Summary
Denne protokol beskriver brugen af Asymmetrisk Flow Field-Flow Fraktionering kombineret med UV-vis detektion til bestemmelse af størrelsen af en ukendt guld nanopartikel prøve.
Abstract
Partikelstørrelse er uden tvivl den vigtigste fysisk-kemiske parameter, der er forbundet med begrebet nanopartikel. Præcis viden om størrelsen og størrelsen fordeling af nanopartikler er af allerstørste betydning for forskellige applikationer. Størrelsesområdet er også vigtigt, da det definerer den mest "aktive" komponent i en nanopartikeldosis.
Asymmetrisk Flow Field-Flow Fraktionering (AF4) er en kraftfuld teknik til dimensionering af partikler i suspension i størrelsesområdet på ca. 1-1000 nm. Der er flere måder at udlede størrelsesoplysninger fra et AF4-eksperiment. Ud over at koble AF4 online med størrelsesfølsomme detektorer baseret på principperne om multivinkellysspredning eller dynamisk lysspredning er der også mulighed for at korrelere størrelsen af en prøve med dens retentionstid ved hjælp af en veletableret teoretisk tilgang (FFF-teori) eller ved at sammenligne den med retentionstiderne for veldefinerede partikelstørrelsesstandarder (ekstern størrelseskalibrering).
Vi beskriver her udviklingen og den interne validering af en standardprocedure (SOP) til dimensionering af en ukendt guld nanopartikelprøve af AF4 kombineret med UV-vis-detektion ved hjælp af ekstern størrelseskalibrering med guld nanopartikelstandarder i størrelsesområdet 20-100 nm. Denne procedure giver en detaljeret beskrivelse af den udviklede arbejdsgang, herunder prøveforberedelse, AF4-instrumentopsætning og -kvalifikation, AF4-metodeudvikling og fraktionering af den ukendte guldnanopartikelprøve samt korrelationen mellem de opnåede resultater og den etablerede eksterne størrelseskalibrering. Den SOP, der er beskrevet her, blev til sidst valideret med succes inden for rammerne af en interlaboratorisk sammenligningsundersøgelse, der fremhævede AF4's fremragende robusthed og pålidelighed til dimensionering af nanopartikelprøver i suspension.
Introduction
Guld nanopartikler (AuNP) i form af kolloidt guld havde været en del af den menneskelige kultur længe før der var en forståelse af, hvad nanopartikler var, og før udtrykket nanopartikel havde fundet vej ind i moderne, videnskabelige ordforråd. Uden særskilt kendskab til deres nanoskala udseende, suspenderet AuNP var allerede blevet brugt til medicinske og andre formål i det gamle Kina, Arabien og Indien i V-VI århundreder f.Kr.1, og også de gamle romere benyttede sig af deres rubinrøde farve til berømt pletten deres keramik i Lycurgus Cup udstille i British Museum2. I den vestlige verden, gennem århundrederne fra middelalderen til den moderne æra, blev suspenderet AuNP overvejende brugt som farvestoffer til glas og emalje (Purple of Cassius)3 samt til behandling af en række sygdomme (Potable Gold), især syfilis4.
Men alle disse undersøgelser havde primært fokuseret på anvendelsen af suspenderet AuNP, og det var op til Michael Faraday i 1857 at indføre den første rationelle tilgang til at undersøge deres dannelse, deres art samt deres egenskaber5. Selvom Faraday allerede var klar over, at disse AuNP skal have meget små dimensioner, var det ikke før udviklingen af elektronmikroskopi, da eksplicitte oplysninger om deres størrelsesfordeling var tilgængelige6,7, hvilket i sidste ende muliggjorde sammenhængen mellem størrelse og andre AuNP-egenskaber.
I dag, takket være deres forholdsvis let og ligetil syntese, bemærkelsesværdige optiske egenskaber (overfladeplasmon resonans), god kemisk stabilitet og dermed mindre toksicitet samt deres høje alsidighed med hensyn til tilgængelige størrelser og overfladeændringer, har AuNP fundet udbredte anvendelser inden for områder som nanoelektronik8, diagnostik9, kræftbehandling10eller lægemiddellevering11. Det er klart, at for disse anvendelser er præcis viden om størrelsen og størrelsesfordelingen af den anvendte AuNP en grundlæggende forudsætning for at sikre optimal effektivitet12, og der er en betydelig efterspørgsel efter robuste og pålidelige værktøjer til at bestemme denne afgørende fysisk-kemiske parameter. I dag er der en overflod af analytiske teknikker, der er i stand til at dimensionere AuNP i suspension, herunder, for eksempel UV-vis Spectroscopy (UV-vis)13, DLS (Dynamic Light Scattering)14 eller Single Particle Induktivt-Koblet Plasma Mass Spectrometry (spICP-MS)15 med Field-Flow Fractionation (FFF) som en nøglespiller på dette område16,17,18,19,20.
Første konceptualiseret i 1966 af J. Calvin Giddings21, FFF består af en familie af elution-baserede fraktionering teknikker, hvor adskillelse finder sted inden for en tynd, bånd-lignende kanal uden en stationær fase22,23. I FFF fremkaldes adskillelsen af samspillet mellem en prøve og et eksternt kraftfelt, der virker vinkelret på retningen af et laminarkanalflow, hvor prøven transporteres nedstrøms normalt mod respektive in-line detektorer. Blandt disse relaterede FFF-teknikker er Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation (AF4), hvor et andet flow (cross flow) fungerer som kraftfelt, blevet den mest anvendte undertype24. I AF4 er kanalbunden (akkumuleringsvæg) udstyret med en semipermeable ultrafiltreringsmembran, der er i stand til at bevare prøven, samtidig med at krydsstrømmen kan passere gennem membranen og forlade kanalen via en ekstra stikkontakt. På denne måde kan krydsstrømmen skubbe prøven mod akkumuleringsvæggen og derved modvirke dens diffusionsinducerede flux (Brownian-bevægelse). I en deraf følgende ligevægt af felt- og diffusionsinducerede fluxer; mindre prøvebestanddeler, der udviser højere diffusionskoefficienter, flugter tættere på kanalcentret, mens større prøvebestanddeler, der udviser lavere diffusionskoefficienter, finder tættere på akkumuleringsvæggen. På grund af den parabolske strømningsprofil inde i kanalen transporteres mindre prøvebestanddele derfor i kanalstrømmens hurtigere laminae og lut før større prøvebestanddele. Ved hjælp af FFF retention parameter og Stokes-Einstein diffusion koefficient ligninger, eluering tid og henholdsvis eluering volumen, af en prøve i AF4 kan derefter direkte oversættes til sin hydrodynamiske størrelse22. Her henviser den beskrevne elueringsfunktion til den normale elueringstilstand og er normalt gyldig for AF4 inden for et partikelstørrelsesområde mellem ca. 1-500 nm (nogle gange op til 2000 nm afhængigt af partikelegenskaber og fraktioneringsparametre), mens sterisk-hyperlayer elution normalt forekommer over denne størrelsesgrænse25.
Der er tre almindelige måder at udlede størrelsesoplysninger efter FFF's separation. Da FFF er et modulopbygget instrument, kan det kombineres nedstrøms medfleredetektorer,f.eks. Men da en prøves fastholdelsesadfærd i en FFF-kanal generelt styres af veldefinerede fysiske kræfter, kan størrelsen også beregnes ved hjælp af en matematisk tilgang (FFF-teori), hvor en simpel koncentrationsdetektor (f.eks. en UV-vis-detektor) er tilstrækkelig til at indikere tilstedeværelsen af en elutingprøve32,33.
