Summary
स्टेम सेल आधारित चिकित्सा मायोकार्डियल इंफेक्शन के बाद घायल हृदय ऊतकों की मरम्मत के लिए एक कुशल रणनीति के रूप में उभरा है । हम जिलेटिन हाइड्रोगेल का उपयोग करके स्टेम सेल प्रत्यारोपण के लिए वीवो आवेदन में एक इष्टतम प्रदान करते हैं जो एंजाइमेटिक रूप से क्रॉस-लिंक्ड होने में सक्षम हैं।
Abstract
पोस्टइनफेक्ट हार्ट फेलियर को रोकने के लिए वर्तमान कार्डियक स्टेम सेल चिकित्सा का सामना करने वाले प्रमुख मुद्दों में से एक घायल मायोकार्डियम के भीतर प्रत्यारोपित कोशिकाओं की कम प्रतिधारण और जीवित रहने की दर है, जो उनकी चिकित्सीय प्रभावकारिता को सीमित करती है। हाल ही में, मचान बायोमैटेरियल्स के उपयोग में सुधार और स्टेम सेल थेरेपी को अधिकतम करने के लिए ध्यान प्राप्त किया है । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य इंजेक्शन हाइड्रोक्सीफेनाइल प्रोपियोनिक एसिड (जीएच) हाइड्रोगेल का उपयोग करके बोन मैरो-व्युत्पन्न मेसेंचिमल स्टेम सेल (एमएससी) प्रत्यारोपण के लिए एक सरल और सीधी तकनीक शुरू करना है; हाइड्रोगेल सीटू और उच्च जैव अनुकूलता में क्रॉस-लिंक्ड होने की क्षमता के कारण कार्डियक ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए सेल डिलीवरी प्लेटफॉर्म के रूप में अनुकूल हैं। हम एमएससी-लोडिंग जीएच हाइड्रोगेल्स (एमएससी/हाइड्रोगेल) बनाने और विट्रो संस्कृति में त्रि-आयामी (3 डी) में उनके अस्तित्व और प्रसार का मूल्यांकन करने के लिए एक सरल तरीका प्रस्तुत करते हैं । इसके अलावा, हम चूहों में एमएससी/हाइड्रोगेल के इंट्रामायोकार्डियल प्रत्यारोपण के लिए एक तकनीक का प्रदर्शन करते हैं, जो बाएं पूर्वकाल के नीचेती (बालक) कोरोनरी धमनी लिगामेंटेशन और बाद में एमएससी/हाइड्रोगेल प्रत्यारोपण के माध्यम से मायोकार्डियल इंफार्क्शन (एमआई) को प्रेरित करने के लिए एक शल्य प्रक्रिया का वर्णन करते हैं ।
Introduction
कार्डियक स्टेम सेल थेरेपी मायोकार्डियल मरम्मत और पुनर्जनन1,2 के लिए एक संभावित दृष्टिकोण के रूप मेंउभराहै । पशु मॉडल और नैदानिक परीक्षणों में हाल ही में सकारात्मक परिणामों के बावजूद, मायोकार्डियल मरम्मत के लिए स्टेम सेल-आधारित चिकित्सा का अनुप्रयोग कम प्रतिधारण और इनफार्टेड हृदय ऊतकों3,4पर इंजेक्शन कोशिकाओं के खराब अस्तित्व के कारण सीमित है। नतीजतन, सेल आधारित ऊतक इंजीनियरिंग के उपयोग, इंजेक्शन बायोमैटेरियल्स5,कार्डियक पैच6,और सेल शीट7सहित, मेजबान मायोकार्डियम के भीतर सेल प्रतिधारण और एकीकरण में सुधार करने के लिए गहन अध्ययन किया गया है ।
बायोइंजीनियर्ड कार्डियक ऊतक की मरम्मत के लिए विभिन्न संभावित दृष्टिकोणों में, उपयुक्त सेल प्रकारों के साथ संयुक्त इंजेक्शन हाइड्रोगेल, जैसे मेसेंकिमल स्टेम सेल (एमएससी), भ्रूणीय स्टेम सेल (ईएसएसी), और प्रेरित प्लूइपेंट स्टेम सेल (आईपीएससी), मायोकार्डियल क्षेत्रों में कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से वितरित करने के लिए एक आकर्षक विकल्प हैं8,9। जिलेटिन, एक प्रसिद्ध प्राकृतिक बहुलक, जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले बायोमैटेरियल्स की एक विस्तृत श्रृंखला की तुलना में अपनी महान जैव अनुकूलता, काफी बायोडिग्रेडेबिलिटी और कम इम्यूनोजेनिसिटी के कारण एक इंजेक्शन मैट्रिक्स के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि जिलेटिन आधारित इंजेक्शन प्लेटफार्मों में काफी क्षमता है, लेकिन वीवो में उनकी प्रयोज्यता उनकी कम यांत्रिक कठोरता और शारीरिक वातावरण में आसान अपमानजनकता के आधार पर सीमित रहती है।
इन सीमाओं को दूर करने के लिए, वीवो अनुप्रयोगों में हाइड्रोक्सीफेनिल प्रोपियोनिक एसिड से मिलकर जिलेटिन आधारित हाइड्रोगेल का एक उपन्यास और सरल डिजाइन प्रस्तावित किया गया है। जिलेटिन-हाइड्रोक्सीफेनिल प्रोपियोनिक एसिड (जीएच) संयुगरों को एंजाइम, सहिजन पेरोक्सिडेज (एचआरपी) की उपस्थिति में सीटू में क्रॉस-लिंक किया जा सकता है, और बाद में हाइड्रोजेल के भीतर विभिन्न दवाओं, बायोमॉलिक्यूल्स या कोशिकाओं को समाहित किया जा सकता है, जो ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में महान क्षमता का सुझाव देते हैं10,11,12,13, 14। इसके अलावा, हमने हाल ही में जीएच हाइड्रोगेल के चिकित्सीय प्रभावों की जांच की है जिसमें एनक्लोजर एमएससी शामिल हैं और एक मुरीन मॉडल15में एमआई के बाद सफल हृदय की मरम्मत और पुनर्जनन में उनके उपयोग का प्रदर्शन किया है। इस प्रोटोकॉल में, हम जीएच हाइड्रोगेल्स के भीतर एमएससी के एनकैप्सुलेशन और इन विट्रो थ्री-डायमेंशनल (3 डी) प्रसार के लिए एक सरल तकनीक का वर्णन करते हैं। हम कोरोनरी धमनी लिगेशन और एमएससी-लोडिंग जीएच हाइड्रोगेल के इंट्रामायोकार्डियल प्रत्यारोपण के माध्यम से एक मुरीन एमआई मॉडल उत्पन्न करने के लिए डिज़ाइन की गई एक शल्य प्रक्रिया भी पेश करते हैं।
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Protocol
सभी पशु अनुसंधान प्रक्रियाओं प्रयोगशाला पशु कल्याण अधिनियम के अनुसार प्रदान की गई, देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए गाइड और दिशा निर्देशों और कृंतक प्रयोगों के लिए नीतियों के लिए संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा प्रदान की गई कैथोलिक चिकित्सा विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन में ।
1. एमएससी और इंजेक्शन जिलेटिन हाइड्रोगेल की तैयारी
- संस्कृति एमएससी 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 100मिमीकल्चर डिश में। जब एमएससी की वृद्धि 80% संगम तक पहुंचती है, तो डी डीपीबीएस के साथ दो बार डिश धोएं और 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्राइपसिन-विकल्प के 1 मिलियन जोड़ें।
नोट: एमएससी को पारंपरिक प्रक्रियाओं के बाद मुरीन बोन मैरो से अलग किया गयाथा 16,दुल्बेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) में सुसंस्कृत 10% भ्रूण बोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% एंटीबायोटिक− एंटीमायकोटिक समाधान शामिल हैं, और इस अध्ययन के लिए मार्ग 7 \ u20129 के बीच उपयोग किया जाता है। - 3 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर संस्कृति माध्यम और अपकेंद्रित्र के 9 एमएल जोड़ें। इसके बाद, परिणामी सुपरनैंट को त्यागें, पीबीएस के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, और बर्फ पर सेल निलंबन बनाए रखें।
- ट्राइपैन ब्लू के 10 माइक्रोन के साथ सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोन को पतला करें और स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल एकाग्रता प्राप्त करें।
- 1 x 107 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व पर एमएससी को 1 एमएल ट्यूब में रीसुस्पेंड और ट्रांसफर करें ।
- पीबीएस में जीएच संयुग्म समाधान का 6.25 डब्ल्यूटी% तैयार करें और 2 शीशियों में अलग करें। इसके बाद, एचआरपी (जीएच सॉल्यूशन ए) के 6 माइक्रोन/एमएल या एच 2 ओ2(जीएच सॉल्यूशन बी) के 0.07 डब्ल्यूटी% के साथ जीएच समाधान मिलाएं।
नोट: प्रकाशित प्रोटोकॉल12,15के अनुसार जिलेटिन-हाइड्रोक्सीफेनिल प्रोपियोनिक एसिड (जीएच) संयोजित तैयार करें ।- एचआरपी (जीएच सॉल्यूशन ए) और जीएच संयोजित समाधान के लिए एचएच संजूगेट समाधान काक्रमशः 9:1वॉल्यूमेट्रिक अनुपात रखें।
- जीएच समाधान ए के साथ एमएससी को मिलाने से पहले, 1,000 x ग्राम पर सेल निलंबन को संक्षेप में अपकाइज करें और परिणामस्वरूप होने वाले सुपरनेट को सावधानीपूर्वक जाता है। इसके बाद, जीएच समाधान ए के साथ एमएससी युक्त गोली मिलाएं।
2. सीटू एमएससी-लोडिंग और विट्रो संस्कृति में त्रि-आयामी में
- लोड जीएच समाधान ए (एमएससी युक्त) और जीएच समाधान बी दोहरी सिरिंज के दोनों तरफ। एक आठ अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड पर 5 x 106 कोशिकाओं/एमएल के अंतिम घनत्व पर MSCs के साथ संयुक्त GH समाधान के ३०० μL प्लेट ।
- एंजाइमेटिक क्रॉस-लिंकिंग के माध्यम से सीटू हाइड्रोगेल गठन और बाद में एमएससी एनकैप्सुलेशन के बाद, डीएमईएम के 700 माइक्रोन जोड़ें जिसमें 10% एफबीएस और 1% एंटीबायोटिक−एंटीमाइकोटिक समाधान शामिल हैं।
- 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर स्लाइड इनक्यूबेट और संस्कृति माध्यम की जगह हर 2\u20123 दिन।
3. जीएच हाइड्रोगेल्स के भीतर इन विट्रो प्रसार और एमएससी के अस्तित्व की पुष्टि
- जीएच हाइड्रोगेल्स के भीतर 3डी सुसंस्कृत एमएससी की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए, पूर्व निर्धारित इनक्यूबेशन समय के बाद एक जीवित/मृत कोशिका धुंधला परख का उपयोग करें ।
- 3, 5, 7 या 14 दिनों के लिए जीएच हाइड्रोगेल्स में एनकैप्सेटेड एमएससी के इनक्यूबेशन के बाद, माध्यम को एस्पिरेट करें और पीबीएस के साथ दो बार अच्छी तरह से धोएं।
- डीपीबीएस के 10 एमएल में कैल्सीन एएम के 5 माइक्रोन और एथिडियम होमाडिमर-1 (एटीएचडी-1) के 20 माइक्रोन युक्त एक धुंधला समाधान तैयार करें।
- कमरे के तापमान पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए कुएं और इनक्यूबेट के लिए धुंधला समाधान के 200 μL जोड़ें।
- धुंधला समाधान को एस्पिरेट करें और पीबीएस के साथ दो बार अच्छी तरह से धोएं।
- ध्यान से स्लाइड से चैंबर अलग और GH हाइड्रोगेल पर एक पूर्ण कवरस्लिप जगह है। एनकैप्सेटेड एमएससी के प्रसार और रूपात्मक परिवर्तनों की डिग्री की कल्पना करने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें।
नोट: फ्लोरोसेंट छवियों को 200x आवर्धन के तहत अधिग्रहीत किया गया था और कैल्सीन के लिए 470/540 एनएम की उत्तेजन/उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य और एटीएचडी-1 के लिए 516/607 एनएम पर चित्रित किया गया था ।
4. चूहों में मायोकार्डियल इंफेक्शन का शामिल होना
- नमकीन में ज़ोलोटिल (30 मिलीग्राम/किलो) और रोम्पगुन (10 मिलीग्राम/किलो) के मिश्रण के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ 7 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL/6 चूहों (20\u201222 ग्राम) के साथ एनेस्थेटाइज करें ।
- सर्जरी से पहले, हेयर रिमूवल क्रीम का उपयोग करके माउस छाती को हटा दें और आयोडीन के साथ त्वचा को स्टरलाइज करें।
- यांत्रिक वेंटिलेशन के माध्यम से पूरक ऑक्सीजन प्रदान करने के लिए श्वासनली में एक कैथेटर डालने के द्वारा एक ऑपरेटिंग टेबल और इंटूबेट पर माउस रखें।
- सर्जिकल कैंची का उपयोग करके त्वचा के माध्यम से धीरे-धीरे काटें और फिर माइक्रो कैंची द्वारा इंटरकोस्टल मांसपेशियों में प्रवेश करें। एक खुली छाती गुहा बनाए रखने के लिए 5-0 रेशम सीवन का उपयोग करके दूसरी और तीसरी बाईं पसलियों को अलग करें।
- ध्यान से एक 8-0 के साथ एक सुई धारक का उपयोग कर छोड़ दिया पूर्वकाल उतरते (बालक) कोरोनरी धमनी ligate पॉलीप्रोपाइलीन सीवन और इलेक्ट्रोकेटरी का उपयोग करके सीवन को काटें।
- पूर्वकाल बाएं वेंट्रिकुलर दीवार में तत्काल रंग परिवर्तन का निरीक्षण करें।
5. एमएससी-लोडिंग जीएच हाइड्रोगेल का इंट्रामायोकार्डियल प्रत्यारोपण
- बालक लिगेशन द्वारा मायोकार्डियल इन्फेक्शन को प्रेरित करने के बाद, 26G सुई से लैस दोहरी सिरिंज का उपयोग करके एमएससी-लोडिंग जीएच समाधानों को दो अलग-अलग बिंदुओं में इंजेक्ट करें (कुल: 2 x10 5 एमएससी/20 माइक्रोनल) ।
- चरण 1 में वर्णित इसी प्रक्रिया के बाद, एमएससी-लोडिंग जीएच समाधानों को दोहरी सिरिंज में तैयार करें और स्थानांतरित करें।
नोट: इनफार्क क्षेत्र के भीतर एमएससी-लोडिंग जीएच हाइड्रोगेल के एनग्रफ्टमेंट का आकलन करने के लिए, एमएससी और जीएच संजूगेट क्रमशः PHK26 और फ्लोरोसीन आइसोथियोसायनेट (फिटसी) के साथ पूर्व-लेबल किए गए थे।
- चरण 1 में वर्णित इसी प्रक्रिया के बाद, एमएससी-लोडिंग जीएच समाधानों को दोहरी सिरिंज में तैयार करें और स्थानांतरित करें।
- खोला छाती गुहा को बहाल करने और 5-0 टांके का उपयोग कर मांसपेशियों और त्वचा को बंद।
नोट: छाती बंद करने से पहले, कैथेटर सिरिंज का उपयोग कर हवा को हटा दें। - श्वास नली निकालें और वसूली के दौरान एक अवरक्त दीपक के नीचे एक पिंजरे में माउस जगह है।
- पोस्ट-ऑपरेटिव एनाल्जेसिया के लिए, कम से कम 72 घंटे के लिए चमड़े के नीचे केटोरोफेन इंजेक्शन (5 मिलीग्राम/किलोग्राम प्रति दिन) का प्रशासन करें। सर्जिकल प्रक्रियाओं के साथ-साथ पर्याप्त दर्द उपचार के बाद उचित वसूली सुनिश्चित करने के लिए सभी चूहों पर उचित समय के लिए बारीकी से नजर रखी जानी चाहिए।
6. इकोकार्डियोग्राफी
- प्रत्यारोपण के चार सप्ताह बाद, शुरू में माउस को 5% आइसोफ्लुनान के साथ एनेस्थेटाइज करें और फिर आइसोफ्लुन एकाग्रता को 1% तक समायोजित करें।
- हेयर रिमूवल क्रीम का उपयोग करके छाती को हटा दें और माउस को हीटिंग पैड पर रखें। छाती पर अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर जेल लगाएं।
- दो आयामी पैरास्टेरल शॉर्ट एक्सिस व्यू प्राप्त करें और पेपिलरी मांसपेशियों के स्तर पर एम-मोड ट्रेसिंग रिकॉर्ड करें।
नोट: बाईं पैरालाइसर लाइन में एक रैखिक सरणी ट्रांसड्यूसर (7\u201215 मेगाहर्ट्ज) रखें और शारीरिक संरचनाओं को देखें। - कार्डियक वॉल मोटाई, कक्ष आयाम, और आंशिक छोटा प्राप्त करने के लिए LVAW, LVID, और LVPW के लिए इसी लाइनों को मापने।
नोट: एक ही शारीरिक स्थान पर उचित मूल्यांकन सुनिश्चित करने के लिए पैपिलरी मांसपेशी के स्तर पर इंजेक्शन अंश (ईएफ), आंशिक छोटा (एफएस), और एंड-सिस्टोलिक वॉल्यूम (ईएसवी) सहित कार्डियक फ़ंक्शन की तुलना करें।
7. हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन
- एमएससी-लोडिंग जीएच हाइड्रोगेल के प्रत्यारोपण के बाद पूर्व निर्धारित समय पर, एक सीओ2 कक्ष में माउस को इच्छामृत्यु और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण15के लिए दिल इकट्ठा करें।
- हेमटॉक्सीलिन और ियोसिन (एच एंड ई) और मैसन के ट्राइक्रोम (एमटी) धुंधला के लिए, 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में विच्छेदित हृदय ऊतकों को ठीक करें और पैराफिन में एम्बेड करें। इसके बाद, माइक्रोटॉम का उपयोग करके पैराफिन-एम्बेडेड हार्ट ब्लॉक को 4 माइक्रोन सीरियल सेक्शन में काटें और मानक प्रोटोकॉल17के अनुसार माउंट दाग के साथ वर्गों को दाग दें।
- 20x आवर्धन पर एक स्लाइड स्कैनर पर छवियों का अधिग्रहण और उपचार समूहों के इनफाक्ट आकार की गणना करें।
इनफार्क आकार (%) = कुल इनफार्केक्ट परिधि/ कुल एलवी परिधि x 100 - मिडलाइन लंबाई माप द्वारा दोनों परिधि की गणना करें। एलवी मिडलाइन परिधि के लिए, एंडोकार्डियल और एपिकार्डियल सतहों के बीच सेंटरलाइन लंबाई को मापें। मिडलाइन इनफार्केक्ट परिधि के लिए, मायोकार्डियम18की पूरी मोटाई का 50% से अधिक सहित इनफार्क की लंबाई को मापें।
नोट: सभी छवि विश्लेषण ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। - पेपिलरी मांसपेशियों के स्तर पर निशान की दीवार की मोटाई को मापें।
- कोलेजन क्षेत्र के अंश की गणना करें।
कोलेजन क्षेत्र (%) = इंटरस्टिशियल फाइब्रोसिस/मायोसाइट क्षेत्र x 100 का कुल क्षेत्रफल
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Representative Results
एमएससी को इन्फेक्टेड मायोकार्डियम तक प्रभावी ढंग से पहुंचाने के लिए, चित्रा 1 में वर्णित सीटू क्रॉस-लिंकेबल हाइड्रोगेल में एमएससी-लोडिंग का उपयोग इस प्रोटोकॉल में किया गया था। वीवो प्रत्यारोपण में से पहले, जीएच हाइड्रोगेल्स में एमएससी के प्रसार और अस्तित्व की पुष्टि 3डी इन विट्रो लाइव/डेड सेल स्टेनिंग परख (लाइव: ग्रीन; डेड: रेड) से हुई थी । जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है, प्रतिनिधि छवियों ने पर्याप्त एमएससी प्रसार का प्रदर्शन किया, जिसमें जीएच हाइड्रोगेल के भीतर शाखाई नेटवर्क दिखाया गया है। इसके अलावा, 14 दिन में एमएससी की एक व्यापक बहुकोशिकीय 3 डी संरचना स्पष्ट रूप से देखी गई, जो यह दर्शाती है कि जीएच हाइड्रोगेल एनक्लोजर कोशिकाओं के लिए एक उचित माइक्रोएनवायरमेंट प्रदान कर सकता है।
बालक लिगेशन के माध्यम से एमआई के शामिल होने के बाद, एमएससी-लोडिंग जीएच हाइड्रोगेल्स को पेरि-इनफार्क क्षेत्रों(चित्रा 3 ए)में इंट्रामायोक्रायल रूप से प्रत्यारोपित किया गया। जैसा कि चित्र 3बीमें दिखाया गया है, एमएससी और जेल को इनफार्ट किए गए क्षेत्र के भीतर उचित रूप से बनाए रखा गया था। पीएचके 26 (लाल) से सना एमएससी, वीएच हाइड्रोगेल्स में अच्छी तरह से एकीकृत किया गया था, जो फिटसी (ग्रीन) से सना हुआ था, जो वीवो आवेदन में के लिए इन्फेक्टेड हार्ट्स में सफल एनग्रेफ्टमेंट और रिटेंशन पेश करता था।
एक मुरीन एमआई मॉडल में एमएससी-लोडिंग जीएच हाइड्रोगेल के चिकित्सीय प्रभावों को सत्यापित करने के लिए, कार्डियक फंक्शन और संरचना में परिवर्तनों का मूल्यांकन 28 के बाद प्रत्यारोपण के दिन इकोकार्डियोग्राफी और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण द्वारा किया गया था और विभिन्न उपचार समूहों के बीच तुलना की गई थी । प्रतिनिधि इकोकार्डियोग्राफी ने अन्य समूहों(चित्रा 4)की तुलना में एमएससी/जेल उपचारित समूह में एफएस, ईएफ और ईएसवी सहित बेहतर हृदय कार्यों को दिखाया । इसके अलावा, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण ने अन्य समूहों की तुलना में एमएससी/जेल उपचारित समूह में कम फाइब्रोसिस, मोटा इनफार्क्ड दीवारों और एक छोटे इनफार्केट आकार का प्रदर्शन किया, जो यह दर्शाता है कि इस प्रोटोकॉल ने एलवी रीमॉडलिंग(चित्रा 5)को काफी क्षीण करके लाभकारी प्रभावों का योगदान दिया।
चित्र 1: इंजेक्शन हाइड्रोगेल का उपयोग करके स्टेम सेल प्रतिधारण और एनग्रफ्टमेंट में सुधार के लिए प्रक्रिया की योजना। सीटू क्रॉस-लिंकेबल जीएच हाइड्रोगेल में बोन मैरो-व्युत्पन्न एमएससी युक्त को इंट्रामायोकार्डियल इंजेक्शन द्वारा इंट्रामायोकार्डियल इंजेक्शन द्वारा अंतर्रुपित हृदय में तैयार किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: जीएच हाइड्रोगेल्स के भीतर इन विट्रो 3डी एमएससी प्रसार। लाइव (ग्रीन)/डेड (रेड) एमएससी की प्रतिनिधि छवियां 3, 5, 7 और 14 दिनों के इनक्यूबेशन (200x आवर्धन; स्केल = १०० माइक्रोन) के बाद लाइव/डेड सेल स्टेनिंग के बाद एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्राप्त की गई । छवियों और वीडियो आंशिक रूप से किम एट अल15से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: एमएससी/हाइड्रोगेल्स के वीवो प्रत्यारोपण में । (क)एमआई(बी)प्रत्यारोपित एमएससी और जीएच हाइड्रोगेल्स की प्रतिनिधि छवियों को क्रमशः PKH26 (लाल) और फिटसी (ग्रीन) के साथ लेबल के शामिल होने के बाद इंट्रामायोकार्डियल प्रत्यारोपण दिखाता एक योजनाबद्ध आरेख । चूहों को प्रत्यारोपण के 1, 3, 5, या 7 दिनों के बाद बलिदान किया गया था और उनके दिलों को एमएससी और जीएच हाइड्रोगेल एनग्रफ्टमेंट की डिग्री का आकलन करने के लिए उत्पादित किया गया था । उत्पादित दिल क्रायो-फिक्स्ड थे, धारावाहिक-खंडों में तैयार किए गए थे, और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (200x आवर्धन; स्केल = 100 माइक्रोन) के माध्यम से चित्रित किए गए थे। इन छवियों को आंशिक रूप से किम एट अल15से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: एमएससी/हाइड्रोगेल्स प्रत्यारोपण के बाद कार्डियक फंक्शन में सुधार । (इकोकार्डियोग्राफी का प्रतिनिधि वीडियो। (ख)डायस्टोल (एलवीडब्ल्यूडी) और सिस्टोल (एलवीडब्ल्यू) में बाएं वेंट्रिकुलर पूर्वकाल दीवार की मोटाई, डायस्टोल (एलवीडीडी) और सिस्टोल (एलवीआईडी) में आंतरिक व्यास और डायस्टोल (एलवीआईडी) में पीछे की दीवार की मोटाई और डायस्टोल (एलवीपीडब्ल्यू) और स्वस्तोल (एलवीडब्ल्यू) में पीछे की दीवार की मोटाई सहित माप के साथ प्रतिनिधि लघु अक्ष एम-मोड छवि। (C\u2012E) सभी उपचार समूहों के प्रत्यारोपण के 28 दिनों के बाद रिजेक्शन अंश (ईएफ), आंशिक छोटा (एफएस), और एंड-सिस्टोलिक वॉल्यूम (ईएसवी) में कार्यात्मक सुधार। डेटा को मानक विचलन ± मतलब के रूप में दर्शाया गया था (*पी & 0.05, **पी एंड एलटी; 0.001, ***पी एंड एलटी; 0.0001; n = 9\u201212 प्रति समूह)। वीडियो और परिणाम आंशिक रूप से किम एट अल15से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: एमएससी/हाइड्रोगेल्स प्रत्यारोपण के बाद कार्डियक संरचना में सुधार । (A)हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन की प्रतिनिधि छवियां । (B\u2012D) कम इनफाक्टेड दीवार पतली और फाइब्रोसिस के साथ-साथ इनफाक्टेड आकार में संरचनात्मक सुधार देखे गए। स्केल = 1 मिमी। डेटा को मानक विचलन ± मतलब के रूप में दर्शाया गया है (*पी & 0.05, **पी एंड एलटी; 0.001, ***पी एंड एलटी; 0.0001; n = 4\u20127 प्रति समूह)। छवियों और परिणामों को आंशिक रूप से किम एट अल15से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
इंजेक्शन जीएच हाइड्रोगेल में वीवो अनुप्रयोगों में काफी संभावनाएं हैं क्योंकि उनकी सीटू में विविध चिकित्सीय एजेंटों को समरूप रूप से शामिल करने की क्षमता है। इसके अलावा, उनके भौतिक और जैव रासायनिक गुणों को आसानी से रोग पर निर्भर आवश्यकताओं के आधार पर हेरफेर किया जा सकता है । इस संबंध में, इंजेक्शन हाइड्रोगेल को घायल हृदय 19,20में खराब अस्तित्व और सेल प्रतिधारण (यानी, 24 घंटे के बाद प्रत्यारोपण के भीतर 10%) द्वारा बाधित वर्तमान कार्डियक स्टेम सेल थेरेपी में प्रमुख सीमाओं को संबोधित करने का प्रस्ताव किया गया है । इस खराब परिणाम को दूर करने के लिए, यहां वर्णित प्रोटोकॉल जीएच हाइड्रोगेल का उपयोग करके सेल प्रतिधारण और अस्तित्व में सुधार करने के लिए एक सरल और व्यवहार्य विधि प्रदान करता है जिसे मायोकार्डियल प्रत्यारोपण के बाद सीटू में क्रॉस-लिंक किया जा सकता है, जिसने एक मुरीन एमआई मॉडल में कार्डियक संरचना और कार्य पर अनुकूल प्रभाव का प्रदर्शन किया है।
इस तकनीक की प्राथमिक लाभ विशेषता किसी भी प्रकार के सेल और बायोमॉलिक्यूल के साथ वीवो प्रयोज्यता में व्यापक है, जिसे इंजेक्शन से पहले प्रीगेल जीएच समाधान के साथ मिश्रण करके लोड किया जा सकता है। इसके अलावा, दाता-से-मेजबान बातचीत की व्यापक समझ प्राप्त करने के लिए, जीएच संघों और/या समझाया जैव अणुओं के एक सरल लेबलिंग दृष्टिकोण को वीवो स्थिरता, मेजबान एकीकरण और अवशोषण कीटिक्स में उनके परिवर्तनों को ट्रैक करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । हमारे ज्ञान के लिए, चिकित्सीय स्टेम कोशिकाओं के साथ संयुक्त इंजेक्शन जिलेटिन आधारित हाइड्रोगेल का उपयोग सबसे पहले विट्रो में हृदय ऊतक की दृढ क्षमता को मान्य करने के लिए और वीवो15में था ।
