Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bakteriyel Endoftalmitin Fare Modelinde İntravitreal Enjeksiyon ve Enfeksiyon Parametrelerinin Niceliği

Published: February 6, 2021 doi: 10.3791/61749
Automatic Translation
*1,2, *1, 2,3, 4, 2,3, 1,2,3
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Burada bakteriyel endoftalmitin fare modelinde intravitreal enjeksiyon ve sonraki bakteriyel nicel bir yöntem tanımladık. Bu protokol, konak bağışıklık yanıtlarını ve bakteriyel ve konak gen ekspresyonunu ölçmek için genişletilebilir.

Abstract

Göz içi bakteriyel enfeksiyonlar görme için bir tehlike vardır. Araştırmacılar, uygun terapötik hedefleri belirlemek ve körlüğü önlemek için ilaçları test etmek için, konak ve bakteriyel faktörleri ve enfeksiyonla ilişkili bağışıklık yanıt yollarını araştırmak için hayvan modellerini kullanırlar. Intravitreal enjeksiyon tekniği organizmalar, ilaçlar veya diğer maddeler doğrudan gözün arka segmentinde vitreus kavite içine enjekte etmek için kullanılır. Burada, fare gözüne enfeksiyonu başlatmak için bu enjeksiyon tekniğini ve göz içi bakterileri ölçme tekniğini gösterdik. Bacillus cereus beyin kalp infüzyon sıvı ortamda 18 saat boyunca büyüdü ve bir konsantrasyon 100 koloni oluşturan birimleri (CFU)/0.5 μL için yeniden askıya alındı. Bir C57BL/6J fare ketamin ve ksilazin kombinasyonu kullanılarak anestezi edildi. Pikolitre mikroenjektör ve cam kılcal iğneler kullanılarak Fare gözünün orta vitreusuna Bacillus süspansiyonunun 0.5°L'si enjekte edildi. Kontralateral kontrol gözüne steril ortam (cerrahi kontrol) enjekte edildi ya da enjekte edilmedi (mutlak kontrol). Enfeksiyon sonrası 10 saat fareler ötenazi yapıldı ve gözler steril cerrahi cımbız kullanılarak hasat edildi ve 400 μL steril PBS ve 1 mm steril cam boncuk içeren bir tüpiçine yerleştirildi. ELISA veya miyeloperoksidaz tahlilleri için tüplere proteinaz inhibitörü eklenmiştir. RNA ekstraksiyonu için uygun lisis arabelleği eklendi. Gözler bir doku homogenizer 1-2 dakika homojenize edildi. Homojenatlar PBS'de 10 kat seri olarak seyreltildi ve agar plakaları üzerine seyreltildi. Homojenlerin geri kalanı ek tahliller için -80 °C'de saklandı. Plakalar 24 saat boyunca kuluçkaya yatırıldı ve göz başına CFU ölçüldü. Bu teknikler fare gözlerinde tekrarlanabilir enfeksiyonlara neden olur ve canlı bakterilerin nicelliğini kolaylaştırır, konak immün yanıt, konak ve bakteriyel gen ekspresyonunun omikleri.

Introduction

Bakteriyel endoftalmit inflamasyona neden olan yıkıcı bir enfeksiyondur, ve, düzgün tedavi edilmezse, görme veya körlük kaybına neden olabilir. Endophthalmitis göz iç içine bakteri girişi sonuçları1,2,3,4,5. Bir kez göz, bakteri çoğaltmak, toksinler ve diğer zararlı faktörler üretmek, ve hassas retina hücreleri ve dokularda geri dönüşümsüz hasara neden olabilir. Göz hasarı da inflamasyon neden olabilir, göz iç içine inflamatuar hücre akını yol açan inflamatuar yolların aktivasyonu nedeniyle1,5,6. Endophthalmitis göz içi cerrahisi (post-operatif), göz (post-travmatik) bir delici yaralanma, ya da farklı bir anatomik siteden göze bakterilerin metastatik yayılması (endojen)7,8,9,10aşağıdaki oluşabilir. Bakteriyel endoftalmit için tedaviler antibiyotikler içerir, anti-inflamatuar ilaçlar, veya cerrahi müdahale3,4,11. Bu tedaviler bile, görme veya göz kendisi kaybolabilir. Bakteriyel endoftalmit sonrası görsel prognoz genellikle tedavi nin etkinliğine, sunumdaki görme keskinliğine ve enfekte organizmanın virülansına bağlı olarak değişir.

Bacillus cereus (B. cereus)travma sonrası endoftalmit 7,12neden olan başlıca bakteriyel patojenlerden biridir. B. cereus endophthalmitis olgularının çoğunda hızlı bir seyir izlenir ve bu da birkaç gün içinde körlüğe neden olabilir. B. cereus endophthalmitis özellikleri hızla gelişen göz içi iltihabı, göz ağrısı, görme keskinliği hızlı kaybı, ve ateş içerir. B. sereus yaygın göz enfeksiyonları 2 neden diğer bakterilere göre gözde hızla büyür2,4,12 ve birçok virülans faktörleri sahip. Bu nedenle, başarılı terapötik müdahale için pencere nispeten kısa1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Bu enfeksiyon için tedaviler genellikle diğer daha az öldürücü patojenlerin neden olduğu endophthalmitis tedavisinde başarılı, ancak B. cereus endophthalmitis genellikle önemli görme kaybı muzdarip hastaların% 70'inden fazla sonuçlanır. Buhastaların yaklaşık% 50 enfekte göz7,16,22,23evisceration veya enükleasyon geçmesi . B. cereus endophthalmitis yıkıcı ve hızlı doğası acil ve uygun tedavi için çağırır. Hastalık gelişiminin altında yatan mekanizmaların ayırt son ilerleme müdahale için potansiyel hedefler tespit ettik19,26,27. B. cereus endophthalmitis deneysel fare modelleri enfeksiyon mekanizmaları ayırt ve görme kaybını önleyebilir potansiyel terapötik test yararlı olmaya devam etmektedir.