Som en tredje mulighed rapporterer vi her anvendelsen af en ekstern størrelseskalibrering34,35 ved hjælp af veldefinerede AuNP-standarder i størrelsesområdet 20-100 nm til dimensionering af en ukendt guld nanopartikelprøve i suspension ved hjælp af AF4 kombineret med UV-vis-detektion. Denne enkle eksperimentelle opsætning blev valgt med vilje for at give så mange laboratorier som muligt mulighed for at deltage i en international interlaboratorisk sammenligning (ILC), som senere blev udført inden for rammerne af EU Horizon 2020-projektet ACEnano baseret på den protokol, der præsenteres her.
Protocol
1. AF4 systemopsætning
- Saml AF4-patronen, og tilslut alle hardwarekomponenter i AF4-systemet og UV-vis-detektoren (Tabel over materialer) i nedenstående vejledning.
- Installer alle nødvendige softwarepakker til kontrol, dataindsamling, behandling og evaluering i nedenstående vejledning.
- Sørg for, at alle nødvendige signalforbindelser mellem AF4-systemet og UV-vis-detektoren er etableret.
- Sørg for, at de etablerede AF4-UV-vis-forbindelser er stramme og uden lækager ved at skylle opsætningen med ultrapure vand (UPW) i 15 minutter (spidsflowhastighed 1 mL∙min-1, fokusflowhastighed 1 mL∙min-1og cross flow rate 1,5 mL∙min-1). For at gøre dette skal du åbne AF4-kontrolsoftwaren og indtaste strømningshastighederne i de respektive paneler på højre overside af landingssiden. Stram de respektive stik (fittings), hvis det er nødvendigt, og gentag proceduren, indtil der ikke kan observeres lækager.
BEMÆRK: Det interne systemtryk under alle målinger skal overvåges og skal være inden for 4 til 12 bar. Hvis trykket er højere eller lavere, skal backpressurerøret justeres. Desuden bør kanaltryktendensen være konstant i hele måletiden.
BEMÆRK: Hvis der er en kanalovn til rådighed, skal du indstille temperaturen til 25 °C for at sikre sammenlignelige målebetingelser under alle AF4-forsøg.
2. Forberedelse af opløsninger og suspensioner til AF4-UV-vis systemkvalifikation og prøveanalyse
- Rengøringsløsning
- Der tilsættes 8 g natriumhydroxid (NaOH) og 2 g natrium dodecylsulfat (SDS) til 1 L UPW, og opløsningen omrøres, indtil opløsningen er fuldstændig opløst.
- Eluent
- Der tilsættes 500 μL filtreret overfladeaktivt middelblanding til 2 L filtreret og afgasset UPW for at opnå elueringsmidlet (0,025% (v/v), pH omkring 9,4).
BEMÆRK: Tabel 1 (også materialetabel) indeholder en detaljeret beskrivelse af forbindelserne i blandingen af overfladeaktive stoffer.
- Der tilsættes 500 μL filtreret overfladeaktivt middelblanding til 2 L filtreret og afgasset UPW for at opnå elueringsmidlet (0,025% (v/v), pH omkring 9,4).
- Vilkårlig AuNP-størrelsesstandard til bestemmelse af massegenvinding
- Vortex en vilkårlig AuNP-størrelsesstandard (50 mg∙L-1) i 2 min og fortynd den 1:4 med UPW for at opnå en endelig massekoncentration på 12,5 mg∙L-1. Vortex i yderligere 2 minutter efter fortynding for at homogenisere den opnåede suspension.
ADVARSEL: Der kræves nødvendige sikkerhedsforanstaltninger og passende beskyttelsesudstyr ved arbejde med kemikalier, især NaOH-pellets.
BEMÆRK: Det anbefales generelt at afgasse og filtrere alle nødvendige opløsninger (undtagen rengøringsopløsningen) ved hjælp af et 0,1 μm membranfilter (hydrofil PVDF eller lignende) for at sikre lav partikelbaggrund under AF4-UV-vis-forsøg. Dette kan fastslås enten ved hjælp af en dedikeret vakuumfiltreringsenhed eller ved hjælp af sprøjtefiltre.
- Vortex en vilkårlig AuNP-størrelsesstandard (50 mg∙L-1) i 2 min og fortynd den 1:4 med UPW for at opnå en endelig massekoncentration på 12,5 mg∙L-1. Vortex i yderligere 2 minutter efter fortynding for at homogenisere den opnåede suspension.
3. Af4-UV-vis systemkvalifikation
- Brug de softwareindstillinger, der er beskrevet i trin 1.4, til at skylle systemet med rengøringsopløsningen i 30 minutter (Tipflowhastighed 1 mL∙min-1, Fokusflowhastighed 1 mL∙min-1og Cross flow rate 1,5 mL∙min-1).
- Skift den respektive eluentflaske, og skyl systemet med UPW i 20 min ( Spidsflowhastighed 1 mL∙min-1, Fokusflowhastighed 1 mL∙min-1og Cross flow rate 1,5 mL∙min-1).
- Udskift de respektive indbyggede pumpefiltre.
- Åbn AF4-patronen, og udskift AF4-membranen. Saml AF4-patronen igen, og tilslut den igen med AF4-UV-vis-systemet.
- Det rensede AF4-UV-vis-system skylles med elueringssystemet i mindst 30 minutter for at afbalancere membranen og stabilisere systemet (Spidsstrømshastighed 1 mL∙min-1, Fokusflowhastighed 1 mL∙min-1og Cross flow rate 1,5 mL∙min-1). Kontroller, om der er potentielle lækager igen (se trin 1.4).
- Kvalificer AF4-UV-vis-systemet ved at bestemme massegenvindingen og variationen af retentionstiden ved hjælp af en vilkårlig AuNP-størrelsesstandard.
- Udfør en direkte injektion uden anvendelse af en separationskraft.
- Opret en ny målefil ved at åbne Fil | Ny | Kør i AF4-kontrolsoftwaren.
- Definer eksempel- og målebeskrivelsen samt injektionsvolumen og eksempelnavn under fanen Kør. Målebetingelserne er vist i tabel 2.
- Angiv måleparametrene i FFF-metoden under den anden fane i overensstemmelse med tabel 2.
- Klik på knappen Kør for at starte målingen.
- Udfør en fraktioneringskørsel med anvendelse af en separationskraft (Cross flow).
- Definer fraktioneringsmetoden som beskrevet i forrige afsnit ved hjælp af de fraktioneringsbetingelser, der er angivet i tabel 3.
- Klik på knappen Kør for at starte målingen.
- Udfør målingen i fire eksemplarer.
BEMÆRK: Det første løb har til formål at konditionere systemet (dvs. AF4-membranen) og vil blive udelukket fra den endelige evaluering af systemets kvalifikationsresultater.
BEMÆRK: Det anbefales at gemme alle genererede kørselsfiler ved at åbne Fil | Gem i AF4-kontrolsoftwaren. - Overvej AF4-UV-vis-systemet kvalificeret, hvis en massegenvinding på >80% og en variation af retentionstiden <2% opnås for den vilkårlige AuNP-størrelsesstandard.
- Når du bruger en autosampler som injektionssystem, skal du fylde autosamplerens nålevaskebeholderflaske med den samme opløsning, som pumpes gennem AF4-UV-vis-systemet (f.eks. rengøringsopløsning, UPW eller respektive elueret) for at sikre optimale kørselsforhold. Ved skift af eluering anbefales det generelt at følge afbavilibreringen af AF4-systemet ved at overvåge UV-vis-detektorsignalet, indtil dets basislinje forbliver stabil på et konstant niveau.
- Udfør en direkte injektion uden anvendelse af en separationskraft.
