Summary
La thérapie à base de cellules souches est apparue comme une stratégie efficace pour réparer les tissus cardiaques blessés après l’infarctus du myocarde. Nous fournissons une application in vivo optimale pour la transplantation de cellules souches utilisant des hydrogels de gélatine qui peuvent être enzymatiquement liés.
Abstract
L’un des principaux problèmes auxquels sont confrontées les thérapies actuelles de cellules souches cardiaques pour prévenir l’insuffisance cardiaque postinfarcte est le faible taux de rétention et de survie des cellules transplantées dans le myocarde blessé, limitant leur efficacité thérapeutique. Récemment, l’utilisation de biomatériaux d’échafaudage a attiré l’attention pour améliorer et maximiser la thérapie par cellules souches. L’objectif de ce protocole est d’introduire une technique simple et simple pour transplanter les cellules souches mésenchymales dérivées de la moelle osseuse (MSCs) à l’aide d’hydrogels injectables d’acide propionique hydroxyphényle (GH); les hydrogels sont favorables en tant que plate-forme de livraison de cellules pour des applications d’ingénierie de tissu cardiaque en raison de leur capacité à être in situ inter-liée et à la biocompatibilité élevée. Nous présentons une méthode simple pour fabriquer des hydrogels GH à chargement par MSC (MSC/hydrogels) et évaluer leur survie et leur prolifération dans la culture in vitro tridimensionnelle (3D). En outre, nous démontrons une technique pour la transplantation intramyocardique de MSC/hydrogels chez les souris, décrivant une procédure chirurgicale pour induire l’infarctus du myocarde (MI) par ligature antérieure gauche d’artère coronaire (LAD) et transplantation suivante de MSC/hydrogels.
Introduction
La thérapie cardiaque de cellules souches est apparue comme approche potentielle pour la réparation et la régénération myocardiques1,2. Malgré les résultats positifs récents dans les modèles animaux et les essais cliniques, l’application de la thérapie à base de cellules souches pour la réparation du myocarde est limitée en raison de la faible rétention et la mauvaise survie des cellules injectées dans les tissus cardiaques infarctus3,4. En conséquence, l’utilisation de l’ingénierie tissulaire à base de cellules, y compris les biomatériaux injectables5, les patchscardiaques 6, et les feuillescellulaires 7, a été intensivement étudié pour améliorer la rétention cellulaire et l’intégration dans le myocarde hôte.
Parmi les diverses approches potentielles de la réparation des tissus cardiaques bioingénieurs, les hydrogels injectables combinés à des types de cellules appropriés, tels que les cellules souches mésenchymiques (CSM), les cellules souches embryonnaires (ESC) et les cellules souches pluripotentes induites (IPSC), sont une option attrayante pour livrer efficacement les cellules dans les régions myocardiques8,9. La gélatine, un polymère naturel bien connu, peut être utilisée comme matrice injectable en raison de sa grande biocompatibilité, de sa biodégradabilité considérable et de sa réduction de l’immunogénicité par rapport à un large éventail de biomatériaux utilisés dans les applications biomédicales. Bien que les plates-formes injectables à base de gélatine aient un grand potentiel, leur applicabilité in vivo reste limitée en raison de leur faible rigidité mécanique et de leur dégradabilité facile dans l’environnement physiologique.
Pour surmonter ces limitations, une conception nouvelle et simple d’hydrogels à base de gélatine composé d’acide propionique hydroxyphényle a été proposée pour des applications in vivo. Les conjugués à l’acide propionique gélatine-hydroxyphényle (GH) peuvent être reliés in situ en présence d’une enzyme, la peroxidase de raifort (HRP), et par la suite encapsuler divers médicaments, biomolécules ou cellules dans l’hydrogel, suggérant un grand potentiel dans les applications d’ingénierietissulaire 10,11,12,13,14. En outre, nous avons récemment étudié les effets thérapeutiques des hydrogels de GH contenant des MSCs encapsulés et avons démontré leur utilisation dans la réparation et la régénération cardiaques réussies après MI dans un modèle murin15. Dans ce protocole, nous décrivons une technique simple pour l’encapsulation et la prolifération tridimensionnelle in vitro (3D) des MSCs dans les hydrogels de GH. Nous introduisons également une procédure chirurgicale conçue pour produire un modèle murin d’MI par ligature d’artère coronaire et transplantation intramyocardique des hydrogels de GH MSC-chargement dans le coeur infarctus.
