Denna artikel rapporterar en enkel metod för att isolera de yttre och inre perivitelline underlag av kyckling ägg samtidigt minimera strukturella förändringar och optimera protein löslighet av varje underlag för proteomic analyser.
Det perivitellinskikt som omger äggulan spelar en grundläggande roll i befruktning, i äggförsvar och i utvecklingen av fågelembryon. Det bildas av två proteinhaltiga underlag som är tätt associerade och bildas av distinkta kvinnliga reproduktionsorgan. Båda strukturerna antas ha sina egna funktionella särdrag, som återstår att definiera. För att karakterisera funktionen hos proteiner som komponerar varje underlager är den första utmaningen att fastställa de förhållanden som skulle möjliggöra mekanisk separation av dessa två invecklade lager, samtidigt som eventuella strukturella skador begränsades. Det andra steget är att optimera de experimentella förhållandena för att underlätta proteinlöslighet från dessa två underlag, för efterföljande biokemiska analyser. Effektiviteten av detta tillvägagångssätt bedöms genom att analysera proteinprofilen för varje underskikt av natrium dodecyl sulfat-poly-akrylamid gel elektrofores (SDS-PAGE), som förväntas vara distinkt mellan de två strukturerna. Detta tvåstegsförfarande är fortfarande enkelt. Det kräver klassisk biokemisk utrustning och reagenser. och är kompatibel med ytterligare djupgående proteomik. Det kan också överföras till andra fågelägg för jämförande biologi, med vetskap om att strukturen och sammansättningen av det perivitellinskiktet har visat sig ha artspecifika egenskaper. Dessutom tillåter de icke-denatureringsförhållanden som utvecklats för sublayers separation (steg 1) sina strukturella analyser genom skanning och överföringselektronmikroskopi. Det kan också utgöra det första steget för efterföljande proteinrening att analysera sina respektive biologiska aktiviteter och 3D-struktur, eller att utföra ytterligare immunohistokemiska eller funktionella analyser. Sådana studier skulle bidra till att dechiffrera den fysiologiska funktionen hos dessa två underlag, vars strukturella och funktionellaintegriteter är avgörande kriterier för reproduktiv framgång.
Syftet med denna metod är att tillhandahålla ett protokoll som möjliggör efterföljande biokemisk karakterisering av det perivitellinskiktet (PL), ett tunt proteinhaltigt skikt som omsluter äggulan och spelar en grundläggande roll i reproduktionen av fågelarter. PL, även kallat “vitelline membran” i litteraturen, är ett tredimensionellt nätverk av tjocka fibrer som består av flera typer av glykoproteiner. Den består av ett inre perivitellinskikt (IPL) (i kontakt med äggulan) som är monterat i äggstocken och av ett yttre perivitellinskikt (OPL, i kontakt med det vita), som ligger på IPL (figur 1) och produceras av infundibulum. Denna senare vävnad är det trattliknande övre segmentet av äggledaren som får den mogna äggulan follikeln efter ägglossningen och platsen där befruktningen äger rum. Utsöndring av OPL sker efter dessa två händelser och följs av den successiva deponeringen av äggvitan och äggskalet i andra specifika segment av äggledaren. PL: s fysiologiska funktioner är inte bara relaterade till befruktning och tidiga stadier av embryogenes, men också till embryots fysiska och molekylära skydd. Den proteomiska analysen av kycklingägg som utfördes på hela PL visade närvaron av 137 olikaproteiner 1, men fördelningen av de flesta av dessa proteiner mellan IPL och OPL återstår att klargöra. Den minimala mängden data som finns tillgängliga i litteraturrapporten som IPL och OPL uppvisar mycket distinktaproteinprofiler 2,3,4, vilket föreslår olika strukturella och funktionella egenskaper. Den relativa bristen på data om fördelningen av proteiner mellan OPL och IPL beror sannolikt på svårigheten att separera båda underlagren som är tunna och inbäddade.
Metoden som presenteras här beskriver de villkor som ska användas för att separera de två underlagarna med begränsad inverkan på deras respektive histologiska struktur samtidigt som deras proteininnehåll bevaras och protokollet möjliggör fullständig löslighet av proteiner för efterföljande analys av proteomik. Den innehåller två huvudsteg: 1) PL-provtagning och OPL/IPL-separation och 2) PL-, OPL- och IPL-behandling för proteinlöslighet och elektrofores för masspektrometrianalys. Arbetsflödet presenteras i figur 2. Även om det nuvarande protokollet har optimerats för proteomiska analyser (steg 2.2), kan det stoppas i vissa steg för histologisk (t.ex. elektronmikroskopi), immunohistokemiska analyser, funktionella studier (steg 1) och för rening av saltlösliga proteiner för att karakterisera deras struktur och biologiska aktivitet (steg 2.1) (figur 2).
Det första steget är avlägsnandet av totalt PL från äggulan(figur 2, steg 1.1). Alla publicerade metoder börjar med separationen av äggvitorna från äggulan manuellt eller med hjälp av en äggavskiljare. Den följs av avlägsnandet av den återstående äggvitan och den tjocka chalazaen med tång eller adsorption på ett filterpapper5 (figur 2A). Därefter varierar de tekniker som valts för att ta prov på PL beroende på de publicerade artiklarna. Vissa papper inkluderar flera tvättar av äggulan, i avjoniserat eller destilleratvatten 1,5,6, i 0,85 till 1% saltlösning2,7,8, i buffringslösningar som 0,15 M NaCl / N-[Tris (hydroxymethyl) metyl]-2-aminoetanesulfonsyra, pH 7.44, eller i 0.01N HCl (pH 2)3. Dessa förfaranden tillämpades på kyckling, anka, ringhalsad fasan, grå rapphöna, cockatiel papegoja, inhemsk duva eller ratiter ägg2,6,9. Avlägsnandet av PL medan äggulan underhålls i en Petri-maträtt utan vattenlösningar kan vara mycket mödosam eftersom PL är bräcklig och äggula tenderar att hålla sig till PL1,5 och är därför fortfarande svår att eliminera efteråt. Användning av sur buffert eller lösning under en timme vid 37 °C3 är inte heller att föredra eftersom sådana förhållanden kan förändra PL-strukturen och leda till proteinförlust. Det är också viktigt att ta bort det område som innehåller germinalskivan eftersom denna zon sannolikt har ett distinkt strukturellt och molekylärt mönster, vilket inte återspeglar hela PL4,6,10 ( Figur2B). Denna metod drar nytta av idéer som lyfts fram i vissa publicerade artiklar och föreslår vissa förbättringar för att underlätta PL-provtagning samtidigt som dess integritet bevaras (figur 2C).
Det andra steget består i att separera de två underlagarna(figur 2, steg 1.2). Detta steg är kritiskt eftersom OPL och IPL är tätt bundna till varandra. Detta steg bör utföras noggrant med tång under ett binokulärt dissekerande mikroskop. Publikationer som rapporterar OPL/IPL separation ärganska begränsade 2,3,7,11 och några av dem använder specifika villkor (sur buffert vid 37 °C för 1 h2,3) som sannolikt kommer att påverka underlagens histologiska struktur och/eller bidra till proteinförlust eller äggula eller vita föroreningar. För att bättre skilja OPL från IPL rapporterade vissa författare användningen av toluidinblått för att färga OPL (det inre lagret förblir färglöst)11. I den metod som utvecklats optimerade vi förutsättningarna så att separationen lätt uppnås och inte kräver användning av något färgämne (figur 2D).
