Denne artikkelen rapporterer en enkel metode for å isolere de ytre og indre perivitelline underlag av kyllingegg samtidig som strukturell endring minimeres og for å optimalisere proteinoppløselse av hvert underlag for proteomiske analyser.
Det perivitelliniske laget som omgir eggeplommen spiller en grunnleggende rolle i befruktning, i eggforsvar og i utviklingen av det fugleembryo. Det er dannet av to proteinakende underlag som er tett forbundet og dannet av distinkte kvinnelige reproduktive organer. Begge strukturene antas å ha sine egne funksjonelle spesifisiteter, som gjenstår å definere. For å karakterisere funksjonen til proteiner som komponerer hvert underlag, er den første utfordringen å etablere forholdene som ville tillate mekanisk separasjon av disse to intrikate lagene, samtidig som det begrenser eventuelle strukturelle skader. Det andre trinnet er å optimalisere de eksperimentelle forholdene for å lette proteinslukbilisering fra disse to underlagene, for påfølgende biokjemiske analyser. Effektiviteten av denne tilnærmingen vurderes ved å analysere proteinprofilen til hvert underlag av Natrium dodecylsulfat-poly-akrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE), som forventes å være forskjellig mellom de to strukturene. Denne to-trinns prosedyren forblir enkel; det krever klassisk biokjemisk utstyr og reagenser; og er kompatibel med ytterligere inngående proteomics. Det kan også transponeres til andre fugleegg for komparativ biologi, vel vitende om at strukturen og sammensetningen av perivitellinlaget har vist seg å ha artsspesifikke egenskaper. I tillegg tillater de ikke-denaturing forholdene utviklet for sublayers separasjon (trinn 1) sine strukturelle analyser ved skanning og overføring elektron mikroskopi. Det kan også utgjøre det første trinnet for påfølgende proteinrensing for å analysere sine respektive biologiske aktiviteter og 3D-struktur, eller å utføre ytterligere immunohistokjemiske eller funksjonelle analyser. Slike studier vil bidra til å tyde den fysiologiske funksjonen til disse to underlagene, hvis strukturelle og funksjonelle integrities er determinante kriterier for reproduktiv suksess.
Formålet med denne metoden er å gi en protokoll som tillater etterfølgende biokjemisk karakterisering av perivitelline laget (PL), et tynt proteinamisk lag som omslutter eggeplommen og spiller en grunnleggende rolle i reproduksjon av fuglearter. PL, også kalt “vitelline membran” i litteraturen, er et tredimensjonalt nettverk av tykke fibre som består av flere typer glykoproteiner. Den består av et indre perivitelline lag (IPL) (i kontakt med eggeplommen) som er montert i eggstokken, og av et ytre perivitelline lag (OPL, i kontakt med den hvite), liggende på IPL (Figur 1) og produsert av infundibulum. Dette sistnevnte vevet er det traktlignende øvre segmentet av ovidukten som mottar den modne eggeplommefollikelen etter eggløsning, og stedet der befruktningen finner sted. Utskillelsen av OPL oppstår etter disse to hendelsene og etterfølges av det påfølgende innskuddet av eggehviten og eggeskallet i andre spesifikke segmenter av oviducten. De fysiologiske funksjonene til PL er ikke bare relatert til befruktning og tidlige stadier av embryogenese, men også til embryoets fysiske og molekylære beskyttelse. Proteomisk analyse av kyllingegg utført på hele PL avslørte tilstedeværelsen av 137 forskjelligeproteiner 1, men fordelingen av de fleste av disse proteinene mellom IPL og OPL gjenstår å bli belyst. Den minimale mengden data som er tilgjengelige i litteraturrapporten om at IPL og OPL viser svært forskjelligeproteinprofiler 2,3,4, noe som tyder på ulike strukturelle og funksjonelle egenskaper. Den relative mangelen på data om fordelingen av proteiner mellom OPL og IPL skyldes sannsynligvis vanskeligheten med å skille mellom mellomlag som er tynne og innebygde.