4. ANALYSE AF4-UV-VIS-prøver
- Forbered alle AuNP-størrelsesstandarder til ekstern størrelseskalibrering ved at hvirvle den respektive AuNP-affjedring (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm, hver 50 mg. L-1) i 2 min. og fortynd den 1:4 med UPW for at opnå en endelig massekoncentration på 12,5 mg∙L-1. Vortex i yderligere 2 minutter efter fortynding for at homogenisere de opnåede suspensioner.
- Forbered den ukendte AuNP-prøve til analyse efter samme procedure som for de kalibreringsstandarder, der er beskrevet i trin 4.1.
- Udfør en direkte injektionsmåling af alle Standarder for AuNP-størrelse ved hjælp af den AF4-metode, der vises i tabel 2.
- Det gør du ved at indtaste de respektive værdier, der er opsummeret i tabel 2, i producentens software på de relevante positioner for at definere separations- og eksempelparametrene og trykke på knappen Kør for at starte eksperimentet.
- Fraktionere hver AuNP-størrelsesstandard individuelt ved hjælp af af4-metoden, der vises i tabel 3, for at etablere den eksterne størrelseskalibreringsfunktion.
- Angiv de respektive værdier, der er opsummeret i tabel 3, i producentens software på de relevante positioner. Fraktioneringsmetoden defineres af et fokuseringstrin, flere elueringstrin og et skylletrin. Når du har konfigureret metoden, skal du trykke på knappen Kør for at starte eksperimentet.
- Udfør en direkte injektionsmåling af den ukendte AuNP-prøve ved hjælp af den AF4-metode, der er vist i tabel 2.
- Udfør fraktioneringen af den ukendte AuNP-prøve ved at udføre den AF4-metode, der er angivet i tabel 3.
- Foretage alle de målinger, der er nævnt i afsnit 3 og 4, i tre eksemplarer, medmindre andet er angivet for at sikre meningsfulde og statistisk relevante resultater.
- Der opbevares 50 mg∙L-1 AuNP-lagerophæng ved 4-8 °C før brug. Fortyndede AuNP-suspensioner er ideelt forberedt inden for 30 minutter før påføring.
BEMÆRK: Hvirvelstrømning er normalt tilstrækkelig, og det er ikke nødvendigt at ultrasonere suspensionerne. - For at muliggøre en korrelation mellem retentionstiden for den ukendte AuNP-prøve og de tilbageholdelsestider, der er opnået for AuNP-størrelsesstandarderne, skal alle prøver måles ved hjælp af samme AF4-metode.
BEMÆRK: For at sikre konstante og gyldige adskillelsesforhold skal du medtage/gentage det fraktioneringstrin, der er beskrevet i afsnittet om systemkvalifikationer (se trin 3.6.2) efter et bestemt antal prøvemålinger (f.eks. 10 målinger). Derudover registreres systemtryk og UV-vis-detektor baseline stabilitet. De skal forblive stabile og konstante langs en komplet AF4-UV-vis-løb.
BEMÆRK: Udskift normalt ultrafiltreringsmembranen, når UV-vis-detektoren (eller MALS-detektoren (Multi Angle Light Scattering), hvis den er tilgængelig), viser et øget støjniveau eller de definerede systemkvalifikationskriterier såsom genopretning, prøvetopform eller repeterbarhed er savnet (eller AF4-UV-vis-systemet blev udsat for en grundig rengøringsprocedure). Under de her beskrevne betingelser er det kvalificerede AF4-UV-vis-system normalt stabilt i mindst 50 målinger ved hjælp af samme membran; Antallet af mulige fortløbende målinger, der opfylder de definerede kvalitetskriterier, kan dog variere betydeligt afhængigt af stikprøve, prøvematrix og elueret sammensætning.
- Der opbevares 50 mg∙L-1 AuNP-lagerophæng ved 4-8 °C før brug. Fortyndede AuNP-suspensioner er ideelt forberedt inden for 30 minutter før påføring.
5. Evaluering af data
- Foretage massegenvindingsberegningen ved hjælp af enten dataevalueringssoftware fra AF4-UV-vis-systemproducenten eller regnearksanalyse efter eksport af alle nødvendige rådata (dvs. UV-vis peak area) fra den respektive dataindsamlingssoftware i nedenstående vejledning.
- AuNP-massegenvindingen beregnes ved at sammenligne områderne under de respektive UV-vis-toppe af fraktioneringsmålingen(A-fraktionering)og målingen af direkte injektion (endirekte injektion)ved hjælp af følgende ligning:
BEMÆRK: Under en direkte injektionsmåling påføres der ingen adskillelseskraft, og derfor kan potentielle interaktioner mellem en analysandart med akkumuleringsvæggen overses. Området under en respektive UV-vis-top kan direkte korreleres med AuNP-massen ved hjælp af Beer-Lambert-loven, forudsat at ingen andre arter i prøven absorberer ved den respektive bølgelængde og/eller i) eluerer på et andet retentionstidspunkt under fraktioneringsbetingelser ii) fjernes gennem AF4-membranen. - Importér de dat.-filer, der er hentet fra både den direkte injektion og fraktioneringskørslen.
- Vælg UV-vis-detektorsporingen under fanen Oversigt.
- Definer et interesseområde (ROI) og en oprindelig plan i signalvisningen og den oprindelige visning for alle målinger.
- Indsæt en kalibrering af direkte injektion via Indsæt.
- Vælg alle direkte injektionskørsler i visningen Indstillinger for direkte injektionskalibrering, og angiv en UV-udryddelseskoefficient.
BEMÆRK: Det er vigtigt at anvende den samme UV-vis-udryddelseskoefficient til både kalibrering og fraktioneringsmåling. - Kalibreringslinjen ved hjælp af området under UV-vis-signalsporet i investeringsafkastet og den injicerede mængde beregnet ud fra den indtastede koncentration og injektionsvolumen. Den opnåede kalibrering vil blive vist i det separate vindue med direkte indsprøjtningskalibreringsfunktion.
- Tildel kalibreringsfunktionen til de respektive fraktioneringsmålinger.
BEMÆRK: For hver kalibreringsstørrelsesstandard og den ukendte AuNP-prøve skal der etableres en separat kalibreringsfunktion på grund af AuNP's størrelsesafhængige UV-vis absorbans. Denne ulempe ved UV-vis-detektoren kan omgås ved hjælp af en massefølsom detektor som f.eks. - Udfør analyserne ved at indsætte en kvantitativ resultatberegning, og resultaterne vises i en tabel til højre som koncentrations- og injicerede beløbsværdier.
- AuNP-massegenvindingen beregnes ved at sammenligne områderne under de respektive UV-vis-toppe af fraktioneringsmålingen(A-fraktionering)og målingen af direkte injektion (endirekte injektion)ved hjælp af følgende ligning:
- Udregn variationen af opbevaringstiden ved hjælp af enten dataevalueringssoftware fra AF4-systemproducenten eller regnearksanalyse efter eksport af alle de nødvendige rådata (dvs. opbevaringstider for AuNP-kalibreringsstandarderne ved de respektive UV-vis peak maxima og respektive ugyldige tider) fra den respektive dataindsamlingssoftware i nedenstående vejledning.
- Åbn vinduet Oversigt for at få vist de respektive UV-sporinger for alle importerede målinger.
- Topdetektering udføres automatisk. justere topregistreringsparametrene i værktøjskassen til signalbehandling for at optimere ydeevnen. Uddrag de respektive peak maxima ved at gå gennem alle målefiler.
- Beregn den relative standardafvigelse for alle målinger ved hjælp af følgende ligning:
Beregningen kan også udføres ved hjælp af en respektive regnearkssoftware.