Det andra huvudsteget är lösligheten av proteiner som komponerar varje underlager. Klassiskt uppnås det genom att blanda renafrystorkade 1,torkade2,6, eller nyberedda3,4,11 PL / underlag direkt med Laemmli-bufferten som används för elektrofores. Andra författare föredrog en preliminär löslighet av lager i 1% NaCl, i en 1% SDS buffring lösning2,3,11 eller i en lösning som innehåller proteashämmare och SDS6 vid rumstemperatur eller Triton följt av inkubation vid 45 °C12, under konstant kraftig omrörning. Vissa författare beskrev också ett protokoll där PL inkuberades i fosfatbuffert saltlösning eller urea och utsätts för ultraljudsbehandling13. Dessa behandlingar följdes alla av en centrifugation och utspädning i Laemmli buffert och alla delar nackdelen med ofullständig protein löslighet från lager som olöslig fråga (pelleten erhålls efter centrifugation) kasseras från provet som ska analyseras.
Dessutom är användningen av denatureringsförhållanden (urea, tvättmedel, hög temperatur etc.) av vissa författare för proteinlöslighet inte förenlig med efterföljande proteinrening för karakterisering eftersom de sannolikt kommer att irreversibelt inaktivera proteiner, störa deras biologiska aktiviteter och också försämra deras 3D-struktur. För detta specifika steg 2 innehåller protokollet ett första delsteg som möjliggör löslighet av de mest rikliga proteinerna under icke-denatureringsförhållanden efter PL/OPL/IPL mekanisk de-structuration, som vid behov inte kommer att störa ytterligare proteinstudier(figur 2,steg 2.1) och ett andra delsteg som möjliggör fullständig löslighet av proteiner för elektrofores och djupgående proteomik(figur 2,steg 2.2). Den kombinerar förslag från olika publicerade artiklar och justeringar till följd av nya idéer som validerats av experimentella studier.
Framgången för det nuvarande protokollet bygger på två kritiska steg som var oberoende optimerade: den mekaniska separationen av OPL och IPL som måste vara så mindre destrukturerande som möjligt, följt av fullständig proteinlöslighet av varje underlager, vilket omvänt är destrukturering och denaturering. Det belyser också några specifika punkter som måste beaktas för att säkerställa ett framgångsrikt uppnående av varje steg.
Protokollet beror inte på äggskalsfärgen, äggvikten, typen av produktion eller den genetiska stammen hos n. Det beror dock på äggets friskhet. Faktum är att ägget genomgår djupgående inre fysikaliskkemiska modifieringar snabbt efter att ha lagts, även om dessa förändringar kan försenas när lagring utförs under kylförhållanden14,15. Förlusten av koldioxid genom äggskalsporerna under lagringen resulterar i en ökning av äggvita pH (från 7,8 till 9,5) medan vissa vattenutbyten sker mellan äggulan och det vita, över PL. Båda modifieringarna påverkar PL: s molekylära och histologiska struktur negativt som blir försvagad och mindrespänd 14,15, sannolikt på grund av fysikaliskkemiska modifieringar av dess proteininnehåll16,17,18. Det antas att separationen av underlag blir mycket svår med lagrade ägg, särskilt om lagringen utförs under en lång period vid rumstemperatur. Hittills har protokollet utförts med ägg som lagrats i mindre än 4 dagar vid 4 °C och den maximala lagringstiden för ett ägg för att effektivt provta PL-underlag är ännu inte känd. Dessutom, om målet är analys av varje underlag, är det viktigt att använda obefruktade ägg. På lekdagen är embryot till ett befruktat ägg 23 timmar gammalt och dess utveckling är mycket snabb efteråt, om ägget inkuberas. Faktum är att embryonal utveckling och tillväxten av vissa extraembryoniska strukturer expanderar med PL som substratum, som därmed snabbt försämras och ersätts av den extraembryonic äggulasäcken 19.
Efter manuell separation av äggulan och äggvitan måste äggulan rengöras från äggvita spår och från chalazae som förblev tätt fastsatt på PL. Spetsen är att rulla äggulan försiktigt på ett filterpapper och utföra omfattande tvättar av äggulan i buffrade lösningar (10 mM Tris-HCl pH 8). Det pH som används för bufferten överensstämmer med äggvitens fysiologiskapH-fel 14 och har visat sig minimera proteinförlusten (figur 3). Användningen av en kyld buffert hjälper sedan till att ta bort PL från äggulan eftersom bufferten vid 4 °C kommer att underlätta PL-borttagning när lipidulan dras tillbaka och blir mindre vätska vid denna temperatur. Ytterligare tvättar gör det möjligt att avlägsna äggularester från PL. Det är också viktigt att skära ut zonen som motsvarar germinalskivan eftersom denna struktur som innehåller kvinnlig pronukleus kanske inte är representativ för PL. Det är platsen för befruktning och multiplikation av embryonala celler när ägget befruktas. Det är tänkt att ha en särskild sammansättning som kanske inte är representativ för hela PL, vilket är anledningen till att den togs bort. Detta specifika steg underlättas starkt när äggulan är nedsänkt i en kall buffert. Även om denna germinala skivstruktur kasseras i det nuvarande protokollet (av målen), kan specifika analyser av detta område i befruktade ägg vara mycket användbara för forskare som är intresserade av att studera utvecklingen av PL-innehållet (proteomik och aktivitet) och struktur (elektronmikroskopi), under de tidiga stadierna av embryogenes19,20,21. I detta skede är hela PL strukturellt intakt och kan bearbetas för ytterligare strukturell analys genom elektronmikroskopi (figur 2), till steg 1.2 eller till steg 2.1 (om målet är att analysera hela PL).
Steg 1.2 måste utföras under ett binokulärt dissekerande mikroskop, eftersom PL är mycket tunn och bräcklig (ca 10 μm tjock). Separationen av underlag är nästan omöjlig i vatten eller i buffert som saknar minimalt salt, och inledande försök att använda dessa alternativ har resulterat i allvarliga PL-skador. Således förblir bufferten som valts för detta steg vid fysiologiskt pH (pH 8) och innehåller 50 mM NaCl. Detta steg är mödosamt och måste utföras noggrant och försiktigt för att förhindra PL-rivning. När de har separerats kan de två underlagarna lätt identifieras eftersom de uppvisar speciella fysiska egenskaper (ogenomskinliga kontra genomskinliga). En brist på homogenitet hos IPL mot bakgrund av mikroskopet bör återspegla en ofullständig separation och därmed förekomsten av de återstående fläckarna av OPL som finns på IPL. Dessutom är det mycket svårt att behandla hela membranet och användningen av 2 cm x 3 cm bitar ökar kraftigt chanserna att lyckas. Det resulterande underlag som erhålls är lämpligt för histologisk undersökning genom elektronmikroskopi (figur 1). Det är anmärkningsvärt att en specifik linjär struktur (0,05 till 1 μm tjock) som heter det kontinuerliga membranet (CM) är synlig på mikrografen (figur 1) och förblir vanligtvis fäst vid det ena eller det andra underlaget under separationsprocessen. Det har tidigare publicerats att när man använder en relativt hög salt molaritet för separation (500 mM), förblev CM fäst vid OPL7 medan användningen av vatten5 kommer att gynna fastsättningen av CM till IPL. I detta protokoll används en låg salt molaritet för att uppnå de specifika målen (PL-underlag strukturellt intakt och minimal förlust av proteiner), vilket innebär att denna CM sannolikt är associerad med IPL. Ytterligare analys av IPL och OPL genom överföringselektronmikroskopi skulle dock tydligt ange på denna hypotes. PL-, OPL- eller IPL-skikt som erhålls i slutet av steg 1 kan också användas för in vitro-analyser för sperma-äggbindningsanalyser22 eller för att analysera de tidiga stegen för embryonal utveckling23,24.
Steg 2 avser löslighet av proteininnehåll, delvis (steg 2.1) eller helt (steg 2.2). PL och/eller OPL är först lyofiliserade för att avlägsna vattenmolekyler och för att möjliggöra exakta viktmätningar. Faktum är att PL huvudsakligen består av vatten (88%)7, medan torrsubstansen innehåller i huvudsak proteiner (80% till 90% beroende på studier), kolhydrater, fetter och mineraler2,7,25. Med tanke på att vattnet i PL avlägsnas genom frystorkning, att kolhydrater i huvudsak återvinns i PL-glykoproteiner och att fett och mineraler kommer från äggula i huvudsak kasseras genom omfattande tvättar, antas det att den resulterande PL består nästan uteslutande av proteiner. Således bör det viktvärde som erhålls efter fullständig lyofilisering huvudsakligen motsvara proteiner. Lika mycket PL, OPL och/eller IPL späds sedan ut i bufferten som innehåller 0,5 M NaCl. Den höga salt molariteten i kombination med mekanisk förstörelse av fibrösa nätverket genom slipning underlättar kraftigt proteinlöslighet under icke-denatureringsförhållanden. Detta steg följs av fullständig löslighet med kokning, SDS-tvättmedel och reducerande medel beta-mercaptoethanol (steg 2.2). Faktum är att vissa IPL-proteiner är SDS-lösliga glykoproteiner25,26,27 och de viktigaste beståndsdelarna i OPL är NaCl-lösliga1,11. Med hjälp av detta protokoll såg vi inte någon återstående pellet av olösliga proteiner efter centrifugation, vilket indikerar att lösligheten sannolikt var fullständig. Proteiner från PL, OPL och/eller IPL analyserades sedan av SDS-PAGE. Resulterande proteinprofiler överensstämmer med publiceradlitteratur 2,4,11,16, men signalens upplösning och intensitet är mycket förbättrad och mycket mer homogen mellan olika IPL- och OPL-oberoende provtagningar.
Dessutom görs kvantitativ jämförelse mellan OPL och IPL möjlig tack vare noggrannheten i den vikt som vi härledde för respektive underlag2,7. Dessutom är både OPL- och IPL-profiler mycket distinkta och förutom ett svagt band vid 14 kDa och 75 kDa delar båda PL-underlag inte synligt band som visar samma molekylvikt. Denna iakttagelse bekräftar effektiviteten hos underlagsseparation utan någon betydande korskontaminering. Enligt den enda PL proteomiska analysenpublicerad 1, bör de mest intensiva banden i OPL (30 kDa) sannolikt Zona-Pellucida protein 1 (102 kDa) och Zona-Pellucida protein 3 (47 kDa). Fördelningen av de mycket rikliga PL-proteinerna ovotransferrin (78 kDa), ovalbuminrelaterat protein X (45 kDa), ovalbumin (43 kDa)1 mellan underlag återstår att klargöra. Faktum är att den höga molekylvikten hos dessa proteiner (>30 kDa) tyder på att de är IPL-proteiner baserade på SDS-PAGE-profilen, men deras vävnadsspecifikitet (oviduct-uttryckta proteiner) skulle hellre associera dessa proteiner till OPL28,29. Dessutom har vissa föreslagit en potentiell förorening av PL-prover av äggvita och äggulaproteiner på grund av otillräckliga tvättningar1. Denna brist på information ligger till grund för utvecklingen av det nuvarande protokollet, som kommer att användas ytterligare för djupgående kvantitativa proteomiker av PL, OPL och IPL.
Alternativt, från steg 2.1 och efter centrifugation för att ta bort den olösliga frågan, är det möjligt att extrahera vissa specifika proteiner för ytterligare biokemisk och biologisk karakterisering. Ett sådant tillvägagångssätt har nyligen tillämpats för att karakterisera de biologiska aktiviteterna och/eller 3D-strukturen hos de två huvudkomponenterna i OPL, det vitelina membranets yttre skiktprotein 1 (VMO1) och avian beta-defensin 11 (AvBD11)30,31. Tillgången till dessa proteiner som renade molekyler kan också bidra till att producera specifika antikroppar för ytterligare experiment som immunohistokemi eller för utveckling av kvantitativa analyser, inklusive enzymkopplade immunsorbenta analyser.
De två viktigaste begränsningarna i detta protokoll är (1) utmaningen med separation av underlag, särskilt om ägg har lagrats mer än 4 dagar vid 4 °C och (2) det faktum att den fullständiga proteinlösligheten kräver att man minskar och nedgradering av buffertar, vilket försämrar de resulterande provens inneboende biologiska aktivitet. När det gäller den första begränsningen kräver mekanisk separation tekniska färdigheter men uppnås enkelt efter 2 eller 3 experimentella utbildningar. Vissa IPL små bitar kan förbli fästa på OPL och vice versa eftersom båda underlag är tätt associerade. Kontaminering av det ena underlaget av det andra bör dock vara minimal om den mekaniska separationen utförs försiktigt. Typiska IPL- och OPL SDS-PAGE-profiler efter optimal underlagringsseparation illustreras i figur 5. När det gäller den andra begränsningen har experimentella steg som presenteras i den här artikeln optimerats för proteomiska analyser, för att ge en uttömmande lista över proteiner som komponerar varje underlager. För ytterligare karakterisering av de biologiska aktiviteterna hos varje protein är det nödvändigt att stanna vid steg 2.1.2, innan du använder denatureringsförhållanden (steg 2.2.1, användning av buffert med SDS och beta-mercaptoethanol följt av kokning). Det är dock anmärkningsvärt att proteiner som härrör från steg 2.1.2 endast är saltlösliga proteiner medan saltolösliga proteiner bildar aggregat. Ett alternativ för att ytterligare bedöma deras respektive aktivitet kan vara att producera saltolösliga proteiner som rekombinanta proteiner med hjälp av heterologa system(E. coli,baculovirus, jäst, etc.).
Detta protokoll kan anpassas till andra fågelägg för jämförande studier för att bättre uppskatta originaliteten hos varje art. Faktum är att PL visar vissa fågelspecifika egenskaper både strukturellt och när det gäller proteinsammansättning, sannolikt på grund av anpassning till nya miljöer men också till utvecklingsspecifikaegenskaper 2,6,9,32. Utvecklingen av detta protokoll som kräver måttlig teknikalitet och klassisk utrustning/material öppnar nya forskningsvägar inom området fågelreproduktion och speciation studier.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma mot Philippe Didier och Karine Anger (INRAE, PEAT, 37380, Nouzilly, Frankrike, https://doi.org/10.15454/1.5572326250887292E12) för att de tillhandahåller obefruktade Isa-bruna ägg. Vi tackar också University of Tours, Frankrike för att ha finansierat M. Bregeons doktorsexamen. Detta arbete fick ekonomiskt stöd från Franska nationella forskningsbyrån (EQLIPSE, ANR-19-CE21-0006).
Binocular dissecting microscope | Vision Engineering, France | Model Mantis Elite | |
Lyophilizer | Cryotec, France | Model Cosmos 80 | |
Mini-Protean II electrophoresis cell | Biorad, Hercules, USA | 1652960 | Any apparatus adapted for protein electrophoresis |
Mixer Mill MM400 | Retsch, Hann, Germany | 20.745.0001 | Mixer mill adapted for for dry, wet, and cryogenic grinding of small amounts of sample |
Ultra fine dissection scissors in stainless steel length 12 cm | Dutscher, Brumath | 5066 | |
Ultra precise tip forceps anti-magnetic stainless steel 9.5x 109.3 mm | Dutscher, Brumath | 327005 |