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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Intravitreale Injektion und Quantifizierung von Infektionsparametern in einem Mausmodell der bakteriellen Endophthalmitis

Published: February 6, 2021 doi: 10.3791/61749
Automatic Translation
*1,2, *1, 2,3, 4, 2,3, 1,2,3
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Wir beschreiben hier eine Methode der intravitrealen Injektion und der anschließenden bakteriellen Quantifizierung im Mausmodell der bakteriellen Endophthalmitis. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um die Immunantworten des Wirts und die bakterielle und die Genexpression zu messen.

Abstract

Intraokulare bakterielle Infektionen sind eine Gefahr für das Sehvermögen. Die Forscher verwenden Tiermodelle, um den Wirt und bakterielle Faktoren und Immunantwortwege im Zusammenhang mit Infektionen zu untersuchen, um lebensfähige therapeutische Ziele zu identifizieren und Medikamente zu testen, um Erblindung zu verhindern. Die intravitreale Injektionstechnik wird verwendet, um Organismen, Medikamente oder andere Substanzen direkt in die Glaskörperhöhle im hinteren Segment des Auges zu injizieren. Hier demonstrierten wir diese Injektionstechnik, um Infektionen im Mausauge und die Technik der Quantifizierung von intraokularen Bakterien zu initiieren. Bacillus cereus wurde 18 Stunden lang in flüssigen Medien des Gehirns angebaut und auf eine Konzentration von 100 Koloniebildenden Einheiten (CFU)/0,5 l resuspendiert. Eine C57BL/6J-Maus wurde mit einer Kombination aus Ketamin und Xylazin anbeet. Mit einem Pikoliter-Mikroinjektor und Glaskapillarnadeln wurde 0,5 l der Bacillus Suspension in den mittleren Glaskörper des Mausauges injiziert. Das kontralaterale Kontrollauge wurde entweder mit sterilen Medien injiziert (chirurgische Kontrolle) oder nicht injiziert (absolute Kontrolle). Nach einer Infektion nach 10 Stunden wurden Mäuse eingeschläfert und die Augen mit einer sterilen chirurgischen Pinzette geerntet und in ein Rohr mit 400 l sterilen PBS und 1 mm sterilen Glasperlen gelegt. Für ELISAs oder Myeloperoxidase-Assays wurde den Röhrchen ein Proteinase-Inhibitor zugesetzt. Für die RNA-Extraktion wurde der entsprechende Lysepuffer hinzugefügt. Die Augen wurden in einem Gewebehomogenisator für 1-2 Minuten homogenisiert. Homogenate wurden in PBS seriell 10-fach verdünnt und auf Agarplatten verdünnt. Der Rest der Homogenate wurde bei -80 °C für zusätzliche Tests gelagert. Die Platten wurden 24 Stunden lang inkubiert und die KBE pro Auge quantifiziert. Diese Techniken führen zu reproduzierbaren Infektionen in den Augen der Maus und erleichtern die Quantifizierung lebensfähiger Bakterien, der Wirtsimmunantwort und der Omics der Wirts- und bakteriellen Genexpression.

Introduction

Bakterielle Endophthalmitis ist eine verheerende Infektion, die Entzündungen verursacht und, wenn sie nicht richtig behandelt wird, zu Verlust des Sehvermögens oder Erblindung führen kann. Endophthalmitis resultiert aus dem Eindringen von Bakterien in das Innere des Auges1,2,3,4,5. Einmal im Auge, Bakterien replizieren, produzieren Toxine und andere schädliche Faktoren, und kann irreversible Schäden an empfindlichen Netzhautzellen und Gewebe verursachen. Augenschäden können auch durch Entzündungen verursacht werden, aufgrund der Aktivierung von entzündungshemmenden Bahnen, die zu einem entzündlichen Zellzufluss in das Innere des Auges führen1,5,6. Endophthalmitis kann nach intraokularer Operation (postoperative), einer durchdringenden Verletzung des Auges (posttraumatische) oder durch metastasierende Ausbreitung von Bakterien in das Auge von einer anderen anatomischen Stelle (endogen)7,8,9,10. Behandlungen für bakterielle Endophthalmitis umfasst Antibiotika, entzündungshemmende Medikamente, oder chirurgische intervention3,4,11. Auch mit diesen Behandlungen kann das Sehvermögen oder das Auge selbst verloren gehen. Die visuelle Prognose nach bakterieller Endophthalmitis variiert in der Regel je nach Wirksamkeit der Behandlung, der Sehschärfe bei der Präsentation und der Virulenz des infizierenden Organismus.

Bacillus cereus (B. cereus) ist einer der wichtigsten bakteriellen Krankheitserreger, die posttraumatische Endophthalmitisverursachen 7,12. Die Mehrheit der Fälle von B. cereus endophthalmitis hat einen schnellen Verlauf, der innerhalb weniger Tage zu Erblindung führen kann. Zu den Merkmalen von B. cereus Endophthalmitis gehören sich schnell entwickelnde intraokulare Entzündungen, Augenschmerzen, schneller Verlust der Sehschärfe und Fieber. B. cereus wächst schnell im Auge im Vergleich zu anderen Bakterien, die häufig Augeninfektionen verursachen2,4,12 und besitzt viele Virulenzfaktoren. Daher ist das Fenster für eine erfolgreiche therapeutische Intervention relativ kurz1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Behandlungen für diese Infektion sind in der Regel erfolgreich bei der Behandlung von Endophthalmitis durch andere weniger virulente Krankheitserreger verursacht, aber B. cereus Endophthalmitis führt häufig zu mehr als 70% der Patienten leiden an signifikanten Sehverlust. Etwa 50% dieser Patienten unterziehen evisceration oder Enukleation des infiziertenAuges 7,16,22,23. Die zerstörerische und schnelle Natur von B. cereus endophthalmitis erfordert eine sofortige und ordnungsgemäße Behandlung. Die jüngsten Fortschritte bei der Unterscheidung der zugrunde liegenden Mechanismen der Krankheitsentwicklung haben potenzielle Ziele fürInterventionen 19,26,27identifiziert. Experimentelle Mausmodelle von B. cereus Endophthalmitis sind weiterhin nützlich, um die Mechanismen der Infektion zu erkennen und potenzielle Therapeutika zu testen, die Sehverlust verhindern können.

Die experimentelle intraokulare Infektion von Mäusen mit B. cereus war ein instrumentelles Modell für das Verständnis von bakteriellen und Wirtsfaktoren sowie deren Wechselwirkungen während der Endophthalmitis28. Dieses Modell imitiert ein posttraumatisches oder postoperatives Ereignis, bei dem Bakterien während einer Verletzung ins Auge eingeführt werden. Dieses Modell ist sehr reproduzierbar und war nützlich für die Erprobung experimenteller Therapien und die Bereitstellung von Daten für Verbesserungen im Standard der Pflege1,6,19,29,30. Wie viele andere Infektionsmodelle ermöglicht dieses Modell eine unabhängige Kontrolle vieler Infektionsparameter und ermöglicht eine effiziente und reproduzierbare Untersuchung der Infektionsergebnisse. Studien in einem ähnlichen Modell bei Kaninchen in den letzten Jahrzehnten haben die Auswirkungen von B. cereus Virulenzfaktoren im Augeuntersucht 2,4,13,14,31. Durch die Injektion von B. cereus mutierten Stämmen ohne individuelle oder mehrere Virulenzfaktoren kann der Beitrag dieser Virulenzfaktoren zur Schwere der Erkrankung durch Ergebnisse wie die Konzentration von Bakterien zu verschiedenen Stunden der Postinfektion oder den Verlust der Sehfunktion13,14,27,31,32gemessen werden. Darüber hinaus wurden Wirtsfaktoren in diesem Modell untersucht, indem Knockout-Mausstämme ohne spezifische entzündliche Wirtsfaktoren26,29,33,34,35infiziert wurden. Das Modell ist auch nützlich für die Prüfung potenzieller Behandlungen für diese Krankheit durch Injektion neuer Verbindungen in das Auge nach der Infektion30,36. In diesem Manuskript beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das die Infektion eines Mausauges mit B. cereus,die Ernte des Auges nach der Infektion, die Quantifizierung der intraokularen bakteriellen Belastung und die Erhaltung von Proben umfasst, um zusätzliche Parameter der Krankheitsschwere zu untersuchen.

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Protocol

Alle Verfahren wurden gemäß den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und der Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research durchgeführt. Die Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des University of Oklahoma Health Sciences Center (Protokollnummern 15-103, 18-043 und 18-087) genehmigt.

1. Sterile Glasnadeln

  1. Schalten Sie den Nadelpipette-Puller ein.
  2. Stellen Sie den Heizknopf ein, bis das Display 12.6 anzeigt.
  3. Öffnen Sie die Tür und füttern Sie das 5 L Kapillarrohr manuell durch die obere Klemme und das Heizfilament, bis sich die Hälfte des Schlauches unter das Filament erstreckt (Abbildung 1A).
  4. Bestätigen Sie, dass sich das Kapillarrohr in der "V"-Nut in der oberen Klemme befindet. Ziehen Sie die obere Klemme fest.
  5. Wenn die untere Klemme geöffnet ist, stellen Sie den vertikalen Schlitten manuell bis zur Obergrenze ein. Bestätigen Sie, dass sich das Rohr in der "V"-Nut in der unteren Klemme befindet. Ziehen Sie die untere Klemme fest.
  6. Schließen Sie die Tür und bestätigen Sie, dass das "Ready"-Licht eingeschaltet ist. Drücken Sie die Starttaste, um die Heizer- und Zugsequenz zu initiieren (Abbildung 1B).
  7. Stellen Sie sicher, dass sich die Heizung automatisch ausschaltet, nachdem Hitze und Schwerkraft das Kapillarrohr auseinandergezogen haben (Abbildung 1C), und der Schlitten bewegt sich nach unten.
  8. Öffnen Sie die Tür. Während Sie die Oberseite des Kapillarrohres halten, ziehen Sie die obere Klemme ab. Entfernen Sie das obere Kapillarrohr und legen Sie es beiseite.
  9. Halten Sie das Kapillarrohr im unteren Schlitten und ziehen Sie die untere Klemme ab. Entfernen Sie das untere Kapillarrohr und legen Sie es beiseite.
  10. Verwenden Sie einen Mikroelektroden-Abschräger mit einer 0,05-m-Aluminiumoxid-Schleifplatte, um das gezogene Kapillarrohr zu verschrägen, um die Injektionsnadeln zu erzeugen.
  11. Pipette genug Wasser auf die Schleifplatte, um die Oberfläche zu bedecken (Abbildung 1D).
  12. Schalten Sie den Beveller so ein, dass er sich bei 60 Umdrehungen zu drehen beginnt. Legen Sie das gezogene Kapillarrohr in die Pipettenklemme in der "V"-Nut. Ziehen Sie die Klemme fest und stellen Sie den Winkel der Pipettenklemme auf 30° ein.
  13. Passen Sie die Spitze der spitzen Kante des Kapillarrohres etwa zwei Drittel vom Drehmittelpunkt der Schleifplatte entfernt an.
  14. Senken Sie das geklemmte Kapillarrohr, indem Sie den groben Regler an der Oberseite des Manipulators einstellen. Fahren Sie fort, das Kapillarrohr zu senken, bis sich die Spitze des Kapillarrohres unter der Wasseroberfläche erstreckt und die schleifmittelförmige Oberfläche der Schleifplatte kontaktiert.
  15. Überwachen Sie den Abschrägungsfortschritt mit dem am Beveller befestigten Mikroskop. Nach 5 min stellen Sie die Feinkontrolle ein, um die Glasnadel von der Schleifplatte zu heben.
  16. Entfernen Sie die Glasnadel und legen Sie sie unter 10-fache Vergrößerung, um die Spitze des Kapillarrohres zu überprüfen (Abbildung 1E,F).
  17. Um sicherzustellen, dass es keine Verstopfungen gibt, legen Sie die Glasnadel in einen Pipettenhalter auf einer Spritze ein und schieben Sie Luft in ein 1 ml Rohr mit 99% Ethanol. Wenn sich An der Spitze der Nadel Luftblasen bilden, hat die Nadel keine Verstopfungen und kann für die Mikroinjektion verwendet werden. Dieser Prozess gewährleistet auch die Sterilität der Glasnadeln.
  18. Ein Kapillarrohr kann bis zu 5 L Flüssigkeit aufnehmen. Markieren Sie das Kapillarrohr in 10 Abschnitte, um die Entfernungen auf der Nadel zu berechnen, um für 0,5 L-Volumen zu markieren. Markieren Sie eine Skala mit diesem Abstand, der für die zukünftige Vorbereitung 0,5 l enthält. Bei einer Nadel von 5 l entsprechen Entfernungen von 0,7 mm Abstand 0,5 l (Abbildung 1G).

2. Bacillus cereus Kultur

  1. Führen Sie alle Verfahren in diesem Abschnitt unter den Bedingungen der Biosicherheitsstufe 2 durch.
  2. Streak Gefriervorrat von B. cereus ATCC 14579 für die Isolation einer einzigen Kolonie auf einer 5% Schafblut-Agarplatte und inkubieren über Nacht bei 37 °C (Abbildung 2A).
  3. Pipette 5 ml sterile Brain Heart Infusion (BHI) Brühe in eine 10 ml sterile Snap-Cap-Röhre(Abbildung 2B). Mit einer sterilen Schleife oder Nadel, wählen Sie eine einzelne Kolonie von B. cereus ATCC 14579 von der Agarplatte und impfen Sie die flüssige BHI.
  4. Wirbeln Sie die Probe kurz. Legen Sie das Snap-Cap-Rohr in einen rotierenden Inkubator. Stellen Sie die Temperatur auf 37 °C und die Geschwindigkeit auf 200 Umdrehungen/nach Minute ein. Entfernen Sie nach 18 h die Kultur aus dem Inkubator (Abbildung 2B).

3. Bakterielle Verdünnung zur intravitrealen Injektion

  1. Führen Sie alle Verfahren in diesem Abschnitt unter den Bedingungen der Biosicherheitsstufe 2 durch.
  2. Berechnen Sie das Volumen der über Nacht B. cereus Kultur zu 10 ml frische BHI hinzufügen, um 200 Kolonie bildende Einheiten pro Mikroliter zu erreichen (CFU / L). Beispielsweise repliziert sich eine Nachtkultur von B. cereus in BHI auf ca. 2 x 108 CFU/ml, die dann auf 200 CFU/L verdünnt werden kann, indem 10 l Übernachtungskultur in 10 ml frisches BHI pipetiert werden.
  3. Pipette 1 ml der frisch verdünnten Kultur in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Bewahren Sie diese Röhre auf Eis bis zur intravitrealen Injektion auf. Führen Sie die intravitreale Injektion innerhalb von 60 min der Verdünnung der Bakterienkultur durch.

4. Maus intravitreale Injektion

  1. Führen Sie alle Verfahren in diesem Abschnitt unter den Bedingungen der Biosicherheitsstufe 2 durch.
  2. Bereiten Sie die Verfahrensstelle vor, indem Sie medizinische Unterpads auf den Operationstisch legen.
  3. Schalten Sie den Mikroinjektor ein und öffnen Sie das Gasventil am Drucklufttank, der am Mikroinjektor befestigt ist. Stellen Sie den Tankregler so lange ein, bis die Gaszufuhr ca. 60 psi beträgt.
  4. Drücken Sie auf dem Mikroinjektor den Modus, bis auf dem Bildschirm Balanceangezeigt wird. Drücken Sie Balance und legen Sie die Computermaus auf den Operationstisch. Schließen Sie den Pipettenhalter aus Edelstahl an den Schlauch an, der an "Fill/Output" des Injektors befestigt ist. Dieses Rohr ist immer mit dem Injektor verbunden.
  5. Setzen Sie die Kapillarnadel am anderen Ende des Pipettenhalters ein, indem Sie den Pipettenhalterum um die Nadel verschrauben.
  6. Schalten Sie das Ophthalmologische Mikroskop ein und schalten Sie sein Licht auf eine Intensität von 50% ein. Stellen Sie das Mikroskop über die Verfahrensstelle auf dem Operationstisch ein und stellen Sie das Mikroskop auf den gewünschten Fokus ein.
  7. Bevor das Verfahren beginnt, bestätigen Sie, dass die Maus ausreichend betäut wird, indem Sie den Pedalentzugsreflex testen. Achten Sie darauf, Ihr IACUC-zugelassenes Protokoll für anästhesien zu befolgen.
  8. Legen Sie die anästhesierte Maus auf die medizinischen Unterpads mit der Nase nach rechts zeigen und auf der linken Seite lehnen.
  9. Schauen Sie sich das rechte Auge der Maus durch das ophthalmologische Mikroskop und öffnen Sie die Deckel, indem Sie die Zange einer umgekehrten Einwirkungszange auf beiden Seiten des Auges öffnen, um die Injektionsstelle freizulegen (Abbildung 3C).
  10. Füllen Sie die Kapillarnadel mit der Verdünnung von 200 CFU/L, indem Sie mit der linken Maustaste auf das mit dem Mikroinjektor verbundene Mauspad klicken (Abbildung 3D).
  11. Sichern Sie den Kopf des Tieres mit der linken Hand und legen Sie die Nadelspitze an den Limbus des Auges. Mit der Nadel in der Abschrägungsposition und im 45°-Winkel, punktieren Sie das Mausauge, aber stellen Sie sicher, dass nur die scharfe Spitze der Nadel (-0,5 mm) bei der Injektion eingesetzt wird.
  12. Sobald die Nadelspitze eingesetzt ist, bewegen Sie die linke Hand vom Mauskopf zum Mauspad und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Mauspad, um 0,5 l der B. cereus Verdünnung zu injizieren. Um Leckagen zu vermeiden, lassen Sie die Nadelspitze im Mausauge für 2-3 Sekunden vor dem Entfernen (Abbildung 3E)1,19,26,27,32,34,36,37,38.
  13. Lassen Sie die Zange los und legen Sie die Maus in einen Käfig, der auf einem wärmenden Pad sitzt. Überwachen Sie diese Mäuse, bis sie sich von der Anästhesie erholt haben (Abbildung 3F).
  14. Sobald Mäuse aus der Anästhesie geborgen sind, kehren Sie den Käfig in sein richtiges Rack zurück. Wenn die Mäuse einer Netzhautfunktionsanalyse durch Elektroretinographie unterzogen werden, sollten Käfige in einen dunklen Raum für eine richtige dunkle Anpassung zurückgeführt werden.

5. Ernterohrvorbereitung

  1. 1 mm sterile Glasperlen in 1,5 ml Schraubkappenrohre geben.
  2. Sterilisieren Sie diese Rohre in einem Autoklaven auf einer trockenen Umgebung. Lassen Sie die Rohre vor Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen.
  3. 10 ml 1x sterile Phosphat-gepufferte Saline (PBS) zu einem sterilen 15 ml Zentrifugenrohr geben.
  4. Fügen Sie 1 Tablette Protease-Hemmer-Cocktail-Tablette in die Tube. Mix durch Wirbel19,27,29,34,35.
  5. Pipette 400 l 1x phosphatgepufferte Saline (PBS) mit Protease-Inhibitor in jedes autoklavische Ernterohr. Beschriften Sie die Rohre und legen Sie sie auf Eis. (Abbildung 4A).

6. Ernte der Augen

  1. Führen Sie alle Verfahren in diesem Abschnitt unter den Bedingungen der Biosicherheitsstufe 2 durch.
  2. Euthanisieren Sie die Maus durch CO2-Inhalation. Verwenden Sie eine sekundäre Methode, um Dieeuthanasie zu bestätigen.
  3. Halten Sie den eingeschläferten Mauskopf sicher und öffnen Sie die feine Spitze Zange auf beiden Seiten des infizierten Auges. Drücken Sie nach unten zum Kopf, um das Auge zu stützen. Sobald die Zange hinter dem Globus des Auges ist, drücken Sie die Zange zusammen. Ziehen Sie Zangen vom Kopf weg, um den Augapfel zu lösen (Abbildung 4B).
  4. Legen Sie den Augapfel sofort in ein markiertes Ernterohr. Rohre für nicht mehr als 60 min auf Eis legen (Abbildung 4C).

7. Intraokularbakterienzahl

  1. Führen Sie alle Verfahren in diesem Abschnitt unter den Bedingungen der Biosicherheitsstufe 2 durch.
  2. Bestätigen Sie, dass alle Ernteröhrchen dicht verschlossen sind und im Gewebehomogenisator ausbalanciert sind (Abbildung 5A). Schalten Sie den Gewebehomogenisator 1 min ein, um die Proben zu homogenisieren. Warten Sie 30 s, und schalten Sie dann eine weitere Minute ein. Rohre auf Eis legen (Abbildung 5B,C).
  3. Jede Probe 10-fach verdünnen, indem man 20 l des Homogenats sequenziell in 180 l sterile 1x PBS überträgt. Verdünnen, bis ein Faktor von 10-7 erreicht ist (Abbildung 5D).
  4. Beschriften Sie jede Reihe einer warmen, quadratischen BHI-Platte mit den richtigen Verdünnungsfaktoren. Übertragen Sie 10 l jeder Verdünnung in einer Reihe auf die obere BHI-Platte, die ca. 45° geneigt ist. Lassen Sie die Probe laufen, bis sie fast den Boden der Platte erreicht, dann legen Sie die Platte flach (Abbildung 5E)39.
  5. Wenn die Probe in den BHI-Agar aufgenommen wird, übertragen Sie die Platte auf einen 37 °C-Inkubator. Kolonien sollten beginnen, 8 h sichtbar zu sein, nachdem sie in den Brutkasten gelegt wurden.
  6. Entfernen Sie die Platte aus dem Brutkasten, bevor das Wachstum der B. cereus Kolonien stört mit der Identifizierung einzelner Kolonien (Abbildung 5F).
  7. Um eine genaue Darstellung der Konzentration in der Stichprobe zu finden, zählen Sie die Zeile, die zwischen 10-100 Kolonien aufweist. Zum Beispiel hat eine Zeile mit dem Verdünnungsanteil von 10-4, die 45 Kolonien hat, eine Konzentration von 4,5 x 105 KBE/ml.
  8. Um die Gesamtzahl der Bakterien pro Auge zu berechnen, multiplizieren Sie die Konzentration mit 0,4, was das Millilitervolumen von 1x PBS darstellt, das zur Homogenisierung des Auges verwendet wird. Beispielsweise würde die Konzentration von 4,5 x 105 KBE/ml 1,8 x 105 CFU B. cereus pro Auge bedeuten.

8. Konservierung von Proben

  1. Die Proben in eine beschriftete Gefrierbox geben und in einen -80 °C-Gefrierschrank geben. Diese Proben können später für die Entzündungsmediatorenanalyse per ELISA verwendet werden.

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Representative Results

Die Erzeugung eines reproduzierbaren Inokulums und die Genauigkeit des intravitrealen Injektionsverfahrens sind wichtige Schritte bei der Entwicklung von Modellen für mikrobielle Endophthalmitis. Hier haben wir das intravitreale Injektionsverfahren mit Gram-positivem Bacillus cereusdemonstriert. Wir injizierten 100 CFU/0,5 l B. cereus in die Mitte von fünf C57BL6-Mäusen. Nach 10 h Nachinfektion beobachteten wir ein intraokulares Wachstum von B. cereus auf ca. 1,8 x 105 KBE/Auge. Abbildung 1 zeigt die Konstruktion von Glasnadeln, um die Bakterien in die Mitte der Mausaugen zu liefern. Bacillus cereus wächst auf einem Blut-Agar-Platte und in Kulturröhren ist in Abbildung 2gezeigt. Abbildung 3 zeigt das intravitreale Injektionsverfahren der Maus mit einem Luftdruckinjektionssystem. Abbildung 4 zeigt den Prozess der Ernte der infizierten Augen nach der gewünschten Zeit nach der Infektion. Abbildung 5 zeigt die Technik zur Homogenisierung der infizierten Augen. Abbildung 6 zeigt die intraokularen Bakterienzahlen von fünf verschiedenen Mausaugen bei einer 10 h Postinfektion. Abbildung 7 zeigt das Gesamtverfahren und eine grafische Darstellung einer intravitrealen Mausinjektion.

Figure 1
Abbildung 1: Herstellung von abgeschrägten Glasnadeln. Glasnadeln wurden aus Einweg-Mikrokapillarpipetten mit einem Nadel-/Pipettenpuller und einem Micropipette-Abschräger hergestellt. (A) Geklemmtes Glaskapillarrohr im Nadel-/Pipette-Zieher. (B,C) Erstellung von Glasnadeln mit der gewünschten Spannung. (D) Abschrägen der Glasmikropipetten. (E,F) Glasmikropipetten vor und nach dem Abschrägen. (E) Skalieren der Glasnadeln. Der Abstand zwischen zwei schwarzen Punkten beträgt 0,5 l. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Bacillus cereus ATCC 14579. (A) Bacillus cereus wächst auf einer Blutagarplatte. Einzelne Kolonien von B. cereus zeigen in der Regel klare Zonen der Hämolyse auf einer Blutagarplatte. (B) Trübe Nachtkulturen von B. cereus. (C) Gram-Färbung von B. cereus. B. cereus sind grampositive stabförmige Bakterien. (D) Elektronenmikroskopie von Bacillus cereus. Diese Elektronenmikroskopie zeigt den stabförmigen Bacillus cereus mit Haarähnlichen Strukturen, die Flagella genannt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: intravitreale Injektion der Maus. Das Injektionsverfahren wird mit einem Druckluftinjektor mit Betrachtung des Operationsfeldes mit einem kommerziellen Mikroskop (A) Ketamin und Xylazin-Medikament durchgeführt, um die Maus zu betäuben. (B) Verabreichung von Ketamin und Xylazin durch intraperitoneale Injektion zur Anästhesisierung der Maus. (C) Klemmen der periokulären Haut zurück, um das Auge zu proptosisieren. (D) Füllen der Nadeln mit Bakterien mit dem Luftdruckinjektor. (E) Intravitreale Injektion. (F) Überwachung infizierter Maus nach Anästhesie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Ernte Maus infiziertauge Auge. Nach der Infektion, nach dem gewünschten Zeitpunkt, ernten infizierte Mausaugen mit steriler Pinzette. (A) PBS mit sterilen Glasperlen. (B) Ernte des infizierten Auges. (C) Ernterohr mit einem Mausauge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Verarbeitung des geernteten Auges für intraokulare Bakterienzahl. (A) Ernterohr mit infiziertem Auge fest an einen Gewebehomogenisator geklemmt. (B) Infizierte Augen wurden zweimal für jeweils 1 min homogenisiert. Spurverdünnung (D) der Augenhomogenate (C) und anschließende Beschichtung (E) für die bakterielle Quantifizierung. (E) Repräsentative individuelle Bacillus cereus Kolonie nach Gleisverdünnung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Intraokularbakterienzahlen bei 10 h Nachinfektion. M, Mausnummer. KBE, koloniebildende Einheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: intravitreale Injektion der Maus. (A) Gesamtflussdiagramm des intravitrealen Injektionsverfahrens der Maus. (B) Grafische Darstellung der intravitrealen Injektion. Während des Eingriffs werden sterile, abgeschrägte Glasnadeln, die eine Kultur von B. cereus enthalten, in die Mitte des Mausauges eingeführt, und B. cereus wird mit einem luftdruckgedronten Mikroinjektionssystem geliefert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Trotz der Verfügbarkeit von potenten Antibiotika, entzündungshemmenden Medikamenten und Vitrektomie-Chirurgie kann bakterielle Endophthalmitis einen Patienten blenden. Klinische Studien waren nützlich bei der Untersuchung von Endophthalmitis; Experimentelle Modelle der Endophthalmitis liefern jedoch schnelle und reproduzierbare Ergebnisse, die in Fortschritte im Standard der Versorgung übersetzt werden können, was zu einem besseren visuellen Ergebnis für die Patienten führt.

Das Glaskörpervolumen des Mausauges beträgt ca. 7 l40. Dieses geringe Volumen ermöglicht nur eine begrenzte Menge an Material injiziert werden. Um Augenschäden zu vermeiden, sollten keine Volumen von mehr als 1,0 l injiziert werden. Der Prozess erfordert spezifische Ausrüstung und Praxis von Techniken, um Reproduzierbarkeit und Genauigkeit zu gewährleisten. Endophthalmitis wurde bei Primaten, Schweinen, Kaninchen, Ratten, Meerschweinchen und in der Maus28,41,42,43,44,45untersucht. Unter den größeren Arten sind die Augen viel näher an den menschlichen Augen, und intravitreale Injektionen in größere Augen können ohne spezielle Ausrüstung durchgeführt werden. Mit Ausnahme der Maus schränkt das Fehlen von Knockout-Stämmen und Reagenzien zur Untersuchung der Immunantworten des Wirts in anderen Tiermodellen ihre Nützlichkeit bei experimentellen Endophthalmitis ein.

Endophthalmitis tritt am häufigsten als Komplikation der Kataraktchirurgie auf. Diese Infektion kann auch nach durchdringenden Augentrauma oder systemische Infektion auftreten. Das visuelle Ergebnis bei dieser Krankheit hängt teilweise von der Virulenz des infizierenden Erregers ab. Bei Mäusen hängt das visuelle Ergebnis auch von ihrem Immunstatus ab. Das Verständnis der Mechanismen der Krankheitspathogenese wurde durch die Untersuchung der Krankheit in experimentellen Tiermodellen erleichtert28. Das Protokoll für die intravitreale Injektion von Mäusen und die Quantifizierung von Infektionsparametern kann angepasst werden, um Endophthalmitis zu untersuchen, die mit fast jeder Art von bakteriellem oder Pilzpathogen eingeleitet wurden28. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auch angewendet und modifiziert werden, um anatomische Veränderungen, entzündliche Prozesse und die Genexpressionsprofile der Bakterien und des Wirts während der Infektion zu untersuchen.

Die intravitreale Injektion der Maus und die anschließende Analyse der Infektionsparameter bestehen aus mehreren kritischen Schritten (Abbildung 7). Die Glasnadel muss genau erstellt, markiert und sterilisiert werden. Das scharfe Ende der abgeschrägten Glasnadel und die richtige Skalierung bestimmen die angemessene Abgabe der Bakterien und die Kugelpunktion. Wenn das Ende der Nadel kurz ist und nicht entsprechend abgeschrägt ist, könnte es ein großes Loch auf der Welt schaffen, das Leckagen, Kontamination des Globus und ein ungenaues Krankheitsergebnis verursachen könnte. Daher wird empfohlen, die Glasmikropipetten zu beobachten, während sie unter dem 10-fachen optischen Zoom eines Hellfeldmikroskops abschrägen. Um die Lieferung der richtigen Menge an Bakterien zu gewährleisten, sollten Verdünnungen vorher berechnet und die richtige Volumenskala auf der Glasnadel markiert werden. Die Parameter für das Nadelziehen und Abschrägen mit anderen Geräten können variieren.

Die beschriebene intravitreale Injektionstechnik nutzt ein luftdruckgebundenes Mikroinjektorsystem zur richtigen Zufuhr der Bakterien in das Mausauge1. Die angemessene Verwendung dieses Mikroinjektors ist entscheidend für die reproduzierbaren Infektionsparameter. Da der Luftdruck die Geschwindigkeit der Lieferung bestimmt, kann übermäßige Kraft schnell ein größeres Volumen in die Augen injizieren, was zu einem übermäßigen Augeninnendruck und/oder Einem Bruch des Globus führen kann. Daher wird empfohlen, einen Druck von 10-13 psi zu verwenden, um während des Verfahrens zu füllen und zu injizieren. Ein weiteres mögliches Problem ist das Auslaufen der bakteriellen Lösung aus den Glasnadeln nach dem Füllen. Leckage kann zur Injektion von ungenauen Volumina in die Mausaugen führen. Überprüfen Sie immer die Verbindungen zwischen dem Injektionssystem, Schläuchen und Glasnadeln vor injektionn.

Die Injektion genauer Mengen von Bakterien ist entscheidend für die Reproduzierbarkeit der experimentellen bakteriellen Endophthalmitis. Verschiedene experimentelle Endophthalmitis-Modelle erfordern die Impfung bestimmter Bakterienzahlen12,28,46,47,48,49. Für B. cereus endophthalmitis ist eine Injektion von 100 KBE erforderlich, um eine reproduzierbare Infektion zu initiieren1. Da das bakterienwachstum vom Wachstumsmedium und den Bedingungen abhängt, müssen Wachstumsumgebung, Medien und Verdünnungen jedes Mal wiederholt werden. Daher wird empfohlen, die Kulturbedingungen vor dem Experiment zu testen, um das genaue Inokulum in dem entsprechenden Injektionsvolumen zu reproduzieren. Wie bereits erwähnt, liegt die Obergrenze für die intravitreale Injektion in die Augen der Maus bei 1,0 l28. Ein übermäßiges Volumen erhöht den Augeninnendruck, der zu Einem Glaukom führen, die Netzhaut vom hinteren Segment lösen oder den Globus brechen könnte. Die intravitreale Injektion und die daraus resultierende Infektion bei Mäusen können B. cereus Endophthalmitis bei einem Menschen nicht perfekt imitieren. Die meisten Tiermodelle menschlicher Krankheiten sind auf diese Weise begrenzt. Bekannte Mengen von B. cereus werden nach dem Wachstum in nährstoffreichen Medien in das Auge injiziert. Bei klinischen Fällen von B. cereus Endophthalmitis sind die infizierenden Mengen nicht bekannt und die Kontaminationsquellen variieren. Die Vorteile der Verwendung von charakterisierten Organismen und Mausstämmen und der Erzeugung reproduzierbarer Infektionskurse überwiegen jedoch diese Einschränkungen.

Die richtige Ernte infizierter Augen ist ein weiterer kritischer Schritt. Die Aufrechterhaltung aseptischer Bedingungen ist unerlässlich, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, die die Interpretation der Daten beeinträchtigen könnte. Daher wird empfohlen, die Werkbank und alle Instrumente mit 70 % Ethanol vor der Ernte zu desinfizieren. Bakterielle Zahlen nehmen während der Infektion schnell in der Glaskörperumgebung zu, was zu Schwellungen des Auges führen kann. Daher sollte darauf geachtet werden, das Auge während der Ernte sanft zu entfernen, um einen Bruch des Globus zu verhindern. Darüber hinaus muss die Kappe des Ernterohrs, das das infizierte Auge enthält, ausreichend angezogen werden, bevor das Rohr in einen Gewebehomogenisator gegeben wird. Eine lose Kappe führt zu Leckagen und Kontamination des Gewebehomogenisators, was zu einer ungenauen Quantifizierung von Bakterien in den undichten Rohren führt. Das Augenhomogenisierungsverfahren erhöht auch die Temperaturen der Rohre. Daher wird empfohlen, 1 Minute zu einem Zeitpunkt zu homogenisieren. Erhöhte Temperaturen könnten die Quantifizierung einiger Infektionsparameter beeinflussen. Während diese Methode nicht die Anzahl der Bakterien innerhalb bestimmter Stellen des Auges liefert, in Kombination mit histologischen Methoden, können wir abschätzen, wo Bakterien lokalisiert werden könnten. Die Lokalisation von B. cereus im Auge während der Endophthalmitis wurde bei Kaninchen berichtet, deren Augen größer und leichter in Subkomzer seziert werden. 2

IntravitrealE Injektion imitiert die Lieferung von Organismen in das hintere Segment des Auges, die Infektion initiiert. Dieser erste Schritt erleichtert die qualitative und quantitative Untersuchung von Infektionsparametern in einem hochreproduzierbaren Mausmodell der experimentellen Endophthalmitis. Diese Modelle werden auch verwendet, um Augenentzündungen zu schätzen, indem Myeloperoxidase in infiltrierende Neutrophile quantifiziert, spezifische Zelltypen durch Durchflusszytometrie identifiziert, Zytokine und Chemokine durch Echtzeit-PCR und/oder ELISA quantifiziert und die okulare Architektur durch Histopathologie1,6,19,20,26,27,34,35,38beobachtet werden. Infizierte Mausaugen werden mit unterschiedlichen Verdünnungsmittel geerntet, abhängig von der Art der zu messenden Infektionsparameter. Für die Genexpressionsanalyse ist ein anderer Lysepuffer erforderlich26. Für die histopathologische Untersuchung werden geerntete Augen in eine fixative Lösung gelegt. Die Vielzahl der genetischen Knockout-Mäuse erleichtert auch die Untersuchung der Rolle verschiedener Immunfaktoren und Zellen. Die intravitreale Injektion ist daher eine tragende Methode für Forscher auf dem Gebiet der intraokularen Infektionen und Therapeutika.

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Disclosures

Die Autoren haben keine finanziellen Konflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Feng Li und Mark Dittmar (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, USA) für ihre Unterstützung. Unsere Forschung wurde von den Nationalen Gesundheitsinstituten R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 und R01EY024140 unterstützt. Unsere Forschung wurde auch durch P30EY21725 (NIH CORE Grant for Live Animal Imaging and Analysis, Molecular Biology, and Cellular Imaging) unterstützt. Unsere Forschung wurde auch durch das NEI Vision Science Pre-Doctoral Trainee Programm 5T32EY023202, ein Presbyterian Health Foundation Research Support Stipendium und ein uneingeschränktes Stipendium an das Dean A. McGee Eye Institute von Research to Prevent Blindness unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-20 µL pipette RANIN L0696003G NA
37oC Incubator Fisher Scientific 11-690-625D NA
Bacto Brain Heart Infusion BD 90003-032 NA
Cell Microinjector MicroData Instrument, Inc. PM2000 NA
Fine tip forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-122 NA
Glass beads 1.0 mm BioSpec 11079110 NA
Incubator Shaker New Brunswick Scientific NB-I2400 NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters Kimble 71900-5 NA
Micro-Pipette Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 NA
Microscope Axiostar Plus Zeiss NA
Microscope OPMI Lumera Zeiss NA
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 NA
Multichannel pipette 30-300 µL Biohit 15626090 NA
Multichannel pipette 5-100 µL Biohit 9143724 NA
Needle/Pipette Puller Kopf 730 NA
PBS GIBCO 1897315 Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Molecular grade
Reverse action forceps Katena K5-8228 NA

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References

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Immunologie und Infektion Problem 168 bakterielle Augeninfektion intraokulare bakterielle Quantifizierung Augeninfektionsparameter intravitreale Injektion intraokulare Injektion Endophthalmitis
Intravitreale Injektion und Quantifizierung von Infektionsparametern in einem Mausmodell der bakteriellen Endophthalmitis
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Mursalin, M. H., Livingston, E., Coburn, P. S., Miller, F. C., Astley, R., Callegan, M. C. Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis. J. Vis. Exp. (168), e61749, doi:10.3791/61749 (2021).

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