Metoden som presenteres her beskriver betingelsene som skal brukes til å skille de to underlagene med begrenset innvirkning på deres respektive histologiske struktur samtidig som proteininnholdet bevares, og for å gi protokollen som tillater fullstendig oppløselighet av proteiner for senere analyse av proteomics. Det inkluderer to hovedtrinn: 1) PL prøvetaking og OPL / IPL separasjon og 2) PL, OPL, og IPL behandling for protein solubilisering og elektroforese for massespektrometri analyse. Arbeidsflyten presenteres i figur 2. Merkbart, selv om den nåværende protokollen er optimalisert for proteomiske analyser (trinn 2.2), kan den stoppes på noen trinn for histologisk (f.eks elektronmikroskopi), immunohistokjemiske analyser, funksjonelle studier (trinn 1), og for rensing av saltløselige proteiner for å karakterisere deres struktur og biologiske aktivitet (trinn 2.1) (figur 2).
Det første trinnet er fjerning av total PL fra eggeplommen (Figur 2, trinn 1.1). Alle publiserte metoder starter med separasjon av eggehviten fra eggeplommen manuelt eller ved hjelp av en eggseparator. Det etterfølges av fjerning av gjenværende eggehvite og den tykke chalazae ved hjelp av tang eller ved adsorpsjon på et filterpapir5 (Figur 2A). Deretter er teknikkene som er valgt for å prøve PL, variable, avhengig av de publiserte artiklene. Noen papirer inkluderer flere vasker av eggeplommen, i deionisert eller destillertvann 1,5,6,i 0,85 til 1% saltløsning2,7,8, i bufringsløsninger som 0,15 M NaCl / N-[Tris (hydroksymetyl) metyl] -2-aminoethanesulfonic acid, pH 7.44, eller i 0.01N HCl (pH 2)3. Disse prosedyrene ble brukt på kylling, and, ringhalset fasan, grå partridge, cockatiel papegøye, innenlandsk due, eller ratitesegg 2,6,9. Fjerning av PL mens eggeplommen opprettholdes i en petriskål uten vandige løsninger kan være svært arbeidskrevende da PL er skjør og eggeplomme har en tendens til å holde seg til PL1,5 og derfor fortsatt vanskelig å eliminere etterpå. Bruk av sur buffer eller oppløsning i en time ved 37 °C3 foretrekkes heller ikke, da slike forhold kan endre PL-strukturen og kan føre til proteintap. Det er også viktig å fjerne området som inneholder bakterieskiven, da denne sonen sannsynligvis vil ha et distinkt strukturelt og molekylært mønster, som ikke gjenspeiler hele PL4,6,10 ( figur2B). Denne metoden utnytter ideer fremhevet av noen publiserte artikler og foreslår noen forbedringer for å lette PL-prøvetaking samtidig som den beholder integriteten (Figur 2C).
Det andre trinnet består av å skille de to underlagene (figur 2, trinn 1.2). Dette trinnet er kritisk som OPL og IPL er tett bundet til hverandre. Dette trinnet bør utføres nøye med tang under et kikkert dissekeremikroskop. Publikasjoner som rapporterer OPL/IPL-separasjon er ganskebegrenset 2,3,7,11, og noen av dem bruker spesifikke forhold (sur buffer ved 37 °C i 1 t2,3) som sannsynligvis vil påvirke den histologiske strukturen til underlagene og/eller bidra til proteintap eller eggeplomme eller hvit forurensning. For bedre å skille OPL fra IPL, rapporterte noen forfattere bruken av toluidenblå for å farge OPL litt (det indre laget forblir fargeløst)11. I metoden som er utviklet, optimaliserte vi forholdene slik at separasjonen enkelt oppnås og ikke krever bruk av fargestoff (figur 2D).