- Udfør bestemmelse af størrelse ved hjælp af enten dataevalueringssoftware fra producenten eller regnearksanalyse efter eksport af alle de nødvendige rådata (opbevaringstid ved UV-vis peak maksimum for analysand og respektive ugyldighedstid) fra den respektive dataindsamlingssoftware i nedenstående vejledning. Der kan etableres en ekstern størrelseskalibreringsfunktion ved at afbilde de korrigerede retentionstider (nettobindingstider, se tabel 5) i AuNP-størrelsesstandarderne (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) i forhold til deres hydrodynamiske størrelser opnået fra tidligere udførte DLS-målinger (se tabel 4).
BEMÆRK: DLS-målingerne bør udføres ideelt på samme dag som de respektive fraktioneringsmålinger for at sikre sammenlignelige prøveegenskaber.- Når du har importeret .dat filer, vises alle målinger under fanen Oversigt. Vælg UV-vis-detektorsignalet på listen over detektorer, som vises under overlejringsvinduet. Definer et investeringsafkast og en oprindelig plan for hver måling, som kan justeres i visningen Signal og Oprindelig plan. Brug værktøjskassen signalbehandling til højre for at udjævne støjende signaler. Brug funktionen Tildel behandlingsparametre til andre kørsler, så parametrene kan allokeres til andre målinger, henholdsvis signaler.
- Vælg kalibreringen af partikelstørrelse under fanen Indsæt.
- Marker alle kalibreringskørsler ved at klikke på den respektive måling i tabellen Vælg referencer til kalibrering øverst til højre. Alle valgte målinger vises i en tabel nedenfor. Angiv den hydrodynamiske radius for alle kalibreringsmålinger, der er angivet i tabel 4. Funktionen vises i kalibreringen af partikelstørrelse – Funktionsvinduet, og ligningen vises også.
BEMÆRK: Korrelationskoefficienten (R2) for den etablerede størrelseskalibreringsfunktion skal være ≥0.990. - Tildel kalibreringsfunktionen til målingerne af den ukendte AuNP-prøve ved at markere de respektive fraktioner på listen Vælg kører for tildeling.
- Vis resultaterne ved at åbne en partikelstørrelsesfordelingsberegning under indsætningsfanen. Den tidligere oprettede partikelstørrelseskalibrering vises som kalibrering for de ukendte AuNP-prøvemålinger, som vises i indstillingernefor højre vindue . Den beregnede størrelse vises i størrelsesfordelingsvinduet med navnet til det maksimale maksimum. Markér afkrydsningsfeltet Gennemsnitssignaler for eksempel for at beregne gennemsnittet af alle målinger af ét eksempel og angive resultatet i den maksimale topetiket.
- Du kan også afbilde kalibreringslinjen over fraktogrammet ved at markere afkrydsningsfeltet Vis kalibreringskurve. Der findes en fordeling af den kumulative størrelse ved at markere afkrydsningsfeltet Vis kumulativ fordeling.
BEMÆRK: Når du bruger producentens software til dataevaluering, anbefales det at føje alle resultater til en rapport, som kan genereres ved at klikke på Rapport under fanen Indsæt. Knappen Rapport føjer alle resultater, tabeller og diagrammer til et dokument. Under fanen Rapport kan rapportindstillingerne ændres ved at åbne Rapportopsætning i sektionen Dokument.
Representative Results
For det første blev AuNP-størrelsesstandarderne fraktioneret af AF4 og opdaget ved UV-vis, der målte AuNP's absorbans ved en bølgelængde på 532 nm (overfladeplasmon resonans af AuNP). Et overlay af de opnåede fraktogtogtogogrammer er præsenteret i figur 1. De enkelte aunp'ers retentionstider ved dets respektive MAKSIMALE UV-vis-spidsbelastninger fra trepartsmålinger er anført i tabel 5. Den relative standardafvigelse for alle retentionstider var under 1,1% med en faldende målevariation med stigende størrelse. Samlet set blev der opnået en fremragende repeterbarhed. Der blev anvendt en konstant adskillelseskraft, hvilket resulterede i et lineært forhold mellem elueringstid og hydrodynamisk størrelse. Den eksterne størrelseskalibreringslinje blev etableret ved at afbilde den angivne hydrodynamiske radius i forhold til den ugyldighedstid, der korrigerede elueringstiden (nettobindingstid). En lineær regressionsanalyse resulterede i en lineær kalibreringsfunktion med en skæringspunkt a = -3,373 nm ± 1,716 nm og en hældning b = 1,209 nm∙min-1 ± 0,055 nm∙min-1. Elutionens lineære opførsel blev bekræftet med en kvadreret korrelationskoefficientR 2 på 0,9958. Den respektive kalibreringsfunktion vises visuelt i figur 2.
Anden del drejede sig om analysen af den ukendte AuNP-stikprøve. Der blev udarbejdet tre aliquots af prøven efter proceduren i protokolafsnittet (punkt 4.2). Hver af de tre aliquots blev undersøgt i tre eksemplarer ved hjælp af samme AF4 fraktionering metode, der også blev anvendt til AuNP størrelse standarder. Alle de ni AF4-UV-vis-fraktogrammer, der blev opnået af den ukendte AuNP-prøve, er beskrevet i figur 3, og deres respektive evalueringer er sammenfattet i tabel 6. Den relative standardafvigelse for de respektive retentionstider var betydeligt lav og lå mellem 0,1% og 0,5%. Ved hjælp af partikelstørrelseskalibreringsfunktionen, der er opnået ved fraktioneringen af AuNP-størrelsesstandarderne, og som korrelerer den med de opnåede retentionstider for den ukendte AuNP-prøve ved UV-vis-topgrænsen, kan der beregnes en samlet gennemsnitlig hydrodynamisk radius på 29,4 nm ± 0,2 nm. Desuden blev der opnået en rimelig massegenvinding på 83,1 % ± 1,2 %, hvilket ikke tydede på nogen signifikant agglomeration eller opløsning af AuNP-prøven eller betydelig adsorption af partikler på membranens overflade. Figur 4 viser den opnåede partikelstørrelsesfordeling med alle ni UV-vis-signalspor, der i gennemsnit fremhæver den anvendte AF4-metodes fremragende robusthed.
Figur 1: AF4-UV-vis-fraktogtog fraktog fra tre eksemplarer analyse af de fire individuelle AuNP størrelse kalibrering standarder med normaliserede signal intensiteter og anvendt konstant cross flow sats (sort linje). Den tomrum peak er fremhævet med grå på omkring 5,9 min. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Opnået ekstern størrelseskalibreringsfunktion, herunder fejllinjer afledt af de respektive standardafvigelser for DLS-målingerne (tabel 4) og varianser i de opnåede AF4-retentionstider (tabel 5) efter at have afbildet den angivne hydrodynamiske radius i forhold til retentionstiden for hver enkelt Kalibreringsstandard for AuNP-størrelse ved det respektive højeste maksimum. En lineær kalibreringsfunktion med standardfejl i form af y = a + bx med a = -3,373 nm ± 1,716 nm og b = 1,209 nm·min-1 ± 0,055 nm·min-1 blev beregnet ud fra en lineær regressionsanalyse. Der blev fastlagt en kvadreret korrelationskoefficient med R2 = 0,9958, hvilket angiver en lineær relation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: AF4-UV-vis fraktogrammer af tre eksemplarer målinger af tre aliquots viser den ukendte AuNP. Den anvendte konstante tværstrømshastighed over måletiden illustreres som en sort linje. Den tomrum peak på omkring 5,9 min er fremhævet med grå. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Overlejring af den opnåede gennemsnitlige partikelstørrelsesfordeling (rød) af den ukendte AuNP-prøve og den anvendte lineære kalibreringsfunktion (syret linje). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Komponent | CAS-nr. | Vægt (%) | |
| Vand | 7732-18-5 | 88.8 | |
| 9-Octadecenosyre (Z)-, forbindelse med 2,2',2''-nitrilotris[ethanol](1:1) | 2717-15-9 | 3.8 | |
| Natriumcarbonat | 497-19-8 | 2.7 | |
| Alkoholer, C12-14-sekundær, ethoxylateret | 84133-50-6 | 1.8 | |
| Tetrasodium EDTA | 64-02-8 | 1.4 | |
| Polyethylen glycol | 25322-68-3 | 0.9 | |
| Natrium oleat | 143-19-1 | 0.5 | |
| Natriumbicarbonat | 144-55-8 | 0.1 | |
Tabel 1 — Oversigt Liste over komponenterne i den blanding af overfladeaktive stoffer, der anvendes til at forberede elueringsmidlet (se også Materialeoversigten).
| AF4-UV-vis-parametre | Enhed | Værdi |
| Afstandstykkelse | Μm | 350 |
| Strømningshastighed for detektor | mL min-1 | 0.5 |
| Tværstrømshastighed | mL min-1 | 0 (konstant i 8 min) |
| Fokusflowhastighed | mL min-1 | 0 |
| Forsinkelsestid/stabiliseringstid | Min | 0 |
| Sprøjteflowhastighed | mL min-1 | 0.5 |
| Overgangstid | Min | 0 |
| Injektionstid | Min | 0.1 |
| Elution skridt | Min | 8 |
| Skyl trintid | Min | 0.1 |
| Strømningshastighed for skylletrin | mL min-1 | 0.1 |
| Indsprøjtningsvolumen | Μl | 10 |
| Koncentration af prøver | mg L-1 | 12.5 |
| Membrantype | Regenereret cellulose | |
| Membran molekylær vægt cut-off | Kda | 10 |
| Eluent | 0,025% (v/v) overfladeaktiv blanding | |
| UV-vis bølgelængde | Nm | 532 |
| UV-vis følsomhed | - | 0.001 |
Tabel 2 — Oversigt Resumé af AF4-UV-vis fraktionering metode parametre til at udføre den direkte injektion køre uden anvendelse af en adskillelse kraft.
| AF4-UV-vis-parametre | Enhed | Værdi |
| Afstandstykkelse | Μm | 350 |
| Strømningshastighed for detektor | mL min-1 | 0.5 |
| Tværstrømshastighed | mL min-1 | 1 (60 min konstant, 10 min lineær) |
| Fokusflowhastighed | mL min-1 | 1.3 |
| Forsinkelsestid/stabiliseringstid | Min | 2 |
| Sprøjteflowhastighed | mL min-1 | 0.2 |
| Overgangstid | Min | 0.2 |
| Injektionstid | Min | 5 |
| Elution skridt | Min | 70 (60 min konstant, 10 min lineær) |
| Skyl trin | Min | 9 |
| Strømningshastighed for skylletrin | mL min-1 | 0.5 |
| Indsprøjtningsvolumen | Μl | 50 |
| Koncentration af prøver | mg L-1 | 12.5 |
| Membrantype | Regenereret cellulose | |
| Membran molekylær vægt cut-off | Kda | 10 |
| Eluent | 0,025% (v/v) overfladeaktiv blanding | |
| UV-vis bølgelængde | Nm | 532 |
| UV-vis følsomhed | - | 0.001 |
Tabel 3 — Oversigt Resumé af AF4-UV-vis fraktionering metode parametre til at udføre fraktionering køre med anvendelse af et kryds flow som adskillelse kraft.
| Kalibreringsstandard | Udjævningsagent | Gennemsnitlig størrelse (TEM) (nm) | CV (gennemsnitlig størrelse TEM) (%) | Zeta potentiale (mV) | SD (zeta potentiale) (mV) | Hydrodynamisk radius (DLS) (nm) | SD (hydrodynamisk radius) (nm) | Pdi | SD (PDI) |
| AuNP 20 nm | Citrat | 20.1 | ≤ 8 | -48.9 | 1.5 | 10.95 | 0.12 | 0.082 | 0.009 |
| AuNP 40 nm | Citrat | 40.8 | ≤ 8 | -30.4 | 1.0 | 20.30 | 0.13 | 0.127 | 0.006 |
| AuNP 80 nm | Citrat | 79.2 | ≤ 8 | -51.5 | 1.3 | 38.85 | 0.23 | 0.138 | 0.013 |
| AuNP 100 nm | Citrat | 102.2 | ≤ 8 | -50.9 | 0.9 | 52.30 | 0.37 | 0.078 | 0.009 |
Tabel 4 — Kommissionen for De Resumé af de fysisk-kemiske parametre i de anvendte AuNP-kalibreringsstandarder, herunder udjævningsmiddel, TEM-gennemsnitsstørrelse, Zeta-potentiale bestemt i den oprindelige suspension samt DLS hydrodynamisk radius og polydispersitetsindeks (PDI) bestemt i eluent.
| Kalibreringsstandard | Køre | Retentionstid ved maksimal maksimal (min.) | Nettoopbevaringstid ved maksimalt maksimum (min.) | Gennemsnitlig nettofastholdelsestid (min.) | SD (%) (nettoopbevaringstid) | SD (min.) (nettoopbevaringstid) |
| AuNP 20 nm | 1 | 17.368 | 11.468 | 11.56 | 1.02 | 0.12 |
| 2 | 17.409 | 11.509 | ||||
| 3 | 17.589 | 11.689 | ||||
| AuNP 40 nm | 1 | 25.316 | 19.416 | 19.49 | 0.68 | 0.13 |
| 2 | 25.32 | 19.42 | ||||
| 3 | 25.548 | 19.648 | ||||
| AuNP 80 nm | 1 | 42.095 | 36.195 | 36.29 | 0.23 | 0.08 |
| 2 | 42.219 | 36.319 | ||||
| 3 | 42.257 | 36.357 | ||||
| AuNP 100 nm | 1 | 50.975 | 45.075 | 45.06 | 0.07 | 0.03 |
| 2 | 50.924 | 45.024 | ||||
| 3 | 50.986 | 45.086 |
Tabel 5 — Kommissionen for De Retentionstider for AuNP-kalibreringsstandarderne ved det respektive maksimale UV-Vis-toppunkt, der er afledt af de respektive AF4-UV-vis-fraktogrammer ved hjælp af den metode, der er beskrevet i tabel 3.
| Aliquote | Køre | Maksimal retentionstid (min.) | Gennemsnitlig retentionstid ved maksimalt maksimum (min.) | Nettoopbevaringstid ved maksimalt maksimum (min.) | SD (%) opbevaringstid | Hydrodynamisk radius (nm) | Inddrivelse (%) |
| 1 | 1 | 32.689 | 32.70 | 26.789 | 0.07 | 29.03 | 85.34 |
| 2 | 32.687 | 26.787 | |||||
| 3 | 32.719 | 26.819 | |||||
| 2 | 1 | 32.989 | 33.08 | 27.089 | 0.37 | 29.49 | 81.73 |
| 2 | 33.073 | 27.173 | |||||
| 3 | 33.187 | 27.287 | |||||
| 3 | 1 | 33.053 | 33.14 | 27.153 | 0.49 | 29.56 | 82.14 |
| 2 | 33.071 | 27.171 | |||||
| 3 | 33.291 | 27.391 |
Tabel 6 — Oversigt Resumé af retentionstiderne ved det respektive MAKSIMALE UV-Vis-toppe, den hydrodynamiske radius beregnet ud fra den eksterne størrelseskalibrering (figur 2) og genfindingshastigheden for den ukendte AuNP-prøve, der er opnået ved af AF4-UV-vis-analyse.
Discussion
Den hydrodynamiske størrelse af en ukendt AuNP blev nøjagtigt vurderet af AF4 kombineret med en UV-vis-detektor ved hjælp af veldefinerede AuNP-størrelsesstandarder fra 20 nm til 100 nm. Den udviklede AF4-metode blev optimeret ved hjælp af en konstant krydsstrømsprofil for at etablere et lineært forhold mellem målt retentionstid og AuNP-størrelse, hvilket giver mulighed for en ligetil størrelsesbestemmelse fra lineær regressionsanalyse. Der var også særlig fokus på at opnå tilstrækkeligt høje genvindingsrater, der ikke tydede på noget signifikant prøvetab under fraktioneringen, og at den udviklede AF4-metode, herunder den anvendte eluerings- og membran, passede godt sammen med alle fraktionerede AuNP-prøver.
Metodeudvikling er uden tvivl det mest kritiske skridt i AF4, og flere parametre, herunder kanaldimensioner, flowparametre samt eluering, membran, afstandshøjde og endda prøveegenskaber, skal tages i betragtning for at forbedre fraktionering inden for et givet elution-tidsvindue. Formålet med dette afsnit er at guide læseren gennem de kritiske trin, der blev optimeret til med succes at bestemme størrelsen på det ukendte AuNP-eksempel, der diskuteres her. For en mere detaljeret beskrivelse af, hvordan man generelt udvikler en AF4-metode, henvises læseren til AF4-afsnittet i 'ISO/TS21362:2018 - Nanoteknologi - Analyse af nanoobjekter ved hjælp af asymmetrisk flow og centrifugalfeltflowfraktionering'25. Under et nærmere kig på de anvendte fraktioneringsbetingelser i tabel 3er det første kritiske skridt indførelsen og lempelsen af AuNP-prøven i AF4-kanalen. Dette trin styres af injektionsflowet, fokusflowet og krydsstrømmen, hvis samspil tvinger prøven til at lokalisere tæt på membranoverfladen og koncentrere den i et smalt bånd nær AF4-kanalens injektionsport, der dybest set definerer udgangspunktet for fraktioneringen. En tilstrækkelig lempelse af prøven er obligatorisk, da prøvebestanddeler i forskellige størrelser i forskellige højder af AF4-kanalen i dette trin derved danner grundlag for en vellykket størrelsesfraktionering. Ufuldstændig prøveafslapning er normalt synlig ved et øget tomrumstopområde som følge af ikke-rodfæstede (dvs. ikke-afslappede) prøvebestanddeler. Denne effekt kan afbødes ved at øge injektionstiden og/eller den anvendte tværstrømshastighed. Begge parametre har dog brug for omhyggelig optimering, især for prøver, der er tilbøjelige til agglomeration og adsorption på AF4-membranen, og kan overvåges af de respektive gendannelseshastigheder opnået for forskellige parameterindstillinger36,37. Den anvendte injektionstid på 5 minutter sammen med en krydsstrømshastighed på 1,0 mL∙min-1 afslørede restitutionshastigheder >80% for alle AuNP-prøver og et ubetydeligt tomrumstopområde, der indikerer næsten optimale afslapningsforhold. Efter tilstrækkelig lempelse af AuNP-prøven blev fokusflowet stoppet, og der blev indledt prøvetransport langs AF4-kanallængden til den respektive UV-vis-detektor, der repræsenterede det andet kritiske trin. For at sikre tilstrækkelig høj fraktioneringseffekt ved rimelige analysetider blev der anvendt en konstant krydsstrømshastighed på 1,0 mL∙min-1 i 30-50 min. (afhængigt af den respektive fraktionerede AuNP-størrelsesstandard) efterfulgt af et 10 min lineært krydsstrømsfald ved en detektorstrømshastighed på 0,5 mL.min.-1. Brug af en konstant krydsstrømsprofil på tværs af adskillelsen af alle AuNP-størrelsesstandarder afslørede et lineært forhold mellem retentionstid og AuNP-størrelse efter FFF-teori22, hvilket muliggjorde størrelsesbestemmelse af den ukendte AuNP-prøve ved simpel lineær regressionsanalyse. Imidlertid er andre profiler end en konstant krydsstrøm også blevet udnyttet til dimensionering af nanopartikler , hvilket i sidste ende fører til et ikke-lineært forhold mellem retentionstid og partikelstørrelse38,39. Desuden er størrelsesbestemmelse i AF4 ved hjælp af veldefinerede størrelsesstandarder ikke begrænset til AuNP, men kan også anvendes på nanopartikler med andre størrelser og elementær sammensætning (f.eks. sølv38,40 eller silica nanopartikler41,42). Derudover er ICP-MS, når man arbejder med fortyndede prøver, en meget følsom elementær detektor, som kan kombineres med AF4, hvilket øger alsidigheden af denne analytiske tilgang til dimensionering af en lang række nanopartikler i suspension.
På trods af sin udbredte anvendelse, ekstern størrelse kalibrering ved hjælp af veldefinerede størrelse standarder i AF4 har nogle særegenheder, der skal overvejes, når du bruger det til nøjagtig dimensionering af ukendte prøver. For det første er den stærkt afhængig af anvendelsen af sammenlignelige betingelser under fraktioneringen af de respektive størrelsesstandarder og den faktiske stikprøve. I det tilfælde, der præsenteres her, er det derfor obligatorisk, at både AuNP-størrelsesstandarderne og den ukendte AuNP-prøve fraktioneres ved hjælp af den samme AF4-metode samt den samme eluent og den samme membran, hvilket gør denne tilgang ret ufleksibel. Da der ikke findes størrelsesfølsomme detektorer, f.eks. Dette gælder især for ukendte prøver, der udviser meget brede størrelsesfordelinger, hvor det fortsat er uklart, om alle prøvebestanddeler følger det normale elueringsmønster: fraktionering fra mindre til større partikler, eller om større prøvebestanddeler allerede lusker i sterisk-hyperlayertilstand og derved potentielt co-eluting med mindre prøvebestanddeler43,44. Hertil kommer, at selvom FFF-teori understreger, at AF4 udelukkende adskiller sig udelukkende baseret på forskelle i hydrodynamisk størrelse med partikler, der betragtes som punktmasser uden interaktioner med deres miljø22, fortæller virkeligheden en anden historie med partikelpartikel- og partikelmembraninteraktioner. (såsom elektrostatisk tiltrækning/ frastødning eller van-der-Waals attraktion) kan spille en betydelig rolle og kan potentielt indføre en målbar bias i størrelsesbestemmelser via ekstern størrelseskalibrering45,46. Det anbefales derfor at anvende størrelsesstandarder, der ideelt set svarer til sammensætningen og overfladeegenskaberne (Zeta-potentialet) af den pågældende partikel40,42 eller, hvis disse ikke er tilgængelige, i det mindste anvende velkaraktererede partikelstørrelsesstandarder (f.eks. polystyren latexpartikler) og omhyggeligt vurdere deres sammenlignelighed med den pågældende partikel, især med hensyn til deres overflade Zeta-potentiale i det respektive miljø, hvor analysen skal udføres41,47.
Alsidigheden af AF4 betragtes ofte som sin største styrke, da den tilbyder et applikationsområde, der går ud over de fleste andre almindelige størrelsesteknikker på dette område22,48,49. Samtidig kan det på grund af dets tilknyttede formentlig kompleksitet også betragtes som dets største ulempe, især mod hurtige og angiveligt brugervenlige størrelsesteknikker som DLS, Nanopartikelsporingsanalyse eller ICP-MS med en enkelt partikel. Ikke desto mindre, når man sætter AF4 i perspektiv med disse populære dimensioneringsteknikker, bliver det klart, at alle teknikker har deres fordele og ulemper, men alle bidrager til en mere omfattende forståelse af nanopartiklernes fysisk-kemiske karakter og bør derfor betragtes som komplementære snarere end konkurrencedygtige.
Standarddriftsproceduren (SOP), der præsenteres her, fremhæver den fremragende anvendelighed af AF4-UV-vis med ekstern størrelseskalibrering til dimensionering af en ukendt AuNP-prøve i suspension og blev til sidst anvendt som en anbefalet retningslinje for AF4-analyse af en ukendt AuNP-prøve inden for en international interlaboratorisk sammenligning (ILC), der blev udført inden for rammerne af Horizon 2020-projektet, ACEnano (resultatet af denne ILC vil være genstand for en fremtidig publikation). Denne protokol, derfor tilføjer op til den opmuntrende og igangværende internationale bestræbelser på at validere og standardisere AF4 metoder25,50,51,52 understreger lovende potentiale AF4 inden for nanopartikel karakterisering.
Disclosures
Alle forfatterne af dette manuskript er medarbejdere hos Postnova Analytics GmbH, hvis produkter anvendes i denne protokol.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke hele ACEnano-konsortiet for frugtbare drøftelser i alle faser af udarbejdelsen af den protokol, der præsenteres her. Forfatterne sætter også pris på finansiering fra EU Horizon 2020-programmet (H2020) i henhold til tilskudsaftale nº 720952 inden for rammerne af ACEnano-projektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 µm Membrane Filters (hydrophilic PVDF) | Postnova Analytics GmbH | Z-FIL-TEF-002 | Used for filtration of aqueous solutions |
| 0.22 µm PVDF Syringe Filter (d = 33 mm) | Merck Millipore | Durapore Millex | Used for filtration of NovaChem100 |
| Adjustable Volume Pipettes (1000 µL) | Eppendorf AG | Research Plus | Used to prepare diluted AuNP suspensions |
| AF4 cartridge | Postnova Analytics GmbH | AF2000 MF - AF4 Analytical Channel | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| AF4 Membrane - Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO) | Postnova Analytics GmbH | Z-AF4-MEM-612-10KD | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Analytical Balance (0.1 mg precision) | Sartorius | ENTRIS124I-1S | Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution |
| Autosampler | Postnova Analytics GmbH | PN5300 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Channel Oven | Postnova Analytics GmbH | PN4020 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Crossflow Module | Postnova Analytics GmbH | AF2000 MF Control Module | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Disposable Pipette Tips (1000 µL) | Eppendorf AG | ep T.I.P.S | Used to prepare diluted AuNP suspensions |
| Flasks (e.g. 2 liter volume) | neoLab | 1-0199 | Used for eluent storage |
| Focus Pump | Postnova Analytics GmbH | PN1131 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) | Postnova Analytics GmbH | VIA-002 | Used for sample storage |
| Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) | Postnova Analytics GmbH | NovaCal Gold | 50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function |
| Magnetic Stirrer | IKA | VIBRAX-VXR | Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW |
| Personal Computer (PC) | Dell Technologies | / | Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual |
| Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.) | / | / | In accordance with respective laboratory’s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials |
| Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) | Postnova Analytics GmbH | Z-VIA-09150868 | Used for sample storage |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), ≥99 %, Blotting Grade | Carl Roth GmbH & Co KG | 2326.1 | Used for the preparation of the cleaning solution |
| Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, ≥98 %, p.a | Carl Roth GmbH & Co KG | 6771.1 | Used for the preparation of the cleaning solution |
| Software Package for Control and Data Acquisition | Postnova Analytics GmbH | NovaFFF AF2000 Software | Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual |
| Software Package for Data Evaluation | Postnova Analytics GmbH | NovaAnalysis Software | Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual |
| Software Package for final Data Processing | OriginLab Corporation | Origin 2019 | Used for final data processing |
| Solvent Degasser | Postnova Analytics GmbH | PN7520 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Solvent Selector | Postnova Analytics GmbH | PN7310 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Solvent Organizer | Postnova Analytics GmbH | PN7140 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Surfactant Mixture | Postnova Analytics GmbH | NovaChem100 | Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation |
| Tip Pump | Postnova Analytics GmbH | PN1130 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Unknown AuNP sample | BBI Solutions | EM.GC60 | 60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function |
| UV-vis Detector | Postnova Analytics GmbH | PN3211 | UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system |
| Vacuum Filtration Unit | Postnova Analytics GmbH | Eluent Filtration System | Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions |
| Vortex | IKA | Vortex Genie 2 | Used for homogenization of diluted AuNP suspensions |
| Water Purification System | Merck Millipore | Milli-Q Integral 5 | Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 MΩcm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions |
References
- Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Gold nanoparticles in biology and medicine: recent advances and prospects. Acta Naturae. 3 (2), 34-55 (2011).
- Wagner, F. E., et al. Before striking gold in gold-ruby glass. Nature. 407 (6805), 691-692 (2000).
- Hunt, L. B. The true story of Purple of Cassius. Gold Bulletin. 9 (4), 134-139 (1976).
- Higby, G. J. Gold in medicine. Gold Bulletin. 15 (4), 130-140 (1982).
- Faraday, M. X. The Bakerian Lecture. -Experimental relations of gold (and other metals) to light. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 147, 145-181 (1857).
- Borries, B. v, Kausche, G. A. Übermikroskopische Bestimmung der Form und Größenverteilung von Goldkolloiden. Kolloid-Zeitschrift. 90 (2), 132-141 (1940).
- Turkevich, J., Hillier, J. Electron Microscopy of Colloidal Systems. Analytical Chemistry. 21 (4), 475-485 (1949).
- Homberger, M., Simon, U. On the application potential of gold nanoparticles in nanoelectronics and biomedicine. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical, and Engineering Sciences. 368 (1915), 1405-1453 (2010).
- Cordeiro, M., Ferreira Carlos, F., Pedrosa, P., Lopez, A., Baptista, P. V. Gold Nanoparticles for Diagnostics: Advances towards Points of Care. Diagnostics. 6 (4), Basel, Switzerland. 43 (2016).
- Vines, J. B., Yoon, J. H., Ryu, N. E., Lim, D. J., Park, H. Gold Nanoparticles for Photothermal Cancer Therapy. Frontiers in Chemistry. 7, 167 (2019).
- Dreaden, E. C., Austin, L. A., Mackey, M. A., El-Sayed, M. A. Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery. Therapeutic Delivery. 3 (4), 457-478 (2012).
- Safh, B. P., Antosh, M. Effect of size on gold nanoparticles in radiation therapy: Uptake and survival effects. Journal of Nanomedicine. 2 (1), 1013-1020 (2019).
- Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of size and concentration of gold nanoparticles from UV-Vis spectra. Analytical Chemistry. 79 (11), 4215-4221 (2007).
- Zheng, T., Bott, S., Huo, Q. Techniques for accurate sizing of gold nanoparticles using dynamic light scattering with particular application to chemical and biological sensing based on aggregate formation. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (33), 21585-21594 (2016).
- Liu, J., Murphy, K. E., MacCuspie, R. I., Winchester, M. R. Capabilities of single particle inductively coupled plasma mass spectrometry for the size measurement of nanoparticles: a case study on gold nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (7), 3405-3414 (2014).
- Contado, C., Argazzi, R. Size sorting of citrate reduced gold nanoparticles by sedimentation field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1216 (52), 9088-9098 (2009).
- Calzolai, L., Gilliland, D., Garcìa, C. P., Rossi, F. Separation and characterization of gold nanoparticle mixtures by flow-field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1218 (27), 4234-4239 (2011).
- Schmidt, B., et al. Quantitative characterization of gold nanoparticles by field-flow fractionation coupled online with light scattering detection and inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (7), 2461-2468 (2011).
- Mekprayoon, S., Siripinyanond, A. Performance evaluation of flow field-flow fractionation and electrothermal atomic absorption spectrometry for size characterization of gold nanoparticles. Journal of Chromatography. A. , (2019).
- López-Sanz, S., Rodríguez Fariñas, N., Zougagh, M., Rios, A., Rodriguez Martín-Doimeadios, R. C. C. AF4-ICP-MS as a powerful tool for the separation of gold nanorods and nanospheres. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. , Advance Article (2020).
- Giddings, C. J. A new separation concept based on a coupling of concentration and flow nonuniformities. Separation Science. 1 (1), 123-125 (1966).
- Schimpf, M. E., Caldwell, K., Giddings, J. C. Field-flow fractionation handbook. , Wiley-Interscience. (2000).
- Contado, C. Field flow fractionation techniques to explore the "nano-world". Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (10), 2501-2518 (2017).
- Wahlund, K. G., Giddings, J. C. Properties of an asymmetrical flow field-flow fractionation channel having one permeable wall. Analytical Chemistry. 59 (9), 1332-1339 (1987).
- ISO. ISO /TS 21362:2018 Nanotechnologies - of nano-objects using asymmetrical-flow and centrifugal field-flow fractionation. ISO. , (2018).
- Gogos, A., Kaegi, R., Zenobi, R., Bucheli, T. D. Capabilities of asymmetric flow field-flow fractionation coupled to multi-angle light scattering to detect carbon nanotubes in soot and soil. Environmental Science: Nano. 6 (1), 584-594 (2014).
- Müller, D., et al. Integration of inverse supercritical fluid extraction and miniaturized asymmetrical flow field-flow fractionation for the rapid analysis of nanoparticles in sunscreens. Analytical Chemistry. 90 (5), 3189-3195 (2018).
- Capomaccio, R., et al. Gold nanoparticles increases UV and thermal stability of human serum albumin. Biointerphases. 11 (4), (2016).
- Levak, M., et al. Effect of protein corona on silver nanoparticle stabilization and ion release kinetics in artificial seawater. Environmental Science & Technology. 51 (3), 1259-1266 (2017).
- Mehn, D., et al. Larger or more? Nanoparticle characterisation methods for recognition of dimers. RSC Advances. 7 (44), 27747-27754 (2017).
- Sogne, V., Meier, F., Klein, T., Contado, C. Investigation of zinc oxide particles in cosmetic products by means of centrifugal and asymmetrical flow field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1515, 196-208 (2017).
- Cumberland, S. A., Lead, J. R. Particle size distributions of silver nanoparticles at environmentally relevant conditions. Journal of Chromatography. A. 1216 (52), 9099-9105 (2009).
- de Carsalade du pont, V., et al. Asymmetric field flow fractionation applied to the nanoparticles characterization: Study of the parameters governing the retention in the channel. International Congress of Metrology. , (2019).
- Loeschner, K., et al. Optimization and evaluation of asymmetric flow field-flow fractionation of silver nanoparticles. Journal of Chromatography. A. 1272, 116-125 (2013).
- Mudalige, T. K., Qu, H., Linder, S. W. An improved methodology of asymmetric flow field flow fractionation hyphenated with inductively coupled mass spectrometry for the determination of size distribution of gold nanoparticles in dietary supplements. Journal of Chromatography. A. 1420, 92-97 (2015).
- Dubascoux, S., Von Der Kammer, F., Le Hécho, I., Gautier, M. P., Lespes, G. Optimisation of asymmetrical flow field flow fractionation for environmental nanoparticles separation. Journal of Chromatography. A. 1206 (2), 160-165 (2008).
- Hagendorfer, H., et al. Application of an asymmetric flow field flow fractionation multi-detector approach for metallic engineered nanoparticle characterization - and limitations demonstrated on Au nanoparticles. Analytica Chimica Acta. 706 (2), 367-378 (2011).
- Geiss, O., Cascio, C., Gilliland, D., Franchini, F., Barrero-Moreno, J. Size and mass determination of silver nanoparticles in an aqueous matrix using asymmetric flow field flow fractionation coupled to inductively coupled plasma mass spectrometer and ultraviolet-visible detectors. Journal of Chromatography. A. 1321, 100-108 (2013).
- Makselon, J., Siebers, N., Meier, F., Vereecken, H., Klumpp, E. Role of rain intensity and soil colloids in the retention of surfactant-stabilized silver nanoparticles in soil. Environmental Pollution. 238, 1027-1034 (2018).
- Bolea, E., Jiménez-Lamana, J., Laborda, F., Castillo, J. R. Size characterization and quantification of silver nanoparticles by asymmetric flow field-flow fractionation coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (9), 2723-2732 (2011).
- Barahona, F., et al. Simultaneous determination of size and quantification of silica nanoparticles by asymmetric flow field-flow fractionation coupled to ICPMS using silica nanoparticles standards. Analytical Chemistry. 87 (5), 3039-3047 (2015).
- Aureli, F., D'Amato, M., Raggi, A., Cubadda, F. Quantitative characterization of silica nanoparticles by asymmetric flow field flow fractionation coupled with online multiangle light scattering and ICP-MS/MS detection. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30, 1266-1273 (2015).
- Myers, M. N., Giddings, J. C. Properties of the transition from normal to steric field-flow fractionation. Analytical Chemistry. 54 (13), 2284-2289 (1982).
- Giddings, J. C. Retention (steric) inversion in field-flow fractionation: practical implications in particle size, density and shape analysis. Analyst. 118 (12), 1487-1494 (1993).
- Wahlund, K. G. Flow field-flow fractionation: Critical overview. Journal of Chromatography. A. 1287, 97-112 (2013).
- Bendixen, N. L., Adlhart, S., Lattuada, C., Ulrich, A. Membrane-particle interactions in an asymmetric flow field flow fractionation channel studied with titanium dioxide nanoparticles. Journal of Chromatography A. 1334, 92-100 (2014).
- Qu, H., Quevedo, I. R., Linder, S. W., Fong, A., Mudalige, T. K. Importance of material matching in the calibration of asymmetric flow field-flow fractionation: material specificity and nanoparticle surface coating effects on retention time. Journal of Nanoparticle Research. 18 (10), 292 (2016).
- Giddings, J. C. Field-flow fractionation: analysis of macromolecular, colloidal, and particulate materials. Science. 260 (5113), 1456-1465 (1993).
- Cascio, C., Gilliland, D., Rossi, F., Calzolai, L., Contado, C. Critical experimental evaluation of key methods to detect, size and quantify nanoparticulate silver. Analytical Chemistry. 86 (24), 12143-12151 (2014).
- Caputo, F., et al. Measuring particle size distribution by asymmetric flow field flow fractionation: a powerful method for the pre-clinical characterisation of lipid-based nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 756-767 (2019).
- Parot, J., Caputo, F., Mehn, D., Hackley, V. A., Calzolai, L. Physical characterization of liposomal drug formulations using multi-detector asymmetrical-flow field flow fractionation. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 320, 495-510 (2020).
- ASTM. ASTM WK68060 - New Test Method for Analysis of Liposomal Drug Formulations using Multidetector Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation (AF4). ASTM. , (2019).