इस शोध में वर्तमान चरण में, जीएच हाइड्रोगेल जो एमएससी से भरे हुए हैं, इंजेक्शन और सीटू में क्रॉस-लिंक्ड हैं, को एक मुरीन एमआई मॉडल में उनकी प्रयोज्यता का आकलन करने के लिए अवधारणा के सबूत के रूप में इस्तेमाल किया गया था। यद्यपि इस विधि से प्रत्यारोपित हृदय ऊतकों में एमएससी एनग्रेफ्टमेंट और प्रतिधारण में सुधार होता है, इंजेक्शन के दौरान विस्तृत स्थितियों को चिकित्सीय प्रभावकारिता को अनुकूलित करने के लिए विचार किया जाना चाहिए, जैसे इंजेक्शन साइट (यानी, पेरी-इनफार्क क्षेत्र या इनफार्क क्षेत्र), इंजेक्शन की मात्रा और संख्या, और हाइड्रोगेल की कठोरता (यानी, इंजेक्शन या रिसाव में आसान) का स्थान।
अंत में, हमने बालक लिगेशन द्वारा एक प्रतिनिधि मुरीन एमआई मॉडल के लिए एक प्रोटोकॉल और प्रत्यारोपित एमएससी के प्रतिधारण और engraftment में सुधार करने के लिए सीटू क्रॉस-लिंक्ड हाइड्रोगेल्स में उपयोग करने वाले स्टेम कोशिकाओं के इंट्रामायोकार्डियल प्रत्यारोपण के लिए एक व्यावहारिक विधि का प्रदर्शन किया है । ये तकनीक एमएससी-लोडिंग इंजेक्शन हाइड्रोगेल के इंट्रामायोकार्डियल प्रत्यारोपण के लिए एक प्रभावी विधि प्रदान करती है और बड़े जानवरों और नैदानिक अनुवाद में आवेदन के लिए उनकी महान क्षमता को उजागर करती है।
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Disclosures
लेखकों के पास इस कार्य के साथ घोषणा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।
Acknowledgments
इस शोध को शिक्षा मंत्रालय (एनआरएफ-2018R1D1A1A02049346) द्वारा वित्त पोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) के माध्यम से बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया जाता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| 5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
| 8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
| 8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
| Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
| Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
| Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| DPBS | Gibco | 14040-133 | |
| Dual-syringe | |||
| EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
| Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
| Forcep | HEBU | HB0458 | |
| Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
| Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
| 50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
| Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
| Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
| Iodine | Green Pharmaceutical | ||
| LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
| Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
| Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
| Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
| HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
| PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
| Slide scanner | Leica | SCN400 | |
| Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
| Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
| Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
| Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |
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