Det andre hovedtrinnet er oppløseligheten av proteiner som komponerer hvert underlag. Klassisk oppnås det ved å blande rene lyofiliserte1,tørket2,6eller nylaget3,4,11 PL / underlag direkte med Laemmli-bufferen som brukes til elektroforese. Andre forfattere foretrakk en foreløpig solubilisering av lag i 1% NaCl, i en 1% SDS buffering løsning2,3,11 eller i en løsning som inneholder proteasehemmere og SDS6 ved romtemperatur eller Triton etterfulgt av inkubasjon ved 45 ° C12, under konstant kraftig omrøring. Noen forfattere beskrev også en protokoll der PL ble inkubert i fosfatbuffer saltvann eller urea og utsatt for sonikering13. Disse behandlingene ble alle etterfulgt av en sentrifugering og fortynning i Laemmli buffer og alle deler ulempen med ufullstendig proteinslukbilisering fra lag som uoppløselig materiale (pellet oppnådd etter sentrifugering) kastes fra prøven som skal analyseres.
I tillegg er bruk av denaturing forhold (urea, vaskemiddel, høy temperatur, etc.) av visse forfattere for protein solubilisering ikke kompatibel med påfølgende protein rensing for karakterisering som de er sannsynlig å irreversibel inaktivere proteiner, forstyrre deres biologiske aktiviteter og også svekke deres 3D struktur. For dette spesifikke trinn 2, protokollen inkluderer en første substep som tillater solubilisering av de mest rikelige proteiner under ikke-denaturing forhold etter PL / OPL / IPL mekanisk de-strukturering, som ikke vil forstyrre ytterligere proteinstudier, om nødvendig (Figur 2, trinn 2.1), og en andre undertrinn som muliggjør fullstendig solubilisering av proteiner for elektroforese og dybde proteomics (Figur 2, trinn 2.2). Den kombinerer forslag hentet fra ulike publiserte artikler og justeringer som følge av nye ideer validert av eksperimentelle studier.
Suksessen til den nåværende protokollen er avhengig av to kritiske trinn som ble uavhengig optimalisert: den mekaniske separasjonen av OPL og IPL som må være så mindre destrukturering som mulig, etterfulgt av den komplette proteinsluktiseringen av hver underlag, som omvendt er destrukturering og denaturing. Det fremhever også noen spesifikke punkter som må tas i betraktning for å sikre vellykket oppnåelse av hvert trinn.
Protokollen er ikke avhengig av eggeskallfargen, eggvekten, produksjonstypen eller hønsegens genetiske stamme. Det avhenger imidlertid av eggets friskhet. Faktisk gjennomgår egget dype interne fysikalske modifikasjoner raskt etter å ha blitt lagt, selv om disse endringene kan forsinkes når lagring utføres under nedkjølteforhold 14,15. Tap av karbondioksid gjennom eggeskallporene under lagring resulterer i økningen av eggehvit pH (fra 7,8 til 9,5), mens noen vannutvekslinger oppstår mellom eggeplommen og den hvite, over PL. Begge modifikasjoner negativt påvirke molekylær og histologisk struktur av PL som blir svekket og mindre spent14,15, sannsynligvis på grunn av fysikalske modifikasjoner av proteininnholdet16,17,18. Det antas at separasjonen av underlag vil bli svært vanskelig med lagrede egg, spesielt hvis lagringen utføres i lang tid ved romtemperatur. Oppdatert har protokollen blitt utført ved hjelp av egg lagret i mindre enn 4 dager ved 4 °C, og maksimal oppbevaringstid for et egg for effektivt å prøve PL-underlag er ennå ikke kjent. I tillegg, hvis målet er analysen av hvert underlag, er det avgjørende å bruke ubefruktede egg. På lådagen er embryoet til et befruktet egg 23 timer gammelt og utviklingen er svært rask etterpå, hvis egget inkuberes. Faktisk ekspanderer embryonal utvikling og veksten av noen ekstraembryoniske strukturer ved hjelp av PL som et substratum, som dermed raskt brytes ned, og erstattes av den ekstraembryoniske eggeplommen19.
Etter manuell separasjon av eggeplommen og eggehviten, må eggeplommen rengjøres fra eggehvite spor og fra chalazae som forble tett festet til PL. Spissen er å rulle eggeplommen forsiktig på et filterpapir og utføre omfattende vasker av eggeplommen i bufrede løsninger (10 mM Tris-HCl pH 8). PH-en som brukes til bufferen er i samsvar med den fysiologiske pH-en til eggehviten14 og har vist seg å minimere proteintap (figur 3). Bruken av en nedkjølt buffer vil da bidra til å fjerne PL fra eggeplommen fordi ved 4 ° C, vil bufferen lette PL fjerning som lipidisk eggeplomme trekker tilbake og blir mindre væske ved denne temperaturen. Ytterligere vasker vil tillate fjerning av eggeplommerester fra PL. Det er også viktig å kutte ut sonen som tilsvarer bakterieplaten fordi denne strukturen som inneholder kvinnelig pronukleus kanskje ikke er representativ for PL. Det er stedet for befruktning og multiplikasjon av embryonale celler når egget befruktes. Det er ment å ha en bestemt sammensetning som kanskje ikke er representativ for hele PL, som er grunnen til at den ble fjernet. Dette spesifikke trinnet er sterkt tilrettelagt når eggeplommen er nedsenket i en kald buffer. Selv om denne bakterieplatestrukturen kastes i den nåværende protokollen (ut av målene), kan spesifikke analyser av dette området i befruktede egg være svært nyttige for forskere som er interessert i å studere utviklingen av PL-innholdet (proteomikk og aktivitet) og struktur (elektronmikroskopi), i de tidlige stadiene av embryogenese19,20,21. På dette stadiet er hele PL strukturelt intakt og kan behandles for ytterligere strukturell analyse av elektronmikroskopi (figur 2), til trinn 1.2 eller til trinn 2.1 (hvis målet er å analysere hele PL).
Trinn 1.2 må utføres under et kikkert dissekeringsmikroskop, da PL er veldig tynn og skjør (ca. 10 μm tykk). Separasjonen av underlag er nesten umulig i vann eller i buffer mangler minimalt salt, og innledende forsøk på å bruke disse alternativene har resultert i alvorlig PL skade. Dermed forblir bufferen som er valgt for dette trinnet ved fysiologisk pH (pH 8) og inneholder 50 mM NaCl. Dette trinnet er vanskelig og må utføres forsiktig og forsiktig for å forhindre PL rive. Når de er separert, kan de to underlagene enkelt identifiseres som de viser særegne fysiske egenskaper (ugjennomsiktig versus gjennomskinnelig). Mangel på homogenitet av IPL under lys av mikroskopet bør gjenspeile en ufullstendig separasjon og dermed tilstedeværelsen av de gjenværende flekkene av OPL tilstede på IPL. I tillegg er det svært vanskelig å behandle hele membranen og bruk av 2 cm x 3 cm stykker øker sjansene for suksess. Det resulterende underlaget er egnet for histologisk studie ved elektronmikroskopi (figur 1). Det er bemerkelsesverdig at en bestemt lineær struktur (0,05 til 1 μm tykk) kalt den kontinuerlige membranen (CM) er synlig på mikrografen (figur 1) og forblir vanligvis festet til det ene eller det andre underlaget under separasjonsprosessen. Det har tidligere blitt publisert at ved bruk av en relativt høy salt molaritet for separasjon (500 mM), CM forble festet til OPL7 mens bruk av vann5 vil favorisere vedlegg av CM til IPL. I denne protokollen brukes en lav salt molaritet for å oppnå de spesifikke målene (PL-underlaget strukturelt intakt og minimalt tap av proteiner), noe som betyr at denne CM sannsynligvis er forbundet med IPL. Imidlertid vil ytterligere analyse av IPL og OPL ved overføring elektronmikroskopi tydelig angi denne hypotesen. PL-, OPL- eller IPL-lag oppnådd på slutten av trinn 1 kan også brukes til in vitro-analyser for sperm-eggbindingsanalyser22 eller for å analysere de tidlige trinnene i embryonal utvikling23,24.
Trinn 2 refererer til oppløselsen av proteininnhold, delvis (trinn 2.1) eller helt (trinn 2.2). PL og/eller OPL er først lyofilisert for å fjerne vannmolekyler og for å tillate nøyaktige vektmålinger. Faktisk er PL hovedsakelig sammensatt av vann (88%)7,mens det tørrestoffetinneholder i hovedsak proteiner (80% til 90% avhengig av studier), karbohydrater, fett og mineraler2,7,25. Tatt i tanke på at vannet i PL fjernes ved frysetørking, at karbohydrater i hovedsak gjenvinnes i PL glykoproteiner, og at fett og mineraler stammer fra eggeplomme i hovedsak kastes av omfattende vasker, antas det at det resulterende PL består nesten utelukkende av proteiner. Dermed bør vektverdien oppnådd etter fullstendig lyofilisering hovedsakelig tilsvare proteiner. Like mye PL, OPL og/eller IPL fortynnes deretter i bufferen som inneholder 0,5 M NaCl. Den høye salt molariteten kombinert til mekanisk ødeleggelse av det fibrøse nettverket ved å slipe forenkler proteinslukbilisering under ikke-denaturingsforhold. Dette trinnet etterfølges av fullstendig solubilisering ved hjelp av kokende, SDS vaskemiddel og det reduserende middelet beta-mercaptoetanol (trinn 2.2). Faktisk er noen IPL-proteiner SDS-løselige glykoproteiner25,26,27 ogde viktigste bestanddelene av OPL er NaCl-løselige1,11. Ved hjelp av denne protokollen så vi ingen gjenværende pellet av uoppløselige proteiner etter sentrifugering, noe som indikerer at solubiliseringen sannsynligvis var fullført. Proteiner fra PL, OPL og/eller IPL ble deretter analysert av SDS-PAGE. Resulterende proteinprofiler er konsistente med publisert litteratur2,4,11,16,men oppløsningen og intensiteten av signalet er svært forbedret og mye mer homogen mellom ulike IPL og OPL uavhengige prøvetakinger.
I tillegg er kvantitativ sammenligning mellom OPL og IPL mulig takket være nøyaktigheten av vekten som vi utledet for de respektiveunderlagene 2,7. Videre er både OPL- og IPL-profiler svært forskjellige og bortsett fra et svakt bånd på 14 kDa og 75 kDa, deler begge PL-underlagene ikke synlig bånd som viser samme molekylvekt. Denne observasjonen bekrefter effektiviteten av sublayers separasjon uten signifikant krysskontaminering. Ifølge den eneste PL proteomiske analysenpublisert 1,bør de mest intense båndene i OPL ( 30 kDa) sannsynligvis er Zona-Pellucida protein 1 (102 kDa) og Zona-Pellucida protein 3 (47 kDa). Fordelingen av svært rikelig PL proteiner ovotransferrin (78 kDa), ovalbumin-relatert protein X (45 kDa), ovalbumin (43 kDa)1 mellom underlag gjenstår å bli belyst. Faktisk antyder den høye molekylvekten av disse proteinene (> 30 kDa) at de er IPL-proteiner basert på SDS-PAGE-profilen, men deres vevspesifisitet (oviduct-uttrykte proteiner) vil heller knytte disse proteinene til OPL28,29. Videre har noen foreslått en potensiell forurensning av PL-prøver av eggehvite og eggeplommeproteiner på grunn av utilstrekkelig vask1. Denne manglende informasjonen er grunnlaget for utviklingen av den nåværende protokollen, som vil bli ytterligere brukt til dyptgående kvantitative proteomikk av PL, OPL og IPL.
Alternativt, fra trinn 2.1 og etter sentrifugering for å fjerne uoppløselig materiale, er det mulig å trekke ut noen spesifikke proteiner for ytterligere biokjemisk og biologisk karakterisering. En slik tilnærming har nylig blitt brukt til å karakterisere biologiske aktiviteter og / eller 3D-strukturen til de to hovedkomponentene i OPL, vitellinmembranens ytre lagprotein 1 (VMO1) og avian beta-defensin 11 (AvBD11)30,31. Tilgjengeligheten av disse proteinene som rensede molekyler kan også bidra til å produsere spesifikke antistoffer for ytterligere eksperimenter som immunohistokjemi eller for utvikling av kvantitative analyser, inkludert enzym-koblede immunosorbentanalyser.
De to viktigste begrensningene i denne protokollen er (1) utfordringen med underlagsseparasjon, spesielt hvis egg har blitt lagret mer enn 4 dager ved 4 ° C og (2) det faktum at den komplette proteinslukbiliseringen krever reduksjon og denaturing buffere, noe som svekker den iboende biologiske aktiviteten til de resulterende prøvene. Når det gjelder den første begrensningen, krever mekanisk separasjon tekniske ferdigheter, men oppnås lett etter 2 eller 3 eksperimentelle treninger. Noen IPL små stykker kan forbli festet til OPL og vice versa som begge underlagene er tett forbundet. Kontaminering av det ene underlaget av det andre bør imidlertid være minimal hvis den mekaniske separasjonen utføres forsiktig. Typiske IPL- og OPL SDS-PAGE-profiler etter optimal separasjon av underlag er illustrert i figur 5. Når det gjelder den andre begrensningen, har eksperimentelle skritt som presenteres i denne artikkelen blitt optimalisert for proteomiske analyser, for å gi en uttømmende liste over proteiner som komponerer hvert underlag. For videre karakterisering av de biologiske aktivitetene til hvert protein, er det nødvendig å stoppe i trinn 2.1.2, før du bruker denaturing forhold (trinn 2.2.1, bruk av buffer med SDS og beta-mercaptoethanol etterfulgt av koking). Det er imidlertid bemerkelsesverdig at proteiner som følge av trinn 2.1.2 bare er saltløselige proteiner mens saltinsoluble proteiner dannes aggregater. Et alternativ for å vurdere deres respektive aktivitet kan være å produsere saltinsoluble proteiner som rekombinante proteiner ved hjelp av heterologe systemer (E. coli, baculovirus, gjær, etc.).
Denne protokollen kan tilpasses andre fugleegg for komparative studier for å bedre sette pris på originaliteten til hver art. Faktisk viser PL noen fuglespesifisiteter både strukturelt og når det gjelder proteinsammensetning, sannsynligvis på grunn av tilpasning til nye miljøer, men også til utviklingsspesifisiteter2,6,9,32. Utviklingen av denne protokollen som krever moderat teknikk og klassisk utstyr / materialer åpner nye forskningsveier innen fuglegjengivelse og spesiasjonsstudier.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige til Philippe Didier og Karine Anger (INRAE, PEAT, 37380, Nouzilly, Frankrike, https://doi.org/10.15454/1.5572326250887292E12) for å gi ubefruktede Isa-brune egg. Vi takker også University of Tours, Frankrike for finansiering av M. Bregeons doktorgrad. Dette arbeidet fikk økonomisk støtte fra The French National Research Agency (EQLIPSE, ANR-19-CE21-0006).
Binocular dissecting microscope | Vision Engineering, France | Model Mantis Elite | |
Lyophilizer | Cryotec, France | Model Cosmos 80 | |
Mini-Protean II electrophoresis cell | Biorad, Hercules, USA | 1652960 | Any apparatus adapted for protein electrophoresis |
Mixer Mill MM400 | Retsch, Hann, Germany | 20.745.0001 | Mixer mill adapted for for dry, wet, and cryogenic grinding of small amounts of sample |
Ultra fine dissection scissors in stainless steel length 12 cm | Dutscher, Brumath | 5066 | |
Ultra precise tip forceps anti-magnetic stainless steel 9.5x 109.3 mm | Dutscher, Brumath | 327005 |