B. cereus ile farelerin deneysel göz içi enfeksiyonu bakteriyel ve konak faktörleri anlamak için araçsal bir model olmuştur, yanı sıra etkileşimleri, endoftalmit sırasında28. Bu model, bir yaralanma sırasında bakterilerin göze sokulan post-travmatik veya postoperatif bir olayı taklit eder. Bu model son derece tekrarlanabilir ve deneysel tedavilertest etmek ve bakım standart iyileştirmeler için veri sağlamak için yararlı olmuştur1,6,19,29,30. Diğer birçok enfeksiyon modeli gibi, bu model enfeksiyon birçok parametre bağımsız kontrol sağlar ve enfeksiyon sonuçlarının verimli ve tekrarlanabilir incelenmesini sağlar. Son birkaç on yıl içinde tavşan benzer bir model çalışmaları gözde B. cereus virülans faktörlerin etkilerini inceledik2,4,13,14,31. B. cereus mutant suşları bireysel veya birden fazla virülans faktörleri eksik enjekte ederek, hastalık şiddetine bu virülans faktörlerin katkısı postenfeksiyon farklı saatlerde bakteri konsantrasyonu veya görsel fonksiyon kaybı13,14,27,31,32gibi sonuçlar ile ölçülebilir. Buna ek olarak, host faktörler belirli inflamatuar konak faktörleri26,29,33,34,35eksik nakavt fare suşları enfekte tarafından bu modelde incelenmiştir . Model aynı zamanda enfeksiyon dan sonra göze yeni bileşikler enjekte ederek bu hastalık için potansiyel tedavileri test etmek için yararlıdır30,36. Bu yazıda, bir fare gözünü B. cereusile enfekte etmeyi, enfeksiyon sonrası gözü niçin hasat etmeyi, göz içi bakteri yükünü nisbeten ölçmeyi ve hastalığın şiddetinin ek parametrelerini test etmek için numunelerin korunmasını içeren ayrıntılı bir protokolü açıklıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm işlemler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi ile Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği'nin Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin Bildirim'deki tavsiyelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokoller Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (protokol numaraları 15-103, 18-043 ve 18-087) tarafından onaylanmıştır.

1. Steril cam iğneler

  1. İğne pipetçekmecesini açın.
  2. Isıtıcı tonuzunu ekran 12,6 gösterene kadar ayarlayın.
  3. Kapıyı açın ve 5 μL'lik kılcal tüpü üst kelepçe ve ısıtıcı filamenti ile borunun yarısı filamentin altına kadar elle besleyin(Şekil 1A).
  4. Kapiller tüpün üst kıskaçtaki "V" oluğunda olduğunu doğrulayın. Üst kıskacı sıkın.
  5. Alt kelepçe açıkken, alt kelepçe üst sınırına ulaşana kadar dikey kaydırağı manuel olarak ayarlayın. Tüpün alt kelepçedeki "V" oluğunda olduğunu doğrulayın. Alt kelepçeyi sıkın.
  6. Kapıyı kapatın ve 'Hazır' ışığının yandığını onaylayın. Isıtıcıyı ve çekme sırasını başlatmak için Başlat düğmesine basın (Şekil 1B).
  7. Isı ve yerçekimi kılcal tüpü ayırdıktan sonra ısıtıcının otomatik olarak kapandığından emin olun(Şekil 1C),ve slayt aşağı doğru hareket eder.
  8. Kapıyı aç. Kılcal tüpün üst kısmını tutarken, üst kelepçeyi sıkın. Üst kılcal tüpü çıkarın ve bir kenara koyun.
  9. Kılcal tüpü alt kaydırakta tutun ve alt kelepçeyi sıkın. Alt kılcal tüpü çıkarın ve bir kenara koyun.
  10. Enjeksiyon iğneleri oluşturmak için çekilen kılcal tüp eve yontmak için 0,05 μm alümina aşındırıcı taşlama plakası ile bir mikroelektrot beveler kullanın.
  11. Pipet, yüzeyi kaplayacak kadar öğütme plakasına yeteri kadar su(Şekil 1D).
  12. 60 rpm'de dönmeye başlayacak şekilde yaveller'ı açın. Çekilen kılcal tüpü "V" oluğundaki pipet kıskaçına yerleştirin. Kelepçeyi sıkın ve pipet kelepçesinin açısını 30°'ye ayarlayın.
  13. Kapiller tüpün sivri ucunu, öğütme plakasının dönme merkezinden yaklaşık üçte iki uzaklıkta ayarlayın.
  14. Manipülatörün üst kısmındaki kaba kontrol topuzunu ayarlayarak kenetlenmiş kılcal tüpü düşürün. Kılcal tüpün ucu su yüzeyinin altına kadar uzananve taşlama plakasının aşındırıcı yüzeyine temas edene kadar kılcal tüpü indirmeye devam edin.
  15. Beveller bağlı mikroskop kullanarak beveling ilerleme izleyin. 5 dakika sonra, taşlama plakası cam iğne yükseltmek için ince kontrol ayarlayın.
  16. Cam iğneyi çıkarın ve kılcal tüpün ucunu kontrol etmek için 10x büyütmenin altına yerleştirin(Şekil 1E,F).
  17. Tıkanıklık olmadığından emin olmak için, cam iğneyi bir şırınga üzerindeki pipet tutucuya yerleştirin ve havayı %99 etanoliçeren 1 mL'lik bir tüpe itin. İğnenin ucunda hava kabarcıkları oluşursa, iğnede tıkanıklık yoktur ve mikroenjeksiyon için kullanılabilir. Bu işlem aynı zamanda cam iğnelerin sterilitesini de sağlar.
  18. Bir kılcal tüp 5 μL sıvı kadar tutabilir. 0,5 μL hacimleri için işaretlemek için iğne üzerindeki mesafeleri hesaplamak için kılcal tüpü 10 bölüme işaretleyin. Gelecekteki hazırlık için 0,5 μL tutan bu mesafeye sahip bir ölçek işaretleyin. 5 μL iğne için, 0,7 mm arayla mesafeler 0,5 μL 'ye eşittir (Şekil 1G).

2. Bacillus cereus kültürü

  1. Biyogüvenlik Düzey 2 koşulları altında bu bölümdeki tüm işlemleri gerçekleştirin.
  2. B. cereus ATCC 14579'un %5 koyun kanı agar plakası üzerinde tek koloni izolasyonu için seri dondurucu stoku ve gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırılamıştır(Şekil 2A).
  3. Pipet 5 mL steril Beyin Kalp İnfüzyonu (BHI) 10 mL steril snap-cap tüp içine et suyu(Şekil 2B). Steril bir döngü veya iğne kullanarak, agar plakab.
  4. Kısa bir süre örneği girdap. Snap-cap tüpünü dönen bir kuluçka makinesine yerleştirin. Sıcaklığı 37 °C'ye ve hızı 200 rpm'ye ayarlayın. 18 saat sonra, kuvözden kültürü çıkarın (Şekil 2B).

3. Intravitreal enjeksiyon için bakteriyel seyreltme

  1. Biyogüvenlik Düzey 2 koşulları altında bu bölümdeki tüm işlemleri gerçekleştirin.
  2. Mikrolitre başına 200 koloni şekillendirme birimi (CFU/μL) elde etmek için bir gecede B. cereus kültürünün hacmini hesaplayın ve 10 mL taze BHI ekleyin. Örneğin, BHI'deki B. cereus'un bir gecede kültürü yaklaşık 2 x 108 CFU/mL'ye kopyalanır ve bu kültür 10 μL'lik gece kültürünü n10 mL taze BHI'ye boruhaline getirerek 200 CFU/μL'ye seyreltilebilir.
  3. Yeni seyreltilmiş kültürün pipet 1 mL'si 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe dönüştürülme. Intravitreal enjeksiyon kadar buz üzerinde bu tüp koruyun. Bakteri kültürünü seyreltme 60 dakika içinde intravitreal enjeksiyon gerçekleştirin.

4. Fare intravitreal enjeksiyon

  1. Biyogüvenlik Düzey 2 koşulları altında bu bölümdeki tüm işlemleri gerçekleştirin.
  2. Ameliyat masasına tıbbi altlıklar yerleştirerek prosedür sitesini hazırlayın.
  3. Mikroenjektörü açın ve mikroenjektöre bağlı basınçlı hava tankıüzerindeki gaz vanasını açın. Gaz teslimatı yaklaşık 60 psi olana kadar tank regülatörü ayarlayın.
  4. Mikroenjektörde, ekran Denge'yigösterene kadar Mod'a basın. Denge tuşuna basın ve bilgisayar faresini ameliyat masasına yerleştirin. Paslanmaz çelik pipet tutucuyu enjektörün 'Dolgu/Çıkış' ekindeki boruya bağlayın. Bu tüp her zaman enjektöre bağlıdır.
  5. Kapiller iğneyi pipet tutucunun diğer ucuna, pipet tutucunun ucunu iğnenin etrafına sıkı vidalayarak yerleştirin.
  6. Oftalmik mikroskobu açın ve ışığını %50'lik bir yoğunluğa çevirin. Mikroskobu ameliyat masasındaki işlem alanı üzerinde ayarlayın ve mikroskobu istenilen odakta ayarlayın.
  7. İşlem başlamadan önce, pedal çekme refleksini test ederek farenin yeterince anestezi yediğini doğrulayın. Anestezi için IACUC onaylı protokolünüze uyun.
  8. Anestezili fareyi, burnu sağa dönük ve sol tarafına yaslanmış tıbbi alt altlara yerleştirin.
  9. Farz mikroskop tan farenin sağ gözüne bakın ve enjeksiyon bölgesini ortaya çıkarmak için gözün her iki tarafındaki ters hareket terlerinin maşalarını açarak kapakları açın(Şekil 3C).
  10. Kapiller iğneyi mikroenjektöre bağlı fare altlığı sola tıklayarak 200 CFU/μL seyreltme ile doldurun(Şekil 3D).
  11. Sol elile hayvanın başını sabitve göz limbus iğne ucu yerleştirin. İğne yukarı konumda ve 45° açıyla fare gözünü delin, ancak enjekte ederken iğnenin sadece keskin ucunun (~0,5 mm) takıldığından emin olun.
  12. İğne ucu yerleştirildikten sonra sol elinizi fare başından fare altağına taşıyın ve B. cereus seyreltme 0,5 μL'lik enjekte etmek için fare altlığı sağ tıklayın. Sızıntıyı önlemek için, çıkarmadan önce fare gözü içinde iğne ucu bırakın 2-3 saniye (Şekil 3E)1,19,26,27,32,34,36,37,38.
  13. Forceps bırakın ve bir ısınma pedüzerinde oturan bir kafes içine fare yerleştirin. Bu fareleri anesteziden iyileşene kadar izleyin(Şekil 3F).
  14. Fareler anesteziden kurtarıldıktan sonra kafesi uygun rafına geri getirin. Eğer fareler elektroretinografi ile retina fonksiyon analizine tabi tutulacaksa, kafesler uygun karanlık adaptasyon için karanlık bir odaya iade edilmelidir.

5. Hasat tüpü hazırlama

  1. 1 mm steril cam boncukları 1,5 mL vidalı kapak tüplerine yerleştirin.
  2. Kuru bir ortamda bir otoklav bu tüpler sterilize. Tüpleri kullanmadan önce oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
  3. Steril 15 mL santrifüj tüpüne 10 mL 1x steril fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
  4. Tüpün içine 1 tablet proteaz inhibitörü kokteyl tableti ekleyin. Girdap tarafından karıştırın19,27,29,34,35.
  5. Pipet 400 μL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) her otoklav hasat tüpü içine proteaz inhibitörü içeren. Tüpleri etiketle ve buza yerleştirin. (Şekil 4A).

6. Gözleri hasat

  1. Biyogüvenlik Düzey 2 koşulları altında bu bölümdeki tüm işlemleri gerçekleştirin.
  2. CO2 inhalasyonu ile fareyi ötenazi. Ötenaziyi doğrulamak için ikincil bir yöntem kullanın.
  3. Ötenazili fare kafasını güvenli tutun ve enfekte gözün her iki tarafındaki ince uç terpelerini açın. Gözü itmek için baş doğru itin. Maşalar göz küresinin arkasına bir kez geldikten sonra maşaları birbirine sıkın. Göz küresini ayırmak için forceps'u kafadan çekin (Şekil 4B).
  4. Hemen etiketli bir hasat tüpü içine göz küresi yerleştirin. Tüpleri en fazla 60 dk buza yerleştirin(Şekil 4C).

7. Göz içi bakteri sayısı

  1. Biyogüvenlik Düzey 2 koşulları altında bu bölümdeki tüm işlemleri gerçekleştirin.
  2. Tüm hasat tüplerinin sıkıca kapalı olduğunu ve doku homogenizer'indeyken dengeli olduğunu doğrulayın(Şekil 5A). Örnekleri homojenize etmek için 1 dakika boyunca doku homogenizer açın. 30'ları bekleyin, sonra bir dakika daha açın. Tüpleri buz üzerine yerleştirin (Şekil 5B,C).
  3. Homojenin 20 μL'sini 180 μL steril 1x PBS'ye sırayla aktararak her numuneyi 10 kat seyreltin. 10-7 faktörüne ulaşılına kadar seyreltin (Şekil 5D).
  4. Uygun seyreltme faktörleri ile sıcak, kare BHI plaka her satır etiket. Her seyreltmenin 10 μL'sini üst üste yaklaşık 45°'lik eğik olan üst BHI plakasına aktarın. Numuneneredeyse plakanın altına ulaşana kadar çalıştırın, sonra plakayı düz olarak yerleştirin (Şekil 5E)39.
  5. Numune BHI agar'a emildiğinde plakayı 37 °C'lik bir kuluçka makinesine aktarın. Koloniler kuvöze yerleştirildikten sonra 8 saat görünür olmaya başlamalıdır.
  6. B. sereüs kolonilerinin büyümesi bireysel kolonilerin tanımlanmasına engel olmadan önce plakayı kuvözden çıkarın(Şekil 5F).
  7. Örnekteki konsantrasyonun doğru bir temsili için, 10-100 kolonileri arasında olan satırı sayın. Örneğin, 45 kolonisi olan 10-4 seyreltme fraksiyonu olan bir satır 4,5 x 105 CFU/mL konsantrasyonuna sahip olacaktır.
  8. Göz başına toplam bakteri sayısını hesaplamak için, gözü homojenize etmek için kullanılan 1x PBS mililitre hacmini temsil eden konsantrasyonu 0,4 ile çarpın. Örneğin, 4.5 x 105 CFU/mL konsantrasyonu 1.8 x 105 CFU B. göz başına cereus çevirir.

8. Örneklerin korunması

  1. Homojen örnekleri etiketli bir dondurucu kutusuna yerleştirin ve bu kutuyu -80 °C'lik bir derin dondurucuya yerleştirin. Bu örnekler daha sonra ELISA tarafından inflamatuar mediator analizi için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tekrarlanabilir bir inokül ve intravitreal enjeksiyon prosedürüdoğruluğu üreten mikrobiyal endoftalmit modelleri geliştirmede önemli adımlardır. Burada, Gram-pozitif Bacillus cereuskullanarak intravitreal enjeksiyon prosedürü gösterdi. Beş C57BL6 farenin orta vitreusuna 100 CFU/0.5 μL B. sereus enjekte ettik. 10 saat sonrası enfeksiyon sonrası B. sereus'un göz içi büyümesini yaklaşık 1.8 x 105 CFU/göz olarak gözlemledik. Şekil 1, bakterileri fare gözlerinin ortasına ulaştırmak için cam iğnelerin yapımını göstermektedir. Kan agar plakası üzerinde ve kültür tüplerinde büyüyen Bacillus cereus Şekil 2'degösterilmiştir. Şekil 3, hava basınçlı enjeksiyon sistemi kullanılarak fare intravitreal enjeksiyon prosedürünü göstermektedir. Şekil 4, enfekte olmuş gözlerin istenilen zaman sonrası enfeksiyon sonrası hasat sürecini göstermektedir. Şekil 5 enfekte gözleri homojenleştirme tekniğini göstermektedir. Şekil 6, 10 saat postenfeksiyonda beş farklı fare gözüne atrai bakteri sayılarını göstermektedir. Şekil 7 genel prosedür ve bir fare intravitreal enjeksiyon grafik gösterimi gösterir.

Figure 1
Şekil 1: Yontmlı cam iğneler yapmak. Cam iğneler tek kullanımlık mikrokapiller pipetlerden iğne/pipet çekmecesi ve mikro pipet örveler kullanılarak yapılmıştır. (A) İğne/pipet çekmecesinde kelepçeli cam kılcal tüp. (B,C) İstenilen gerilimkullanılarak cam iğnelerin oluşturulması. (D) Cam mikropipetleri beveling. (E,F) Cam mikropipetler önce ve sonra beveling. (E) Cam iğneleri ölçekleme. İki siyah nokta arasındaki boşluk 0,5 μL tutar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Bacillus cereus ATCC 14579. (A) Bacillus cereus bir kan agar plaka üzerinde büyüyor. B. cereus bireysel koloniler genellikle bir kan agar plaka üzerinde hemoliz net bölgeleri görüntüler. (B) B. cereus'unbir gecede taret kültürleri . (C) B. cereusgram boyama . B. cereus Gram-pozitif çubuk şeklinde bakterilerdir. (D) Bacillus cereuselektron mikrografı . Bu elektron mikrografı kamçı gibi yapılarla çubuk şeklinde bacillus cereus'u gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Fare intravitreal enjeksiyon. Enjeksiyon işlemi fareanestezik için ticari bir mikroskop(A)ketamin ve ksilazin ilaç kullanılarak çalışma alanı görüntüleme ile basınçlı hava enjektörü kullanılarak gerçekleştirilir. (B) Ketamin ve ksilazin fareyi anestezik için intraperitoneal enjeksiyon ile uygulanması. (C) Perioküler derinin gözü desteklemek için geri kelepçelemesi. (D) Hava basınçlı enjektör kullanarak iğnelerin bakteri ile doldurulması. (E) Intravitreal enjeksiyon. (F) Anestezi sonrası enfekte farenin izlenmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Hasat fare enfekte göz. Enfeksiyon sonrası, istenilen zaman noktasından sonra, steril cımbız kullanarak enfekte fare gözleri hasat. (A) Steril cam boncuk içeren PBS. (B) Enfekte gözün hasadı. (C) Fare gözü içeren hasat tüpü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Göz içi bakteri sayısı için hasat edilen gözün işlenmesi. (A) Enfekte göz ile Hasat tüpü sıkıca bir doku homogenizer kenetlenmiş. (B) Enfekte gözler her biri 1 dk için iki kez homojenize edildi. Ray seyreltmesi(D) gözün homojen (C) ve sonraki kaplama (E) bakteriyel nicelik için. (E) Parça seyreltme sonra temsilci bireysel Bacillus cereus kolonisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Göz içi bakteriyel sayıları 10 saat postenfeksiyon. M, fare numarası. CFU, koloni oluşturan birimler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Fare intravitreal enjeksiyon. (A) Farenin intravitreal enjeksiyon prosedürünün genel akış şeması. (B) İntravitreal enjeksiyonun grafiksel sunumu. İşlem sırasında, B. cereus kültürünü içeren steril, yakan cam iğneler fare gözünün ortasına yerleştirilir ve B. cereus hava basınçlı mikroenjeksiyon sistemi kullanılarak teslim edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Güçlü antibiyotikler, anti-inflamatuar ilaçlar ve vitrektomi cerrahisi durumu bile, bakteriyel endofalmit bir hasta kör olabilir. Klinik çalışmalar endofalmit in incelenmesinde yararlı olmuştur; ancak, endoftalmit deneysel modelleri, bakım standardında ilerlemeye çevrilebilen hızlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar ve bu da hastalar için daha iyi görsel sonuçlar sağlar.

Fare gözünün vitreus hacmi yaklaşık 7 μL40'tır. Bu küçük hacim sadece sınırlı miktarda malzemenin enjekte edilmesine izin verir. Oküler hasarı önlemek için 1.0 μL'den büyük hacimlere enjekte edilmemelidir. Süreç, tekrarlanabilirlik ve doğruluk sağlamak için özel ekipman ve tekniklerin uygulanmasını gerektirir. Endophthalmitis primatlar, domuz, tavşan, sıçan, kobay ve fare28,41,42,43,44,45incelenmiştir . Büyük türler arasında, gözler intravitreal enjeksiyonları daha büyük gözlere boyutu çok daha yakın özel ekipman olmadan yapılabilir. Fare dışında, nakavt suşları ve reaktiflerin yokluğu diğer hayvan modellerinde konak bağışıklık yanıtları incelemek için deneysel endophthalmitis onların yararlılığını kısıtlar.

Endophthalmiten sık katarakt cerrahisinin bir komplikasyonu olarak görülür. Bu enfeksiyon aynı zamanda penetran oküler travma veya sistemik enfeksiyon sonrasında oluşabilir. Bu hastalığın görsel sonucu kısmen enfekte patojenin virülansına bağlıdır. Farelerde, görsel sonuç da onların bağışıklık durumuna bağlıdır. Hastalık patogenezinin mekanizmalarının anlaşılması deneysel hayvan modellerinde hastalık incelenerek kolaylaştırılmıştır28. Fare intravitreal enjeksiyon ve enfeksiyon parametrelerinin nicelleştirme protokolü bakteriyel veya mantar patojen hemen hemen her türlü başlatılan endoftalmit çalışma için adapte edilebilir28. Ayrıca, bu protokol aynı zamanda anatomik değişiklikler, inflamatuar süreçler ve enfeksiyon sırasında hem bakteri hem de konak gen ekspresyonu profilleri çalışmak için uygulanabilir ve değiştirilebilir.

Fare intravitreal enjeksiyonu ve enfeksiyon parametrelerinin sonraki analizi birkaç kritik adımdan oluşur(Şekil 7). Cam iğne doğru oluşturulmalı, işaretlenmeli ve sterilize edilmelidir. Yontma cam iğne ve uygun ölçekleme keskin ucu bakteri ve küre delinme yeterli teslim belirler. İğnenin ucu kısa ysa ve uygun şekilde yaslanmazsa, dünya üzerinde sızıntıya, kürenin kirlenmesine ve yanlış bir hastalık sonucuna neden olabilecek büyük bir delik oluşturabilir. Bu nedenle, parlak bir alan mikroskobu10x optik zum altında yaslanırken cam mikropipetleri gözlemlemek için tavsiye edilir. Doğru miktarda bakterinin teslimini sağlamak için seyreltmeler önceden hesaplanmalı ve cam iğneüzerinde uygun hacim ölçeği işaretlenmelidir. İğne çekme ve diğer ekipman türlerini kullanma parametreleri değişebilir.

Açıklanan intravitreal enjeksiyon tekniği fare gözü1içine bakterilerin uygun teslim için bir hava basınçlı mikroenjektör sistemi kullanır. Bu mikroenjektörün uygun kullanımı tekrarlanabilir enfeksiyon parametreleri için çok önemlidir. Hava basıncı doğum hızını belirlediğinden, aşırı kuvvet hızla gözlere daha büyük bir hacim enjekte edebilir, aşırı göz içi basıncı ve / veya küre rüptürü neden. Bu nedenle, tavsiye 10-13 psi bir basınç kullanmak ve işlem sırasında enjekte etmektir. Bir diğer potansiyel sorun da dolgu dan sonra cam iğnelerden bakteriyel çözelti sızıntısı. Sızıntı fare gözlerine yanlış hacimlerin enjekte edilmesine neden olabilir. Enjeksiyonlardan önce enjeksiyon sistemi, tüp ve cam iğneler arasındaki bağlantıları her zaman kontrol edin.

Bakterilerin doğru miktarlarda enjekte deneysel bakteriyel endophthalmitis tekrarlanabilirlik için hayati önem taşımaktadır. Farklı deneysel endophthalmitis modelleri bakteri belirli sayıları n aşılanması gerektirir12,28,46,47,48,49. B. cereus endophthalmitis için, bir tekrarlanabilir enfeksiyon başlatmak için 100 CFU enjekte gereklidir1. Bakteri üremesi büyüme ortamına ve koşullarına bağlı olduğundan, büyüme ortamı, ortam ve seyreltmeler her seferinde tekrarlanmalıdır. Bu nedenle, enjeksiyon için uygun hacimde doğru inokül çoğaltmak için deney öncesi kültür koşulları test etmek için tavsiye edilir. Yukarıda belirtildiği gibi, fare gözleriiçine intravitreal enjeksiyon için üst sınır 1.0 μL28olduğunu. Aşırı hacim glokom neden olabilir göz içi basıncı yükseltir, arka segmentten retina ayırmak, ya da dünya yırtılma. Intravitreal enjeksiyon ve farelerde ortaya çıkan enfeksiyon mükemmel bir insanda B. cereus endophthalmitis taklit olmayabilir. İnsan hastalığının çoğu hayvan modelleri bu şekilde sınırlıdır. B. cereus bilinen miktarlarda besin açısından zengin medya büyüme sonra göze enjekte edilir. B. cereus endophthalmitis klinik olguları için, enfekte miktarları bilinmemektedir ve kontaminasyon kaynakları değişir. Ancak, karakterize organizmalar ve fare suşları kullanarak ve tekrarlanabilir enfeksiyon kursları üreten avantajları bu sınırlamalar ağır basar.

Enfekte gözlerin doğru hasat başka bir kritik adımdır. Aseptik koşulların korunması, verilerin yorumlanmasına engel olabilecek çapraz kontaminasyonu önlemek için gereklidir. Bu nedenle, tavsiye hasat öncesi tezgah ve% 70 etanol ile tüm aletleri dezenfekte etmektir. Bakteriyel sayılar enfeksiyon sırasında vitreus ortamında hızla artar, bu da gözde şişmeye neden olabilir. Bu nedenle, hasat sırasında gözü nazikçe çıkarmak için dikkatli olunmalıdır. Ayrıca, enfekte göz içeren hasat tüpkapağı yeterince doku homogenizer tüp yerleştirmeden önce sıkılmalıdır. Gevşek bir kapak sızıntı ve doku homogenizer kirlenmesi sızıntı tüpleri bakterilerin yanlış quantitation yol açacaktır. Göz homojenizasyon prosedürü de tüplerin sıcaklıkları yükseltir. Bu nedenle, bir seferde 1 dakika homojenize önerilir. Yüksek sıcaklıklar bazı enfeksiyon parametrelerinin niceliğini etkileyebilir. Bu yöntem gözün belirli yerlerinde bakteri sayısını sağlamasa da, histolojik yöntemlerle birleştiğinde bakterilerin lokalize olabileceği yerleri tahmin edebiliriz. Endoftalmit sırasında gözde B. cereus lokalizasyonu tavşanlarda bildirilmiştir, gözleri daha büyük ve daha kolay alt bölümlere kesilir. 2.000

Intravitreal enjeksiyon enfeksiyonu başlatır gözün arka segmentine organizmaların teslim taklit eder. Bu ilk adım deneysel endoftalmitin son derece tekrarlanabilir fare modelinde enfeksiyon parametrelerinin nitel ve nicel çalışmasını kolaylaştırır. Bu modeller aynı zamanda nötrofillerin infiltrasyonunda miyeloperoksidaz'ı ölçerek, akış sitometrisine göre belirli hücre tiplerini tanımlayarak, gerçek zamanlı PCR ve/veya ELISA ile sitokin ve kemokinleri ölçerek ve oküler mimariyi histopatoloji1,6,19,20,26,27,34,35,38olarak tahmin etmek için kullanılır. Enfekte fare gözleri ölçülecek enfeksiyon parametrelerinin türüne bağlı olarak farklı dilüentler ile hasat edilir. Gen ekspresyonu analizi için farklı bir lisis tamponu gereklidir26. Histopatolojik inceleme için hasat edilen gözler fiksatif bir çözeltiye yerleştirilir. Genetik nakavt farelerin çokluğu da çalışma çeşitli bağışıklık faktörleri ve hücrelerin rolünü kolaylaştırır. Intravitreal enjeksiyon bu nedenle göz içi enfeksiyonları ve terapötik alanında araştırmacılar için bir dayanak tekniğidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak mali bir çatışmaları yok.

Acknowledgments

Yazarlar Dr Feng Li ve Mark Dittmar (OUHSC P30 Canlı Hayvan Görüntüleme Çekirdek, Dean A. McGee Göz Enstitüsü, Oklahoma City, Tamam, ABD) yardımları için teşekkür ederiz. Araştırmamız Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 ve R01EY024140. Araştırmamız ayrıca P30EY21725 (Canlı Hayvan Görüntüleme ve Analizi, Moleküler Biyoloji ve Hücresel Görüntüleme için NIH CORE hibesi) tarafından desteklenmiştir. Araştırmamız ayrıca NEI Vision Science Pre-doctoree programı 5T32EY023202, Presbiteryen Sağlık Vakfı Araştırma Desteği hibesi ve Körlüğü Önlemek Için Araştırma'dan Dean A. McGee Göz Enstitüsü'ne sınırsız bir hibe ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-20 µL pipette RANIN L0696003G NA
37oC Incubator Fisher Scientific 11-690-625D NA
Bacto Brain Heart Infusion BD 90003-032 NA
Cell Microinjector MicroData Instrument, Inc. PM2000 NA
Fine tip forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-122 NA
Glass beads 1.0 mm BioSpec 11079110 NA
Incubator Shaker New Brunswick Scientific NB-I2400 NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters Kimble 71900-5 NA
Micro-Pipette Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 NA
Microscope Axiostar Plus Zeiss NA
Microscope OPMI Lumera Zeiss NA
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 NA
Multichannel pipette 30-300 µL Biohit 15626090 NA
Multichannel pipette 5-100 µL Biohit 9143724 NA
Needle/Pipette Puller Kopf 730 NA
PBS GIBCO 1897315 Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Molecular grade
Reverse action forceps Katena K5-8228 NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
  2. Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Pathogenesis of gram-positive bacterial endophthalmitis. Infection and Immunity. 67 (7), 3348-3356 (1999).
  3. Durand, M. L. Bacterial and Fungal Endophthalmitis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (3), 597-613 (2017).
  4. Callegan, M. C., Engelbert, M., Parke, D. W., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Bacterial endophthalmitis: Epidemiology, therapeutics, and bacterium-host interactions. Clinical Microbiology Reviews. 15 (1), 111-124 (2002).
  5. Livingston, E. T., Mursalin, M. H., Callegan, M. C. A Pyrrhic Victory: The PMN Response to Ocular Bacterial Infections. Microorganisms. 7 (11), 537 (2019).
  6. Ramadan, R. T., Moyer, A. L., Callegan, M. C. A role for tumor necrosis factor-alpha in experimental Bacillus cereus endophthalmitis pathogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (10), 4482-4489 (2008).
  7. Davey, R. T., Tauber, W. B. Posttraumatic endophthalmitis: The emerging role of Bacillus cereus infection. Reviews of Infectious Dissease. 9 (1), 110-123 (1987).
  8. Ramappa, M., et al. An outbreak of acute post-cataract surgery Pseudomonas sp. endophthalmitis caused by contaminated hydrophilic intraocular lens solution. Ophthalmology. 119 (3), 564-570 (2012).
  9. Coburn, P. S., et al. Bloodstream-To-Eye Infections Are Facilitated by Outer Blood-Retinal Barrier Dysfunction. PLoS One. 11 (5), 015560 (2016).
  10. Ness, T., Pelz, K., Hansen, L. L. Endogenous endophthalmitis: Microorganisms, disposition and prognosis. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (8), 852-856 (2007).
  11. Novosad, B. D., Callegan, M. C. Severe bacterial endophthalmitis: Towards improving clinical outcomes. Expert Review of Ophthalmology. 5 (5), 689-698 (2010).
  12. Mursalin, M. H., Livingston, E. T., Callegan, M. C. The cereus matter of Bacillus endophthalmitis. Experimental Eye Research. 193, 107959 (2020).
  13. Callegan, M. C., et al. Relationship of plcR-regulated factors to Bacillus endophthalmitis virulence. Infection and Immunity. 71 (6), 3116-3124 (2003).
  14. Beecher, D. J., Pulido, J. S., Barney, N. P., Wong, A. C. Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: Methods and implication of involvement of hemolysin BL. Infection and Immunity. 63 (2), 632-639 (1995).
  15. Callegan, M. C., et al. Contribution of membrane-damaging toxins to Bacillus endophthalmitis pathogenesis. Infection and Immunity. 70 (10), 5381-5389 (2002).
  16. Cowan, C. L. Jr, Madden, W. M., Hatem, G. F., Merritt, J. C. Endogenous Bacillus cereus panophthalmitis. Annals of Ophthalmology. 19 (2), 65-68 (1987).
  17. Callegan, M. C., et al. Virulence factor profiles and antimicrobial susceptibilities of ocular Bacillus isolates. Current Eye Research. 31 (9), 693-702 (2006).
  18. Callegan, M. C., et al. Bacillus endophthalmitis: Roles of bacterial toxins and motility during infection. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3233-3238 (2005).
  19. Mursalin, M. H. Bacillus S-layer-mediated innate interactions during endophthalmitis. Frontiers in Immunology. 11 (215), (2020).
  20. Moyer, A. L., Ramadan, R. T., Novosad, B. D., Astley, R., Callegan, M. C. Bacillus cereus-induced permeability of the blood-ocular barrier during experimental endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3783-3793 (2009).
  21. Callegan, M. C., et al. Efficacy of vitrectomy in improving the outcome of Bacillus cereus endophthalmitis. Retina. 31 (8), 1518-1524 (2011).
  22. David, D. B., Kirkby, G. R., Noble, B. A. Bacillus cereus endophthalmitis. British Journal of Ophthalmology. 78 (7), 577-580 (1994).
  23. Vahey, J. B., Flynn, H. W. Jr Results in the management of Bacillus endophthalmitis. Ophthalmic Surgery. 22 (11), 681-686 (1991).
  24. Wiskur, B. J., Robinson, M. L., Farrand, A. J., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Toward improving therapeutic regimens for Bacillus endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (4), 1480-1487 (2008).
  25. Alfaro, D. V., et al. Experimental Bacillus cereus post-traumatic endophthalmitis and treatment with ciprofloxacin. British Journal of Ophthalmology. 80 (8), 755-758 (1996).
  26. Coburn, P. S., et al. TLR4 modulates inflammatory gene targets in the retina during Bacillus cereus endophthalmitis. BMC Ophthalmology. 18 (1), 96 (2018).
  27. Mursalin, M. H., et al. S-layer Impacts the Virulence of Bacillus in Endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (12), 3727-3739 (2019).
  28. Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
  29. Parkunan, S. M., et al. CXCL1, but not IL-6, significantly impacts intraocular inflammation during infection. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1125-1134 (2016).
  30. LaGrow, A. L., et al. A Novel Biomimetic Nanosponge Protects the Retina from the Enterococcus faecalis Cytolysin. mSphere. 2 (6), 00335 (2017).
  31. Beecher, D. J., Olsen, T. W., Somers, E. B., Wong, A. C. Evidence for contribution of tripartite hemolysin BL, phosphatidylcholine-preferring phospholipase C, and collagenase to virulence of Bacillus cereus endophthalmitis. Infection and Immunity. 68 (9), 5269-5276 (2000).
  32. Callegan, M. C., et al. The role of pili in Bacillus cereus intraocular infection. Experimental Eye Research. 159, 69-76 (2017).
  33. Miller, F. C., et al. Targets of immunomodulation in bacterial endophthalmitis. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100763 (2019).
  34. Parkunan, S. M., Astley, R., Callegan, M. C. Role of TLR5 and flagella in Bacillus intraocular infection. PLoS One. 9 (6), 100543 (2014).
  35. Parkunan, S. M., et al. Unexpected roles for Toll-Like receptor 4 and TRIF in intraocular infection with Gram-positive bacteria. Infection and Immunity. 83 (10), 3926-3936 (2015).
  36. Coburn, P. S., et al. Disarming Pore-Forming Toxins with Biomimetic Nanosponges in Intraocular Infections. mSphere. 4 (3), 00262-00319 (2019).
  37. LaGrow, A., et al. Biomimetic nanosponges augment gatifloxacin in reducing retinal damage during experimental MRSA endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (9), 4632 (2019).
  38. Novosad, B. D., Astley, R. A., Callegan, M. C. Role of Toll-like receptor (TLR) 2 in experimental Bacillus cereus endophthalmitis. PLoS One. 6 (12), 28619 (2011).
  39. Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
  40. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution in the mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (3), 1109-1112 (2006).
  41. Beyer, T. L., O'Donnell, F. E., Goncalves, V., Singh, R. Role of the posterior capsule in the prevention of postoperative bacterial endophthalmitis: experimental primate studies and clinical implications. British Journal of Ophthalmology. 69 (11), 841-846 (1985).
  42. Tucker, D. N., Forster, R. K. Experimental bacterial endophthalmitis. Archives of Ophthalmology. 88 (6), 647-649 (1972).
  43. Alfaro, D. V., et al. Experimental pseudomonal posttraumatic endophthalmitis in a swine model. Treatment with ceftazidime, amikacin, and imipenem. Retina. 17 (2), 139-145 (1997).
  44. Silverstein, A. M., Zimmerman, L. E. Immunogenic endophthalmitis produced in the guinea pig by different pathogenetic mechanisms. American Journal of Ophthalmology. 48 (5), 435-447 (1959).
  45. Ravindranath, R. M., Hasan, S. A., Mondino, B. J. Immunopathologic features of Staphylococcus epidermidis-induced endophthalmitis in the rat. Current Eye Research. 16 (10), 1036-1043 (1997).
  46. Kumar, A., Singh, C. N., Glybina, I. V., Mahmoud, T. H., Yu, F. S. Toll-like receptor 2 ligand-induced protection against bacterial endophthalmitis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 255-263 (2010).
  47. Mylonakis, E., et al. The Enterococcus faecalis fsrB gene, a key component of the fsr quorum-sensing system, is associated with virulence in the rabbit endophthalmitis model. Infection and Immunity. 70 (8), 4678-4681 (2002).
  48. Sanders, M. E., et al. The Streptococcus pneumoniae capsule is required for full virulence in pneumococcal endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 865-872 (2011).
  49. Hunt, J. J., Astley, R., Wheatley, N., Wang, J. T., Callegan, M. C. TLR4 contributes to the host response to Klebsiella intraocular infection. Current Eye Research. 39 (8), 790-802 (2014).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 168 bakteriyel göz enfeksiyonu göz içi bakteriyel nicelleştirme göz enfeksiyonu parametreleri intravitreal enjeksiyon göz içi enjeksiyonu endophthalmitis
Bakteriyel Endoftalmitin Fare Modelinde İntravitreal Enjeksiyon ve Enfeksiyon Parametrelerinin Niceliği
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mursalin, M. H., Livingston, E.,… More

Mursalin, M. H., Livingston, E., Coburn, P. S., Miller, F. C., Astley, R., Callegan, M. C. Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis. J. Vis. Exp. (168), e61749, doi:10.3791/61749 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter