Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Intravitreal injeksjon og mengde infeksjon parametere i en musemodell av bakteriell endoftalmitt

Published: February 6, 2021 doi: 10.3791/61749
Automatic Translation
*1,2, *1, 2,3, 4, 2,3, 1,2,3
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver her en metode for intravitreal injeksjon og påfølgende bakteriell kvantitet i musemodell av bakteriell endoftalmitt. Denne protokollen kan utvides for måling av vertens immunresponser og bakterielle og vertsgenuttrykk.

Abstract

Intraokulære bakterielle infeksjoner er en fare for synet. Forskere bruker dyremodeller for å undersøke verten og bakterielle faktorer og immunresponsveier forbundet med infeksjon for å identifisere levedyktige terapeutiske mål og for å teste legemidler for å forhindre blindhet. Den intravitreale injeksjonsteknikken brukes til å injisere organismer, legemidler eller andre stoffer direkte inn i glasslegemet i det bakre segmentet av øyet. Her demonstrerte vi denne injeksjonsteknikken for å initiere infeksjon i museøyet og teknikken for å kvantifisere intraokulære bakterier. Bacillus cereus ble dyrket i hjernen hjerte infusjon flytende media i 18 timer og resuspended til en konsentrasjon 100 koloni forming enheter (CFU) / 0,5 μL. En C57BL/6J-mus ble bedøvet ved hjelp av en kombinasjon av ketamin og xylazin. Ved hjelp av en picoliter mikroinjektor og glasskapillære nåler, ble 0,5 μL av Bacillus suspensjon injisert i midten glasslegemet av museøyet. Det kontralaterale kontrolløyet ble enten injisert med sterilt medium (kirurgisk kontroll) eller ble ikke injisert (absolutt kontroll). Ved 10 timer etter infeksjon ble mus eutanisert, og øynene ble høstet ved hjelp av sterile kirurgiske pinsett og plassert i et rør som inneholder 400 μL sterile PBS og 1 mm sterile glassperler. For ELISAs eller myeloperoxidaseanalyser ble proteinasehemmer tilsatt i rørene. For RNA-ekstraksjon ble den aktuelle lysisbufferen lagt til. Øynene ble homogenisert i en vev homogenisator i 1-2 minutter. Homogenater ble serielt fortynnet 10 ganger i PBS og spor fortynnet på agarplater. Resten av homogenatene ble lagret ved -80 °C for ytterligere analyser. Platene ble inkubert i 24 timer og CFU per øye ble kvantifisert. Disse teknikkene resulterer i reproduserbare infeksjoner i museøynene og letter kvantitet av levedyktige bakterier, vertens immunrespons og omics av vert og bakteriell genuttrykk.

Introduction

Bakteriell endoftalmitt er en ødeleggende infeksjon som forårsaker betennelse, og hvis den ikke behandles riktig, kan det føre til tap av syn eller blindhet. Endoftalmitt skyldes inntreden av bakterier i det indre av øyet1,2,3,4,5. En gang i øyet, bakterier replikere, produsere giftstoffer og andre skadelige faktorer, og kan forårsake irreversible skader på delikate retinale celler og vev. Okulær skade kan også skyldes betennelse, på grunn av aktivering av inflammatoriske veier som fører til inflammatorisk celletilstrømning til det indre av øyet1,5,6. Endoftalmitt kan oppstå etter intraokulær kirurgi (postoperativ), en gjennomtrengende skade på øyet (posttraumatisk), eller fra metastatisk spredning av bakterier inn i øyet fra et annet anatomisk sted (endogene)7,8,9,10. Behandlinger for bakteriell endoftalmitt inkluderer antibiotika, antiinflammatoriske legemidler eller kirurgisk inngrep3,4,11. Selv med disse behandlingene kan synet eller øyet i seg selv gå tapt. Den visuelle prognosen etter bakteriell endoftalmitt varierer vanligvis avhengig av behandlingseffektiviteten, synsskarpheten ved presentasjon og virulens av den smittende organismen.

Bacillus cereus (B. cereus) er en av de store bakterielle patogener som forårsaker posttraumatisk endoftalmitt7,12. Et flertall av B. cereus endoftalmitt tilfeller har en rask kurs, noe som kan resultere i blindhet innen få dager. Kjennetegnene på B. cereus endoftalmitt inkluderer raskt utviklende intraokulær betennelse, øyesmerter, raskt tap av synsskarphet og feber. B. cereus vokser raskt i øyet sammenlignet med andre bakterier som vanligvis forårsakerøyeinfeksjoner 2,4,12 og har mange virulensfaktorer. Derfor er vinduet for vellykket terapeutisk intervensjon relativt kort1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Behandlinger for denne infeksjonen er vanligvis vellykket i behandling av endoftalmitt forårsaket av andre mindre virulent patogener, men B. cereus endoftalmitt resulterer vanligvis i større enn 70% av pasientene som lider av betydelig synstap. Omtrent 50% av disse pasientene gjennomgår evisceration eller enucleation av det infiserteøyet 7,16,22,23. Den destruktive og raske naturen til B. cereus endoftalmitt krever umiddelbar og riktig behandling. Nylig fremgang i å skjelne de underliggende mekanismene for sykdomsutvikling har identifisert potensielle mål for intervensjon19,26,27. Eksperimentelle musemodeller av B. cereus endoftalmitt fortsetter å være nyttige for å skjelne mekanismene for infeksjon og teste potensielle terapeutiske midler som kan forhindre synstap.

