोफिलाइजेशन के बाद प्राप्त वजन मूल्य मुख्य रूप से प्रोटीन के अनुरूप होना चाहिए। इसके बाद 0.5 एम एनएसीएल वाले बफर में पीएल, ओपीएल और/या आईपीएल की समान मात्रा को पतला कर दिया जाता है । उच्च नमक मोलेरिटी को बहुत पीसकर रेशेदार नेटवर्क के यांत्रिक विनाश के लिए संयुक्त रूप से गैर-विकृत स्थितियों के तहत प्रोटीन घुलनशीलता की सुविधा प्रदान करता है। इस चरण के बाद उबलते, एसडीएस डिटर्जेंट और कम करने वाले एजेंट बीटा-मर्केप्टोथेन (चरण 2.2) का उपयोग करके पूर्ण घुलनशीलता होती है। दरअसल, आईपीएल के कुछ प्रोटीन एसडीएस-घुलनशील ग्लाइकोप्रोटीन25,26,27 हैं और ओपीएल के प्रमुख घटक एनएसीएल-घुलनशील1, 11हैं । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हमने अपकेंद्रण के बाद अघुलनशील प्रोटीन का कोई शेष गोली नहीं देखा, जो इंगित करता है कि घुलनशीलता की संभावना पूरी हो गई थी। पीएल, ओपीएल और/या आईपीएल से प्रोटीन का विश्लेषण एसडीएस-पेज द्वारा किया गया । परिणामस्वरूप प्रोटीन प्रोफाइल प्रकाशित साहित्य2,4,11, 16के अनुरूप हैं, लेकिन सिग्नल के संकल्प और तीव्रता में अत्यधिक सुधार हुआ है और विभिन्न आईपीएल और ओपीएल स्वतंत्र नमूनों के बीच बहुत अधिक समरूप है।
इसके अलावा, ओपीएल और आईपीएल के बीच मात्रात्मक तुलना उस वजन की सटीकता के लिए संभव है जिसे हमने संबंधित उपलेयर्स2,7के लिए अनुमानित किया था। इसके अलावा, ओपीएल और आईपीएल प्रोफाइल दोनों बहुत अलग हैं और 14 केडीए और 75 केडीए में एक बेहोश बैंड को छोड़कर, दोनों पीएल सबलेयर एक ही आणविक वजन प्रदर्शित करने वाले बैंड साझा नहीं करते हैं। यह अवलोकन कोई महत्वपूर्ण क्रॉस-संदूषण के साथ उपलेयरों के अलगाव की दक्षता की पुष्टि करता है। 1प्रकाशित एकमात्र पीएल प्रोटेओमिक विश्लेषण के अनुसार, ओपीएल (एंड एलटी;30 केडीए) में सबसे तीव्र बैंड को लिसोजाइम (14 केडीए), विटेललाइन झिल्ली बाहरी परत प्रोटीन 1 (17 केडीए), एवियन बीटा-डेफ के अनुरूप होना चाहिए एन्सिन 11 (12 केडीए का स्पष्ट आणविक वजन), जबकि आईपीएल के तीव्र बैंड (>30 केडीए) की संभावना है जोना-पेलुसिडा प्रोटीन 1 (१०२ केडीए) और जोना-पेलुसिडा प्रोटीन 3 (४७ केडीए) । सबलेयर्स के बीच बहुत प्रचुर मात्रा में पीएल प्रोटीन ओवोट्रांसफेरिन (78 केडीए), अंडाकार से संबंधित प्रोटीन एक्स (45 केडीए), ओवलबुमिन (43 केडीए)1 का वितरण स्पष्ट होना बाकी है। दरअसल, इन प्रोटीनों के उच्च आणविक वजन (>30 kDa) से पता चलता है कि वे एसडीएस-पेज प्रोफाइल के आधार पर आईपीएल प्रोटीन हैं, लेकिन उनकी ऊतक-विशिष्टता (ओविडक्ट-व्यक्त प्रोटीन) इन प्रोटीनों को ओपीएल28, 29से संबद्ध करेगी । इसके अलावा, कुछ ने अपर्याप्त धुलाई 1 के कारण अंडे के सफेद और अंडे की जर्दी प्रोटीन द्वारापीएलनमूनों के संभावित संदूषण का सुझाव दिया है । यह जानकारी की कमी वर्तमान प्रोटोकॉल के विकास का आधार है, जिसका उपयोग पीएल, ओपीएल और आईपीएल के गहन मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स के लिए आगे किया जाएगा ।
वैकल्पिक रूप से, कदम 2.1 से और अपकेंद्री के बाद अघुलनशील पदार्थ को दूर करने के लिए, आगे जैव रासायनिक और जैविक लक्षण वर्णन के लिए कुछ विशिष्ट प्रोटीन निकालना संभव है। इस तरह के एक दृष्टिकोण हाल ही में जैविक गतिविधियों और/या OPL के दो मुख्य घटकों की 3 डी संरचना, vitelline झिल्ली बाहरी परत प्रोटीन 1 (VMO1) और एवियन बीटा-defensin 11 (AvBD11)30, 31की विशेषता के लिए लागू किया गया है । शुद्ध अणुओं के रूप में इन प्रोटीनों की उपलब्धता इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री जैसे अतिरिक्त प्रयोगों के लिए या एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरबेंट परख सहित मात्रात्मक परख के विकास के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उत्पादन करने में भी मदद कर सकती है।
इस प्रोटोकॉल की दो प्रमुख सीमाएं हैं (1) सबलेयर्स जुदाई के साथ चुनौती, खासकर यदि अंडे 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों से अधिक संग्रहीत किए गए हैं और (2) तथ्य यह है कि पूर्ण प्रोटीन घुलनशीलता को कम करने और बफर को विकृत करने की आवश्यकता होती है, जो परिणामस्वरूप नमूनों की आंतरिक जैविक गतिविधि को ख़राब करते हैं। पहली सीमा के बारे में, यांत्रिक जुदाई तकनीकी कौशल की आवश्यकता है, लेकिन आसानी से 2 या 3 प्रयोगात्मक प्रशिक्षण के बाद प्राप्त किया जाता है । आईपीएल के कुछ छोटे टुकड़े ओपीएल से जुड़े रह सकते हैं और इसके विपरीत दोनों सबलेयर्स कसकर जुड़े हुए हैं । हालांकि, यदि यांत्रिक पृथक्करण सावधानी से किया जाता है तो दूसरे के द्वारा एक उपलेयर का संदूषण कम होना चाहिए। इष्टतम सबलेयर जुदाई के बाद विशिष्ट आईपीएल और ओपीएल एसडीएस-पेज प्रोफाइल चित्र 5में सचित्र हैं । दूसरी सीमा के बारे में, इस लेख में प्रस्तुत प्रयोगात्मक चरणों को प्रोटेओमिक विश्लेषणों के लिए अनुकूलित किया गया है, ताकि प्रत्येक सबलेयर की रचना करने वाले प्रोटीन की एक विस्तृत सूची प्रदान की जा सके। प्रत्येक प्रोटीन की जैविक गतिविधियों के आगे लक्षण वर्णन के लिए, डेनैचिंग स्थितियों (चरण 2.2.1, उबलते द्वारा पीछा किए जाने वाले एसडीएस और बीटा-मर्केप्टोथेन के साथ बफर का उपयोग करने से पहले, चरण 2.1.2 पर रोकना आवश्यक है)। हालांकि, यह उल्लेखनीय है कि चरण 2.1.2 के परिणामस्वरूप प्रोटीन केवल नमक में घुलनशील प्रोटीन होते हैं जबकि नमक-अघुलनशील प्रोटीन एकत्र होते हैं। उनकी संबंधित गतिविधि का आगे आकलन करने का एक विकल्प यह हो सकता है कि हेट्रोलॉगस सिस्टम(ई कोलाई,बाकुलोवायरस, खमीर आदि) का उपयोग करके पुनर्संयोजन प्रोटीन के रूप में नमक-अघुलनशील प्रोटीन का उत्पादन किया जाए।
प्रत्येक प्रजाति की मौलिकता की बेहतर सराहना करने के लिए तुलनात्मक अध्ययन के लिए इस प्रोटोकॉल को अन्य एवियन अंडों के अनुकूल बनाया जा सकता है। वास्तव में, पीएल संरचनात्मक रूप से और प्रोटीन संरचना दोनों के संदर्भ में कुछ पक्षी-विशिष्टताओं को प्रदर्शित करता है, जो नए वातावरण के अनुकूलन के कारण होने की संभावना है, लेकिन विकासात्मक विशिष्टताओं2,6,9,32के लिए भी। इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए मध्यम तकनीकीता और शास्त्रीय उपकरण/सामग्री की आवश्यकता होती है, पक्षी प्रजनन और विशिष्टता अध्ययन के क्षेत्र में नए अनुसंधान के रास्ते खोलता है ।
The authors have nothing to disclose.
हम बिना निषेचित ईसा-भूरे अंडे प्रदान करने के लिए फिलिप डिडिएर और करीन क्रोध (INRAE, पीट, 37380, Nouzilly, फ्रांस, https://doi.org/10.15454/1.5572326250887292E12) के लिए आभारी हैं। हम एम ब्रेजॉन की पीएचडी के वित्तपोषण के लिए यूनिवर्सिटी ऑफ टूर्स, फ्रांस को भी धन्यवाद देते हैं। इस काम को फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (EQLIPSE, ANR-19-CE21-0006) से वित्तीय सहायता मिली ।
Binocular dissecting microscope | Vision Engineering, France | Model Mantis Elite | |
Lyophilizer | Cryotec, France | Model Cosmos 80 | |
Mini-Protean II electrophoresis cell | Biorad, Hercules, USA | 1652960 | Any apparatus adapted for protein electrophoresis |
Mixer Mill MM400 | Retsch, Hann, Germany | 20.745.0001 | Mixer mill adapted for for dry, wet, and cryogenic grinding of small amounts of sample |
Ultra fine dissection scissors in stainless steel length 12 cm | Dutscher, Brumath | 5066 | |
Ultra precise tip forceps anti-magnetic stainless steel 9.5x 109.3 mm | Dutscher, Brumath | 327005 |