Summary
وقد برز العلاج القائم على الخلايا الجذعية كاستراتيجية فعالة لإصلاح أنسجة القلب المصابة بعد احتشاء عضلة القلب. نحن نقدم الأمثل في تطبيق vivo لزرع الخلايا الجذعية باستخدام هيدروجيلات الجيلاتين التي هي قادرة على أن تكون الأنزيمية عبر الارتباط.
Abstract
واحدة من القضايا الرئيسية التي تواجه العلاجات الحالية للخلايا الجذعية القلبية لمنع فشل القلب بعد الأنف هو انخفاض معدلات الاحتفاظ والبقاء على قيد الحياة من الخلايا المزروعة داخل عضلة القلب المصابة، والحد من فعاليتها العلاجية. في الآونة الأخيرة ، اكتسب استخدام المواد الحيوية السقالات الاهتمام لتحسين وتعظيم العلاج بالخلايا الجذعية. الهدف من هذا البروتوكول هو إدخال تقنية بسيطة ومباشرة لزرع الخلايا الجذعية النخاعية النخاعية المشتقة من نخاع العظم (MSCs) باستخدام هيدروكسيفينيل هيدروجيل (GH) هيدروجيل. الهيدروجيل مواتية كمنصة تسليم الخلايا لتطبيقات هندسة الأنسجة القلبية بسبب قدرتها على أن تكون مشتركة مرتبطة في الموقع وارتفاع التوافق الحيوي. نقدم طريقة بسيطة لاصطناق هيدروجيلات GH تحميل MSC (MSC / hydrogels) وتقييم بقائها وانتشارها في ثلاثي الأبعاد (3D) في الثقافة المختبرية. بالإضافة إلى ذلك ، نبرهن على تقنية لزراعة MSC / hydrogels داخل القلب في الفئران ، واصفين إجراءً جراحيًا للحث على احتشاء عضلة القلب (MI) عبر ربط الشريان التاجي السفلي (LAD) الخلفي وزرع MSC / hydrogels اللاحقة.
Introduction
وقد برز العلاج بالخلايا الجذعية القلبية كمقاربة محتملة لإصلاح عضلة القلب وتجديد1,2. على الرغم من النتائج الإيجابية الأخيرة في النماذج الحيوانية والتجارب السريرية، فإن تطبيق العلاج القائم على الخلايا الجذعية لإصلاح عضلة القلب محدود بسبب انخفاض الاحتفاظ بالخلايا المحقونة وسوء بقائها على قيد الحياة في أنسجة القلب المُفرَّجة3،4. ونتيجة لذلك، استخدام هندسة الأنسجة القائمة على الخلايا، بما في ذلك المواد الحيوية عن طريق الحقن5، بقع القلب6، والأوراق الخلوية7، وقد درست بشكل مكثف لتحسين الاحتفاظ بالخلايا والتكامل داخل عضلة القلب المضيف.
من بين مختلف النهج المحتملة لإصلاح أنسجة القلب الهندسة الحيوية، والهيدروجين القابلة للحقن جنبا إلى جنب مع أنواع الخلايا المناسبة، مثل الخلايا الجذعية mesenchymal (MSCs)، والخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)، والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs)، هي خيار جذاب لتسليم الخلايا بفعالية في المناطق عضلة القلب8،9. الجيلاتين، وهو بوليمر طبيعي معروف، يمكن استخدامه كمصفوفة قابلة للحقن بسبب قدرتها البيولوجية الكبيرة، والتحلل الحيوي الكبير، وانخفاض المناعة بالمقارنة مع مجموعة واسعة من المواد الحيوية المستخدمة في التطبيقات الطبية الحيوية. على الرغم من أن منصات حقن الجيلاتين القائمة لديها إمكانات كبيرة, لا تزال تطبيقها في الجسم الحي محدودة على أساس صلابة الميكانيكية المنخفضة وسهولة التحلل في البيئة الفسيولوجية.
للتغلب على هذه القيود، تم اقتراح تصميم رواية وبسيطة من الهيدروجيلات القائم على الجيلاتين تتكون من حمض البرروبيونيك هيدروكسي فينيل لتطبيقات في الجسم الحي. يمكن أن تكون الدعامات اليليباتية-هيدروكسيفينيل بروبيونيك (GH) مترافقات عبر مرتبطة في الموقع في وجود إنزيم، بيروكسيديز الفجل (HRP)، وتغليف في وقت لاحق مختلف الأدوية، الجزيئات الحيوية، أو الخلايا داخل الهيدروجيل، مما يشير إلى إمكانات كبيرة في تطبيقات هندسة الأنسجة10،11،13،14. وبالإضافة إلى ذلك، قمنا مؤخرا بالتحقيق في الآثار العلاجية للHGH الهيدروجيل التي تحتوي على MSCs مغلفة وأظهرت استخدامها في إصلاح القلب الناجح وتجديد بعد MI في نموذج مورين15. في هذا البروتوكول، نحن وصف تقنية بسيطة للتغليف وفي المختبر ثلاثي الأبعاد (3D) انتشار MSCs داخل الهيدروجيلات GH. كما نقدم إجراءً جراحيًا مصممًا لتوليد نموذج murine MI عن طريق ربط الشريان التاجي وزراعة القلب داخل القلب من الهيدروجيل GH الذي يتم تحميله MSC في القلب المُهذب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم توفير جميع إجراءات البحث عن الحيوانات وفقا لقانون رعاية الحيوانات المختبرية، ودليل رعاية واستخدام المختبرات، والمبادئ التوجيهية والسياسات المتعلقة بتجارب القوارض التي قدمتها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كلية الطب التابعة للجامعة الكاثوليكية في كوريا.
1- إعداد الـ MSCs والجيلاتين الهيدروجيلات القابلة للحقن
- ثقافة MSCs في طبق ثقافة 100 مم في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. عندما يصل نمو MSCs إلى 80٪ من الالتقاء، اغسل الطبق مرتين مع DPBS وأضف 1 مل من التربسين البديل عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
ملاحظة: تم عزل MSCs من نخاع العظام مورين بعد الإجراءات التقليدية16، المستزرعة في متوسط النسر المعدل (DMEM) في دولبيككو (DMEM) التي تحتوي على مصل الأبقار الجنينية بنسبة 10٪ (FBS) و 1٪ مضاد حيوي −محلول مضاد للوميكوليك ، وتستخدم بين الممر 7\u20129 لهذه الدراسة. - إضافة 9 مل من الثقافة المتوسطة والطرد المركزي في 500 × ز لمدة 3 دقائق. بعد ذلك ، تجاهل الماثر الناتج ، resuspend الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني ، والحفاظ على تعليق الخلية على الجليد.
- تمييع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من الأزرق Trypan والحصول على تركيز الخلية باستخدام عداد الخلايا الآلي.
- إعادة بناء ونقل MSCs إلى أنبوب 1 مل في كثافة 1 × 107 خلايا / مل.
- إعداد 6.25 wt٪ من محلول غ مترافق في برنامج تلفزيوني وفصل في 2 قارورة. بعد ذلك، اخلطي حلول GH مع إما 6 ميكروغرام/مل من الـ HRP (حل GH A) أو 0.07 wt٪ من H2O2 (GH الحل B).
ملاحظة: إعداد الجيلاتين هيدروكسيفينيل بروبيونيك حمض (GH) conjugates وفقا للبروتوكولات المنشورة12،15.- الحفاظ على نسبة 9:1 الحجمي من GH حل conjugate لHHP (GH حل A) و GH حل اقتران H2O2 (GH الحل B)، على التوالي.
- قبل خلط MSCs مع GH الحل A، طرد مركزي لفترة وجيزة تعليق الخلية في 1000 × ز وpirate بعناية عظمى الناتجة. في وقت لاحق، مزيج بيليه تحتوي على MSCs مع GH الحل A.
2. في الموقع MSC التحميل وثلاثية الأبعاد في الثقافة في المختبر
- تحميل GH الحل A (التي تحتوي على MSCs) و GH الحل B في جانبي حقنة مزدوجة. لوحة 300 ميكرولتر من حلول GH المدمجة مع MSCs بكثافة نهائية تبلغ 5 × 106 خلايا/مل على شريحة غرفة ذات ثمانية بئر.
- بعد تشكيل هيدروجيل في الموقع وتغليف MSC اللاحقة عبر الربط عبر الأنزيمية، إضافة 700 ميكرولتر من DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ مضاد حيوي-حل مضاد للعمول.
- احتضان الشريحة عند 37 درجة مئوية و5٪ CO2 واستبدال الوسط ثقافة كل 2\u20123 أيام.
3. تأكيد انتشار في المختبر والبقاء من MSCs داخل الهيدروجيلات GH
- لتحديد جدوى MSCs مثقف 3D داخل هيدروجيلس GH، استخدم خلية حية / ميتة تلطيخ المقايسة بعد وقت الحضانة المحددة سلفا.
- بعد حضانة MSCs مغلفة في هيدروجيلس GH لمدة 3، 5، 7 أو 14 يوما، التعرق المتوسطة وغسل البئر مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- إعداد حل تلطيخ يحتوي على 5 ميكرولتر من الكالسين AM و 20 ميكرولتر من الإتهيديوم هومديمر-1 (EthD-1) في 10 مل من DPBS.
- إضافة 200 μL من حل تلطيخ إلى البئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
- التعرق حل تلطيخ وغسل البئر مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- قم بفصل الغرفة بعناية عن الشريحة ووضع غطاء كامل على الهيدروجيلات GH. استخدم مجهرًا مجهريًا لتصور درجة الانتشار والتغيرات المورفولوجية لثنائيات MSCs المغلفة.
ملاحظة: تم الحصول على صور الفلورسنت تحت التكبير 200x وصورت في الإثارة / الانبعاثات الطول الموجي من 470/540 نانومتر للكالسين و516/607 نانومتر لEthD-1.
4. التعريفي احتشاء عضلة القلب في الفئران
- تخدير الذكور 7 أسابيع من العمر C57BL/6 الفئران (20\u201222 غرام) مع حقن داخل الصفتون من خليط من Zoletil (30 ملغ / كجم) وRompun (10 ملغ / كغ) في المالحة.
- قبل الجراحة، إزالة الصدر الماوس باستخدام كريم إزالة الشعر وتعقيم الجلد مع اليود.
- ضع الماوس على طاولة التشغيل و intubate عن طريق إدخال قسطرة في القصبة الهوائية لتوفير الأكسجين التكميلي عن طريق التهوية الميكانيكية.
- قطع بلطف من خلال الجلد باستخدام مقص الجراحية ومن ثم اختراق العضلات الوربية بواسطة مقص صغير. فصل الأضلاع اليسرى 2 و 3 باستخدام خياطة الحرير 5-0 للحفاظ على تجويف الصدر المفتوح.
- ligate بعناية في اليسار الأمامي تنازلي (LAD) الشريان التاجي باستخدام حامل إبرة مع 8-0 البولي بروبلين خياطة وقطع خياطة باستخدام الكهربائي.
- مراقبة تغير اللون الفوري في الجدار البطيني الأيسر الأمامي.
5. زرع داخل الرحم من هيدروجيلس GH تحميل MSC
- بعد الحث على احتشاء عضلة القلب من قبل ربط LAD، حقن 10 ميكرولتر من حلول GH MSC التحميل في نقطتين مختلفتين في المنطقة الحدودية في المزارع (المجموع: 2 × 105 MSCs/20 ميكرولتر) باستخدام حقنة مزدوجة مجهزة بإبرة 26G.
- باتباع نفس الإجراء الموضح في الخطوة 1، قم بإعداد ونقل حلول GH التي تحمل MSC إلى حقنة مزدوجة.
ملاحظة: لتقييم engraftment من هيدروجيل GH تحميل MSC داخل المنطقة الزراعية، MSCs وCONS الاقتران تم مسبقا المسمى مع PHK26 وisothiocyanate الفلوريسين (FITC)، على التوالي.
- باتباع نفس الإجراء الموضح في الخطوة 1، قم بإعداد ونقل حلول GH التي تحمل MSC إلى حقنة مزدوجة.
- استعادة تجويف الصدر المفتوحة وإغلاق العضلات والجلد باستخدام 5-0 الغرز.
ملاحظة: قبل إغلاق الصدر، قم بإزالة الهواء باستخدام حقنة قسطرة. - قم بإزالة أنبوب القصبة الهوائية ووضع الماوس في قفص تحت مصباح الأشعة تحت الحمراء أثناء التعافي.
- للانسهاة بعد الجراحة، تُعطى حقن كيتوبروفين تحت الجلد (5 ملغم/كغم يومياً) بحد أدنى 72 ساعة. يجب مراقبة جميع الفئران عن كثب لفترة مناسبة لضمان الشفاء السليم بعد العمليات الجراحية وكذلك علاج الألم الكافي.
6- تخطيط صدى القلب
- بعد أربعة أسابيع من الزرع، في البداية تخدير الماوس مع isoflurane 5٪ ثم ضبط تركيز isoflurane إلى 1٪.
- إزالة الصدر باستخدام كريم إزالة الشعر ووضع الماوس على وسادة التدفئة. تطبيق هلام محول الموجات فوق الصوتية على الصدر.
- الحصول على ثنائي الأبعاد محاور قصيرة الباراسترالي وجهات النظر وسجل M-وضع تتبع على مستوى العضلات الحليمية.
ملاحظة: ضع محول صفيف خطي (7\u201215 ميغاهرتز) في الخط الباراسترالي الأيسر وعرض الهياكل التشريحية. - قياس الخطوط المقابلة لـ LVAW و LVID و LVPW للحصول على سمك جدار القلب ، وبعد الغرفة ، وتقصير جزئي.
ملاحظة: قارن وظيفة القلب بما في ذلك كسر الطرد (EF)، وتقصير الكسور (FS)، وحجم نهاية الانقباضي (ESV) على مستوى العضلات الحليمية لضمان التقييم السليم في نفس الموقع التشريحي.
7. التقييم الهستولوجي
- في الوقت المحدد سلفا بعد زرع هيدروجيل GH تحميل MSC في القلب المعاجم، والقتل الرحيم الفأر في غرفة CO2 وجمع القلب للتحليل النسيجي15.
- للهماتوسلين ويوسين (H & E) وماسون ثلاثية اللون (MT) تلطيخ, إصلاح أنسجة القلب تشريح في 4٪ شبهformaldehyde (PFA) وتضمين في البارافين. المقبل، وقطع كتل القلب البارافين جزءا لا يتجزأ من 4 ميكرومتر المقاطع المسلسل باستخدام microtome وصمة عار المقاطع مع وصمة عار طن متري وفقا للبروتوكولات القياسية17.
- الحصول على الصور على ماسح الشرائح في التكبير 20x وحساب حجم المزارع لمجموعات العلاج.
حجم الإحفار (٪) = إجمالي محيط المزارع / إجمالي محيط LV x 100 - حساب كلا المحيطين قياس طول خط الوسط. بالنسبة لضاحية خط الوسط LV، قم بقياس أطوال الخط المركزي بين الأسطح البطانية والإيبلاردي. بالنسبة لضواط خط الوسط ، قم بقياس أطوال الإحتلال بما في ذلك أكثر من 50٪ من سمك عضلة القلب18كله .
ملاحظة: تم إجراء كافة تحليلات الصور باستخدام برنامج ImageJ. - قياس سمك الجدار من ندبة في مستويات العضلات الحليمة.
- حساب جزء من منطقة الكولاجين.
منطقة الكولاجين (٪) = المساحة الإجمالية للتليف الخلالي/منطقة myocyte × 100
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ومن أجل تسليم MSCs بفعالية إلى عضلة القلب المُهدَّد، استُخدمت في هذا البروتوكول كبسولات هيدروجيلات قابلة للربط عبرية قابلة للربط في الموقع موصوفة في الشكل 1. قبل زرع الجسم الحي ، تم تأكيد انتشار وبقاء MSCs في هيدروجيلس GH بواسطة 3D في المختبر الحي / الخلية الميتة التي تلطيخ المقايسة (العيش: الأخضر ؛ الميت: الأحمر). كما هو مبين في الشكل 2، أظهرت الصور التمثيلية انتشارًا كافًا من MSCs ، مما يظهر الشبكات المتفرعة داخل الهيدروجيلات GH. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ بوضوح في اليوم 14 هيكل متعدد الخلايا متعددة الخلايا ثلاثية الأبعاد من MSCs، مما يشير إلى أن الهيدروجيلات GH يمكن أن توفر بيئة دقيقة مناسبة للخلايا المغلفة.
بعد تحريض MI عبر ربط LAD، تم زرع هيدروجيل GH للتحميل MSC داخل الرحم في مناطق ما حول البحار(الشكل 3A). وكما هو مبين في الشكل 3B،فإن مراكز الانبعاثات المتوسطية وجلها قد استداما بشكل مناسب داخل المنطقة التي تُجرى فيها اُستهدَم. MSCs، ملطخة PHK26 (الأحمر)، كانت متكاملة بشكل جيد في هيدروجيلس GH، ملطخة مع FITC (الأخضر)، وتقديم engraftment الناجحة والاحتفاظ في قلوب مُحتفرة لفي تطبيق الجسم الحي.
للتحقق من الآثار العلاجية للhh hydrogels GH تحميل MSC في نموذج مورين MI، تم تقييم التغيرات في وظيفة القلب وهيكله عن طريق تخطيط صدى القلب والتحليل النسيجي في اليوم 28 بعد زرع ومقارنتها بين مجموعات العلاج المختلفة. وأظهرت تخطيط صدى القلب ممثل تحسين وظائف القلب، بما في ذلك FS، EF، وESV، في MSC / هلام المجموعة المعالجة مقارنة مع المجموعات الأخرى (الشكل 4). وبالإضافة إلى ذلك، أظهر التحليل النسيجي أقل التليف، والجدران الأكثر سمكاً، وحجم افارة أصغر في المجموعة المعالجة MSC/gel مما كانت عليه في المجموعات الأخرى، مما يشير إلى أن هذا البروتوكول ساهم في تأثيرات مفيدة من خلال إعادة عرض LV المخففة بشكل كبير (الشكل 5).
الشكل 1: مخطط عملية تحسين الاحتفاظ بالخلايا الجذعية والنقش باستخدام الهيدروجيلات القابلة للحقن. في الموقع عبر وصلة هيدروجيل GH التي تحتوي على MSCs المشتقة من نخاع العظم تم إعدادها وزرعها عن طريق الحقن داخل القلب في القلب المُحتفر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: في المختبر 3D MSC انتشار داخل هيدروجيلات GH. صور تمثيلية من العيش (الأخضر) / الميتة (الحمراء) MSCs التي تم الحصول عليها عن طريق المجهر confocal بعد تلطيخ الخلية الحية / الميتة بعد 3 و 5 و 7 و 14 يوما من الحضانة (200x التكبير ؛ مقياس = 100 ميكرومتر). تم تكييف الصور والفيديو جزئيا بإذن من كيم وآخرون15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: في زرع الجسم الحي من MSC/ هيدروجيلس. (أ) رسم تخطيطي يظهر زرع داخل القلب بعد تحريض MI.(ب)صور تمثيلية لـ MSCs وHGH هيدروجيلز المسمى PKH26 (أحمر) و FITC (الأخضر) على التوالي. تم التضحية الفئران بعد 1، 3، 5، أو 7 أيام من زرع ثم تم استئصال قلوبهم لتقييم درجة MSC وHGH هيدروجيل engraftment. كانت القلوب المشطوبة ثابتة بالتبريد ، وتم إعدادها في أقسام تسلسلية ، وصورت عبر نسخة مجهرية سفالية (200x تكبير ؛ مقياس = 100 ميكرومتر). تم تكييف الصور جزئيا بإذن من كيم وآخرون15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحسينات في وظيفة القلب بعد زرع MSC/Hydrogels. (أ)فيديو تمثيلي للتصوير الصدى. (B) ممثل قصيرة المحور M-الوضع الصورة مع القياسات، بما في ذلك سمك الجدار الأمامي البطيني الأيسر في دياستول (LVAWD) وsytole (LVAWs)، القطر الداخلي في diastole (LVIDd) وsystole (LVIDs)، وسمك الجدار الخلفي في دياستول (LVPWd) وsytole (LVPWs). (C\u2012E) تحسينات وظيفية في كسر القذف (EF) ، وتقصير كسري (FS) ، والحجم الانقباضي (ESV) بعد 28 يومًا من زرع جميع مجموعات العلاج. تم تمثيل البيانات على أنها متوسط الانحراف المعياري ±(* p < 0.05, **p < 0.001, ***p < 0.0001; n = 9\u201212 لكل مجموعة). تم تكييف مقاطع الفيديو والنتائج جزئيًا بإذن من Kim etal. 15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحسينات في بنية القلب بعد زرع MSC/Hydrogels. (أ) صور تمثيلية للتقييم النسيجي. (B\u2012D) ولوحظت تحسينات هيكلية في حجم infarct، جنبا إلى جنب مع أقل ترقق الجدار والتليف. مقياس = 1 مم. يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط الانحراف المعياري ± (*p < 0.05, **p < 0.001, ***p < 0.0001; n = 4\u20127 لكل مجموعة). تم تكييف الصور والنتائج جزئيا بإذن من كيم وآخرون15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
حقن هيدروجيلس GH لديها إمكانات كبيرة في التطبيقات في الجسم الحي بسبب قدرتها على دمج متجانسة العوامل العلاجية المتنوعة في الموقع. وعلاوة على ذلك، يمكن التلاعب بسهولة بخواصها الفيزيائية والبيوكيميائية استنادا إلى المتطلبات التي تعتمد على الأمراض. في هذا الصدد، وقد اقترح هيدروجيلس عن طريق الحقن لمعالجة القيود الرئيسية في العلاج بالخلايا الجذعية القلبية الحالية يعوقها سوء البقاء على قيد الحياة والاحتفاظ بالخلايا (أي، < 10٪ في غضون 24 ح بعد زرع) في القلب المصاب19،20. للتغلب على هذه النتيجة السيئة، يوفر البروتوكول الموصوف هنا طريقة بسيطة وممكنة لتحسين الاحتفاظ بالخلايا والبقاء على قيد الحياة باستخدام الهيدروجيلات GH التي يمكن ربطها في الموقع بعد زرع عضلة القلب، والتي أظهرت تأثيرات مواتية على بنية القلب ووظيفته في نموذج مورين مي.
الميزة الأساسية لهذه التقنية هو واسع في قابلية للتطبيق في الجسم الحي مع أي نوع من الخلايا والجزيئات الحيوية، والتي يمكن تحميلها ببساطة عن طريق خلط مع الحل GH pregel قبل الحقن. وعلاوة على ذلك ، للحصول على فهم شامل للتفاعلات بين المانحين إلى المضيف ، يمكن تكييف نهج وضع العلامات المباشر لconjugates GH و / أو الجزيئات الحيوية المغلفة لتتبع التغيرات في استقرارها في الجسم الحي ، والتكامل المضيف ، وحركية التشتت. على حد علمنا، كان استخدام الهيدروجيلات القابلة للحقن المستندة إلى الجيلاتين جنبا إلى جنب مع الخلايا الجذعية العلاجية أول من التحقق من صحة الإمكانات التصالحية للأنسجة القلبية في المختبر وفي الجسم الحي15.
في المرحلة الحالية من هذا البحث، استخدمت الهيدروجيلات GH التي يتم تحميلها مع MSCs، حقن، وعبر ربط في الموقع كدليل على مفهوم لتقييم قابليتها للتطبيق في نموذج MI مورين. على الرغم من أن هذه الطريقة تحسنت على ما يبدو MSC engraftment والاحتفاظ في أنسجة القلب المزروعة، وينبغي النظر في الشروط التفصيلية أثناء الحقن لتحسين فعالية العلاجية، مثل موقع الحقن (أي، منطقة ما حول الحفارة أو منطقة نقش)، وحجم وعدد من الحقن، وتصلب الهيدروجيل (أي، من الصعب حقن أو من السهل أن تتسرب).
في الختام، أظهرنا بروتوكولا لنموذج مورين MI ممثل من قبل ربط LAD وطريقة عملية لزرع داخل القلب للخلايا الجذعية باستخدام هيدروجيلات عبر الارتباط في الموقع لتحسين الاحتفاظ وengraftment من MSCs المزروعة. توفر هذه التقنيات طريقة فعالة لزراعة الهيدروجيل القابلة للحقن في داخل الرحم MSC، وتسليط الضوء على إمكاناتها الكبيرة للتطبيق في الحيوانات الكبيرة والترجمة السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفات يتلقّون ما من تعارضات الفائدة أن يعلن مع هذا عمل.
Acknowledgments
ويدعم هذا البحث من قبل برنامج بحوث العلوم الأساسية من خلال مؤسسة البحوث الوطنية في كوريا (NRF) الممولة من وزارة التربية والتعليم (NRF-2018R1D1A02049346)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| 5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
| 8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
| 8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
| Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
| Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
| Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| DPBS | Gibco | 14040-133 | |
| Dual-syringe | |||
| EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
| Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
| Forcep | HEBU | HB0458 | |
| Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
| Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
| 50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
| Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
| Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
| Iodine | Green Pharmaceutical | ||
| LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
| Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
| Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
| Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
| HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
| PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
| Slide scanner | Leica | SCN400 | |
| Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
| Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
| Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
| Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |
References
- Jhund, P. S., McMurray, J. J. Heart failure after acute myocardial infarction: a lost battle in the war on heart failure. Circulation. 118 (20), 2019-2021 (2008).
- Cahill, T. J., Kharbanda, R. K. Heart failure after myocardial infarction in the era of primary percutaneous coronary intervention: Mechanisms, incidence and identification of patients at risk. World Journal of Cardiology. 9 (5), 407-415 (2017).
- Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. npj Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
- Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018, 1909346 (2018).
- Alagarsamy, K. N., Yan, W., Srivastava, A., Desiderio, V., Dhingra, S. Application of injectable hydrogels for cardiac stem cell therapy and tissue engineering. Reviews in Cardiovascular Medicine. 20 (4), 221-230 (2019).
- Gaetani, R., et al. Epicardial application of cardiac progenitor cells in a 3D-printed gelatin/hyaluronic acid patch preserves cardiac function after myocardial infarction. Biomaterials. 61, 339-348 (2015).
- Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circualtion Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).
- Hasan, A., et al. Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Repair after Myocardial Infarction. Advanced Science. 2 (11), 1500122 (2015).
- Wu, R., Hu, X., Wang, J. Concise Review: Optimized Strategies for Stem Cell-Based Therapy in Myocardial Repair: Clinical Translatability and Potential Limitation. Stem Cells. 36 (4), 482-500 (2018).
- Lee, Y., et al. In situ forming gelatin-based tissue adhesives and their phenolic content-driven properties. Journal of Materials Chemistry B. 1 (18), 2407-2414 (2013).
- Lee, Y., Bae, J. W., Lee, J. W., Suh, W., Park, K. D. Enzyme-catalyzed in situ forming gelatin hydrogels as bioactive wound dressings: effects of fibroblast delivery on wound healing efficacy. Journal of Materials Chemistry B. 2 (44), 7712-7718 (2014).
- Lee, S. H., et al. In situ Crosslinkable Gelatin Hydrogels for Vasculogenic Induction and Delivery of Mesenchymal Stem Cells. Advanced Functional Materials. 24 (43), 6771-6781 (2014).
- Jung, B. K., et al. A hydrogel matrix prolongs persistence and promotes specific localization of an oncolytic adenovirus in a tumor by restricting nonspecific shedding and an antiviral immune response. Biomaterials. 147, 26-38 (2017).
- Kim, G., et al. Tonsil-derived mesenchymal stem cell-embedded in situ crosslinkable gelatin hydrogel therapy recovers postmenopausal osteoporosis through bone regeneration. PLoS One. 13 (7), 0200111 (2018).
- Kim, C. W., et al. MSC-Encapsulating in situ Cross-Linkable Gelatin Hydrogels To Promote Myocardial Repair. ACS Applied Bio Materials. 3 (3), 1646-1655 (2020).
- Meirelles Lda, S., Nardi, N. B. Murine marrow-derived mesenchymal stem cell: isolation, in vitro expansion, and characterization. Br J Haematol. 123 (4), 702-711 (2003).
- Ojha, N., et al. Characterization of the structural and functional changes in the myocardium following focal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), 2435-2443 (2008).
- Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. Journal of Applied Physiology. 102 (6), 2104-2111 (2007).
- Terrovitis, J., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. Journal of the American College of Cardiology. 54 (17), 1619-1626 (2009).
- Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell Therapy for Cardiovascular Disease: A Comparison of Methods of Delivery. Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (2), 177-181 (2011).
