Summary
Kök hücre bazlı tedavi, miyokard enfarktüsünden sonra yaralı kalp dokularını onarmak için etkili bir strateji olarak ortaya çıkmıştır. Enzmatik olarak çapraz bağlanabilen jelatin hidrojelleri kullanarak kök hücre nakli için en uygun in vivo uygulamayı sağlıyoruz.
Abstract
Postinfarkt kalp yetmezliğini önlemek için mevcut kardiyak kök hücre tedavilerinin karşılaştığı en önemli sorunlardan biri, yaralı miyokard içindeki nakledilen hücrelerin düşük tutma ve sağkalım oranlarıdır ve terapötik etkinliklerini sınırlar. Son zamanlarda, kök hücre tedavisini geliştirmek ve en üst düzeye çıkarmak için iskele biyomalzemelerinin kullanımı dikkat çekmektedir. Bu protokolün amacı, enjekte edilebilir hidroksifenil propiyonik asit (GH) hidrojelleri kullanarak kemik iliği türevi mezenkimal kök hücreleri (MSC' ler) nakletmek için basit ve basit bir teknik sunmaktır; hidrojeller, kardiyak doku mühendisliği uygulamaları için bir hücre dağıtım platformu olarak elverişlidir, çünkü çapraz in situ ve yüksek biyouyumluluk yeteneğine sahiptir. MSC yüklemeli GH hidrojellerini (MSC/hidrojeller) imal etmek ve hayatta kalmalarını ve çoğalmalarını üç boyutlu (3D) in vitro kültürde değerlendirmek için basit bir yöntem sunuyoruz. Ek olarak, farelerde MSC/hidrojellerin intramiyokardiyal nakli için bir teknik göstererek, sol ön alçalma (LAD) koroner arter ligasyonu ve daha sonra MSC/hidrojel nakli yoluyla miyokard infarktüsüne (MI) indükleyen cerrahi bir prosedürü tarif ediyoruz.
Introduction
Kardiyak kök hücre tedavisi miyokard onarımı ve yenilenmesi için potansiyel bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır1,2. Hayvan modellerinde ve klinik çalışmalarda son olumlu sonuçlara rağmen, miyokard onarımı için kök hücre bazlı tedavi uygulaması, enfarktüslü kalp dokularında enjekte edilen hücrelerin düşük tutulması ve zayıf hayatta kalması nedeniyle sınırlıdır3,4. Sonuç olarak, enjekte edilebilir biyomalzemeler5, kardiyak yamalar6ve hücre sayfaları7dahil olmak üzere hücre bazlı doku mühendisliğinin kullanımı, konak miyokard içinde hücre tutulmasını ve entegrasyonunu iyileştirmek için yoğun bir şekilde çalışılmıştır.
Biyomühendislik kalp dokusu onarımına yönelik çeşitli potansiyel yaklaşımlar arasında, mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), embriyonik kök hücreler (ESC'ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) gibi uygun hücre tipleriyle birlikte enjekte edilebilir hidrojeller, hücreleri miyokard bölgelerine etkili bir şekilde ulaştırmak için cazip bir seçenektir8,9. Tanınmış bir doğal polimer olan jelatin, biyomedikal uygulamalarda kullanılan çok çeşitli biyomalzemelerle karşılaştırıldığında, büyük biyouyumluluğu, önemli ölçüde biyobozunurluğu ve azaltılmış immünojenikliği nedeniyle enjekte edilebilir bir matris olarak kullanılabilir. Jelatin bazlı enjekte edilebilir platformlar büyük bir potansiyele sahip olsa da, düşük mekanik sertliklerine ve fizyolojik ortamdaki kolay bozulmalarına bağlı olarak in vivo uygulanabilirlikleri sınırlı kalır.
Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, in vivo uygulamalar için hidroksifenil propiyonik asitten oluşan jelatin bazlı hidrojellerin yeni ve basit bir tasarımı önerilmiştir. Jelatin-hidroksifenil propiyonik asit (GH) konjugeleri bir enzim, yaban turpu peroksidaz (HRP) varlığında yerinde çapraz bağlanabilir ve daha sonra çeşitli ilaçları, biyomolekülleri veya hidrojel içindeki hücreleri kapsülleyebilir, bu da doku mühendisliği uygulamalarında büyük potansiyel olduğunu düşündürür10,11,12,13,14. Ek olarak, son zamanlarda kapsüllenmiş MSC'ler içeren GH hidrojellerinin terapötik etkilerini araştırdık ve bir murine modelinde MI'den sonra başarılı kardiyak onarım ve rejenerasyonda kullanımlarını gösterdik15. Bu protokolde, GH hidrojelleri içindeki MSC'lerin kapsüllenmesi ve in vitro üç boyutlu (3D) çoğalması için basit bir teknik açıklıyoruz. Ayrıca koroner arter ligasyonu ve MSC yüklemeli GH hidrojellerinin enfarktüslü kalbe intramiyokardiyal nakli yoluyla bir murine MI modeli oluşturmak için tasarlanmış cerrahi bir prosedür sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan araştırma prosedürleri, Kore Katolik Üniversitesi Tıp Fakültesi'nde Laboratuvar Hayvanları Refahı Yasası, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından sağlanan Kemirgen Deneyleri Kılavuz ve Politikalarına uygun olarak sağlanmıştır.
1. MSC'lerin ve enjekte edilebilir jelatin hidrojellerinin hazırlanması
- 37 °C ve %5 CO2'de100 mm'lik bir kültür çanasında KÜLTÜR MSC'leri. MSC büyümesi% 80 izdihama ulaştığında, kabı DPBS ile iki kez yıkayın ve 3 dakika boyunca 37 °C'de 1 mL tripsin ikame ekleyin.
NOT: MSC'ler geleneksel prosedürlerden sonra murine kemik iliğinden izole edildi16, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası'nda (DMEM) %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 antibiyotik−antimykotik çözelti içeren kültürlendi ve bu çalışma için 7\u20129 geçişi arasında kullanıldı. - 3 dakika boyunca 500 x g'da 9 mL kültür ortamı ve santrifüj ekleyin. Daha sonra, elde edilen süpernatant atın, hücreleri 1 mL PBS'de yeniden biriktirin ve hücre süspansiyonunun buzda tutulmasını sağlayın.
- 10 μL hücre süspansiyonu 10 μL Trypan mavisi ile seyreltin ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonu elde edin.
- MSC'leri 1 x 107 hücre/mL yoğunlukta 1 mL'lik bir tüpe yeniden aktarın ve aktarın.
- PBS'de GH konjuge çözeltisinin %6,25'ini hazırlayın ve 2 şişeye ayırın. Ardından, GH çözümlerini 6 μg/mL HRP (GH çözeltisi A) veya H 2 O2'nin (GHçözümü B)%0,07 wt ile karıştırın.
NOT: Yayınlanan protokollere göre jelatin-hidroksifenil propiyonik asit (GH) konjugeleri hazırlayın12,15.- Sırasıyla GH konjuge çözümünün HRP (GH çözümü A) ve GH konjuge çözümünün H 2 O2'ye(GH çözümü B) 9:1 hacimsel oranını koruyun.
- MSC'leri GH çözeltisi A ile karıştırmadan önce, hücre süspansiyonu 1.000 x g'da kısa bir süre santrifüj edin ve elde eden süpernatantı dikkatlice emiş edin. Daha sonra, MSC'leri içeren peleti GH çözeltisi A ile karıştırın.
2. Yerinde MSC yükleme ve üç boyutlu in vitro kültürü
- GH çözümü A 'yı (MSC'leri içeren) ve GH çözümü B'yi çift şırıngın her iki tarafına yükleyin. Sekiz kuyulu bir hazne slaydı üzerine 5 x 10 6 hücre/mL'lik son yoğunlukta MSC'lerle kombineGH çözeltilerinin plakası 300 μL.
- In situ hidrojel oluşumu ve daha sonra enzymatic çapraz bağlama ile MSC kapsüllemeden sonra, % 10 FBS ve% 1 antibiyotik−antimycotic çözelti içeren 700 μL DMEM ekleyin.
- Slaydı 37 °C ve %5 CO2'de kuluçkaya yatırın ve kültür ortamını her 2\u20123 günde bir değiştirin.
3. GH hidrojelleri içindeki MSC'lerin in vitro çoğalması ve hayatta kalmasının onaylanması
- GH hidrojelleri içinde 3D kültürlü MSC'lerin uygulanabilirliğini belirlemek için, önceden belirlenmiş kuluçka süresinden sonra canlı / ölü hücre boyama tahlilini kullanın.
- GH hidrojellerinde kapsüllenmiş MSC'lerin 3, 5, 7 veya 14 gün boyunca inkübasyonundan sonra, ortamı aspire edin ve kuyuyu PBS ile iki kez yıkayın.
- 10 mL DPBS'de 5 μL kalsein ve 20 μL ethidyum homodimer-1 (EthD-1) içeren bir boyama çözeltisi hazırlayın.
- Kuyuya 200 μL boyama çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Boyama çözeltisini epire edin ve kuyuyu PBS ile iki kez yıkayın.
- Odayı slayttan dikkatlice ayırın ve GH hidrojellerinin üzerine tam bir kapak yerleştirin. Kapsüllenmiş MSC'lerin çoğalma derecesini ve morfolojik değişikliklerini görselleştirmek için konfokal mikroskopi kullanın.
NOT: Floresan görüntüler 200x büyütme altında elde edildi ve calcein için 470/540 nm ve EthD-1 için 516/607 nm uyarılma / emisyon dalga boylarında görüntülendi.
4. Farelerde miyokard enfarktüsü indüksiyonu
- 7 haftalık erkek C57BL/6 fareleri (20\u201222 g) salin içinde Zoletil (30 mg/kg) ve Rompun (10 mg/kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun.
- Ameliyattan önce, epilasyon kremi kullanarak fare göğsünü depilate edin ve cildi iyotla sterilize edin.
- Fareyi bir ameliyat masasına yerleştirin ve mekanik havalandırma yoluyla ek oksijen sağlamak için nefes borusuna bir kateter takarak entübe edin.
- Cerrahi makas kullanarak cildi hafifçe kesin ve ardından mikro makasla interkostal kaslara nüfuz edin. Açık göğüs boşluğunu korumak için 5-0 ipek dikiş kullanarak 2. ve 3. sol kaburgaları ayırın.
- Sol ön alçalı (LAD) koroner arteri 8-0'lık bir iğne tutucu kullanarak dikkatlice lige edin polipropilen dikiş ve elektrokoter kullanarak dikişi kesin.
- Ön sol ventrikül duvarında hemen bir renk değişikliği gözlemleyin.
5. MSC yüklü GH hidrojellerinin intramiyokardiyal nakli
- LAD ligasyonu ile miyokard enfarktüsüne indükledikten sonra, 26G iğne ile donatılmış çift şırınga kullanarak enfarktüs sınır bölgesindeki iki farklı noktaya (toplam: 2 x10 5 MSC/20 μL) 10 μL MSC yüklemeli GH çözeltisi enjekte edin.
- Adım 1'de açıklanan prosedürü izleyerek, MSC yüklemeli GH çözümlerini hazırlayın ve çift şırınna aktarın.
NOT: MSC yüklemeli GH hidrojellerinin enfarktüs alanı içindeki entrikalarını değerlendirmek için, MSC'ler ve GH konjugeleri sırasıyla PHK26 ve floresan izotiyosiyanat (FITC) ile önceden etiketlenmiştir.
- Adım 1'de açıklanan prosedürü izleyerek, MSC yüklemeli GH çözümlerini hazırlayın ve çift şırınna aktarın.
- Açılan göğüs boşluğunu geri yükleyin ve 5-0 dikiş kullanarak kasları ve cildi kapatın.
NOT: Göğüs kapatmadan önce kateter şırınnası kullanarak havayı çıkarın. - Trakeal tüpü çıkarın ve kurtarma sırasında fareyi kızılötesi lambanın altındaki bir kafese yerleştirin.
- Ameliyat sonrası analjezi için, en az 72 saat boyunca deri altı Ketoprofen enjeksiyonları (günde 5 mg / kg) verin. Tüm fareler, yeterli ağrı tedavisinin yanı sıra cerrahi işlemlerden sonra uygun iyileşmeyi sağlamak için uygun bir süre için yakından izlenmelidir.
6. Ekokardiyografi
- Transplantasyondan dört hafta sonra, başlangıçta fareyi% 5 izofluran ile uyuşturun ve daha sonra izofluran konsantrasyonu% 1'e ayarlayın.
- Epilasyon kremi kullanarak göğsünü depilate edin ve fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin. Göğüse ultrason dönüştürücü jel uygulayın.
- İki boyutlu parasternal kısa eksen görünümleri elde edin ve papiller kas seviyesinde M modu izlemeleri kaydedin.
NOT: Sol parasternal çizgiye doğrusal bir dizi dönüştürücü (7\u201215 MHz) yerleştirin ve anatomik yapıları görüntüleyin. - Kardiyak duvar kalınlığı, oda boyutu ve fraksiyonel kısaltma elde etmek için LVAW, LVID ve LVPW için karşılık gelen çizgileri ölçün.
NOT: Aynı anatomik konumda doğru değerlendirmeyi sağlamak için papiller kas seviyesinde ejeksiyon fraksiyonu (EF), fraksiyonel kısaltma (FS) ve son sistolik hacim (ESV) dahil olmak üzere kardiyak fonksiyonu karşılaştırın.
7. Histolojik değerlendirme
- MSC yüklemeli GH hidrojellerinin enfarktüslü kalbe naklinden sonra önceden belirlenmiş zamanda, fareyi bir CO2 odasında ötenazi yapın ve histolojik analiz için kalbi toplayın15.
- Hematoksilin ve eozin (H&E) ve Masson'un üç renkli (MT) lekeleri için, parçalanmış kalp dokularını% 4 paraformaldehitte (PFA) sabitlenin ve parafin içine gömün. Daha sonra, parafin gömülü kalp bloklarını bir mikrotom kullanarak 4 μm seri bölümlere kesin ve bölümleri standart protokollere göre MT lekesi ile lekele17.
- Slayt tarayıcısında 20x büyütme ile görüntü alın ve tedavi gruplarının enfarktüs boyutunu hesaplayın.
Enfarktüs boyutu (%) = toplam enfarktüs çevresi / toplam LV çevresi x 100 - Orta çizgi uzunluğu ölçümüne göre her iki çevreyi de hesaplayın. LV orta hat çevreleri için endokardiyal ve epikardiyal yüzeyler arasındaki merkez çizgisi uzunluklarını ölçün. Orta hat enfarktüs çevreleri için, miyokard18'intüm kalınlığının% 50'sinden fazlası dahil olmak üzere enfarktüs uzunluklarını ölçün.
NOT: Tüm görüntü analizleri ImageJ yazılımı kullanılarak gerçek gerçekleştirildi. - Papiller kas seviyelerinde yara izinin duvar kalınlığını ölçün.
- Kollajen alanının fraksiyonunu hesaplayın.
Kollajen alanı (%) = interstisyel fibrozis/miyosit alanının toplam alanı x 100
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MsC'leri enfarktüslü miyokardlara etkili bir şekilde ulaştırmak için, Şekil 1'de açıklanan MSC yüklemeli yerinde çapraz bağlanabilir hidrojeller bu protokolde kullanılmıştır. In vivo transplantasyondan önce, GH hidrojellerinde MSC'lerin çoğalması ve hayatta kalması 3D in vitro canlı / ölü hücre boyama tahlili ile doğrulandı (canlı: yeşil; ölü: kırmızı). Şekil 2'degösterildiği gibi, temsili görüntüler GH hidrojelleri içindeki dallı ağları gösteren yeterli MSC çoğalması sergiledi. Ek olarak, MSC'lerin geniş bir çok hücreli 3D yapısı 14.
LAD ligasyonu yoluyla MI indüksiyonu yapıldıktan sonra, MSC-loading GH hidrojelleri intramiyokardiyel olarak peri-enfarktüs bölgelerine nakledildi (Şekil 3A). Şekil 3B'degösterildiği gibi, MSC'ler ve jel enfarktüs bölgesinde uygun şekilde sürdürülmüştür. PHK26 (kırmızı) ile boyanmış MSC'ler, FITC (yeşil) ile boyanmış GH hidrojellerine iyi entegre edildi ve in vivo uygulama için enfarktüs kalplerde başarılı bir engraftment ve tutma sundu.
MSC-loading GH hidrojellerinin murine MI modelinde terapötik etkilerini doğrulamak için transplantasyon sonrası 28. günde ekokardiyografi ve histolojik analiz ile kardiyak fonksiyon ve yapıdaki değişiklikler değerlendirildi ve farklı tedavi grupları arasında karşılaştırıldı. Temsili ekokardiyografi, MSC/jel tedavi grubunda FS, EF ve ESV dahil olmak üzere diğer gruplara kıyasla iyileştirilmiş kardiyak fonksiyonlargöstermiştir (Şekil 4). Ek olarak, histolojik analizde MSC/jel işlenmiş grupta diğer gruplara göre daha az fibrozis, daha kalın enfarktüs duvarları ve daha küçük bir enfarktüs boyutu sergilendi ve bu protokolün LV yeniden şekillendirmeyi önemli ölçüde azaltarak yararlı etkilere katkıda bulunduğunu gösterdi (Şekil 5).
Şekil 1: Enjekte edilebilir hidrojeller kullanılarak kök hücre tutulmasını ve engraftment iyileştirilmesi için sürecin şeması. Kemik iliğinden türetilmiş MSC'ler içeren in situ çapraz bağlanabilir GH hidrojelleri enfarktüslü kalbe intramiyokardiyal enjeksiyon ile hazırlandı ve nakledildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: GH hidrojellerde in vitro 3D MSC çoğalması. 3, 5, 7 ve 14 günlük inkübasyondan sonra canlı/ölü hücre lekelenmesini takiben konfokal mikroskopi ile elde edilen canlı (yeşil)/ölü (kırmızı) MSC'lerin temsili görüntüleri (200x büyütme; ölçek = 100 μm). Görüntüler ve video kısmen Kim ve ark.15'inizniyle uyarlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: MSC/Hydrogels in vivo transplantasyonu. (A) MI indüksiyonu sonrası intramiyokardiyal transplantasyonu gösteren şematik bir diyagram. (B) Sırasıyla PKH26 (kırmızı) ve FITC (yeşil) ile etiketlenmiş nakledilen MSC'lerin ve GH hidrojellerinin temsili görüntüleri. Fareler 1, 3, 5 veya 7 günlük transplantasyondan sonra kurban edildi ve daha sonra MSC ve GH hidrojel engraftment derecesini değerlendirmek için kalpleri çıkarıldı. Eksiz kalpler kriyo-sabitlendi, seri bölümlere hazırlandı ve konfokal bir mikroskopi ile görüntülendi (200x büyütme; ölçek = 100 μm). Görüntüler kısmen Kim ve ark.15'inizniyle uyarlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: MSC/Hydrogels transplantasyonu sonrasında kardiyak fonksiyonda iyileşmeler. (A) Ekokardiyografinin temsili videosu. (B) Diastole (LVAWd) ve systole (LVAWs) sol ventrikül ön duvar kalınlığı, diastole (LVIDd) ve systole (LVIDs) iç çapı ve diastole (LVPWd) ve systole (LVPWs) posterior duvar kalınlığı dahil olmak üzere ölçümlerle temsili kısa eksenli M modu görüntüsü. (C\u2012E) Tüm tedavi gruplarının 28 günlük naklinden sonra ejeksiyon fraksiyonunda (EF), fraksiyonel kısaltmada (FS) ve son sistolik hacimde (ESV) fonksiyonel iyileşmeler. Veriler ortalama ± standart sapma olarak temsil edildi (*p < 0.05, **p < 0.001, ***p < 0.0001; n = grup başına 9\u201212). Videolar ve sonuçlar kısmen Kim ve ark.15'in izniyle uyarlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: MSC/Hydrogels transplantasyonu sonrasında kardiyak yapıda iyileşmeler. (A) Histolojik değerlendirmenin temsili görüntüleri. (B\u2012D) Enfarktüs boyutunda, daha az enfarktüs duvar inceltme ve fibrozis ile birlikte yapısal iyileşmeler gözlendi. Ölçek = 1 mm. Veriler ortalama ± standart sapma olarak temsil edilir (*p < 0.05, **p < 0.001, ***p < 0.0001; n = grup başına 4\u20127). Görüntüler ve sonuçlar kısmen Kim ve ark.15'inizniyle uyarlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enjekte edilebilir GH hidrojelleri, çeşitli terapötik ajanları yerinde homojen bir şekilde dahil etme yetenekleri nedeniyle in vivo uygulamalar için büyük bir potansiyele sahiptir. Ayrıca, fiziksel ve biyokimyasal özellikleri hastalığa bağlı gereksinimlere göre kolayca manipüle edilebilir. Bu bakımdan, enjekte edilebilir hidrojeller, yaralı kalp19,20'dezayıf sağkalım ve hücre tutulması (yani, 24 saat içinde % 10) tarafından engellenen mevcut kardiyak kök hücre tedavisindeki başlıca sınırlamaları ele almak için önerilmiştir. Bu kötü sonucun üstesinden gelmek için, burada açıklanan protokol, bir murine MI modelinde kardiyak yapı ve işlev üzerinde olumlu etkiler gösteren miyokard naklinden sonra yerinde çapraz bağlanabilen GH hidrojelleri kullanarak hücre tutma ve sağkalımı iyileştirmek için basit ve uygulanabilir bir yöntem sunmaktadır.
Bu tekniğin birincil avantaj özelliği, enjeksiyondan önce pregel GH çözeltisi ile karıştırılarak yüklenebilen her türlü hücre ve biyomolekül ile geniş in vivo uygulanabilirliğidir. Ayrıca, donörden konakçıya etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılması için, GH konjugelerinin ve/veya kapsüllenmiş biyomoleküllerin basit bir etiketleme yaklaşımı, in vivo stabilite, konak entegrasyonu ve resorpsiyon kinetiğindeki değişiklikleri izlemek için uyarlanabilir. Bilgimize göre, enjekte edilebilir jelatin bazlı hidrojellerin terapötik kök hücrelerle birleştirilmesi, kardiyak doku in vitro ve in vivo15'inrestoratif potansiyelini doğrulayan ilk kullanımdı.
Bu araştırmanın şu anki aşamasında, MSC'lerle yüklenen, enjekte edilen ve çapraz bağlı in situ olan GH hidrojelleri, bir murine MI modelinde uygulanabilirliklerini değerlendirmek için bir kavram kanıtı olarak kullanılmıştır. Bu yöntem, nakledilen kalp dokularında MSC engraftasyon ve tutmasını geliştirmiş gibi görünse de, enjeksiyon sırasındaki ayrıntılı koşullar, enjeksiyon bölgesinin (yani peri-enfarktüs bölgesi veya enfarktüs bölgesi), enjeksiyonların hacmi ve sayısı ve hidrojel sertliği (yani enjekte edilmesi zor veya sızdırılması kolay) gibi terapötik etkinliği optimize etmek için düşünülmelidir.
Sonuç olarak, LAD ligasyonu ile temsili bir murine MI modeli için bir protokol ve nakledilen MSC'lerin tutulmasını ve engraftasyonunu iyileştirmek için in situ çapraz bağlı hidrojeller kullanarak kök hücrelerin intramiyokardiyal nakli için pratik bir yöntem gösterdik. Bu teknikler MSC yüklemeli enjekte edilebilir hidrojellerin intramiyokardiyal nakli için etkili bir yöntem sağlar ve büyük hayvanlarda uygulama ve klinik çeviri için büyük potansiyellerini vurgular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların bu eserle beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu araştırma, Eğitim Bakanlığı (NRF-2018R1D1A1A02049346) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) aracılığıyla Temel Bilim Araştırma Programı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| 5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
| 8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
| 8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
| Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
| Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
| Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| DPBS | Gibco | 14040-133 | |
| Dual-syringe | |||
| EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
| Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
| Forcep | HEBU | HB0458 | |
| Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
| Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
| 50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
| Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
| Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
| Iodine | Green Pharmaceutical | ||
| LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
| Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
| Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
| Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
| HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
| PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
| Slide scanner | Leica | SCN400 | |
| Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
| Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
| Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
| Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |
References
- Jhund, P. S., McMurray, J. J. Heart failure after acute myocardial infarction: a lost battle in the war on heart failure. Circulation. 118 (20), 2019-2021 (2008).
- Cahill, T. J., Kharbanda, R. K. Heart failure after myocardial infarction in the era of primary percutaneous coronary intervention: Mechanisms, incidence and identification of patients at risk. World Journal of Cardiology. 9 (5), 407-415 (2017).
- Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. npj Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
- Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018, 1909346 (2018).
- Alagarsamy, K. N., Yan, W., Srivastava, A., Desiderio, V., Dhingra, S. Application of injectable hydrogels for cardiac stem cell therapy and tissue engineering. Reviews in Cardiovascular Medicine. 20 (4), 221-230 (2019).
- Gaetani, R., et al. Epicardial application of cardiac progenitor cells in a 3D-printed gelatin/hyaluronic acid patch preserves cardiac function after myocardial infarction. Biomaterials. 61, 339-348 (2015).
- Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circualtion Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).
- Hasan, A., et al. Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Repair after Myocardial Infarction. Advanced Science. 2 (11), 1500122 (2015).
- Wu, R., Hu, X., Wang, J. Concise Review: Optimized Strategies for Stem Cell-Based Therapy in Myocardial Repair: Clinical Translatability and Potential Limitation. Stem Cells. 36 (4), 482-500 (2018).
- Lee, Y., et al. In situ forming gelatin-based tissue adhesives and their phenolic content-driven properties. Journal of Materials Chemistry B. 1 (18), 2407-2414 (2013).
- Lee, Y., Bae, J. W., Lee, J. W., Suh, W., Park, K. D. Enzyme-catalyzed in situ forming gelatin hydrogels as bioactive wound dressings: effects of fibroblast delivery on wound healing efficacy. Journal of Materials Chemistry B. 2 (44), 7712-7718 (2014).
- Lee, S. H., et al. In situ Crosslinkable Gelatin Hydrogels for Vasculogenic Induction and Delivery of Mesenchymal Stem Cells. Advanced Functional Materials. 24 (43), 6771-6781 (2014).
- Jung, B. K., et al. A hydrogel matrix prolongs persistence and promotes specific localization of an oncolytic adenovirus in a tumor by restricting nonspecific shedding and an antiviral immune response. Biomaterials. 147, 26-38 (2017).
- Kim, G., et al. Tonsil-derived mesenchymal stem cell-embedded in situ crosslinkable gelatin hydrogel therapy recovers postmenopausal osteoporosis through bone regeneration. PLoS One. 13 (7), 0200111 (2018).
- Kim, C. W., et al. MSC-Encapsulating in situ Cross-Linkable Gelatin Hydrogels To Promote Myocardial Repair. ACS Applied Bio Materials. 3 (3), 1646-1655 (2020).
- Meirelles Lda, S., Nardi, N. B. Murine marrow-derived mesenchymal stem cell: isolation, in vitro expansion, and characterization. Br J Haematol. 123 (4), 702-711 (2003).
- Ojha, N., et al. Characterization of the structural and functional changes in the myocardium following focal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), 2435-2443 (2008).
- Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. Journal of Applied Physiology. 102 (6), 2104-2111 (2007).
- Terrovitis, J., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. Journal of the American College of Cardiology. 54 (17), 1619-1626 (2009).
- Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell Therapy for Cardiovascular Disease: A Comparison of Methods of Delivery. Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (2), 177-181 (2011).