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Protocol
Toutes les procédures de recherche sur les animaux ont été fournies conformément à la Loi sur le bien-être des animaux de laboratoire, au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et aux Lignes directrices et politiques pour les expériences de rongeurs fournies par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’École de médecine de l’Université catholique de Corée.
1. Préparation des MSC et des hydrogels injectables de gélatine
- Culture MSCs dans un plat de culture de 100 mm à 37 °C et 5% CO2. Lorsque la croissance des MSC atteint 80% de confluence, laver le plat deux fois avec du DPBS et ajouter 1 mL de trypsine substitut à 37 °C pendant 3 min.
REMARQUE : Les MSC ont été isolés de la moelle osseuse murine suivant lesprocédures conventionnelles 16, cultivés dans le milieu modifié de l’aigle de Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de solution antibiotique−antimycotique, et utilisés entre le passage 7\u20129 pour cette étude. - Ajouter 9 mL de culture moyenne et centrifugeuse à 500 x g pendant 3 min. Ensuite, jetez le supernatant qui en résulte, resuspendez les cellules en 1 mL de PBS et maintenez la suspension cellulaire sur la glace.
- Diluer 10 μL de suspension cellulaire avec 10 μL de bleu Trypan et obtenir la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé.
- Resuspendez et transférez les MSC dans un tube de 1 mL à une densité de 1 x 107 cellules/mL.
- Préparez une solution conjuguée GH de 6,25 % dans PBS et séparez-la en 2 flacons. Ensuite, mélangez les solutions GH avec 6 μg/mL de HRP (gh solution A) ou 0,07 wt% de H2O2 (GH solution B).
NOTE : Préparer l’acide propionique gélatine-hydroxylphylphyle (GH) conjugué selon les protocolesédités 12,15.- Gardez un rapport volumétrique de 9:1 de gh solution conjuguée à HRP (GH solution A) et GH solution conjuguée à H2O2 (GH solution B), respectivement.
- Avant de mélanger les MSC avec la solution GH A, centrifugez brièvement la suspension cellulaire à 1 000 x g et aspirez soigneusement le supernatant qui en résulte. Par la suite, mélanger la pastille contenant des MSC avec la solution GH A.
2. Chargement in situ du MSC et culture in vitro tridimensionnelle
- Chargez la solution GH A (contenant des MSCs) et la solution GH B de chaque côté d’une double seringue. Plaque 300 μL des solutions GH combinées avec les MSC à une densité finale de 5 x 106 cellules/mL sur une glissière de chambre de huit puits.
- Après la formation in situ d’hydrogel et l’encapsulation suivante de MSC par l’intermédiaire de la liaison croisée enzymatique, ajoutez 700 μL de DMEM contenant 10% de FBS et 1% de solution antibiotique−antimycotique.
- Incuber la diapositive à 37 °C et 5 % de CO2 et remplacer le milieu de culture tous les 2\u20123 jours.
3. Confirmation de la prolifération in vitro et de la survie des SMC dans les hydrogels GH
- Pour déterminer la viabilité des SMC cultivés en 3D dans les hydrogels GH, utilisez un test de coloration des cellules vivantes ou mortes après le temps d’incubation prédéterminé.
- Après incubation des MSC encapsulés dans les hydrogels GH pendant 3, 5, 7 ou 14 jours, aspirez le milieu et lavez le puits deux fois avec du PBS.
- Préparer une solution de coloration contenant 5 μL de calcéine AM et 20 μL d’éthidium homodimer-1 (EthD-1) dans 10 mL de DPBS.
- Ajouter 200 μL de la solution de coloration au puits et incuber pendant 30 min dans l’obscurité à température ambiante.
- Aspirer la solution de coloration et laver le puits deux fois avec PBS.
- Séparez soigneusement la chambre de la glissière et placez un coverslip complet sur les hydrogels GH. Utilisez une microscopie confocale pour visualiser le degré de prolifération et les changements morphologiques des CSM encapsulés.
REMARQUE : Les images fluorescentes ont été acquises sous grossissement de 200 x et photographiées aux longueurs d’onde excitation/émission de 470/540 nm pour la calcéine et de 516/607 nm pour EthD-1.
4. Induction de l’infarctus du myocarde chez la souris
- Anesthésier les souris C57BL/6 mâles de 7 semaines (20\u201222 g) par injection intraperitoneal d’un mélange de Zoletil (30 mg/kg) et rompun (10 mg/kg) en solution saline.
- Avant la chirurgie, dépolar le coffre de la souris à l’aide de crème d’épilation et stériliser la peau avec de l’iode.
- Placez la souris sur une table d’opération et intubez en insérant un cathéter dans la trachée pour fournir de l’oxygène supplémentaire par ventilation mécanique.
- Coupez doucement la peau à l’aide de ciseaux chirurgicaux, puis pénètrez les muscles intercostals par micro ciseaux. Séparez les 2e et 3e côtes gauches à l’aide d’une suture en soie 5-0 pour maintenir une cavité thoracique ouverte.
- Ligate soigneusement l’artère coronaire descendante antérieure gauche (LAD) utilisant un support d’aiguille avec un 8-0 suture en polypropylène et couper la suture à l’aide d’électrocautery.
- Observez un changement de couleur immédiat dans la paroi ventriculaire gauche antérieure.
5. Transplantation intramyocardique d’hydrogels GH à chargement par MSC
- Après avoir induisé l’infarctus du myocarde par ligature LAD, injectez 10 μL de solutions GH à chargement MSC en deux points différents à la zone frontalière infarctus (total : 2 x 105 MSCs/20 μL) à l’aide d’une seringue double munie d’une aiguille 26G.
- Suivant la même procédure décrite à l’étape 1, préparez et transférez les solutions GH à chargement par MSC dans une double seringue.
REMARQUE : Pour évaluer l’engraftment des hydrogels GH à chargement par MSC dans la zone infarctusée, les SMC et les conjugués gh ont été pré-étiquetés avec phk26 et isothiocyanate de fluorescéine (FITC), respectivement.
- Suivant la même procédure décrite à l’étape 1, préparez et transférez les solutions GH à chargement par MSC dans une double seringue.
- Restaurer la cavité thoracique ouverte et fermer les muscles et la peau à l’aide de sutures 5-0.
REMARQUE : Avant la fermeture de la poitrine, retirez l’air à l’aide d’une seringue cathéter. - Retirez le tube trachéal et placez la souris dans une cage sous une lampe infrarouge pendant la récupération.
- Pour l’analgésie postopératoire, administrer des injections sous-cutanées de kétoprofène (5 mg/kg par jour) pour un minimum de 72 h. Toutes les souris devraient être étroitement surveillées pendant un moment approprié pour assurer le rétablissement approprié après des procédures chirurgicales aussi bien que le traitement adéquat de douleur.
6. Échocardiographie
- Quatre semaines après la transplantation, anesthésier d’abord la souris avec 5% d’isoflurane, puis ajuster la concentration d’isoflurane à 1%.
- Dépeler la poitrine à l’aide de crème d’épilation et placer la souris sur un coussin chauffant. Appliquer le gel transducteur à ultrasons sur la poitrine.
- Acquérir des vues parasternales à axe court bidimensionnel et enregistrer des tracés en mode M au niveau du muscle papillaire.
REMARQUE : Placez un transducteur linéaire (7\u201215 MHz) dans la ligne parasternale gauche et visualisez les structures anatomiques. - Mesurez les lignes correspondantes pour LVAW, LVID et LVPW pour obtenir l’épaisseur de la paroi cardiaque, la dimension de la chambre et le raccourcissement fractionnel.
REMARQUE : Comparez la fonction cardiaque comprenant la fraction d’éjection (EF), le raccourcissement fractionnel (FS), et le volume systolique final (ESV) au niveau du muscle papillaire pour assurer l’évaluation appropriée au même endroit anatomique.
7. Évaluation histologique
- Au moment prédéterminé après la transplantation des hydrogels GH msc-chargement dans le coeur infarctus, euthanasier la souris dans une chambre de CO2 et de recueillir le cœur pour l’analyse histologique15.
- Pour l’hématoxyline et l’éosine (H&E) et la coloration trichrome (MT) de Masson, fixez les tissus cardiaques disséqués en paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et intégris à la paraffine. Ensuite, coupez les blocs cardiaques intégrés à la paraffine en sections de série de 4 μm à l’aide d’une microtome et tachez les sections avec de la tache MT selon les protocoles standard17.
- Obtenez des images sur un scanner de diapositives à 20x grossissement et calculez la taille infarctus des groupes de traitement.
Taille infarctus (%) = circonférence infarctus totale / circonférence totale du LV x 100 - Calculez les deux circonférences par mesure de la longueur médiane. Pour les circonférences intermédiaires LV, mesurez les longueurs de la ligne centrale entre les surfaces endocardiques et épicardiales. Pour les circonférences infarctus de la ligne médiane, mesurer les longueurs de l’infarctus, y compris plus de 50 % de toute l’épaisseur du myocarde18.
REMARQUE : Toutes les analyses d’images ont été effectuées à l’aide du logiciel ImageJ. - Mesurer l’épaisseur de la paroi de la cicatrice aux niveaux musculaires papillaires.
- Calculer la fraction de la zone de collagène.
Zone de collagène (%) = superficie totale de fibrose interstitielle/zone myocyte x 100
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Representative Results
Pour livrer efficacement les CSM au myocarde infarctus, des hydrogels in situ à chargement in situ à liaison croisée décrits à la figure 1 ont été utilisés dans ce protocole. Avant la transplantation in vivo, la prolifération et la survie des SMC dans les hydrogels GH ont été confirmées par un test de coloration 3D in vitro des cellules vivantes/mortes (vivant : vert; mort : rouge). Comme le montre la figure 2, lesimages représentatives présentaient une prolifération suffisante de CSDM, montrant des réseaux ram ramés dans les hydrogels GH. En outre, une structure multicellulaire étendue de 3D des MSCs a été clairement observée au jour 14, indiquant que les hydrogels de GH pourraient fournir un microenvironnement approprié pour les cellules encapsulées.
Après l’induction de l’IM par ligature LAD, les hydrogels GH à chargement par MSC ont été transplantés intramyocardially dans les zones péri-infarctus (Figure 3A). Comme le montre la figure 3B,les MSC et le gel ont été soutenus de façon appropriée dans la région infarctus. Les CSS, tachés de PHK26 (rouge), étaient bien intégrés dans les hydrogels GH, tachés de FITC (vert), présentant un engraftment et une rétention réussis dans les cœurs infarctus pour une application in vivo.
Pour vérifier les effets thérapeutiques des hydrogels GH msc-loading dans un modèle murin d’IM, les changements dans la fonction et la structure cardiaques ont été évalués par échocardiographie et analyse histologique au jour 28 post-transplantation et comparés parmi les différents groupes de traitement. L’échocardiographie représentative a montré des fonctions cardiaques améliorées, y compris FS, EF, et ESV, dans le groupe MSC/gel traité par rapport aux autres groupes (figure 4). En outre, l’analyse histologique a montré moins de fibrose, des murs infarctus plus épais, et une plus petite taille d’infarctus dans le groupe traité msc/gel que dans les autres groupes, indiquant que ce protocole a contribué des effets bénéfiques en atténuant de manière significative le remodelage de LV (figure 5).
Figure 1 : Schéma du processus d’amélioration de la rétention et de l’engraftment des cellules souches à l’aide d’hydrogels injectables. Des hydrogels de GH in situ recoupés contenant des MSCs dérivés de la moelle osseuse ont été préparés et transplantés par injection intramyocardique dans le cœur infarctus. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Prolifération in vitro de MSC 3D dans les hydrogels de GH. Images représentatives de MSC vivants (verts)/morts (rouges) obtenues par microscopie confoccale à la suite de taches de cellules vivantes/mortes après 3, 5, 7 et 14 jours d’incubation (grossissement de 200 x; échelle = 100 μm). Les images et la vidéo ont été partiellement adaptées avec la permission de Kim et coll.15. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Transplantation in vivo de MSC/Hydrogels. (A) Diagramme schématique montrant la transplantation intramyocardique après l’induction de MI. (B) Images représentatives de MSCs transplantés et d’hydrogels GH étiquetés avec PKH26 (rouge) et FITC (vert), respectivement. Des souris ont été sacrifiées après 1, 3, 5, ou 7 jours de transplantation et leurs coeurs ont alors été excisés pour évaluer le degré d’engraftment d’hydrogel de MSC et de GH. Les cœurs excisés étaient cryo-fixes, préparés en sections de série et photographiés au moyen d’une microcopie confoccale (grossissement de 200 x; échelle = 100 μm). Les images ont été partiellement adaptées avec la permission de Kim et coll.15. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Amélioration de la fonction cardiaque après la transplantation de MSC/Hydrogels. (A) Vidéo représentative de l’échocardiographie. (B) Image représentative de mode M à axe court avec mesures, y compris l’épaisseur du mur antérieur ventriculaire gauche en diastole (LVAWd) et systole (LVAWs), diamètre interne en diastole (LVIDd) et systole (LVIDs), et épaisseur postérieure du mur en diastole (LVPWd) et systole (LVPWs). (C\u2012E) Améliorations fonctionnelles de la fraction d’éjection (EF), du raccourcissement fractionnel (FS) et du volume systolique final (ESV) après 28 jours de transplantation de tous les groupes de traitement. Les données étaient représentées comme un écart type moyen de ± (*p < 0,05, **p < 0,001, ***p < 0,0001; n = 9\u201212 par groupe). Les vidéos et les résultats ont été partiellement adaptés avec la permission de Kim et coll.15. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Amélioration de la structure cardiaque à la suite de la transplantation de MSC/Hydrogels. (A) Images représentatives de l’évaluation histologique. (B\u2012D) Des améliorations structurelles ont été observées dans la taille infarctus, avec moins d’amincissement et de fibrose de mur infarctus. Échelle = 1 mm. Les données sont représentées comme l’écart type moyen de ± (*p < 0,05, **p < 0,001, ***p < 0,0001; n = 4\u20127 par groupe). Les images et les résultats ont été partiellement adaptés avec la permission de Kim et coll.15. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Hydrogels GH injectables ont un grand potentiel pour les applications in vivo en raison de leur capacité à incorporer homogènement divers agents thérapeutiques in situ. En outre, leurs propriétés physiques et biochimiques peuvent être facilement manipulées en fonction des besoins dépendants de la maladie. À cet égard, des hydrogels injectables ont été proposés pour répondre aux principales limitations de la thérapie actuelle par cellules souches cardiaques entravées par une mauvaise survie et la rétention cellulaire (c.-à-d. et 10 % dans les 24 h après la transplantation) dans lecœur blessé 19,20. Pour surmonter ce mauvais résultat, le protocole décrit ci-après fournit une méthode simple et faisable pour améliorer la rétention et la survie cellulaires utilisant des hydrogels de GH qui peuvent être inter-liés in situ après transplantation myocardique, qui ont démontré des effets favorables sur la structure et la fonction cardiaques dans un modèle murin d’MI.
La principale caractéristique avantage de cette technique est sa large applicabilité in vivo avec n’importe quel type de cellule et de biomolécule, qui peut être chargé en mélangeant simplement avec la solution GH pregel avant l’injection. En outre, pour obtenir une compréhension complète des interactions donneur-hôte, une approche d’étiquetage simple des conjugués gh et/ou des biomolécules encapsulées peut être adaptée pour suivre les changements dans leur stabilité in vivo, l’intégration de l’hôte et la cinétique de résorption. À notre connaissance, l’utilisation d’hydrogels injectables à base de gélatine combinés avec des cellules souches thérapeutiques a été la première à valider le potentiel réparateur du tissu cardiaque in vitro et in vivo15.
À l’étape actuelle de cette recherche, les hydrogels GH chargés de MSC, injectés et reliés entre eux in situ ont été utilisés comme preuve de concept pour évaluer leur applicabilité dans un modèle mi murin. Bien que cette méthode ait apparemment amélioré l’engreffe et la rétention du MSC dans les tissus cardiaques transplantés, les conditions détaillées pendant l’injection devraient être considérées pour optimiser l’efficacité thérapeutique, comme l’emplacement du site d’injection (c.-à-d. zone péri-infarctus ou zone infarctus), le volume et le nombre d’injections, et la rigidité de l’hydrogel (c.-à-d. difficile à injecter ou facile à fuir).
En conclusion, nous avons démontré un protocole pour un modèle murin représentatif d’MI par ligature de LAD et une méthode pratique pour la transplantation intramyocardique des cellules souches utilisant des hydrogels in situ croisés pour améliorer la conservation et l’engraftment des MSCs transplantés. Ces techniques fournissent une méthode efficace pour la transplantation intramyocardique d’hydrogels injectables à chargement par MSC et mettent en évidence leur grand potentiel d’application chez les grands animaux et leur traduction clinique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer avec cet ouvrage.
Acknowledgments
Cette recherche est soutenue par le Programme de recherche en sciences fondamentales par l’intermédiaire de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le ministère de l’Éducation (NRF-2018R1D1A1A02049346)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| 5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
| 8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
| 8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
| Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
| Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
| Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| DPBS | Gibco | 14040-133 | |
| Dual-syringe | |||
| EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
| Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
| Forcep | HEBU | HB0458 | |
| Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
| Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
| 50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
| Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
| Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
| Iodine | Green Pharmaceutical | ||
| LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
| Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
| Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
| Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
| HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
| PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
| Slide scanner | Leica | SCN400 | |
| Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
| Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
| Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
| Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |
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