Eksperimentell intraokulær infeksjon av mus med B. cereus har vært en instrumentell modell for å forstå bakterielle og vertsfaktorer, samt deres interaksjoner, under endoftalmitt28. Denne modellen etterligner en posttraumatisk eller postoperativ hendelse, der bakterier blir introdusert i øyet under en skade. Denne modellen er svært reproduserbar og har vært nyttig for testing av eksperimentelle terapier og gi data for forbedringer i standard foromsorg 1,6,19,29,30. Som mange andre infeksjonsmodeller gir denne modellen mulighet for uavhengig kontroll av mange infeksjonsparametere og muliggjør effektiv og reproduserbar undersøkelse av infeksjonsutfall. Studier i en lignende modell hos kaniner de siste tiårene har undersøkt effekten av B. cereus virulens faktorer i øyet2,4,13,14,31. Ved å injisere B. cereus muterte stammer som mangler individuelle eller flere virulensfaktorer, kan bidraget fra disse virulensfaktorene til sykdomsalvorlighetsgrad måles ved utfall som konsentrasjon av bakterier på forskjellige timer etter infection eller tap av visuellfunksjon 13,14,27,31,32. I tillegg har vertsfaktorer blitt undersøkt i denne modellen ved å infisere knockout-musstammer som mangler spesifikke inflammatoriskevertsfaktorer 26,29,33,34,35. Modellen er også nyttig for å teste potensielle behandlinger for denne sykdommen ved å injisere nye forbindelser i øyet etter infeksjon30,36. I dette manuskriptet beskriver vi en detaljert protokoll som inkluderer å infisere et museøye med B. cereus, høste øyet etter infeksjon, kvantifisere intraokulær bakteriell belastning og bevare prøver for å analysere ytterligere parametere for sykdomsalvorlighetsgrad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer ble utført etter anbefalingene i Veiledningen for pleie og bruk av laboratoriedyr og Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Protokollene ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Oklahoma Health Sciences Center (protokollnummer 15-103, 18-043 og 18-087).

1. Sterile glassnåler

  1. Slå på nålepipettetrekkeren.
  2. Juster varmebryteren til displayet viser 12.6.
  3. Åpne døren og mat 5 μL kapillærrøret manuelt gjennom den øvre klemmen og varmeapparatfilamentet til halvparten av slangen strekker seg under filamentet (figur 1A).
  4. Kontroller at kapillærrøret er i "V"-sporet i den øvre klemmen. Stram den øvre klemmen.
  5. Mens den nedre klemmen er åpen, justerer du det vertikale lysbildet manuelt til den nedre klemmen når sin øvre grense. Kontroller at røret er i "V"-sporet i den nedre klemmen. Stram den nedre klemmen.
  6. Lukk døren og bekreft at "Klar"-lampen er på. Trykk på Start -knappen for å starte varmeapparatet og trekke i rekkefølge (figur 1B).
  7. Pass på at varmeren slås av automatisk etter at varme og tyngdekraften trekker kapillærrøret fra hverandre (figur 1C), og at lysbildet beveger seg nedover.
  8. Åpne døren. Mens du holder toppen av kapillærrøret, løsner du den øverste klemmen. Fjern det øvre kapillærrøret og sett det til side.
  9. Hold kapillærrøret i det nederste lysbildet og stram den nedre klemmen. Fjern det nedre kapillærrøret og sett det til side.
  10. Bruk en mikroelektrod beveler med en 0,05 μm alumina slipeplate for å skråne det trukket kapillærrøret for å lage injeksjonsnåler.
  11. Pipette nok vann på slipeplaten til å dekke overflaten (figur 1D).
  12. Slå påfasingen slik at den begynner å rotere ved 60 o/min. Plasser det trekkede kapillærrøret i pipetteklemmen i "V"-sporet. Stram klemmen og juster vinkelen på pipetteklemmen til 30°.
  13. Juster spissen av den spisse kanten av kapillærrøret ca to tredjedeler avstand fra midten av rotasjonen av slipeplaten.
  14. Senk det klemmede kapillærrøret ved å justere den grove kontrollknappen øverst på manipulatoren. Fortsett å senke kapillærrøret til spissen av kapillærrøret strekker seg under vannoverflaten og kommer i kontakt med slipeplatens slipende overflate.
  15. Overvåk skråfremdriften ved hjelp av mikroskopet som er festet tilfaseren. Etter 5 min, juster den fine kontrollen for å heve glassnålen fra slipeplaten.
  16. Fjern glassnålen og plasser den under 10x forstørrelse for å kontrollere spissen av kapillærrøret (figur 1E, F).
  17. For å sikre at det ikke er noen blokkeringer, sett glassnålen inn i en pipetteholder på en sprøyte og skyv luft inn i et 1 ml rør på 99% etanol. Hvis luftbobler dannes på spissen av nålen, har nålen ingen blokkeringer og kan brukes til mikroinjeksjon. Denne prosessen sikrer også steriliteten til glassnålene.
  18. Ett kapillærrør kan holde opptil 5 μL væske. Merk kapillærrøret i 10 seksjoner for å beregne avstandene på nålen for å markere for 0,5 μL volumer. Merk en skala med den avstanden som holder 0,5 μL for fremtidig forberedelse. For en 5 μL kanyle tilsvarer avstandene på 0,7 mm fra hverandre 0,5 μL (figur 1G).

2. Bacillus cereus kultur

  1. Utfør alle prosedyrer i dette avsnittet under Biosafety Level 2 forhold.
  2. Strekfryser av B. cereus ATCC 14579 for enkeltkoloniisolasjon på en 5% saublodgarplate og inkuber over natten ved 37 °C (figur 2A).
  3. Pipette 5 ml steril hjernehjerteinfusjon (BHI) buljong i et 10 ml sterilt snap-cap rør (figur 2B). Bruk en steril løkke eller nål, velg en enkelt koloni av B. cereus ATCC 14579 fra agarplaten og inokuler væsken BHI.
  4. Vortex prøven kort. Plasser snap-cap-røret i en roterende inkubator. Still inn temperaturen ved 37 °C og hastighet ved 200 o/min. Etter 18 timer, fjern kulturen fra inkubatoren (figur 2B).

3. Bakteriell fortynning for intravitreal injeksjon

  1. Utfør alle prosedyrer i dette avsnittet under Biosafety Level 2 forhold.
  2. Beregn volumet av natten B. cereus kultur for å legge til 10 ml frisk BHI for å oppnå 200 kolonidannende enheter per mikroliter (CFU / μL). For eksempel replikerer en kultur over natten av B. cereus i BHI til ca. 2 x 108 CFU/ml, som deretter kan fortynnes til 200 CFU/μL ved å pipe 10 μL av overnattingskulturen i 10 ml frisk BHI.
  3. Pipette 1 ml av den nyfortynnede kulturen i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Hold dette røret på is til intravitreal injeksjon. Utfør intravitreal injeksjon innen 60 min for fortynnende bakteriell kultur.

4. Mus intravitreal injeksjon

  1. Utfør alle prosedyrer i dette avsnittet under Biosafety Level 2 forhold.
  2. Forbered prosedyrestedet ved å plassere medisinske underputer på operasjonsbordet.
  3. Slå på mikroinjektoren og åpne gassventilen på trykklufttanken festet til mikroinjektoren. Juster tankregulatoren til gassleveringen er ca. 60 psi.
  4. Trykk modus på mikroinjektoren til skjermen viser Balanse. Trykk På Balanse og plasser datamusen på operasjonsbordet. Koble pipetteholderen i rustfritt stål til slangen som er festet til injektorens fyll/utgang. Dette røret er alltid koblet til injektoren.
  5. Sett kapillærnålen inn i den andre enden av pipetteholderen ved å skru rørholderkontakten rundt nålen.
  6. Slå på oftalmisk mikroskop og slå på lyset til en intensitet på 50%. Juster mikroskopet over prosedyrestedet på operasjonsbordet og juster mikroskopet til ønsket fokus.
  7. Før prosedyren begynner, må du bekrefte at musen er tilstrekkelig bedøvet ved å teste pedaluttaksrefleksen. Sørg for å følge din IACUC godkjentprotokoll for anestesi.
  8. Plasser den bedøvede musen på de medisinske underputene med nesen pekende mot høyre og lener seg på venstre side.
  9. Se på musens høyre øye gjennom oftalmisk mikroskop og åpne lokkene ved å åpne tangen på en omvendt virkningstang på hver side av øyet for å eksponere injeksjonsstedet (figur 3C).
  10. Fyll kapillærnålen med fortynningen på 200 CFU/μL ved å klikke på musematten som er koblet til mikroinjektoren (figur 3D).
  11. Fest dyrets hode med venstre hånd og plasser tuppen av nålen på øyets lem. Med nålen i skråstilling og i 45° vinkel punkterer du museøyet, men sørg for at bare den skarpe spissen av nålen (~ 0,5 mm) settes inn ved injeksjon.
  12. Når nålespissen er satt inn, flytter du venstre hånd fra musehodet til musematten og høyreklikker på musematten for å injisere 0,5 μL av B. cereus fortynning. For å unngå lekkasje, la nålespissen inne i museøyet stå i 2-3 sekunder før du fjerner (figur 3E)1,19,26,27,32,34,36,37,38.
  13. Slipp tangen og plasser musen i et bur som sitter på en varmepute. Overvåk disse musene til de har kommet seg fra anestesi (figur 3F).
  14. Når musene er gjenopprettet fra anestesi, returner buret til riktig stativ. Hvis musene vil bli utsatt for retinal funksjonsanalyse av elektroretinografi, bør bur returneres til et mørkt rom for riktig mørk tilpasning.

5. Preparat av høstingsrør

  1. Plasser 1 mm sterile glassperler i 1,5 ml skruehetterør.
  2. Steriliser disse rørene i en autoklav på en tørr innstilling. La rørene avkjøles til romtemperatur før bruk.
  3. Tilsett 10 ml 1x steril fosfatbufret saltvann (PBS) i et sterilt sentrifugerør på 15 ml.
  4. Tilsett 1 tablett proteasehemmercocktailtablett i røret. Bland ved vortexing19,27,29,34,35.
  5. Pipette 400 μL 1x fosfatbufret saltvann (PBS) som inneholder proteasehemmer i hvert autoklavert avlingsrør. Merk rørene og legg på is. (Figur 4A).

6. Høsting øynene

  1. Utfør alle prosedyrer i dette avsnittet under Biosafety Level 2 forhold.
  2. Euthanize musen ved CO2 innånding. Bruk en sekundær metode for å bekrefte eutanasi.
  3. Hold det eutaniserte musehodet sikkert og åpne de fine spissene på hver side av det infiserte øyet. Skyv ned mot hodet for å proptose øyet. Når tangene er bak øyets klode, klem tangene sammen. Trekk tangen bort fra hodet for å løsne øyeeplet (figur 4B).
  4. Plasser umiddelbart øyeeplet i et merket høstrør. Plasser rørene på is i ikke mer enn 60 min (figur 4C).

7. Intraokulær bakterietelling

  1. Utfør alle prosedyrer i dette avsnittet under Biosafety Level 2 forhold.
  2. Kontroller at alle innhøstingsrør er tett lukket og er balansert mens du er i vevshomogenisatoren (figur 5A). Slå på vevhomogenisatoren i 1 min for å homogenisere prøvene. Vent til 30 s, og slå deretter på i et minutt til. Plasser rørene på is (figur 5B,C).
  3. Serialt fortynne hver prøve 10 ganger ved sekvensielt overføring av 20 μL av homogenatet til 180 μL av steril 1x PBS. Fortynn til en faktor på 10-7 er nådd (figur 5D).
  4. Merk hver rad med en varm, firkantet BHI-plate med de riktige fortynningsfaktorene. Overfør 10 μL av hver fortynning på rad til den øverste BHI-platen som vippes ca. 45°. La prøven kjøre til den nesten når bunnen av platen, og legg deretter platen flatt (figur 5E)39.
  5. Når prøven absorberes i BHI agar, overfør platen til en 37 °C inkubator. Kolonier skal begynne å være synlige 8 timer etter å ha blitt plassert i inkubatoren.
  6. Fjern platen fra inkubatoren før veksten av B. cereus kolonier forstyrrer identifisere individuelle kolonier (Figur 5F).
  7. For en nøyaktig representasjon av konsentrasjonen i prøven, telle raden som har mellom 10-100 kolonier. For eksempel vil en rad med fortynningsfraksjonen på 10-4 som har 45 kolonier ha en konsentrasjon på 4,5 x 105 CFU / ml.
  8. For å beregne det totale antall bakterier per øye, multiplisere konsentrasjonen med 0,4, som representerer millilitervolumet på 1x PBS som brukes til å homogenisere øyet. For eksempel vil konsentrasjonen på 4,5 x 105 CFU/ml oversettes til 1,8 x 105 CFU B. cereus per øye.

8. Bevaring av prøver

  1. Plasser homogene prøver i en merket fryseboks og legg denne boksen i en -80 °C fryser. Disse prøvene kan brukes senere til inflammatorisk mekleranalyse av ELISA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generering av reproduserbar inokul og nøyaktighet av intravitreal injeksjonsprosedyren er viktige trinn i utviklingen av modeller av mikrobiell endoftalmitt. Her demonstrerte vi den intravitreale injeksjonsprosedyren ved hjelp av Gram-positive Bacillus cereus. Vi injiserte 100 CFU/0,5 μL B. cereus i midten av glasslegemet på fem C57BL6-mus. Etter 10 timer etterinfeksjon observerte vi intraokulær vekst av B. cereus til ca. 1,8 x 105 CFU/øye. Figur 1 demonstrerer bygging av glassnåler for å levere bakteriene inn i midten av museøynene. Bacillus cereus vokser på en blod agar plate og i kulturrør er vist i figur 2. Figur 3 viser musen intravitreal injeksjon prosedyre ved hjelp av en luft trykksatt injeksjon system. Figur 4 demonstrerer prosessen med å høste de infiserte øynene etter ønsket tid etterinfeksjon. Figur 5 viser teknikken for homogenisering av de infiserte øynene. Figur 6 viser intraokulære bakterietall fra fem forskjellige museøyne ved 10 timer etterinfeksjon. Figur 7 viser den generelle prosedyren og en grafisk representasjon av en mus intravitreal injeksjon.

Figure 1
Figur 1: Lage skråglassnåler. Glassnåler ble laget av engangs mikrokapillærpipetter ved hjelp av en nål / pipette avtrekker og en mikropipette beveler. (A) Fastklemt glasskapillærrør i nålen/pipettetrekkeren. (B, C) Opprettelse av glassnåler ved hjelp av ønsket spenning. (D) Skrånende glass mikropipetter. (E, F) Glassmikropipetter før og etter skrånende. Skaleringav glassnåler. Mellomrom mellom to svarte punkter holder 0,5 μL. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Bacillus cereus ATCC 14579.  Bacillus cereus vokser på en blodagarplate. Individuelle kolonier av B. cereus viser vanligvis klare soner av hemolyse på en blod agar plate. (B)Turbid over natten kulturer av B. cereus. Gram-farging av B. cereus. B. cereus er Gram-positive stangformede bakterier. (D) Electron mikrograf av Bacillus cereus. Denne elektronmikrografen viser stangformet Bacillus cereus med hår som strukturer kalt flagella. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Mus intravitreal injeksjon. Injeksjonsprosedyren utføres ved hjelp av en trykksatt luftinjektor med visning av operasjonsfeltet ved hjelp av et kommersielt mikroskop (A) ketamin og xyazinstoff for å bedøve musen. (B) Administrering av ketamin og xyazin ved intraperitoneal injeksjon for å bedøve musen. (C) Klemming periocular hud tilbake for å proptose øyet. (D)Fylle opp nålene med bakterier ved hjelp av luft trykkinjektor. Intravitrealinjeksjon. (F)Overvåking infisert mus etter anestesi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Høsting av museinfiserte øyne. Post-infeksjon, etter ønsket tidspunkt, høste infiserte museøyne ved hjelp av sterile pinsett. PBSinneholder sterile glassperler. (B)Høsting av det infiserte øyet. (C) Harvest tube som inneholder et museøye. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Behandling av det høstede øyet for intraokulær bakterietelling. (A)Høstrør med infisert øye klemt tett til en vev homogenisator. (B) Infiserte øyne ble homogenisert to ganger i 1 min hver. Spor fortynning (D) av øyet homogenater (C) og påfølgende plating (E) for bakteriell kvantitet. (E) Representativ individuell Bacillus cereus koloni etter spor fortynning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Intraokulære bakterietall ved 10 timer etterinfeksjon. M, musenummer. CFU, kolonidannende enheter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Mus intravitreal injeksjon. (A)Total flytskjema av musen intravitreal injeksjon prosedyre. (B)Grafisk presentasjon av intravitreal injeksjon. Under prosedyren settes sterile, skråglassnåler som inneholder en kultur av B. cereus inn i midten av museøyet, og B. cereus leveres ved hjelp av et lufttrykksklimainjeksjonssystem. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv med tilgjengeligheten av potente antibiotika, antiinflammatoriske legemidler og vitrektomikirurgi, kan bakteriell endoftalmitt blinde en pasient. Kliniske studier har vært nyttige for å studere endoftalmitt; Eksperimentelle modeller av endoftalmitt gir imidlertid raske og reproduserbare resultater som kan oversettes til fremgang i standardbehandling, noe som resulterer i bedre visuelt resultat for pasientene.

Glasslegemet i museøyet er ca. 7 μL40. Dette lille volumet gjør det bare mulig å injisere en begrenset mengde materiale. Volumer over 1,0 μL skal ikke injiseres for å unngå okulær skade. Prosessen krever spesifikt utstyr og praksis av teknikker for å sikre reproduserbarhet og nøyaktighet. Endoftalmitt har blitt studert i primater, svin, kaniner, rotter, marsvin og i musen28,41,42,43,44,45. Blant de større artene er øynene mye nærmere i størrelse til menneskelige øyne, og intravitreale injeksjoner i større øyne kan utføres uten spesialutstyr. Bortsett fra musen, begrenser fraværet av knockout-stammer og reagenser for å studere vertens immunresponser i andre dyremodeller deres nytte i eksperimentell endoftalmitt.

Endoftalmitt forekommer oftest som en komplikasjon av kataraktkirurgi. Denne infeksjonen kan også oppstå etter penetrerende okulær traumer eller systemisk infeksjon. Det visuelle resultatet i denne sykdommen avhenger delvis av virulensen av det infiserende patogenet. Hos mus avhenger det visuelle utfallet også av deres immunstatus. Forstå mekanismene for sykdom patogenese har blitt tilrettelagt ved å studere sykdommen i eksperimentelle dyremodeller28. Protokollen for mus intravitreal injeksjon og kvantifisering av infeksjon parametere kan tilpasses for å studere endoftalmitt initiert med nesten alle typer bakteriell eller sopp patogen28. Videre kan denne protokollen også brukes og endres for å studere anatomiske endringer, inflammatoriske prosesser og genuttrykksprofilene til både bakterier og vert under infeksjon.

Mus intravitreal injeksjon og påfølgende analyse av infeksjonsparametere består av flere kritiske trinn (figur 7). Glassnålen må opprettes nøyaktig, merkes og steriliseres. Den skarpe enden av skråglass nål og riktig skalering bestemmer tilstrekkelig levering av bakterier og kloden punktering. Hvis enden av nålen er kort og ikke er riktig skråstilt, kan det skape et stort hull på kloden som kan forårsake lekkasje, forurensning av kloden og et unøyaktig sykdomsutfall. Derfor anbefales det å observere glassmikropipettene mens de skrår under 10x optisk zoom av et lyst feltmikroskop. For å sikre levering av riktig mengde bakterier, bør fortynninger beregnes på forhånd, og riktig volumskala bør merkes på glassnålen. Parametere for nåletrekking og skrånende bruk av andre typer utstyr kan variere.

Den beskrevne intravitrealinjeksjonsteknikken benytter et mikroinjektorsystem med trykktrykk for riktig levering av bakteriene inn i museøyet1. Riktig bruk av denne mikroinjektoren er avgjørende for reproduserbare infeksjonsparametre. Siden lufttrykket bestemmer leveringshastigheten, kan overdreven kraft raskt injisere et større volum i øynene, noe som forårsaker overdreven intraokulært trykk og / eller kloden brudd. Derfor er anbefalingen å bruke et trykk på 10-13 psi for å fylle og injisere under prosedyren. Et annet potensielt problem er lekkasje av bakteriell løsning fra glassnåler etter fylling. Lekkasje kan føre til injeksjon av unøyaktige volumer i museøynene. Kontroller alltid forbindelsene mellom injeksjonssystemet, slangen og glassnåler før injeksjoner.

Injeksjon av nøyaktige mengder bakterier er avgjørende for reproduserbarheten av eksperimentell bakteriell endoftalmitt. Ulike eksperimentelle endoftalmitt modeller krever inokulasjon av bestemte antall bakterier12,28,46,47,48,49. For B. cereus endoftalmitt er det nødvendig å injisere 100 CFU for å initiere en reproduserbar infeksjon1. Siden bakterieveksten avhenger av vekstmediet og forholdene, må vekstmiljøet, media og fortynninger gjentas hver gang. Derfor anbefales det å teste kulturforholdene før forsøket for å reprodusere nøyaktig inokulum i riktig volum for injeksjon. Som nevnt ovenfor er den øvre grensen for intravitreal injeksjon i museøynene 1,0 μL28. Et overdrevent volum løfter det intraokulære trykket som kan resultere i glaukom, løsne netthinnen fra det bakre segmentet eller bryte kloden. Intravitreal injeksjon og den resulterende infeksjonen hos mus kan ikke perfekt etterligne B. cereus endoftalmitt hos et menneske. De fleste dyremodeller av menneskelig sykdom er begrenset på denne måten. Kjente mengder B. cereus injiseres i øyet etter vekst i næringsrike medier. For kliniske tilfeller av B. cereus endoftalmitt er infiserende mengder ikke kjent, og forurensningskildene varierer. Fordelene ved å bruke karakteriserte organismer og musestammer og generere reproduserbare infeksjonskurs oppveier imidlertid disse begrensningene.

Riktig høsting av infiserte øyne er et annet kritisk skritt. Opprettholde aseptiske forhold er avgjørende for å unngå krysskontaminering som kan forstyrre tolkningen av dataene. Derfor er anbefalingen å desinfisere arbeidsbenken og alle instrumenter med 70% etanol før høsting. Bakterietallene øker raskt inne i glasslegemet under infeksjon, noe som kan forårsake hevelse i øyet. Derfor bør det tas hensyn til å forsiktig fjerne øyet under høsting forhindre brudd på kloden. Videre må hetten på innhøstingsrøret som inneholder det infiserte øyet strammes tilstrekkelig før røret plasseres i vevshomogenisator. En løs hette vil resultere i lekkasje og forurensning av vevhomogenisatoren som fører til unøyaktig mengde bakterier i de lekkende rørene. Øyehomogeniseringsprosedyren øker også temperaturen på rørene. Derfor anbefales det å homogenisere 1 minutt om gangen. Forhøyede temperaturer kan påvirke mengden av noen infeksjonsparametere. Selv om denne metoden ikke gir antall bakterier innenfor bestemte steder av øyet, når det kombineres med histologiske metoder, kan vi anslå hvor bakterier kan lokaliseres. Lokalisering av B. cereus i øyet under endoftalmitt er rapportert hos kaniner, hvis øyne er større og lettere dissekert til underavdelinger. 1.2 Km 2

Intravitreal injeksjon etterligner levering av organismer til det bakre segmentet av øyet, som initierer infeksjon. Dette første trinnet letter den kvalitative og kvantitative studien av infeksjonsparametere i en svært reproduserbar musemodell av eksperimentell endoftalmitt. Disse modellene brukes også til å estimere okulær betennelse ved å kvantifisere myeloperoxidase i infiltrering av nøytrofiler, identifisere spesifikke celletyper ved strømningscytometri, kvantifisere cytokiner og chemokines av sanntids PCR og / eller ELISA, og observere okulær arkitektur ved histopatologi1,6,19,20,26,27,34,35,38. Infiserte museøyne høstes med forskjellige fortynningsmidler avhengig av hvilken type infeksjonsparametere som skal måles. For genuttrykksanalyse kreves en annen lysisbuffer26. For histopatologisk undersøkelse plasseres høstede øyne i en fikseringsløsning. Mangfoldet av genetiske knockoutmus letter også studien rollen til ulike immunfaktorer og celler. Intravitreal injeksjon er derfor en bærebjelke teknikk for forskere innen intraokulære infeksjoner og terapeutiske midler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen økonomiske konflikter å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Feng Li og Dittmar (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, USA) for deres hjelp. Vår forskning har blitt støttet av National Institutes of Health tilskudd R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947, og R01EY024140. Vår forskning har også blitt støttet av P30EY21725 (NIH CORE stipend for Live Animal Imaging and Analysis, Molecular Biology, og Cellular Imaging). Vår forskning har også blitt støttet av NEI Vision Science Pre-doctoral Trainee program 5T32EY023202, en Presbyterian Health Foundation Research Support stipend, og en ubegrenset tilskudd til Dean A. McGee Eye Institute fra forskning for å hindre blindhet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-20 µL pipette RANIN L0696003G NA
37oC Incubator Fisher Scientific 11-690-625D NA
Bacto Brain Heart Infusion BD 90003-032 NA
Cell Microinjector MicroData Instrument, Inc. PM2000 NA
Fine tip forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-122 NA
Glass beads 1.0 mm BioSpec 11079110 NA
Incubator Shaker New Brunswick Scientific NB-I2400 NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters Kimble 71900-5 NA
Micro-Pipette Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 NA
Microscope Axiostar Plus Zeiss NA
Microscope OPMI Lumera Zeiss NA
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 NA
Multichannel pipette 30-300 µL Biohit 15626090 NA
Multichannel pipette 5-100 µL Biohit 9143724 NA
Needle/Pipette Puller Kopf 730 NA
PBS GIBCO 1897315 Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Molecular grade
Reverse action forceps Katena K5-8228 NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
  2. Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Pathogenesis of gram-positive bacterial endophthalmitis. Infection and Immunity. 67 (7), 3348-3356 (1999).
  3. Durand, M. L. Bacterial and Fungal Endophthalmitis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (3), 597-613 (2017).
  4. Callegan, M. C., Engelbert, M., Parke, D. W., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Bacterial endophthalmitis: Epidemiology, therapeutics, and bacterium-host interactions. Clinical Microbiology Reviews. 15 (1), 111-124 (2002).
  5. Livingston, E. T., Mursalin, M. H., Callegan, M. C. A Pyrrhic Victory: The PMN Response to Ocular Bacterial Infections. Microorganisms. 7 (11), 537 (2019).
  6. Ramadan, R. T., Moyer, A. L., Callegan, M. C. A role for tumor necrosis factor-alpha in experimental Bacillus cereus endophthalmitis pathogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (10), 4482-4489 (2008).
  7. Davey, R. T., Tauber, W. B. Posttraumatic endophthalmitis: The emerging role of Bacillus cereus infection. Reviews of Infectious Dissease. 9 (1), 110-123 (1987).
  8. Ramappa, M., et al. An outbreak of acute post-cataract surgery Pseudomonas sp. endophthalmitis caused by contaminated hydrophilic intraocular lens solution. Ophthalmology. 119 (3), 564-570 (2012).
  9. Coburn, P. S., et al. Bloodstream-To-Eye Infections Are Facilitated by Outer Blood-Retinal Barrier Dysfunction. PLoS One. 11 (5), 015560 (2016).
  10. Ness, T., Pelz, K., Hansen, L. L. Endogenous endophthalmitis: Microorganisms, disposition and prognosis. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (8), 852-856 (2007).
  11. Novosad, B. D., Callegan, M. C. Severe bacterial endophthalmitis: Towards improving clinical outcomes. Expert Review of Ophthalmology. 5 (5), 689-698 (2010).
  12. Mursalin, M. H., Livingston, E. T., Callegan, M. C. The cereus matter of Bacillus endophthalmitis. Experimental Eye Research. 193, 107959 (2020).
  13. Callegan, M. C., et al. Relationship of plcR-regulated factors to Bacillus endophthalmitis virulence. Infection and Immunity. 71 (6), 3116-3124 (2003).
  14. Beecher, D. J., Pulido, J. S., Barney, N. P., Wong, A. C. Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: Methods and implication of involvement of hemolysin BL. Infection and Immunity. 63 (2), 632-639 (1995).
  15. Callegan, M. C., et al. Contribution of membrane-damaging toxins to Bacillus endophthalmitis pathogenesis. Infection and Immunity. 70 (10), 5381-5389 (2002).
  16. Cowan, C. L. Jr, Madden, W. M., Hatem, G. F., Merritt, J. C. Endogenous Bacillus cereus panophthalmitis. Annals of Ophthalmology. 19 (2), 65-68 (1987).
  17. Callegan, M. C., et al. Virulence factor profiles and antimicrobial susceptibilities of ocular Bacillus isolates. Current Eye Research. 31 (9), 693-702 (2006).
  18. Callegan, M. C., et al. Bacillus endophthalmitis: Roles of bacterial toxins and motility during infection. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3233-3238 (2005).
  19. Mursalin, M. H. Bacillus S-layer-mediated innate interactions during endophthalmitis. Frontiers in Immunology. 11 (215), (2020).
  20. Moyer, A. L., Ramadan, R. T., Novosad, B. D., Astley, R., Callegan, M. C. Bacillus cereus-induced permeability of the blood-ocular barrier during experimental endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3783-3793 (2009).
  21. Callegan, M. C., et al. Efficacy of vitrectomy in improving the outcome of Bacillus cereus endophthalmitis. Retina. 31 (8), 1518-1524 (2011).
  22. David, D. B., Kirkby, G. R., Noble, B. A. Bacillus cereus endophthalmitis. British Journal of Ophthalmology. 78 (7), 577-580 (1994).
  23. Vahey, J. B., Flynn, H. W. Jr Results in the management of Bacillus endophthalmitis. Ophthalmic Surgery. 22 (11), 681-686 (1991).
  24. Wiskur, B. J., Robinson, M. L., Farrand, A. J., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Toward improving therapeutic regimens for Bacillus endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (4), 1480-1487 (2008).
  25. Alfaro, D. V., et al. Experimental Bacillus cereus post-traumatic endophthalmitis and treatment with ciprofloxacin. British Journal of Ophthalmology. 80 (8), 755-758 (1996).
  26. Coburn, P. S., et al. TLR4 modulates inflammatory gene targets in the retina during Bacillus cereus endophthalmitis. BMC Ophthalmology. 18 (1), 96 (2018).
  27. Mursalin, M. H., et al. S-layer Impacts the Virulence of Bacillus in Endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (12), 3727-3739 (2019).
  28. Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
  29. Parkunan, S. M., et al. CXCL1, but not IL-6, significantly impacts intraocular inflammation during infection. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1125-1134 (2016).
  30. LaGrow, A. L., et al. A Novel Biomimetic Nanosponge Protects the Retina from the Enterococcus faecalis Cytolysin. mSphere. 2 (6), 00335 (2017).
  31. Beecher, D. J., Olsen, T. W., Somers, E. B., Wong, A. C. Evidence for contribution of tripartite hemolysin BL, phosphatidylcholine-preferring phospholipase C, and collagenase to virulence of Bacillus cereus endophthalmitis. Infection and Immunity. 68 (9), 5269-5276 (2000).
  32. Callegan, M. C., et al. The role of pili in Bacillus cereus intraocular infection. Experimental Eye Research. 159, 69-76 (2017).
  33. Miller, F. C., et al. Targets of immunomodulation in bacterial endophthalmitis. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100763 (2019).
  34. Parkunan, S. M., Astley, R., Callegan, M. C. Role of TLR5 and flagella in Bacillus intraocular infection. PLoS One. 9 (6), 100543 (2014).
  35. Parkunan, S. M., et al. Unexpected roles for Toll-Like receptor 4 and TRIF in intraocular infection with Gram-positive bacteria. Infection and Immunity. 83 (10), 3926-3936 (2015).
  36. Coburn, P. S., et al. Disarming Pore-Forming Toxins with Biomimetic Nanosponges in Intraocular Infections. mSphere. 4 (3), 00262-00319 (2019).
  37. LaGrow, A., et al. Biomimetic nanosponges augment gatifloxacin in reducing retinal damage during experimental MRSA endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (9), 4632 (2019).
  38. Novosad, B. D., Astley, R. A., Callegan, M. C. Role of Toll-like receptor (TLR) 2 in experimental Bacillus cereus endophthalmitis. PLoS One. 6 (12), 28619 (2011).
  39. Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
  40. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution in the mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (3), 1109-1112 (2006).
  41. Beyer, T. L., O'Donnell, F. E., Goncalves, V., Singh, R. Role of the posterior capsule in the prevention of postoperative bacterial endophthalmitis: experimental primate studies and clinical implications. British Journal of Ophthalmology. 69 (11), 841-846 (1985).
  42. Tucker, D. N., Forster, R. K. Experimental bacterial endophthalmitis. Archives of Ophthalmology. 88 (6), 647-649 (1972).
  43. Alfaro, D. V., et al. Experimental pseudomonal posttraumatic endophthalmitis in a swine model. Treatment with ceftazidime, amikacin, and imipenem. Retina. 17 (2), 139-145 (1997).
  44. Silverstein, A. M., Zimmerman, L. E. Immunogenic endophthalmitis produced in the guinea pig by different pathogenetic mechanisms. American Journal of Ophthalmology. 48 (5), 435-447 (1959).
  45. Ravindranath, R. M., Hasan, S. A., Mondino, B. J. Immunopathologic features of Staphylococcus epidermidis-induced endophthalmitis in the rat. Current Eye Research. 16 (10), 1036-1043 (1997).
  46. Kumar, A., Singh, C. N., Glybina, I. V., Mahmoud, T. H., Yu, F. S. Toll-like receptor 2 ligand-induced protection against bacterial endophthalmitis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 255-263 (2010).
  47. Mylonakis, E., et al. The Enterococcus faecalis fsrB gene, a key component of the fsr quorum-sensing system, is associated with virulence in the rabbit endophthalmitis model. Infection and Immunity. 70 (8), 4678-4681 (2002).
  48. Sanders, M. E., et al. The Streptococcus pneumoniae capsule is required for full virulence in pneumococcal endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 865-872 (2011).
  49. Hunt, J. J., Astley, R., Wheatley, N., Wang, J. T., Callegan, M. C. TLR4 contributes to the host response to Klebsiella intraocular infection. Current Eye Research. 39 (8), 790-802 (2014).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 168 bakteriell øyeinfeksjon intraokulær bakteriell kvantifisering okulær infeksjonsparametre intravitreal injeksjon intraokulær injeksjon endoftalmitt
Intravitreal injeksjon og mengde infeksjon parametere i en musemodell av bakteriell endoftalmitt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mursalin, M. H., Livingston, E.,… More

Mursalin, M. H., Livingston, E., Coburn, P. S., Miller, F. C., Astley, R., Callegan, M. C. Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis. J. Vis. Exp. (168), e61749, doi:10.3791/61749 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter