Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Интравитреальная инъекция и количественная оценка параметров инфекции в мышиной модели бактериального эндофтальмита

Published: February 6, 2021 doi: 10.3791/61749
Automatic Translation
*1,2, *1, 2,3, 4, 2,3, 1,2,3
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Здесь описан метод интравитреальной инъекции и последующей бактериальной количественной оценки в мышиной модели бактериального эндофтальмита. Этот протокол может быть расширен для измерения иммунных реакций хозяина и бактериальной и экспрессии генов-хозяина.

Abstract

Внутриглазные бактериальные инфекции представляют опасность для зрения. Исследователи используют модели животных для исследования принимающих и бактериальных факторов и путей иммунного ответа, связанных с инфекцией, для выявления жизнеспособных терапевтических целей и тестирования препаратов для предотвращения слепоты. Метод внутривитреальной инъекции используется для инъекций организмов, лекарств или других веществ непосредственно в стекловидную полость в задней части глаза. Здесь мы продемонстрировали этот метод инъекций, чтобы инициировать инфекцию в глазу мыши и метод количественной оценки внутриглазных бактерий. Bacillus cereus выращивался в жидком средстве инфузии сердца мозга в течение 18 часов и перерасходулся в концентрацию 100 единиц формирования колонии (CFU)/0,5 МЛ. Мышь C57BL/6J была анестезирована с помощью комбинации кетамина и ксилазина. Используя микроинжектор пиколитера и стеклянные капиллярные иглы, 0,5 мкл подвески Bacillus был введен в середине стекловидного глаза мыши. Контралатеральный контрольный глаз либо вводили стерильными средствами (хирургический контроль), либо не вводили (абсолютный контроль). В 10 часов после заражения мышей усыпляли, а глаза собирали с помощью стерильных хирургических пинцетов и помещали в трубку, содержащую стерильные PBS 400 МЛ и 1 мм стерильные стеклянные бусины. Для анализов ELISAs или миелопероксидазы в трубки был добавлен ингибитор протеиназы. Для извлечения РНК был добавлен соответствующий буфер лиза. Глаза гомогенизировались в тканевом гомогенизаторе в течение 1-2 минут. Гомогенаты были последовательно разбавлены 10 раз в PBS и трек разбавленных на агар пластин. Остальные гомогенаты хранились при -80 градусов по Цельсию для дополнительных анализов. Плиты были инкубированы в течение 24 часов и CFU на глаз был количественно. Эти методы приводят к воспроизводимым инфекциям в глазах мыши и облегчают количественную оценку жизнеспособных бактерий, иммунного ответа хозяина и омиков экспрессии генов хозяина и бактерий.

Introduction

Бактериальный эндофтальмит является разрушительной инфекцией, которая вызывает воспаление, и, если не лечить должным образом, может привести к потере зрения или слепоты. Эндофтальмит является результатом проникновения бактерий ввнутреннюю часть глаза 1,2,3,4,5. Оказавшись в глазу, бактерии размножаются, производят токсины и другие вредные факторы, и может привести к необратимым повреждениям тонких клеток сетчатки и тканей. Повреждение глаз также может быть вызвано воспалением, из-за активации воспалительных путей, ведущих к воспалительному притокуклеток в внутреннюю часть глаза 1,5,6. Эндофтальмит может возникнуть после внутриглазной хирургии (послеоперационной), проникающей травмы глаза (посттравматического), или от метастатического распространения бактерий в глаз из другого анатомического участка (эндогенного)7,8,9,10. Лечение бактериального эндофтальмита включает антибиотики, противовоспалительные препараты или хирургическоевмешательство 3,4,11. Даже с этими процедурами, зрение или сам глаз могут быть потеряны. Визуальный прогноз после бактериального эндофтальмита обычно варьируется в зависимости от эффективности лечения, остроты зрения при презентации и вирулентности инфекционного организма.

Bacillus cereus (B. cereus) является одним из основных бактериальных патогенов, который вызывает посттравматическийэндофтальмит 7,12. Большинство случаев эндофтальмита B. cereus имеют быстрый курс, который может привести к слепоте в течение нескольких дней. Отличительными чертами эндофтальмита B. cereus являются быстро развивающееся внутриглазное воспаление, боль в глазах, быстрая потеря остроты зрения и лихорадка. B. cereus быстро растет в глазу по сравнению с другими бактериями, которые обычно вызываютглазные инфекции 2,4,12 и обладает многими факторами вирулентности. Таким образом, окно для успешного терапевтическоговмешательства относительно короткое 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Лечение этой инфекции, как правило, успешно в лечении эндофтальмита, вызванного другими менее вирулентных патогенов, но B. cereus эндофтальмит обычно приводит к более чем 70% пациентов, страдающих от значительной потери зрения. Около 50% из этих пациентов проходят evisceration или enucleation инфицированногоглаза 7,16,22,23. Разрушительный и быстрый характер эндофтальмита B. cereus требует немедленного и надлежащего лечения. Недавний прогресс в различение основных механизмов развития болезни определили потенциальные цели длявмешательства 19,26,27. Экспериментальные модели мыши B. cereus эндофтальмит продолжают быть полезными в распознавании механизмов инфекции и тестирования потенциальных терапевтических средств, которые могут предотвратить потерю зрения.

Экспериментальная внутриглазная инфекция мышей с B. cereus была инструментальной моделью для понимания бактериальных и принимающих факторов, а также их взаимодействий, во время эндофтальмита28. Эта модель имитирует посттравматическое или послеоперационное событие, при котором бактерии вводятся в глаз во время травмы. Эта модель очень воспроизводится и была полезна для тестирования экспериментальной терапии и предоставления данныхдля улучшения стандарта ухода 1,6,19,29,30. Как и многие другие модели инфекции, эта модель позволяет осуществлять независимый контроль над многими параметрами инфекции и позволяет эффективно и воспроизводимое обследование исходов инфекции. Исследования в аналогичной модели у кроликов за последние несколько десятилетий изучили влияние факторов вирулентности B. cereus в глазу 2,4,13,14,31. Путем впрыскивать напряжения мутанта B. cereus нуждаясь индивидуальных или множественных факторах вирулентности, вклад этих факторов вирулентности к суровости заболевания можно измерить исходами such as концентрация бактерий на по-разному часах postinfection или потеря визуальнофункции 13,14,27,31,32. Кроме того, принимающие факторы были изучены в этой модели, заражая нокаутом штаммов мыши не хватаетконкретных воспалительных факторов хозяина 26,29,33,34,35. Модель также полезна для тестирования потенциальных методов лечения этого заболевания путем введения новых соединений в глаз послезаражения 30,36. В этой рукописи мы описываем подробный протокол, который включает в себя заражение мышеловки B. cereus,сбор глаз после инфекции, количественную оценку внутриглазной бактериальной нагрузки и сохранение образцов для анализа дополнительных параметров тяжести заболевания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры были выполнены в соответствии с рекомендациями в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных и Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии Заявление для использования животных в офтальмологических и исследования зрения. Протоколы были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Центра медицинских наук Университета Оклахомы (протокольные номера 15-103, 18-043 и 18-087).

1. Стерильные стеклянные иглы

  1. Включите шкив иглы пипетки.
  2. Отрегулируйте ручку Heater до тех пор, пока дисплей не появит 12,6.
  3. Откройте дверь и вручную кормить 5 йл капиллярной трубки через верхний зажим и обогреватель нити до половины трубки простирается ниже нити (Рисунок 1A).
  4. Подтвердите, что капиллярная трубка находится в канавке "V" в верхнем зажиме. Затяните верхний зажим.
  5. С открытым нижним зажимом вручную отрегулируйте вертикальный слайд до тех пор, пока нижний зажим не достигнет своего верхнего предела. Подтвердите, что трубка находится в пазе "V" в нижнем зажиме. Затяните нижний зажим.
  6. Закройте дверь и подтвердите, что свет «Готов». Нажмите кнопку Пуск, чтобы инициировать нагреватель и потянув последовательность(рисунок 1B).
  7. Убедитесь, что нагреватель выключается автоматически после того, как тепло и гравитация разъедеткапиллярную трубку (рисунок 1С),и слайд движется вниз.
  8. Откройте дверь. Держа верхнюю часть капиллярной трубки, разняжать верхний зажим. Снимите верхнюю капиллярную трубку и отложите ее в сторону.
  9. Держите капиллярную трубку в нижней горке и разньте нижний зажим. Удалите нижнюю капиллярную трубку и отложите ее в сторону.
  10. Используйте микроэлектрозное скошенное с 0,05 мкм глинозема абразивной шлифовальной пластины, чтобы скошенной вытащил капиллярной трубки для создания иглы инъекции.
  11. Pipette достаточно воды на шлифовальной пластине, чтобы покрыть поверхность (Рисунок 1D).
  12. Включите beveller так, чтобы он начал вращаться при 60 об/мин. Поместите вытащил капиллярной трубки в зажим пипетки в "V" паз. Затяните зажим и отрегулируйте угол зажима пипетки до 30 градусов.
  13. Отрегулируйте кончик остроконечного края капиллярной трубки примерно на две трети расстояния от центра вращения шлифовальной пластины.
  14. Опустите зажатую капиллярную трубку, регулируя грубую ручку управления в верхней части манипулятора. Продолжайте опустить капиллярную трубку до тех пор, пока кончик капиллярной трубки не опустится ниже поверхности воды и не контактирует с абразивной поверхностью шлифовальной пластины.
  15. Мониторинг скошенного прогресса с помощью микроскопа, прикрепленного к скошенной. Через 5 минут отрегулируйте тонкий контроль, чтобы поднять стеклянную иглу из шлифовальной пластины.
  16. Удалите стеклянную иглу и поместите ее под 10-х увеличение, чтобы проверить кончик капиллярной трубки(рисунок 1E,F).
  17. Чтобы убедиться, что нет завалов, вставьте стеклянную иглу в держатель пипетки на шприце и нажмите воздух в 1 мл трубки 99% этанола. Если пузырьки воздуха образуются на кончике иглы, игла не имеет завалов и может быть использована для микроинъекции. Этот процесс также обеспечивает стерильность стеклянных игл.
  18. Одна капиллярная трубка может в течение 5 йл жидкости. Отметь капиллярную трубку на 10 секций для расчета расстояний на игле для отметки в 0,5 МКЛ. Отметь шкалу с тем расстоянием, которое держит 0,5 МКЛ для будущей подготовки. Для иглы 5 йл расстояния на расстоянии 0,7 мм друг от друга приравниваются к 0,5 МКЛ(рисунок 1G).

2. Культура Bacillus cereus

  1. Выполните все процедуры в этом разделе в условиях Biosafety Level 2.
  2. Полоса морозильник запас B. cereus ATCC 14579 для одной колонии изоляции на 5% овец крови агар пластины и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию (Рисунок 2A).
  3. Pipette 5 мл стерильного мозга инфузии сердца (BHI) бульон в 10 мл стерильных оснастки колпачок трубки(рисунок 2B). Используя стерильную петлю или иглу, выберите одну колонию B. cereus ATCC 14579 из агарной пластины и прививки жидкости BHI.
  4. Кратко провокеть образец. Поместите трубку оснастки в вращающийся инкубатор. Установите температуру на уровне 37 градусов по Цельсию и скорость на 200 об/мин. После 18 ч, удалить культуру из инкубатора(рисунок 2B).

3. Бактериальное разбавление для интравитреальной инъекции

  1. Выполните все процедуры в этом разделе в условиях Biosafety Level 2.
  2. Рассчитайте объем ночной культуры B. cereus, чтобы добавить к 10 мл свежего BHI для достижения 200 единиц формирования колонии на микролитер (CFU/L). Например, ночная культура B. cereus в BHI размножается примерно до 2 х 108 CFU/mL, которые затем могут быть разбавлены до 200 CFU/L путем трубопроводирования 10 МКЛ ночной культуры в 10 мл свежего BHI.
  3. Pipette 1 мл свежеотбавленной культуры в 1,5 мл микроцентрифуг трубки. Поддерживайте эту трубку на льду до интравитреальной инъекции. Выполните внутривитреальную инъекцию в течение 60 минут после разбавления бактериальной культуры.

4. Мышь интравитреальной инъекции

  1. Выполните все процедуры в этом разделе в условиях Biosafety Level 2.
  2. Подготовьте место процедуры, поместив медицинские подпада на операционный стол.
  3. Включите микроинъектор и откройте газовый клапан на сжатом воздушном баке, прикрепленном к микроинъектору. Отрегулируйте регулятор бака до тех пор пока поставка газа не будет приблизительно 60 psi.
  4. На микроинъекторе нажмите Режим до тех пор, пока на экране не будет показан баланс. Нажмите баланс и поместите компьютерную мышь на операционный стол. Подключите держатель пипетки из нержавеющей стали к трубе, прикрепленной к 'Fill/Output' инжектора. Эта трубка всегда подключена к инжектору.
  5. Вставьте капиллярную иглу на другой конец держателя пипетки, привинчивая плотный разъем держателя пипетки вокруг иглы.
  6. Включите офтальмологический микроскоп и включите его свет на 50%. Отрегулируйте микроскоп над местом процедуры на операционном столе и отрегулируйте микроскоп к нужному фокусу.
  7. Перед началом процедуры подтвердите, что мышь адекватно анестезируется, проверяя рефлекс снятия педали. Не забудьте следовать утвержденного IACUC протокола для анестезии.
  8. Поместите анестезировалую мышь на медицинские подпада с носом указал на правую и опираясь на левую сторону.
  9. Посмотрите на правый глаз мыши через офтальмологический микроскоп и откройте крышки, открыв щипцы обратного действия щипцы по обе стороны от глаза, чтобы разоблачить место инъекции (Рисунок 3C).
  10. Заполните капиллярной иглой с разбавлением 200 CFU/L левой нажатием коврика мыши, подключенного к микроинъектору(рисунок 3D).
  11. Закрепим голову животного левой рукой и поместите кончик иглы на лимбус глаза. С помощью иглы в положении скошенного и под углом 45 градусов проткните глаз мыши, но убедитесь, что при введении вставляется только острый кончик иглы (0,5 мм).
  12. После вставки кончика иглы перемести левую руку с головы мыши на коврик для мыши и нажмите правой кнопкой мыши на коврик для введения 0,5 мл разбавления B. cereus. Чтобы предотвратить утечку, оставьте кончик иглы внутри мышиного глаза на 2-3 секунды передудалением (рисунок 3E)1,19,26,27,32,34,36,37,38.
  13. Отпустите типсы и поместите мышь в клетку, которая сидит на греящую площадку. Мониторинг этих мышей, пока они не оправились от анестезии (Рисунок 3F).
  14. Как только мыши выздоравливают от анестезии, верните клетку в правильную стойку. Если мыши будут подвергнуты анализу функции сетчатки с помощью электроретинографии, клетки должны быть возвращены в темную комнату для надлежащей темной адаптации.

5. Подготовка к сбору трубки

  1. Поместите 1 мм стерильные стеклянные бусины в 1,5 мл винт крышки труб.
  2. Стерилизовать эти трубки в автоклаве на сухой обстановке. Пусть трубы остыть до комнатной температуры перед использованием.
  3. Добавьте 10 мл 1x стерильного фосфатно-буферного солевого раствора (PBS) в стерильную центрифугу 15 мл.
  4. Добавьте в трубку 1 таблетку таблетки для ингибитора протеазы. Смешайте вихрем19,27,29,34,35.
  5. Pipette 400 йл 1x фосфат-буферного солевого раствора (PBS), содержащего ингибитор протеазы в каждой автоклавной трубки сбора урожая. Этикетка труб и место на льду. (Рисунок 4A).

6. Сбор глаз

  1. Выполните все процедуры в этом разделе в условиях Biosafety Level 2.
  2. Усытворяйте мышь при вдыхании CO2. Используйте вторичный метод для подтверждения эвтаназии.
  3. Держите усыпляемую голову мыши в безопасности и откройте тонкие щипцы кончика по обе стороны от инфицированного глаза. Нажмите вниз к голове, чтобы опора глаза. После того, как щипцы находятся за глобусом глаза, сжать щипцы вместе. Вытяните типсы от головы, чтобы отделить глазное яблоко (Рисунок 4B).
  4. Немедленно поместите глазное яблоко в помеченную трубку для сбора урожая. Поместите трубки на лед не более 60 мин(рисунок 4C).

7. Внутриглазное количество бактерий

  1. Выполните все процедуры в этом разделе в условиях Biosafety Level 2.
  2. Подтвердите, что все трубы сбора урожая плотно закрыты и сбалансированы в то время как в ткани гомогенизатора(рисунок 5A). Включите гомогенизатор тканей в течение 1 мин, чтобы гомогенизировать образцы. Подождите 30 с, а затем включите еще минуту. Поместите трубки на лед(рисунок 5B,C).
  3. Серийно разбавляют каждый образец в 10 раз, последовательно передавая 20 МКЛ гомогената в 180 МКЛ стерильного 1x PBS. Разбавлять до тех пор, покафактор 10 -7 не будет достигнут(рисунок 5D).
  4. Этикетка каждого ряда теплой, квадратной пластины BHI с надлежащими факторами разбавления. Передача 10 йл каждого разбавления подряд на верхнюю пластину BHI, которая наклонена примерно на 45 градусов. Пусть образец работать, пока он почти не достигнет нижней части пластины, а затем заложить пластину плоской (Рисунок 5E)39.
  5. Когда образец всасывается в агар BHI, перенесите пластину в инкубатор с 37 градусами Цельсия. Колонии должны начать быть видимыми 8 ч после того, как помещены в инкубатор.
  6. Удалите пластину из инкубатора до роста колоний B. cereus мешает выявлению отдельных колоний(рисунок 5F).
  7. Для точного представления концентрации в выборке подсчитайте строку, которая имеет между 10-100 колониями. Например, строка с разбавленной фракцией 10-4, которая имеет 45 колоний, будет иметь концентрацию 4,5 х 105 CFU/mL.
  8. Чтобы вычислить общее количество бактерий на глаз, умножьте концентрацию на 0,4, что представляет собой миллилитр объем 1x PBS используется для гомогенизации глаза. Например, концентрация 4,5 х10 5 CFU/mL будет переводиться в 1,8 х 105 CFU B. cereus на глаз.

8. Сохранение образцов

  1. Поместите образцы гомогената в помеченную морозильную коробку и поместите эту коробку в морозильную камеру -80 градусов по Цельсию. Эти образцы могут быть использованы позже для воспалительного анализа посредника ELISA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Создание воспроизводимой инокулы и точность процедуры внутривитреальной инъекции являются ключевыми шагами в разработке моделей микробного эндофтальмита. Здесь мы продемонстрировали процедуру внутривитреальной инъекции с помощью Грам-положительного Bacillus cereus. Мы ввели 100 CFU/0,5 МЛ B. cereus в середине стекловидного пяти мышей C57BL6. После 10 h постинфекции, мы наблюдали внутриглазный рост B. cereus примерно до 1,8 х 105 CFU/глаз. Рисунок 1 демонстрирует конструкцию стеклянных игл для доставки бактерий в середине глаза мыши. Bacillus cereus, растущий на пластине агара крови и в культурных трубках, показан на рисунке 2. На рисунке 3 показана процедура внутривитреальной инъекции мыши с помощью системы впрыска под давлением воздуха. Рисунок 4 демонстрирует процесс сбора инфицированных глаз после желаемого времени после заражения. На рисунке 5 показана методика гомогенизации инфицированных глаз. Рисунок 6 демонстрирует внутриглазные бактериальные отсчеты от пяти различных глаз мыши при 10 h постинфекции. На рисунке 7 изображена общая процедура и графическое представление интравитреальной инъекции мыши.

Figure 1
Рисунок 1: Изготовление скошенных стеклянных игл. Стеклянные иглы были сделаны из одноразовых микрокапильярных пипеток с помощью иглы/ пипетки шкив и микропипец beveler. (A) Зажатая стеклянная капиллярная трубка в игле/пипетке. (B,C) Создание стеклянных игл с использованием желаемого напряжения. (D)Сеяние стеклянных микропипет. (E,F) Стеклянные микропипюты до и после скошения. (E)Масштабирование стеклянных игл. Пространство между двумя черными точками имеет 0,5 млрд. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Bacillus cereus ATCC 14579. (A) Bacillus cereus растет на пластине агара крови. Отдельные колонии B. cereus обычно отображают четкие зоны гемолизиса на агарной пластине крови. (B)Мутные ночные культуры B. cereus. (C)Грам-окрашивание B. cereus. B. cereus - это грамположительных стержневидных бактерий. (D) Электронный микрограф Bacillus cereus. Этот электронный микрограф показывает стержень формы Bacillus cereus с волосами, как структуры, называемые flagella. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Мышь интравитреальной инъекции. Процедура инъекции выполняется с помощью инжектора под давлением с просмотром операционного поля с помощью коммерческого микроскопа(A)кетамина и ксилазина препарата для обезболивать мышь. (B) Введение кетамина и ксилазина путем внутриперитонеальной инъекции для анестезии мыши. (C)Зажим периокулярной кожи обратно, чтобы опора глаза. (D) Заполнение иглы с бактериями с помощью воздуха под давлением инжектора. (E)Интравитреальная инъекция. (F)Мониторинг инфицированных мышей после анестезии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Сбор мыши инфицированных глаз. После заражения, после желаемой точки времени, урожай инфицированных глаз мыши с помощью стерильных пинцетом. (A)PBS, содержащий стерильные стеклянные бусы. (B)Сбор зараженного глаза. (C)Урожай трубки, содержащей мышиный глаз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Обработка собранного глаза для внутриглазного бактериального подсчета. (A)Урожай трубки с инфицированным глазом плотно зажаты в ткани гомогенизатора. (B) Зараженные глаза были гомогенизированы дважды в течение 1 мин каждый. Отслеживайтеразбавление (D)гомогенатовглаз (C)и последующее покрытие(E)для бактериальной количественной оценки. (E) Представитель отдельных Bacillus cereus колонии после отслеживания разбавления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Внутриглазные бактериальные рассчитывает на 10 ч послеинфекции. М, номер мыши. CFU, колонии формирования подразделений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Мышь интравитреальной инъекции. (A)Общий потокчарт мыши интравитреальной процедуры инъекции. (B)Графическое представление интравитреальной инъекции. Во время процедуры стерильные, скошенные стеклянные иглы, содержащие культуру B. cereus, вставляются в середину глаза мыши, а B. cereus доставляются с помощью системы микроинъекции под давлением воздуха. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Даже при наличии мощных антибиотиков, противовоспалительных препаратов и витректомии, бактериальный эндофтальмит может ослепить пациента. Клинические исследования были полезны в изучении эндофтальмита; однако экспериментальные модели эндофтальмита обеспечивают быстрые и воспроизводимые результаты, которые могут быть переведены на прогресс в стандарте ухода, что приводит к улучшению визуального результата для пациентов.

Стекловидного объема мышиного глаза составляет примерно 7 йл40. Этот небольшой объем позволяет вводить лишь ограниченное количество материала. Объемы, более 1,0 МЛ, не следует вводить, чтобы избежать повреждения глаз. Этот процесс требует специального оборудования и практики методов для обеспечения воспроизводимости и точности. Эндофтальмит был изучен у приматов, свиней, кроликов, крыс, морскихсвинок и в мыши 28,41,42,43,44,45. Среди крупных видов, глаза гораздо ближе по размеру к человеческим глазам, и интравитреальные инъекции в большие глаза могут быть выполнены без специального оборудования. За исключением мыши, отсутствие штаммов нокаута и реагентов для изучения иммунных реакций хозяина в других моделях животных ограничивает их полезность при экспериментальном эндофтальмите.

Эндофтальмит встречается чаще всего как осложнение хирургии катаракты. Эта инфекция может также произойти после проникающей глазной травмы или системной инфекции. Визуальный исход этого заболевания отчасти зависит от вирулентности инфекционного патогена. У мышей, визуальный результат также зависит от их иммунного статуса. Понимание механизмов патогенеза болезни было облегчено путем изучения болезни в экспериментальных животныхмоделях 28. Протокол для интравитреальной инъекции мыши и количественной оценки параметров инфекции могут быть адаптированы для изучения эндофтальмита, начатого практически с любым типом бактериального или грибковогопатогена 28. Кроме того, этот протокол также может быть применен и изменен для изучения анатомических изменений, воспалительных процессов и профилей экспрессии генов как бактерий, так и хозяина во время инфекции.

Интравитреальная инъекция мыши и последующий анализ параметров инфекции состоят из нескольких критических шагов(рисунок 7). Стеклянная игла должна быть точно создана, отмечена и стерилизована. Острый конец скошенной стеклянной иглы и правильное масштабирование определяет адекватную доставку бактерий и прокол земного шара. Если конец иглы короткий и не является надлежащим скошенным, это может создать большое отверстие на земном шаре, которое может привести к утечке, загрязнению земного шара и неточному исходу болезни. Поэтому рекомендуется наблюдать стеклянные микропипеты при скошении под 10-х оптическим зумом яркого полевого микроскопа. Для обеспечения доставки правильного количества бактерий, разбавления должны быть рассчитаны заранее, и надлежащая шкала громкости должна быть отмечена на стеклянной игле. Параметры для вытягивания иглы и скошения с использованием других типов оборудования могут варьироваться.

Описанный метод внутривитреальной инъекции использует систему микроинъектора под давлением воздуха для правильной доставки бактерий в глаз мыши1. Надлежащее использование этого микроинъектора имеет решающее значение для воспроизводимых параметров инфекции. Поскольку давление воздуха определяет скорость доставки, чрезмерная сила может быстро вводить больший объем в глаза, вызывая чрезмерное внутриглазное давление и/или разрыв земного шара. Таким образом, рекомендация заключается в использовании давления 10-13 пси для заполнения и введения во время процедуры. Другой потенциальной проблемой является утечка бактериального раствора из стеклянных игл после заполнения. Утечка может привести к инъекции неточных объемов в глаза мыши. Всегда проверяйте связи между системой инъекций, трубками и стеклянными иглами перед инъекциями.

Инъекция точных количеств бактерий имеет жизненно важное значение для воспроизводимости экспериментального бактериального эндофтальмита. Различные экспериментальные модели эндофтальмита требуют прививкиопределенного количества бактерий 12,28,46,47,48,49. Для B. cereus эндофтальмит, инъекционные 100 CFU необходимо инициировать воспроизводимую инфекцию1. Поскольку рост бактерий зависит от среды роста и условий, среда роста, средства массовой информации и разбавления должны повторяться каждый раз. Поэтому перед экспериментом рекомендуется проверить культурные условия, чтобы воспроизвести точный инокулум в соответствующем объеме для инъекций. Как отмечалось выше, верхний предел для интравитреальной инъекции в глаза мыши составляет 1,0йл 28. Чрезмерный объем повышает внутриглазное давление, которое может привести к глаукоме, отделить сетчатку от заднего сегмента или разорвать глобус. Интравитреальная инъекция и полученная инфекция у мышей не могут идеально имитировать эндофтальмит B. cereus у человека. Большинство животных моделей болезней человека ограничены таким образом. Известные количества B. cereus вводят в глаз после роста в богатых питательными веществами средств массовой информации. В клинических случаях эндофтальмита B. cereus, инфекционные количества не известны и источники загрязнения различаются. Однако преимущества использования характерных организмов и штаммов мышей и генерации воспроизводимых инфекционных курсов перевешивают эти ограничения.

Правильный сбор инфицированных глаз является еще одним важным шагом. Поддержание асептических условий имеет важное значение для того, чтобы избежать перекрестного загрязнения, которое может помешать интерпретации данных. Поэтому рекомендуется дезинфицировать рабочую скамью и все приборы 70% этанола перед сбором урожая. Бактериальные номера быстро увеличиваются внутри стекловидной среды во время инфекции, которая может вызвать отек глаза. Поэтому следует позаботиться о том, чтобы аккуратно удалить глаз во время уборки урожая предотвратить разрыв земного шара. Кроме того, крышка трубки сбора урожая, содержащая инфицированный глаз, должна быть адекватно ужесточена перед размещением трубки в гомогенизаторе тканей. Свободная крышка приведет к утечке и загрязнению однородности тканей, что приведет к неточной количественной оценке бактерий в протекающих трубках. Процедура гомогенизации глаз также повышает температуру труб. Поэтому рекомендуется гомогенизировать по 1 минуте за раз. Повышенные температуры могут повлиять на количественную оценку некоторых параметров инфекции. Хотя этот метод не обеспечивает количество бактерий в определенных местах глаза, в сочетании с гистологическими методами, мы можем оценить, где бактерии могут быть локализованы. Локализация B. cereus в глазу во время эндофтальмита была зарегистрирована у кроликов, чьи глаза больше и легче вскрыть в подкомпартии. 2 М.В.

Интравитреальная инъекция имитирует доставку организмов в задний сегмент глаза, который инициирует инфекцию. Этот первый шаг облегчает качественное и количественное изучение параметров инфекции в высоко воспроизводимой мышиной модели экспериментального эндофтальмита. Эти модели также используются для оценки воспаления глаз путем количественной оценки миелопероксидазы в проникновении нейтрофилов, выявление конкретных типов клеток по цитометрии потока, количественно цитокинов и хемокиных в режиме реального времени ПЦР и / или ELISA, и наблюдения глазнойархитектуры гистопатологии 1,6,19,20,26,27,34,35. Зараженные глаза мыши собирают с различными разминочных в зависимости от типа параметров инфекции, которые будут измерены. Для анализа экспрессии генов требуется другой буфер лиза26. Для гистопатологического обследования собранные глаза помещаются в фиксаторный раствор. Множество генетических мышей нокаутом также облегчает изучение роли различных иммунных факторов и клеток. Интравитреальная инъекция, таким образом, является основой метода для исследователей в области внутриглазных инфекций и терапевтических средств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет финансовых конфликтов для раскрытия.

Acknowledgments

Авторы благодарят д-р Фэн Ли и Марк Диттмар (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Дин А. МакГи глаз институт, Оклахома-Сити, OK, США) за их помощь. Наше исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения гранты R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947, и R01EY024140. Наше исследование также было поддержано P30EY21725 (грант NIH CORE для живой визуализации и анализа животных, молекулярной биологии и клеточной визуализации). Наши исследования также были поддержаны NEI Vision Science Pre-докторской программы стажера 5T32EY023202, пресвитерианского фонда здравоохранения научно-исследовательской поддержки гранта, а также неограниченный грант декан а. МакГи глаз института исследований для предотвращения слепоты.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-20 µL pipette RANIN L0696003G NA
37oC Incubator Fisher Scientific 11-690-625D NA
Bacto Brain Heart Infusion BD 90003-032 NA
Cell Microinjector MicroData Instrument, Inc. PM2000 NA
Fine tip forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-122 NA
Glass beads 1.0 mm BioSpec 11079110 NA
Incubator Shaker New Brunswick Scientific NB-I2400 NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters Kimble 71900-5 NA
Micro-Pipette Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 NA
Microscope Axiostar Plus Zeiss NA
Microscope OPMI Lumera Zeiss NA
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 NA
Multichannel pipette 30-300 µL Biohit 15626090 NA
Multichannel pipette 5-100 µL Biohit 9143724 NA
Needle/Pipette Puller Kopf 730 NA
PBS GIBCO 1897315 Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Molecular grade
Reverse action forceps Katena K5-8228 NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
  2. Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Pathogenesis of gram-positive bacterial endophthalmitis. Infection and Immunity. 67 (7), 3348-3356 (1999).
  3. Durand, M. L. Bacterial and Fungal Endophthalmitis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (3), 597-613 (2017).
  4. Callegan, M. C., Engelbert, M., Parke, D. W., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Bacterial endophthalmitis: Epidemiology, therapeutics, and bacterium-host interactions. Clinical Microbiology Reviews. 15 (1), 111-124 (2002).
  5. Livingston, E. T., Mursalin, M. H., Callegan, M. C. A Pyrrhic Victory: The PMN Response to Ocular Bacterial Infections. Microorganisms. 7 (11), 537 (2019).
  6. Ramadan, R. T., Moyer, A. L., Callegan, M. C. A role for tumor necrosis factor-alpha in experimental Bacillus cereus endophthalmitis pathogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (10), 4482-4489 (2008).
  7. Davey, R. T., Tauber, W. B. Posttraumatic endophthalmitis: The emerging role of Bacillus cereus infection. Reviews of Infectious Dissease. 9 (1), 110-123 (1987).
  8. Ramappa, M., et al. An outbreak of acute post-cataract surgery Pseudomonas sp. endophthalmitis caused by contaminated hydrophilic intraocular lens solution. Ophthalmology. 119 (3), 564-570 (2012).
  9. Coburn, P. S., et al. Bloodstream-To-Eye Infections Are Facilitated by Outer Blood-Retinal Barrier Dysfunction. PLoS One. 11 (5), 015560 (2016).
  10. Ness, T., Pelz, K., Hansen, L. L. Endogenous endophthalmitis: Microorganisms, disposition and prognosis. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (8), 852-856 (2007).
  11. Novosad, B. D., Callegan, M. C. Severe bacterial endophthalmitis: Towards improving clinical outcomes. Expert Review of Ophthalmology. 5 (5), 689-698 (2010).
  12. Mursalin, M. H., Livingston, E. T., Callegan, M. C. The cereus matter of Bacillus endophthalmitis. Experimental Eye Research. 193, 107959 (2020).
  13. Callegan, M. C., et al. Relationship of plcR-regulated factors to Bacillus endophthalmitis virulence. Infection and Immunity. 71 (6), 3116-3124 (2003).
  14. Beecher, D. J., Pulido, J. S., Barney, N. P., Wong, A. C. Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: Methods and implication of involvement of hemolysin BL. Infection and Immunity. 63 (2), 632-639 (1995).
  15. Callegan, M. C., et al. Contribution of membrane-damaging toxins to Bacillus endophthalmitis pathogenesis. Infection and Immunity. 70 (10), 5381-5389 (2002).
  16. Cowan, C. L. Jr, Madden, W. M., Hatem, G. F., Merritt, J. C. Endogenous Bacillus cereus panophthalmitis. Annals of Ophthalmology. 19 (2), 65-68 (1987).
  17. Callegan, M. C., et al. Virulence factor profiles and antimicrobial susceptibilities of ocular Bacillus isolates. Current Eye Research. 31 (9), 693-702 (2006).
  18. Callegan, M. C., et al. Bacillus endophthalmitis: Roles of bacterial toxins and motility during infection. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3233-3238 (2005).
  19. Mursalin, M. H. Bacillus S-layer-mediated innate interactions during endophthalmitis. Frontiers in Immunology. 11 (215), (2020).
  20. Moyer, A. L., Ramadan, R. T., Novosad, B. D., Astley, R., Callegan, M. C. Bacillus cereus-induced permeability of the blood-ocular barrier during experimental endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3783-3793 (2009).
  21. Callegan, M. C., et al. Efficacy of vitrectomy in improving the outcome of Bacillus cereus endophthalmitis. Retina. 31 (8), 1518-1524 (2011).
  22. David, D. B., Kirkby, G. R., Noble, B. A. Bacillus cereus endophthalmitis. British Journal of Ophthalmology. 78 (7), 577-580 (1994).
  23. Vahey, J. B., Flynn, H. W. Jr Results in the management of Bacillus endophthalmitis. Ophthalmic Surgery. 22 (11), 681-686 (1991).
  24. Wiskur, B. J., Robinson, M. L., Farrand, A. J., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Toward improving therapeutic regimens for Bacillus endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (4), 1480-1487 (2008).
  25. Alfaro, D. V., et al. Experimental Bacillus cereus post-traumatic endophthalmitis and treatment with ciprofloxacin. British Journal of Ophthalmology. 80 (8), 755-758 (1996).
  26. Coburn, P. S., et al. TLR4 modulates inflammatory gene targets in the retina during Bacillus cereus endophthalmitis. BMC Ophthalmology. 18 (1), 96 (2018).
  27. Mursalin, M. H., et al. S-layer Impacts the Virulence of Bacillus in Endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (12), 3727-3739 (2019).
  28. Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
  29. Parkunan, S. M., et al. CXCL1, but not IL-6, significantly impacts intraocular inflammation during infection. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1125-1134 (2016).
  30. LaGrow, A. L., et al. A Novel Biomimetic Nanosponge Protects the Retina from the Enterococcus faecalis Cytolysin. mSphere. 2 (6), 00335 (2017).
  31. Beecher, D. J., Olsen, T. W., Somers, E. B., Wong, A. C. Evidence for contribution of tripartite hemolysin BL, phosphatidylcholine-preferring phospholipase C, and collagenase to virulence of Bacillus cereus endophthalmitis. Infection and Immunity. 68 (9), 5269-5276 (2000).
  32. Callegan, M. C., et al. The role of pili in Bacillus cereus intraocular infection. Experimental Eye Research. 159, 69-76 (2017).
  33. Miller, F. C., et al. Targets of immunomodulation in bacterial endophthalmitis. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100763 (2019).
  34. Parkunan, S. M., Astley, R., Callegan, M. C. Role of TLR5 and flagella in Bacillus intraocular infection. PLoS One. 9 (6), 100543 (2014).
  35. Parkunan, S. M., et al. Unexpected roles for Toll-Like receptor 4 and TRIF in intraocular infection with Gram-positive bacteria. Infection and Immunity. 83 (10), 3926-3936 (2015).
  36. Coburn, P. S., et al. Disarming Pore-Forming Toxins with Biomimetic Nanosponges in Intraocular Infections. mSphere. 4 (3), 00262-00319 (2019).
  37. LaGrow, A., et al. Biomimetic nanosponges augment gatifloxacin in reducing retinal damage during experimental MRSA endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (9), 4632 (2019).
  38. Novosad, B. D., Astley, R. A., Callegan, M. C. Role of Toll-like receptor (TLR) 2 in experimental Bacillus cereus endophthalmitis. PLoS One. 6 (12), 28619 (2011).
  39. Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
  40. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution in the mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (3), 1109-1112 (2006).
  41. Beyer, T. L., O'Donnell, F. E., Goncalves, V., Singh, R. Role of the posterior capsule in the prevention of postoperative bacterial endophthalmitis: experimental primate studies and clinical implications. British Journal of Ophthalmology. 69 (11), 841-846 (1985).
  42. Tucker, D. N., Forster, R. K. Experimental bacterial endophthalmitis. Archives of Ophthalmology. 88 (6), 647-649 (1972).
  43. Alfaro, D. V., et al. Experimental pseudomonal posttraumatic endophthalmitis in a swine model. Treatment with ceftazidime, amikacin, and imipenem. Retina. 17 (2), 139-145 (1997).
  44. Silverstein, A. M., Zimmerman, L. E. Immunogenic endophthalmitis produced in the guinea pig by different pathogenetic mechanisms. American Journal of Ophthalmology. 48 (5), 435-447 (1959).
  45. Ravindranath, R. M., Hasan, S. A., Mondino, B. J. Immunopathologic features of Staphylococcus epidermidis-induced endophthalmitis in the rat. Current Eye Research. 16 (10), 1036-1043 (1997).
  46. Kumar, A., Singh, C. N., Glybina, I. V., Mahmoud, T. H., Yu, F. S. Toll-like receptor 2 ligand-induced protection against bacterial endophthalmitis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 255-263 (2010).
  47. Mylonakis, E., et al. The Enterococcus faecalis fsrB gene, a key component of the fsr quorum-sensing system, is associated with virulence in the rabbit endophthalmitis model. Infection and Immunity. 70 (8), 4678-4681 (2002).
  48. Sanders, M. E., et al. The Streptococcus pneumoniae capsule is required for full virulence in pneumococcal endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 865-872 (2011).
  49. Hunt, J. J., Astley, R., Wheatley, N., Wang, J. T., Callegan, M. C. TLR4 contributes to the host response to Klebsiella intraocular infection. Current Eye Research. 39 (8), 790-802 (2014).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 168 бактериальная глазная инфекция внутриглазная бактериальная квантификация параметры глазной инфекции интравитреальная инъекция внутриглазная инъекция эндофтальмит
Интравитреальная инъекция и количественная оценка параметров инфекции в мышиной модели бактериального эндофтальмита
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mursalin, M. H., Livingston, E.,… More

Mursalin, M. H., Livingston, E., Coburn, P. S., Miller, F. C., Astley, R., Callegan, M. C. Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis. J. Vis. Exp. (168), e61749, doi:10.3791/61749 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter