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Bioengineering

निलंबन में गोल्ड नैनोकणों के आकार के लिए विषम प्रवाह क्षेत्र-प्रवाह अंश

Published: September 11, 2020 doi: 10.3791/61757
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Research & Development, Postnova Analytics GmbH

Summary

यह प्रोटोकॉल अज्ञात सोने के नैनोपार्टिकल नमूने के आकार के निर्धारण के लिए यूवी-विस डिटेक्शन के साथ मिलकर विषम प्रवाह फील्ड-फ्लो फ्रैक्शन के उपयोग का वर्णन करता है।

Abstract

कण का आकार यकीनन नैनोपार्टिकल की धारणा से जुड़ा सबसे महत्वपूर्ण भौतिक-रासायनिक पैरामीटर है। नैनोकणों के आकार और आकार वितरण का सटीक ज्ञान विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। आकार सीमा भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह नैनोपार्टिकल खुराक के सबसे "सक्रिय" घटक को परिभाषित करता है।

विषम प्रवाह फील्ड-फ्लो फ्रैक्शन (एएफ4) लगभग 1-1000 एनएम की आकार सीमा में निलंबन में कणों के आकार के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। AF4 प्रयोग से आकार की जानकारी प्राप्त करने के कई तरीके हैं। मल्टी-एंगल लाइट स्कैटरिंग या डायनामिक लाइट स्कैटरिंग के सिद्धांतों के आधार पर आकार-संवेदनशील डिटेक्टरों के साथ ऑनलाइन AF4 को युग्मित करने के अलावा, एक अच्छी तरह से स्थापित सैद्धांतिक दृष्टिकोण (एफएफएफ सिद्धांत) का उपयोग करके या अच्छी तरह से परिभाषित कण आकार मानकों (बाहरी आकार अंशांकन) के प्रतिधारण समय के साथ तुलना करके अपने प्रतिधारण समय के साथ एक नमूने के आकार को सहसंबंधित करने की संभावना भी है।

हम यहां 20-100 एनएम की आकार सीमा में सोने के नैनोपार्टिकल मानकों के साथ बाहरी आकार अंशांकन का उपयोग करके यूवी-विस डिटेक्शन के साथ मिलकर AF4 द्वारा अज्ञात सोने के नैनोपार्टिकल नमूने के आकार के लिए एक मानक ऑपरेटिंग प्रक्रिया (एसओपी) के विकास और इन-हाउस सत्यापन का वर्णन करते हैं। यह प्रक्रिया नमूना तैयारी, एएफ 4 उपकरण सेटअप और योग्यता, एएफ 4 विधि विकास और अज्ञात सोने के नैनोपार्टिकल नमूने के अंशांकन के साथ-साथ स्थापित बाहरी आकार अंशांकन के साथ प्राप्त परिणामों के सहसंबंध सहित विकसित कार्यप्रवाह का विस्तृत विवरण प्रदान करती है। यहां वर्णित एसओपी को अंततः निलंबन में नैनोपार्टिकेट नमूनों के आकार के लिए AF4 की उत्कृष्ट मजबूती और विश्वसनीयता को रेखांकित करते हुए एक अंतरसंवर्ती तुलना अध्ययन के फ्रेम में सफलतापूर्वक मान्य किया गया था ।

Introduction

कोलाइडियल सोने के रूप में सोने के नैनोकण (AuNP) मानव संस्कृति का एक हिस्सा रहा था लंबे समय से पहले नैनोकणों की समझ थी और नैनोकण शब्द से पहले समकालीन, वैज्ञानिक शब्दावली में अपना रास्ता मिल गया था । उनके नैनोस्केल उपस्थिति के अलग ज्ञान के बिना, निलंबित AuNP पहले से ही प्राचीन चीन, अरब, और भारत में चिकित्सा और अन्य प्रयोजनों के लिए वी-छठी शताब्दियों ईसा पूर्व1में इस्तेमाल किया गया था, और यह भी प्राचीन रोमन अपने माणिक लाल रंग का लाभ लेने के लिए मशहूर ब्रिटिश संग्रहालय2में Lycurgus कप प्रदर्शनी में अपने मिट्टी के बर्तनों दाग । पश्चिमी दुनिया में, मध्य युग से आधुनिक युग तक सदियों से, निलंबित AuNP मुख्य रूप से ग्लास और तामचीनी (कैसियस के बैंगनी)3 के लिए रंग एजेंटों के रूप में इस्तेमाल किया गया था और साथ ही विभिन्न प्रकार के रोगों (पीने योग्य सोना), विशेष रूप से सिफलिस4का इलाज करने के लिए।

हालांकि, इन सभी अध्ययनों ने मुख्य रूप से निलंबित AuNP के आवेदन पर ध्यान केंद्रित किया था और यह 1857 में माइकल फैराडे पर निर्भर था कि वे उनके गठन, उनके स्वभाव के साथ-साथ उनकी संपत्तियों5की जांच करने के लिए पहला तर्कसंगत दृष्टिकोण पेश करें। यद्यपि फैराडे को पहले से ही पता था कि इन AuNP में बहुत मिनट के आयाम होने चाहिए, यह इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के विकास तक नहीं था जब उनके आकार वितरण के बारे में स्पष्ट जानकारी6,7सुलभ थी, अंततः आकार और अन्य AuNP गुणों के बीच संबंध को सक्षम करती है।

आजकल, उनके काफी आसान और सरल संश्लेषण, उल्लेखनीय ऑप्टिकल गुणों (सतह प्लाज्मन अनुनाद), अच्छी रासायनिक स्थिरता और इस प्रकार मामूली विषाक्तता के साथ-साथ उपलब्ध आकारों और सतह संशोधनों के मामले में उनकी उच्च बहुमुखी प्रतिभा के लिए धन्यवाद, AuNP ने नैनोइलेक्ट्रॉनिक्स8,डायग्नोस्टिक्स9,कैंसर थेरेपी10,या ड्रग डिलीवरी11जैसे क्षेत्रों में व्यापक अनुप्रयोग पाए हैं। जाहिर है, इन अनुप्रयोगों के लिए, लागू AuNP के आकार और आकार वितरण का सटीक ज्ञान इष्टतम प्रभावकारिता12 सुनिश्चित करने के लिए एक मौलिक शर्त है और इस महत्वपूर्ण भौतिक-रासायनिक पैरामीटर को निर्धारित करने के लिए मजबूत और विश्वसनीय उपकरणों की पर्याप्त मांग है। आज, निलंबन में AuNP को आकार देने में सक्षम विश्लेषणात्मक तकनीकों की अधिकता है, उदाहरण के लिए, यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोपी (यूवी-विस)13,डायनामिक लाइट स्कैटरिंग (डीएलएस)14 या सिंगल पार्टिकल प्रेरक-युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एसपीआईसीपी-एमएस)15 फील्ड-फ्लो फ्रैक्शन (एफएफएफ) के साथ इस क्षेत्र में एक प्रमुख खिलाड़ी16,17,18,19,20।

पहली अवधारणा 1 9 66 में जे केल्विन गिडिंग्स21द्वारा की गई थी, एफएफएफ में एल्यूशन-आधारित अंश तकनीकों का एक परिवार शामिल है, जहां एक स्थिर चरण22, 23के बिना एक पतली, रिबन जैसे चैनल के भीतर अलगाव होता है। एफएफएफ में, अलगाव एक बाहरी बल क्षेत्र के साथ एक नमूने की बातचीत से प्रेरित होता है जो एक लैमिनार चैनल प्रवाह की दिशा के लंबवत कार्य करता है, जिसमें नमूना आमतौर पर संबंधित इन-लाइन डिटेक्टरों की ओर डाउनस्ट्रीम ले जाया जाता है। इन संबंधित एफएफएफ-तकनीकों में, असममित प्रवाह फील्ड-फ्लो फ्रैक्शन (AF4), जहां एक दूसरा प्रवाह (क्रॉस फ्लो) बल क्षेत्र के रूप में कार्य करता है, सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले उपप्रकार24बन गया है। AF4 में, चैनल बॉटम (संचय दीवार) एक अर्धपरिष्क अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली से लैस है जो नमूना को बनाए रखने में सक्षम है, जबकि साथ ही क्रॉस फ्लो को झिल्ली के माध्यम से पारित करने और एक अतिरिक्त आउटलेट के माध्यम से चैनल छोड़ने की अनुमति देता है। इसका मतलब है, क्रॉस फ्लो नमूने को संचय दीवार की ओर धकेल सकता है जिससे इसके प्रसार-प्रेरित फ्लक्स (ब्राउनियन मोशन) का मुकाबला हो सकता है। जिसके परिणामस्वरूप क्षेत्र और प्रसार-प्रेरित प्रवाह के संतुलन में; उच्च प्रसार गुणांक का प्रदर्शन करने वाले छोटे नमूना घटक चैनल केंद्र के करीब संरेखित होते हैं जबकि कम प्रसार गुणांक प्रदर्शित करने वाले बड़े नमूना घटक संचय दीवार के करीब का पता लगाते हैं। चैनल के अंदर पैराबोलिक प्रवाह प्रोफ़ाइल के कारण, छोटे नमूना घटकों को इसलिए चैनल प्रवाह के तेज लैमिना में ले जाया जाता है और बड़े नमूना घटकों से पहले एल्यूट किया जाता है। FFF प्रतिधारण पैरामीटर और स्टोक्स-आइंस्टीन प्रसार गुणांक समीकरणों का उपयोग करना, elution समय और, क्रमशः elution मात्रा, AF4 में एक नमूने के तो सीधे अपने हाइड्रोडायनामिक आकार22में अनुवाद किया जा सकता है । यहां वर्णित एल्यूशन व्यवहार सामान्य एल्यूशन मोड को संदर्भित करता है और आमतौर पर लगभग 1-500 एनएम (कभी-कभी कण गुणों और अंश मापदंडों के आधार पर 2000 एनएम तक) के बीच एक कण आकार सीमा के भीतर AF4 के लिए मान्य होता है, जबकि स्टीरिक-हाइपरलेयर एल्यूशन आमतौर पर इस आकार सीमा25से ऊपर होता है।

एफएफएफ द्वारा अलग होने के बाद आकार की जानकारी प्राप्त करने के तीन सामान्य तरीके हैं। चूंकि एफएफएफ एक मॉड्यूलर उपकरण है, इसलिए इसे मल्टी-एंगल लाइट स्कैटरिंग (माल्स)26, 27,डायनामिक लाइट स्कैटरिंग (डीएलएस)28,29,या यहां तक कि अतिरिक्त आकारकीजानकारी प्राप्त करने के लिए दोनों के संयोजन के आधार पर आकार-संवेदनशील प्रकाश बिखरने वाले डिटेक्टरों जैसे कई डिटेक्टरों के साथ डाउनस्ट्रीम जोड़ा जासकताहै। हालांकि, चूंकि एफएफएफ-चैनल में नमूने का प्रतिधारण व्यवहार आम तौर पर अच्छी तरह से परिभाषित भौतिक ताकतों द्वारा नियंत्रित होता है, इसलिए आकार की गणना गणितीय दृष्टिकोण (एफएफएफ सिद्धांत) का उपयोग करके भी की जा सकती है, जहां एक साधारण एकाग्रता डिटेक्टर (जैसे, यूवी-विस डिटेक्टर) एक eluting नमूना32,33की उपस्थिति को इंगित करने के लिए पर्याप्त है।

तीसरे विकल्प के रूप में, हम यहांयूवी-विस डिटेक्शन के साथ मिलकर एएफ4 का उपयोग करके निलंबन में एक अज्ञात सोने नैनोपार्टिकल नमूने के आकार के लिए 20-100 एनएम की आकार सीमा में अच्छी तरह से परिभाषित AuNP मानकों का उपयोग करके बाहरी आकार अंशांकन34, 35 के आवेदन की रिपोर्ट करते हैं। इस सरल प्रयोगात्मक सेटअप को एक अंतरराष्ट्रीय अंतरसंरोधी तुलना (आईएलसी) में शामिल होने के लिए संभव के रूप में कई प्रयोगशालाओं की अनुमति देने के उद्देश्य पर चुना गया था, जिसे बाद में यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के आधार पर यूरोपीय संघ क्षितिज 2020 परियोजना एसीएनानो के फ्रेम में किया गया था।

Protocol

1. AF4 सिस्टम सेटअप

  1. AF4 कारतूस को इकट्ठा करें और निर्माता के मैनुअल में दिए गए निर्देशों का पालन करते हुए AF4 सिस्टम और यूवी-विस डिटेक्टर(सामग्री की तालिका)के सभी हार्डवेयर घटकों को जोड़ें।
  2. निर्माता के मैनुअल में दिए गए निर्देशों के बाद नियंत्रण, डेटा अधिग्रहण, प्रसंस्करण और मूल्यांकन के लिए सभी आवश्यक सॉफ्टवेयर पैकेज स्थापित करें।
  3. सुनिश्चित करें कि AF4 प्रणाली और यूवी-विस डिटेक्टर के बीच सभी आवश्यक सिग्नल कनेक्शन स्थापित किए गए हैं।
  4. सुनिश्चित करें कि स्थापित AF4-UV-विस कनेक्शन तंग हैं और 15 मिनट (टिप प्रवाह दर 1 एमएल∙मिन-1, फोकस फ्लो दर 1एमएल∙मिन-1,और क्रॉस फ्लो रेट 1.5 एमएल∙मिन-1) के लिए अल्ट्रापुरे पानी (यूपीडब्ल्यू) के साथ सेटअप को फ्लश करके लीकेज के बिना। ऐसा करने के लिए, AF4 नियंत्रण सॉफ्टवेयर खोलें और लैंडिंग पृष्ठ के दाईं ओर संबंधित पैनलों में प्रवाह दरों में प्रवेश करें। यदि आवश्यक हो तो संबंधित कनेक्टर (फिटिंग) को कस लें, और प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि कोई लीकेज नमूदार न हो जाए।
    नोट: सभी मापों के दौरान आंतरिक प्रणाली के दबाव की निगरानी की जानी चाहिए और 4 से 12 बार के भीतर होना चाहिए। यदि दबाव अधिक या कम है, तो बैकप्रेशर ट्यूबिंग को समायोजित करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, चैनल दबाव प्रवृत्ति पूर्ण माप समय पर स्थिर होना चाहिए।
    नोट: यदि कोई चैनल ओवन उपलब्ध है, तो सभी AF4 प्रयोगों में तुलनीय माप की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए इसका तापमान 25 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।

2. AF4-यूवी-विस सिस्टम योग्यता और नमूना विश्लेषण के लिए समाधान और निलंबन की तैयारी

  1. सफाई समाधान
    1. ठोस सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) के 8 ग्राम और सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) के 2 ग्राम यूपीडब्ल्यू के 1 एल में जोड़ें और कुल विघटन तक समाधान को हिलाएं।
  2. एलेंट
    1. eluent (0.025% (v/v), पीएच के आसपास 9.4) प्राप्त करने के लिए फ़िल्टर और degassed UPW के 2 एल करने के लिए फ़िल्टर किए गए सर्फेक्टेंट मिश्रण के 500μL जोड़ें।
      नोट: सर्फेक्टेंट मिश्रण के यौगिकों का विस्तृत विवरण तालिका 1 (सामग्री की तालिकाभी) में दिया गया है।
  3. बड़े पैमाने पर वसूली निर्धारण के लिए मनमाने ढंग से AuNP आकार मानक
    1. भंवर एक मनमाने ढंग से AuNP आकार मानक (५०मिलीग्राम∙L-1)2 मिनट के लिए और यह 1:4 UPW के साथ पतला करने के लिए १२.५ मिलीग्राम∙L-1 के अंतिम जन एकाग्रता प्राप्तकरतेहैं । प्राप्त निलंबन को समरूप बनाने के लिए कमजोर पड़ने के बाद अतिरिक्त 2 मिनट के लिए भंवर।
      सावधानी: रसायनों, विशेष रूप से नाओह छर्रों के साथ काम करते समय आवश्यक एहतियाती उपाय और उपयुक्त सुरक्षा उपकरण की आवश्यकता होती है।
      नोट: आम तौर पर AF4-यूवी-विस प्रयोगों के दौरान कम कण पृष्ठभूमि सुनिश्चित करने के लिए 0.1 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर (हाइड्रोफिलिक पीवीडीएफ या इसी तरह) का उपयोग करके सभी आवश्यक समाधानों (सफाई समाधान को छोड़कर) को डी-गैस और फ़िल्टर करने की सिफारिश की जाती है। यह या तो एक समर्पित वैक्यूम निस्पंदन इकाई द्वारा या सिरिंज फिल्टर का उपयोग करके स्थापित किया जा सकता है।

3. AF4-यूवी-विस सिस्टम योग्यता

  1. 30 मिनट (टिप फ्लो रेट 1 मिलियन-1, फोकस फ्लो रेट 1 एमएल∙∙मिन-1, और क्रॉस फ्लो रेट 1.5 एमएल∙मिन-1) के लिए सफाई समाधान के साथ सिस्टम को फ्लश करने के लिए स्टेप1.4में वर्णित सॉफ्टवेयर सेटिंग्सकाउपयोग करें।
  2. संबंधित एल्युंट बोतल को बदलें और 20 मिनट (टिप फ्लो रेट 1एमएल∙मिन-1,फोकस फ्लो रेट 1 एमएल∙मिन-1, और क्रॉस फ्लो रेट 1.5 एमएल∙मिन-1) के लिए यूपीडब्ल्यू के साथ सिस्टम को फ्लश करें।
  3. संबंधित इनलाइन पंप फिल्टर को बदलें।
  4. AF4 कारतूस खोलें और AF4 झिल्ली को बदलें। AF4 कारतूस को फिर से इकट्ठा करें और इसे AF4-UV-विस प्रणाली के साथ फिर से कनेक्ट करें।
  5. झिल्ली को बराबर करने और सिस्टम को स्थिर करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए एल्यूएंट के साथ साफ AF4-यूवी-विस सिस्टम को फ्लश करें (टिप फ्लो रेट 1एमएल∙मिन-1,फोकस फ्लो रेट 1 एमएल∙मिन-1, और क्रॉस फ्लो रेट 1.5एमएल∙मिन-1)। संभावित लीकेज के लिए फिर से जांच करें (चरण 1.4 देखें)।
  6. मनमाने ढंग से AuNP आकार मानक का उपयोग करके बड़े पैमाने पर वसूली और प्रतिधारण समय की भिन्नता का निर्धारण करके AF4-UV-विस प्रणाली को अर्हता प्राप्त करें।
    1. एक जुदाई बल के आवेदन के बिना एक सीधा इंजेक्शन चलाने प्रदर्शन करते हैं।
      1. फाइल खोलकर नई माप फाइल बनाएं | नई | AF4 नियंत्रण सॉफ्टवेयर में चलाएं।
      2. रन टैब के भीतर नमूना और माप विवरण के साथ-साथ इंजेक्शन की मात्रा और नमूना नाम को परिभाषित करें। माप की स्थिति तालिका 2में प्रदर्शित की जाती है।
      3. तालिका 2के अनुसार दूसरे टैब एफएफएफ विधि में माप मापदंडों को निर्धारित करें।
      4. माप शुरू करने के लिए रन बटन पर क्लिक करें।
    2. एक जुदाई बल (क्रॉस फ्लो) के आवेदन के साथ एक अंश रन प्रदर्शन करते हैं।
      1. तालिका 3में निर्दिष्ट अंश शर्तों का उपयोग करके पिछले खंड में वर्णित अंश विधि को परिभाषित करें।
      2. माप शुरू करने के लिए रन बटन पर क्लिक करें।
      3. माप को चौगुनी में करें।
        नोट: पहले रन प्रणाली कंडीशनिंग (यानी, AF4 झिल्ली) करना है और प्रणाली योग्यता परिणामों के अंतिम मूल्यांकन से बाहर रखा जाएगा ।
        नोट: फ़ाइल खोलकर सभी जेनरेट की गई फ़ाइलों को सहेजने की सिफारिश की जाती | AF4 नियंत्रण सॉफ्टवेयर में सहेजें।
      4. यदि एएफ 4-यूवी-विस-सिस्टम योग्य है, यदि मनमाने ढंग से AuNP आकार मानक के लिए प्रतिधारण समय और एलटी;2% की भिन्नता प्राप्त की जाती है तो एएफ4-यूवी-विस-सिस्टम योग्य पर विचार करें।
      5. इंजेक्शन प्रणाली के रूप में ऑटोसंप्लर का उपयोग करते समय, इष्टतम रन की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए ऑटोसंप्लर की सुई धोने वाले जलाशय की बोतल को उसी समाधान के साथ भरें जो AF4-यूवी-विस प्रणाली (जैसे, सफाई समाधान, यूपीडब्ल्यू या संबंधित एल्यूएंट) के माध्यम से पंप किया जाता है। एल्यूंट बदलते समय, आम तौर पर यूवी-विस-डिटेक्टर सिग्नल की निगरानी करके AF4-सिस्टम के पुनः संतुलन का पालन करने की सिफारिश की जाती है जब तक कि इसकी बेसलाइन स्थिर स्तर पर स्थिर न हो जाए।

4. AF4-यूवी-विस नमूना विश्लेषण

  1. संबंधित AuNP निलंबन (20 एनएम, 40 एनएम, 80 एनएम, 100 एनएम, प्रत्येक 50 मिलीग्राम) को भंवर से जोड़कर बाहरी आकार अंशांकन के लिए सभी AuNP आकार मानक तैयार करें। एल-1) 2 मिनट के लिए और इसे 1:4 UPW के साथ पतला करने के लिए 12.5 मिलीग्राम∙L-1 की अंतिम जन एकाग्रता प्राप्त करने के लिए। प्राप्त निलंबन को समरूप बनाने के लिए कमजोर पड़ने के बाद अतिरिक्त 2 मिनट के लिए भंवर।
  2. चरण 4.1 में वर्णित अंशांकन मानकों के लिए एक ही प्रक्रिया लागू करने वाले विश्लेषण के लिए अज्ञात AuNP नमूना तैयार करें।
  3. तालिका 2में प्रदर्शित एएफ 4 विधि का उपयोग करके सभी AuNP आकार मानकों का प्रत्यक्ष इंजेक्शन माप करें।
    1. ऐसा करने के लिए, पृथक्करण और नमूना मापदंडों को परिभाषित करने और प्रयोग शुरू करने के लिए रन बटन दबाने के लिए उपयुक्त पदों पर निर्माता के सॉफ्टवेयर में तालिका 2 में संक्षेप में संबंधित मान दर्ज करें।
  4. बाहरी आकार अंशांकन समारोह स्थापित करने के लिए तालिका 3 में प्रदर्शित AF4 विधि का उपयोग करके व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक AuNP आकार मानक को फिर से दर्ज करें।
    1. तालिका 3 में संक्षेप में संबंधित मानों को उपयुक्त पदों पर निर्माता के सॉफ्टवेयर में दर्ज करें। अंश विधि को एक फोकसिंग चरण, कई एल्यूशन चरणों और कुल्ला चरणों द्वारा परिभाषित किया गया है। विधि स्थापित करने के बाद, प्रयोग शुरू करने के लिए रन बटन दबाएं।
  5. तालिका 2में प्रदर्शित एएफ 4 विधि का उपयोग करके अज्ञात AuNP नमूने का सीधा इंजेक्शन माप करें।
  6. तालिका 3में सूचीबद्ध एएफ 4 विधि का संचालन करके अज्ञात AuNP नमूने का अंश करें।
  7. जब तक सार्थक और सांख्यिकीय रूप से प्रासंगिक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए अन्यथा नहीं कहा जाता है, तब तक ट्रिप्लिकेट में धारा 3 और 4 में उल्लिखित सभी मापों को पूरा करें।
    1. उपयोग से पहले 50 मिलीग्राम∙एल-1 AuNP स्टॉक निलंबन 4-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। पतला AuNP निलंबन आदर्श आवेदन से पहले 30 मिनट के भीतर तैयार कर रहे हैं।
      नोट: भंवर आमतौर पर पर्याप्त है और निलंबन का कोई अल्ट्रासोनिकेशन आवश्यक नहीं है।
    2. औएनपी आकार मानकों के लिए प्राप्त अवधारण समय के साथ अज्ञात AuNP नमूने के प्रतिधारण समय का एक संबंध सक्षम करने के लिए, एक ही AF4 विधि का उपयोग करके सभी नमूनों को मापने के लिए।
      नोट: निरंतर और वैध पृथक्करण स्थितियों को आश्वस्त करने के लिए, नमूना मापन (जैसे, 10 माप) की एक निर्धारित संख्या के बाद सिस्टम योग्यता अनुभाग (चरण 3.6.2 देखें) में वर्णित अंश चरण को शामिल/दोहराएं। इसके अलावा रिकॉर्ड सिस्टम प्रेशर और यूवी-विस डिटेक्टर बेसलाइन स्टेबिलिटी। वे स्थिर और एक पूर्ण AF4-यूवी-विस रन के साथ स्थिर रहना चाहिए ।
      नोट: आमतौर पर, अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली को बदलें जब यूवी-विस डिटेक्टर (या मल्टी एंगल लाइट स्कैटरिंग (माल्स) डिटेक्टर, यदि उपलब्ध हो) एक वृद्धि हुई शोर स्तर या परिभाषित प्रणाली योग्यता मानदंड जैसे वसूली, नमूना चोटी के आकार, या पुनरावृत्ति को याद किया जाता है (या AF4-यूवी-विस-सिस्टम को पूरी तरह से सफाई प्रक्रिया के अधीन किया गया था)। यहां वर्णित शर्तों के तहत, योग्य AF4-UV-विस प्रणाली आमतौर पर एक ही झिल्ली का उपयोग करके कम से कम 50 मापों के लिए स्थिर होती है; हालांकि, परिभाषित गुणवत्ता मानदंडों को पूरा करने वाले संभावित लगातार मापों की संख्या नमूना, नमूना मैट्रिक्स और एल्युंट संरचना के आधार पर काफी भिन्न हो सकती है।

5. डेटा मूल्यांकन

  1. निर्माता के मैनुअल में दिए गए निर्देशों का पालन करते हुए संबंधित डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर से सभी आवश्यक कच्चे डेटा (यानी, यूवी-विस पीक एरिया) के निर्यात के बाद AF4-यूवी-विस सिस्टम निर्माता या स्प्रेडशीट विश्लेषण द्वारा प्रदान किए गए डेटा मूल्यांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बड़े पैमाने पर वसूली गणना करें।
    1. निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके अंश माप (एकअंश)और प्रत्यक्ष इंजेक्शन माप (एकप्रत्यक्ष इंजेक्शन)की संबंधित यूवी-विस चोटियों के तहत क्षेत्रों की तुलना करके AuNP जन वसूली की गणना करें:
      Equation 2
      नोट: एक प्रत्यक्ष इंजेक्शन माप के दौरान, कोई जुदाई बल लागू नहीं किया जाता है, और इसलिए संचय दीवार के साथ एक विश्लेषण प्रजातियों की संभावित बातचीत को नजरअंदाज किया जा सकता है। एक संबंधित यूवी-विस चोटी के तहत क्षेत्र को सीधे बीयर-लैम्बर्ट कानून का उपयोग करके AuNP द्रव्यमान से सहसंबद्ध किया जा सकता है, यह मानते हुए कि नमूने के भीतर कोई अन्य प्रजाति संबंधित तरंगदैर्ध्य में अवशोषित नहीं होती है और/या i) अंश की स्थिति के तहत एक और प्रतिधारण समय पर elutes) AF4 झिल्ली के माध्यम से हटा दिया जाता है ।
    2. दात का आयात करें. प्रत्यक्ष इंजेक्शन और अंश दोनों से प्राप्त फ़ाइलें चलती हैं।
    3. अवलोकन टैब में यूवी-विस डिटेक्टर ट्रेस का चयन करें।
    4. सभी मापों के लिए सिग्नल और बेसलाइन दृश्य में रुचि के क्षेत्र (आरओआई) और एक आधार रेखा को परिभाषित करें।
    5. डालनेके माध्यम से एक प्रत्यक्ष इंजेक्शन अंशांकन डालें ।
    6. प्रत्यक्ष इंजेक्शन अंशांकन सेटिंग्स दृश्य में सभी प्रत्यक्ष इंजेक्शन रन का चयन करें और एक यूवी विलुप्त होने गुणांक दर्ज करें।
      नोट: अंशांकन और अंशकरण माप दोनों के लिए एक ही यूवी-विस विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।
    7. आरओआई के भीतर यूवी-विस सिग्नल ट्रेस के तहत क्षेत्र का उपयोग करके अंशांकन लाइन स्थापित करें और प्रवेश एकाग्रता और इंजेक्शन की मात्रा से गणना की गई इंजेक्शन राशि। प्राप्त अंशांकन अलग प्रत्यक्ष इंजेक्शन अंशांकन समारोह खिड़की में दिखाया जाएगा।
    8. अंशांकन समारोह को संबंधित अंशांकन मापों को असाइन करें।
      नोट: प्रत्येक अंशांकन आकार मानक और अज्ञात AuNP नमूने के लिए, AuNP के आकार निर्भर यूवी-विस अवशोषण के कारण एक अलग अंशांकन समारोह स्थापित करने की आवश्यकता है। यूवी-विस डिटेक्टर की इस खामी को आईसीपी-एमएस जैसे बड़े पैमाने पर संवेदनशील डिटेक्टर का उपयोग करके दरकिनार किया जा सकता है।
    9. मात्रात्मक परिणाम गणना डालकर विश्लेषण करें और परिणाम एकाग्रता और इंजेक्शन राशि मूल्यों के रूप में दाईं ओर एक मेज के भीतर प्रदर्शित किए जाएंगे।
  2. सभी आवश्यक कच्चे डेटा (यानी, संबंधित यूवी-विस पीक मैक्सिमा और संबंधित शून्य समय पर AuNP अंशांकन मानकों के प्रतिधारण समय) के निर्यात के बाद एएफ4 सिस्टम निर्माता द्वारा प्रदान किए गए डेटा मूल्यांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रतिधारण समय की भिन्नता की गणना करें।
    1. सभी आयातित मापों के लिए संबंधित यूवी निशान प्रदर्शित करने के लिए अवलोकन विंडो खोलें।
    2. चोटी का पता लगाने स्वचालित रूप से किया जाएगा; प्रदर्शन को अनुकूलित करने के लिए सिग्नल प्रोसेसिंग टूलबॉक्स के भीतर पीक डिटेक्शन पैरामीटर को समायोजित करें। सभी माप फ़ाइलों के माध्यम से जा रहा द्वारा संबंधित चोटी मैक्सिमा निकालें।
    3. निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके सभी मापों के लिए सापेक्ष मानक विचलन की गणना करें:
      Equation 1
      गणना भी एक संबंधित स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग कर किया जा सकता है।
  3. निर्माता के मैनुअल में दिए गए निर्देशों का पालन करते हुए संबंधित डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर से सभी आवश्यक कच्चे डेटा (यूवी-विस पीक मैक्सिमम ऑफ एनालिटे और संबंधित शून्य समय) के निर्यात के बाद निर्माता द्वारा प्रदान किए गए डेटा मूल्यांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके आकार निर्धारण करें। पहले से किए गए डीएलएस मापन से प्राप्त उनके हाइड्रोडायनामिक आकारों के खिलाफ एनयूएनपी आकार मानकों (20 एनएम, 40 एनएम, 80 एनएम, 100 एनएम) के शून्य समय सही प्रतिधारण समय (शुद्ध प्रतिधारण समय, तालिका 5देखें) की साजिश रचकर एक बाहरी आकार अंशांकन समारोह स्थापित किया जा सकता है (तालिका 4देखें)।
    नोट: डीएलएस माप आदर्श रूप से उसी दिन आयोजित किया जाना चाहिए जैसा कि तुलनात्मक नमूना गुणों को सुनिश्चित करने के लिए संबंधित अंश माप।
    1. .dat फाइलों को आयात करने के बाद सभी माप अवलोकन टैब में प्रदर्शित होते हैं। डिटेक्टरों की सूची से यूवी-विस डिटेक्टर सिग्नल का चयन करें, जो ओवरले विंडो के नीचे प्रदर्शित होता है। प्रत्येक माप के लिए एक आरओआई और बेसलाइन परिभाषित करें, जिसे सिग्नल और बेसलाइन दृश्य में समायोजित किया जा सकता है। चिकनी शोर संकेतों के अधिकार पर सिग्नल प्रोसेसिंग टूलबॉक्स का उपयोग करें। क्रमशः अन्य मापों को आवंटित किए जाने वाले मापदंडों को अनुमति देने के लिए अन्य रन फ़ंक्शन के लिए असाइन प्रोसेसिंग पैरामीटर का उपयोग करें।
    2. डालने टैब से कण आकार अंशांकन का चयन करें।
    3. ऊपरी दाईं ओर अंशांकन तालिका के लिए चयन संदर्भ में संबंधित माप पर क्लिक करके सभी अंशांकन रन का चयन करें । सभी चयनित माप नीचे एक तालिका में प्रदर्शित किया जाएगा । तालिका 4में निर्दिष्ट सभी अंशांकन मापों के लिए हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या दर्ज करें। समारोह कण आकार अंशांकन में प्रदर्शित किया जाएगा - समारोह खिड़की और समीकरण के रूप में अच्छी तरह से दिखाया जाएगा।
      नोट: स्थापित आकार अंशांकन समारोह के सहसंबंध गुणांक (आर2)≥0.990 होना चाहिए।
    4. असाइनमेंट सूची के लिए चयन रन के भीतर संबंधित अंशों का चयन करके अज्ञात AuNP नमूने के माप को अंशांकन फ़ंक्शन असाइन करें।
    5. डालने टैब के भीतर एक कण आकार वितरण गणना खोलकर परिणाम प्रदर्शित करें। पहले से बनाए गए कण आकार अंशांकन को अज्ञात AuNP नमूना माप के लिए अंशांकन के रूप में सूचीबद्ध किया जाएगा, जो सही विंडो सेटिंग्स में प्रदर्शित होताहै। गणना आकार अधिकतम करने के लिए लेबल आकार वितरण खिड़की में दिखाया जाएगा। एक नमूने के सभी मापों को औसत करने के लिए नमूना चेकबॉक्स के लिए औसत संकेतों का चयन करें और परिणाम को पीक अधिकतम लेबल में सूचीबद्ध करें।
    6. इसके अतिरिक्त, शो अंशांकन वक्र चेकबॉक्स का चयन करके फ्रैक्टोग्राम पर अंशांकन लाइन की साजिश करें। शो संचयी वितरण चेकबॉक्स का चयन करके एक संचयी आकार वितरण उपलब्ध है।
      नोट: डेटा मूल्यांकन के लिए निर्माता के सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते समय, सभी परिणामों को रिपोर्ट में जोड़ने की सिफारिश की जाती है, जिसे डालने टैब के अंदर रिपोर्ट पर क्लिक करके उत्पन्न किया जा सकता है। रिपोर्ट बटन एक दस्तावेज़ के लिए सभी परिणाम, टेबल, और आरेख जोड़ता है। रिपोर्ट टैब के तहत, दस्तावेज़ अनुभाग के भीतर रिपोर्ट सेटअप खोलकर रिपोर्ट सेटिंग को बदला जा सकता है।

Representative Results

सबसे पहले, AuNP आकार मानकों को AF4 द्वारा अलग किया गया था और यूवी-विस द्वारा 532 एनएम (AuNP की सतह प्लाज्मन प्रतिध्वनि) की तरंग दैर्ध्य पर AuNP के अवशोषण को मापने का पता चला था। प्राप्त फ्रैक्टोग्राम का एक ओवरले चित्र 1में प्रस्तुत किया जाता है । प्रत्येक ओएनपी के प्रत्येक यूवी-विस पीक मैक्सिमम पर ट्राइप्लेकेट माप से प्राप्त समय तालिका 5में सूचीबद्ध है। सभी प्रतिधारण समय के सापेक्ष मानक विचलन बढ़ते आकार के साथ एक कम माप विचरण के साथ १.१% से नीचे था । कुल मिलाकर, एक उत्कृष्ट दोहराव हासिल किया गया था । एक निरंतर पृथक्करण बल लागू किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप एल्यूशन समय और हाइड्रोडायनामिक आकार का रैखिक संबंध हुआ। बाहरी आकार अंशांकन लाइन शून्य समय सही एल्यूशन समय (शुद्ध प्रतिधारण समय) के खिलाफ निर्दिष्ट हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या की साजिश रचकर स्थापित किया गया था। एक रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण के परिणामस्वरूप एक अवरोधक के साथ एक रैखिक अंशांकन समारोह में एक = -3.373 एनएम ± 1.716 एनएम और एक ढलान बी = 1.209 एनएम ∙1 ± 0.055 एनएम∙मिन-1। 0.9958 के एक चुकता सहसंबंध गुणांक आर2 के साथ संलसंदन के रैखिक व्यवहार की पुष्टि की गई थी। संबंधित अंशांकन समारोह नेत्रहीन चित्र 2में प्रदर्शित किया जाता है ।

दूसरा भाग अज्ञात AuNP नमूने के विश्लेषण के साथ निपटा । प्रोटोकॉल सेक्शन(सेक्शन 4.2)में वर्णित प्रक्रिया के अनुसार नमूने के तीन एलिकोट तैयार किए गए थे। तीन aliquots में से प्रत्येक एक ही AF4 अंश विधि है कि भी AuNP आकार मानकों के लिए लागू किया गया था का उपयोग कर ट्रिपलीकेट में जांच की थी । अज्ञात AuNP नमूने से प्राप्त किए गए सभी नौ एएफ 4-यूवी-विस फ्रैक्टोग्राम को चित्र 3 में प्रस्तुत किया गया है और उनके संबंधित मूल्यांकन तालिका 6में संक्षेप में प्रस्तुत किए गए हैं। संबंधित प्रतिधारण समय का सापेक्ष मानक विचलन काफी कम था और 0.1% और 0.5% के बीच था। AuNP आकार मानकों के अंशांकन से प्राप्त कण आकार अंशांकन समारोह का उपयोग करना और यूवी-विस पीक अधिकतम पर अज्ञात AuNP नमूने के प्राप्त प्रतिधारण समय के साथ इसे सहसंबंधित करना, 29.4 एनएम ± 0.2 एनएम के समग्र औसत हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या की गणना की जा सकती है। इसके अलावा, 1.2% ± 83.1% की उचित द्रव्यमान वसूली प्राप्त की गई थी जो कोई महत्वपूर्ण समूह या AuNP नमूने के विघटन या झिल्ली की सतह पर कणों के काफी सोखने का संकेत नहीं देता था। चित्रा 4 सभी नौ यूवी-विस सिग्नल निशान के साथ प्राप्त कण आकार वितरण को प्रदर्शित करता है जो लागू AF4 विधि की उत्कृष्ट मजबूती को रेखांकित करता है।

Figure 1
चित्रा 1: सामान्यीकृत सिग्नल तीव्रता और लागू निरंतर क्रॉस फ्लो दर (ब्लैक लाइन) के साथ चार व्यक्तिगत AuNP आकार अंशांकन मानकों के ट्रिपलीकेट विश्लेषण से प्राप्त AF4-UV-विस फ्रैक्टोग्राम। शून्य चोटी ग्रे में लगभग 5.9 मिनट पर प्रकाश डाला गया है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: अपने संबंधित शिखर पर प्रत्येक व्यक्ति AuNP आकार अंशांकन मानक के प्रतिधारण समय के खिलाफ निर्दिष्ट हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या की साजिश रचने के बाद, डीएलएस माप(तालिका 4)के संबंधित मानक विचलन से प्राप्त त्रुटि सलाखों और प्राप्त AF4 प्रतिधारण समय(तालिका 5)में भिन्नता सहित बाहरी आकार अंशांकन समारोह प्राप्त किया। y = ए + बीएक्स के रूप में मानक त्रुटियों के साथ एक रैखिक अंशांकन समारोह = 3.373 एनएम ± 1.716 एनएम और बी = 1.209 एनएम-मिन-1 ± 0.055 एनएम-मिन-1 की गणना रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण से की गई थी। आर 2 =0.9958 के साथ एक चुकता सहसंबंध गुणांक निर्धारित किया गया था, एक रैखिक संबंध का संकेत है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: अज्ञात AuNP को प्रदर्शित करने वाले तीन एलिकोट्स के ट्रिपलिटेट मापों के AF4-UV-विस फ्रैक्टोग्राम। माप समय पर लागू निरंतर पार प्रवाह दर एक काली रेखा के रूप में सचित्र है। लगभग 5.9 मिनट पर शून्य चोटी ग्रे में हाइलाइट की गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: अज्ञात औप नमूने के प्राप्त औसत कण आकार वितरण (लाल) और एप्लाइड रैखिक अंशांकन समारोह (बिंदीदार रेखा) का ओवरले। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

घटक कैस-नहीं वजन (%)
पानी 7732-18-5 88.8
9-ऑक्टेसेनोइक एसिड (जेड)), 2,2'-नाइट्रोलॉट्रिस [इथेनॉल] के साथ यौगिक (1:1) 2717-15-9 3.8
सोडियम कार्बोनेट 497-19-8 2.7
अल्कोहल, C12-14-माध्यमिक, एथॉक्सिलेटेड 84133-50-6 1.8
टेट्रासोडियम एडटा 64-02-8 1.4
पॉलीथीन ग्लाइकोल 25322-68-3 0.9
सोडियम ओलेट 143-19-1 0.5
सोडियम बाइकार्बोनेट 144-55-8 0.1

तालिका 1: एल्यूंट तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सर्फेक्टेंट मिश्रण के घटकों की सूची (सामग्री की तालिकाभी देखें)।

AF4-यूवी-विस पैरामीटर इकाई मान
स्पेसर मोटाई सुक्ष्ममापी 350
डिटेक्टर प्रवाह दर एमएल मिन-1 0.5
क्रॉस फ्लो रेट एमएल मिन-1 0 (8 मिनट के लिए स्थिर)
फोकस फ्लो रेट एमएल मिन-1 0
विलंब समय/ स्थिरीकरण का समय मिनट 0
इंजेक्शन प्रवाह दर एमएल मिन-1 0.5
संक्रमण का समय मिनट 0
इंजेक्शन का समय मिनट 0.1
एल्यूशन स्टेप मिनट 8
कुल्ला कदम समय मिनट 0.1
कुल्ला कदम प्रवाह दर एमएल मिन-1 0.1
इंजेक्शन की मात्रा माइक्रोल 10
नमूना एकाग्रता एमजी एल-1 12.5
झिल्ली प्रकार पुनर्जीवित सेल्यूलोज
झिल्ली आणविक वजन कट-ऑफ केडीए 10
एलेंट 0.025% (v/v) सर्फेक्टेंट मिश्रण
यूवी-विस तरंगदैर्ध्य एनएम 532
यूवी-विस संवेदनशीलता - 0.001

तालिका 2: एएफ 4-यूवी-विस आंशिक विधि मापदंडों का सारांश एक जुदाई बल के आवेदन के बिना प्रत्यक्ष इंजेक्शन चलाने के लिए।

AF4-यूवी-विस पैरामीटर इकाई मान
स्पेसर मोटाई सुक्ष्ममापी 350
डिटेक्टर प्रवाह दर एमएल मिन-1 0.5
क्रॉस फ्लो रेट एमएल मिन-1 1 (60 मिनट स्थिर, 10 मिनट रैखिक)
फोकस फ्लो रेट एमएल मिन-1 1.3
विलंब समय/ स्थिरीकरण का समय मिनट 2
इंजेक्शन प्रवाह दर एमएल मिन-1 0.2
संक्रमण का समय मिनट 0.2
इंजेक्शन का समय मिनट 5
एल्यूशन स्टेप मिनट 70 (60 मिनट स्थिर, 10 मिनट रैखिक)
कुल्ला कदम मिनट 9
कुल्ला कदम प्रवाह दर एमएल मिन-1 0.5
इंजेक्शन की मात्रा माइक्रोल 50
नमूना एकाग्रता एमजी एल-1 12.5
झिल्ली प्रकार पुनर्जीवित सेल्यूलोज
झिल्ली आणविक वजन कट-ऑफ केडीए 10
एलेंट 0.025% (v/v) सर्फेक्टेंट मिश्रण
यूवी-विस तरंगदैर्ध्य एनएम 532
यूवी-विस संवेदनशीलता - 0.001

तालिका 3: सेपरेशन फोर्स के रूप में क्रॉस फ्लो के आवेदन के साथ अंश चलाने के लिए एएफ 4-यूवी-विस आंशिक विधि मापदंडों का सारांश।

अंशांकन मानक कैपिंग एजेंट मतलब आकार (TEM) (एनएम) सीवी (मतलब आकार TEM) (%) जीटा क्षमता (एमवी) एसडी (जीटा क्षमता) (एमवी) हाइड्रोडायनामिक रेडियस (डीएलएस) (एनएम) एसडी (हाइड्रोडायनामिक रेडियस) (एनएम) पीडीआई एसडी (पीडीआई)
औप 20 एनएम साइट्रेट 20.1 ≤ 8 -48.9 1.5 10.95 0.12 0.082 0.009
औप 40 एनएम साइट्रेट 40.8 ≤ 8 -30.4 1.0 20.30 0.13 0.127 0.006
औप 80 एनएम साइट्रेट 79.2 ≤ 8 -51.5 1.3 38.85 0.23 0.138 0.013
औप 100 एनएम साइट्रेट 102.2 ≤ 8 -50.9 0.9 52.30 0.37 0.078 0.009

तालिका 4: लागू AuNP अंशांकन मानकों के भौतिक-रासायनिक मापदंडों का सारांश, कैपिंग एजेंट, TEM मतलब आकार, देशी निलंबन में निर्धारित जीटा क्षमता के साथ-साथ डीएलएस हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या, और पॉलीडिसपरिटी इंडेक्स (पीडीआई) एल्यूंट में निर्धारित किया गया है।

अंशांकन मानक चलाना पीक मैक्सिमम (न्यूनतम) पर प्रतिधारण समय पीक मैक्सिमम (न्यूनतम) पर नेट रिटेंशन टाइम औसत शुद्ध प्रतिधारण समय (न्यूनतम) एसडी (%) (शुद्ध प्रतिधारण समय) एसडी (न्यूनतम) (शुद्ध प्रतिधारण समय)
औप 20 एनएम 1 17.368 11.468 11.56 1.02 0.12
2 17.409 11.509
3 17.589 11.689
औप 40 एनएम 1 25.316 19.416 19.49 0.68 0.13
2 25.32 19.42
3 25.548 19.648
औप 80 एनएम 1 42.095 36.195 36.29 0.23 0.08
2 42.219 36.319
3 42.257 36.357
औप 100 एनएम 1 50.975 45.075 45.06 0.07 0.03
2 50.924 45.024
3 50.986 45.086

तालिका 5: टेबल 3में वर्णित विधि का उपयोग करके संबंधित एएफ 4-यूवी-विस फ्रैक्टोग्राम से प्राप्त संबंधित यूवी-विस पीक मैक्सिमम में AuNP अंशांकन मानकों का अवधारण समय।

अलीकोट चलाना अवधारण समय पीक अधिकतम (न्यूनतम) पीक मैक्सिमम (न्यूनतम) पर औसत प्रतिधारण समय पीक मैक्सिमम (न्यूनतम) पर नेट रिटेंशन टाइम एसडी (%) अवधारण का समय हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या (एनएम) रिकवरी (%)
1 1 32.689 32.70 26.789 0.07 29.03 85.34
2 32.687 26.787
3 32.719 26.819
2 1 32.989 33.08 27.089 0.37 29.49 81.73
2 33.073 27.173
3 33.187 27.287
3 1 33.053 33.14 27.153 0.49 29.56 82.14
2 33.071 27.171
3 33.291 27.391

तालिका 6: संबंधित यूवी-विस पीक मैक्सिमम पर प्रतिधारण समय का सारांश, बाहरी आकार अंशांकन(चित्रा 2)से गणना किए गए हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या और AF4-यूवी-विस विश्लेषण से प्राप्त अज्ञात AuNP नमूने की वसूली दर।

Discussion

एक अज्ञात AuNP के हाइड्रोडायनामिक आकार का सही मूल्यांकन AF4 द्वारा किया गया था, जिसमें यूवी-विस डिटेक्टर के साथ मिलकर 20 एनएम से 100 एनएम तक अच्छी तरह से परिभाषित AuNP आकार मानकों का उपयोग किया गया था। विकसित AF4 विधि को मापा प्रतिधारण समय और AuNP आकार के बीच एक रैखिक संबंध स्थापित करने के लिए एक निरंतर क्रॉस फ्लो प्रोफाइल का उपयोग करके अनुकूलित किया गया था, इस प्रकार रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण से एक सीधा आकार निर्धारण की अनुमति दी गई थी। विशेष ध्यान भी पर्याप्त रूप से उच्च वसूली दरों को प्राप्त करने पर था जो अंश के दौरान कोई महत्वपूर्ण नमूना हानि का संकेत नहीं देता है, और विकसित AF4 विधि, जिसमें लागू एल्यूंट और झिल्ली शामिल है, जो सभी आंशिक AuNP नमूनों के साथ अच्छी तरह से मेल खाती है।

विधि विकास यकीनन AF4 में सबसे महत्वपूर्ण कदम है और चैनल आयामों, प्रवाह मापदंडों के साथ-साथ एल्युंट, झिल्ली, स्पेसर ऊंचाई और यहां तक कि नमूना गुणों सहित कई मापदंडों को ध्यान में रखा जाना चाहिए ताकि किसी दिए गए एल्यूशन टाइम विंडो के भीतर अंश में सुधार किया जा सके। इस पैराग्राफ का उद्देश्य पाठक को उन महत्वपूर्ण चरणों के माध्यम से मार्गदर्शन करना है जिन्हें यहां चर्चा किए गए अज्ञात AuNP नमूने के आकार को सफलतापूर्वक निर्धारित करने के लिए अनुकूलित किया गया था। आम तौर पर एएफ 4 विधि विकसित करने के तरीके के अधिक विस्तृत विवरण के लिए, पाठक को 'आईएसओ/TS21362:2018 - नैनोटेक्नोलॉजीज - विषम प्रवाह और अपकेंद्रित्र क्षेत्र-प्रवाह आंशिकता'25का उपयोग करके नैनो-ऑब्जेक्ट्स का विश्लेषण करने के एएफ4 अनुभाग को संदर्भित किया जाता है। तालिका 3में दिए गए लागू अंश शर्तों को करीब से देखने के बाद, पहला महत्वपूर्ण कदम AF4 चैनल में AuNP नमूने का परिचय और विश्राम है। यह कदम इंजेक्शन प्रवाह, फोकस प्रवाह और क्रॉस फ्लो द्वारा नियंत्रित होता है, जिसका परस्पर क्रिया नमूना झिल्ली सतह के करीब का पता लगाने और इसे AF4 चैनल के इंजेक्शन बंदरगाह के पास एक संकीर्ण बैंड में ध्यान केंद्रित करने के लिए प्रेरित करता है जो मूल रूप से अंश के प्रारंभिक बिंदु को परिभाषित करता है। नमूने की पर्याप्त छूट अनिवार्य है क्योंकि इस चरण के दौरान, विभिन्न आकारों के नमूना घटक AF4 चैनल की विभिन्न ऊंचाइयों में पता लगाते हैं जिससे एक सफल आकार अंश के लिए आधार प्रदान होता है। अधूरा नमूना छूट आमतौर पर एक वृद्धि हुई शून्य पीक क्षेत्र द्वारा दिखाई देती है जिसके परिणामस्वरूप गैर-संरक्षित (यानी, गैर-शिथिल) नमूना घटक होते हैं। इस प्रभाव को इंजेक्शन समय और/या लागू क्रॉस फ्लो दर में वृद्धि करके कम किया जा सकता है । हालांकि, दोनों मापदंडों को सावधानीपूर्वक अनुकूलन की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से उन नमूनों के लिए जो AF4 झिल्ली पर समूहीकरण और सोखने से ग्रस्त होते हैं, और विभिन्न पैरामीटर सेटिंग्स36, 37के लिए प्राप्त संबंधित वसूली दरों द्वारा निगरानी की जा सकती है। 1.0 एमएल∙मिनट -1 के क्रॉस फ्लो रेट के साथ5 मिनट के लागू इंजेक्शन समय से पता चला कि सभी AuNP नमूनों के लिए वसूली दर और 80% और एक नगण्य शून्य पीक क्षेत्र लगभग इष्टतम छूट की स्थिति का संकेत है। AuNP नमूने की पर्याप्त छूट के बाद, ध्यान प्रवाह बंद कर दिया गया था और संबंधित यूवी-विस डिटेक्टर के लिए AF4 चैनल लंबाई के साथ नमूना परिवहन दूसरे महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व शुरू किया गया था । उचित विश्लेषण समय पर पर्याप्त रूप से उच्च अंश शक्ति सुनिश्चित करने के लिए, 30-50 मिनट के लिए 1.0 मिलीएल∙मिन-1 की निरंतर क्रॉस फ्लो दर (संबंधित आंशिक AuNP आकार मानक के आधार पर) इसके बाद 0.5 mL.मिनट-1 की डिटेक्टर प्रवाह दर पर10 मिनट की रैखिक क्रॉस फ्लो क्षय लागू किया गया था। सभी AuNP आकार मानकों के पृथक्करण में एक निरंतर क्रॉस फ्लो प्रोफाइल का उपयोग करने से एफएफएफ-थ्योरी22के बाद प्रतिधारण समय और AuNP आकार के बीच एक रैखिक संबंध का पता चला, जिससे सरल रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण द्वारा अज्ञात AuNP नमूने के आकार निर्धारण को सक्षम किया जा सके। हालांकि, नैनोकणों के आकार के लिए निरंतर क्रॉस फ्लो के अलावा अन्य प्रोफाइल का भी शोषण किया गया है, जिससे अंततः प्रतिधारण समय और कण आकार38, 39के बीच एक गैर-रैखिक संबंधहोताहै। इसके अलावा, अच्छी तरह से परिभाषित आकार मानकों का उपयोग कर AF4 में आकार निर्धारण AuNP तक ही सीमित नहीं है, लेकिन यह भी अन्य आकार और मौलिक संरचना (जैसे, चांदी38,40 या सिलिका नैनोकणों41,42)के साथ नैनोकणों के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, तनु नमूनों के साथ काम करते समय, आईसीपी-एमएस एक अत्यंत संवेदनशील मौलिक डिटेक्टर है, जिसे AF4 के साथ जोड़ा जा सकता है, जो निलंबन में नैनोकणों की एक बड़ी विविधता को आकार देने के लिए इस विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा को जोड़ता है।

इसके व्यापक अनुप्रयोग के बावजूद, AF4 में अच्छी तरह से परिभाषित आकार मानकों का उपयोग करके बाहरी आकार अंशांकन में कुछ विशिष्टताओं की आवश्यकता है जिन्हें अज्ञात नमूनों के सटीक आकार के लिए इसका उपयोग करते समय विचार करने की आवश्यकता है। सबसे पहले, यह संबंधित आकार मानकों और वास्तविक नमूने के अंश के दौरान तुलनीय स्थितियों के आवेदन पर भारी निर्भर करता है। यहां प्रस्तुत मामले में, इसलिए यह अनिवार्य है कि AuNP आकार मानकों के साथ-साथ अज्ञात AuNP नमूने दोनों को एक ही AF4 विधि के साथ-साथ एक ही एल्यूंट और एक ही झिल्ली का उपयोग करके आंशिक किया जाता है जो इस दृष्टिकोण को काफी अनम्य बनाता है। इसके अलावा, कोई आकार के प्रति संवेदनशील डिटेक्टरों, उदाहरण के लिए, हाथ में प्रकाश बिखरने (MALS और DLS) होने, यह निर्धारित करना मुश्किल है कि आकार मानकों का उपयोग कर एक संबंधित AF4 विधि पर्याप्त रूप से अच्छी तरह से काम करता है या नहीं । यह विशेष रूप से अज्ञात नमूनों के लिए सही है जो बहुत व्यापक आकार के वितरण प्रदर्शित करते हैं, जहां यह स्पष्ट नहीं है कि सभी नमूना घटक सामान्य एल्यूशन पैटर्न का पालन करते हैं: छोटे से बड़े कणों तक का अंश, या क्या बड़े नमूना घटक पहले से ही स्टीरिक-हाइपरलेयर मोड में हैं जिससे संभावित रूप से छोटे नमूना घटकों43, 44के साथ सह-eluting होते हैं। इसके अलावा, हालांकि FFF-सिद्धांत पर जोर देती है कि AF4 पूरी तरह से कणों के साथ हाइड्रोडायनामिक आकार में मतभेदों के आधार पर अलग करता है उनके पर्यावरण22के साथ किसी भी बातचीत के बिना बिंदु जनता माना जा रहा है, वास्तविकता कण कण और कण के साथ एक अलग कहानी कहता है- झिल्ली बातचीत (जैसे इलेक्ट्रोस्टैटिक आकर्षण/प्रतिकर्षण या वैन-डेर-वाल्स आकर्षण) काफी भूमिका निभा सकते हैं और संभावित रूप से बाहरी आकार अंशांकन45,46के माध्यम से आकार निर्धारण में एक औसत दर्जे का पूर्वाग्रह पेश कर सकते हैं । इसलिए आकार मानकों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है जो आदर्श रूप से संरचना और सतह गुणों (जीटा क्षमता) को रुचि के कण40,42 या, से मेल खाते हैं। यदि ये उपलब्ध नहीं हैं, तो कम से कम अच्छी तरह से विशेषता वाले कण आकार मानकों (जैसे, पॉलीस्टीरिन लेटेक्स कणों) का उपयोग करें और विशेष रूप से संबंधित वातावरण में उनकी सतह जीटा क्षमता के संदर्भ में ब्याज के कण के साथ उनकी तुलनीयता का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन करें, जिसमें विश्लेषण41, 47किया जाएगा ।

AF4 की बहुमुखी प्रतिभा को अक्सर इसकी सबसे बड़ी ताकत माना जाता है, क्योंकि यह एक आवेदन सीमा प्रदान करता है जो इस क्षेत्र में अधिकांश अन्य सामान्य आकार लेने की तकनीकों से परे जाता है22,48,49। साथ ही, इसकी संबद्ध संभावित जटिलता के कारण, इसे विशेष रूप से डीएलएस, नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण, या एकल कण आईसीपी-एमएस जैसी तेजी से और जाहिरा तौर पर आसानी से उपयोग करने वाली आकार देने की तकनीकों के खिलाफ इसकी सबसे महत्वपूर्ण खामी के रूप में भी माना जा सकता है। फिर भी, जब इन लोकप्रिय आकार देने की तकनीकों के साथ परिप्रेक्ष्य में AF4 डाल, यह स्पष्ट हो जाता है कि सभी तकनीकों को अपने पेशेवरों और विपक्ष है, लेकिन उन सभी को नैनोकणों की भौतिको-रासायनिक प्रकृति की एक अधिक व्यापक समझ में योगदान और इसलिए पूरक के बजाय प्रतिस्पर्धी माना जाना चाहिए ।

मानक ऑपरेटिंग प्रक्रिया (एसओपी) यहां प्रस्तुत की, निलंबन में एक अज्ञात AuNP नमूने के आकार के लिए बाहरी आकार अंशांकन के साथ AF4-UV-vis की उत्कृष्ट प्रयोज्यता पर प्रकाश डाला गया और अंततः एक अंतरराष्ट्रीय अंतरसंवर्ती तुलना (आईएलसी) के भीतर एक अज्ञात AuNP नमूने के AF4 विश्लेषण के लिए एक अनुशंसित दिशानिर्देश के रूप में लागू किया गया था जो क्षितिज 2020 परियोजना के फ्रेम में आयोजित किया गया था, एसीएननो (इस आईएलसी का परिणाम भविष्य के प्रकाशन का विषय होगा)। इसलिए, यह प्रोटोकॉल नैनोकण लक्षण वर्णन के क्षेत्र में AF4 की आशाजनक क्षमता कोरेखांकित करतेहुएAF4 पद्धतियों को मान्य और मानकीकृत करने के लिए उत्साहजनक और चल रहे अंतरराष्ट्रीय प्रयासों को जोड़ता है ।

Disclosures

इस पांडुलिपि के सभी लेखक पोस्टनोवा एनालिटिक्स जीएमबीएच के कर्मचारी हैं, जिनके उत्पादों का उपयोग इस प्रोटोकॉल में किया जाता है।

Acknowledgments

लेखक यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल की तैयारी के सभी चरणों में उपयोगी चर्चाओं के लिए पूरे ACEnano कंसोर्टियम का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । लेखक भी ACEnano परियोजना के फ्रेम में अनुदान समझौते nº ७२०९५२ के तहत यूरोपीय संघ क्षितिज २०२० कार्यक्रम (H2020) से धन की सराहना करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 µm Membrane Filters (hydrophilic PVDF) Postnova Analytics GmbH Z-FIL-TEF-002 Used for filtration of aqueous solutions
0.22 µm PVDF Syringe Filter (d = 33 mm) Merck Millipore Durapore Millex Used for filtration of NovaChem100
Adjustable Volume Pipettes (1000 µL) Eppendorf AG Research Plus Used to prepare diluted AuNP suspensions
AF4 cartridge Postnova Analytics GmbH AF2000 MF - AF4 Analytical Channel Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
AF4 Membrane - Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO) Postnova Analytics GmbH Z-AF4-MEM-612-10KD Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Analytical Balance (0.1 mg precision) Sartorius ENTRIS124I-1S Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution
Autosampler Postnova Analytics GmbH PN5300 Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Channel Oven Postnova Analytics GmbH PN4020 Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Crossflow Module Postnova Analytics GmbH AF2000 MF Control Module Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Disposable Pipette Tips (1000 µL) Eppendorf AG ep T.I.P.S Used to prepare diluted AuNP suspensions
Flasks (e.g. 2 liter volume) neoLab 1-0199 Used for eluent storage
Focus Pump Postnova Analytics GmbH PN1131 Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) Postnova Analytics GmbH VIA-002 Used for sample storage
Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) Postnova Analytics GmbH NovaCal Gold 50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function
Magnetic Stirrer IKA VIBRAX-VXR Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW
Personal Computer (PC) Dell Technologies / Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual
Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.) / / In accordance with respective laboratory’s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials
Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) Postnova Analytics GmbH Z-VIA-09150868 Used for sample storage
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), ≥99 %, Blotting Grade Carl Roth GmbH & Co KG 2326.1 Used for the preparation of the cleaning solution
Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, ≥98 %, p.a Carl Roth GmbH & Co KG 6771.1 Used for the preparation of the cleaning solution
Software Package for Control and Data Acquisition Postnova Analytics GmbH NovaFFF AF2000 Software Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual
Software Package for Data Evaluation Postnova Analytics GmbH NovaAnalysis Software Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual
Software Package for final Data Processing OriginLab Corporation Origin 2019 Used for final data processing
Solvent Degasser Postnova Analytics GmbH PN7520 Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Solvent Selector Postnova Analytics GmbH PN7310 Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Solvent Organizer Postnova Analytics GmbH PN7140 Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Surfactant Mixture Postnova Analytics GmbH NovaChem100 Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation
Tip Pump Postnova Analytics GmbH PN1130 Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Unknown AuNP sample BBI Solutions EM.GC60 60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function
UV-vis Detector Postnova Analytics GmbH PN3211 UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system
Vacuum Filtration Unit Postnova Analytics GmbH Eluent Filtration System Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions
Vortex IKA Vortex Genie 2 Used for homogenization of diluted AuNP suspensions
Water Purification System Merck Millipore Milli-Q Integral 5 Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 MΩcm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions

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बायोइंजीनियरिंग अंक 163 असममित प्रवाह क्षेत्र-प्रवाह अंश AF4 यूवी-विस डिटेक्शन गोल्ड नैनोकण कण आकार बाहरी आकार अंशांकन मानक ऑपरेटिंग प्रक्रिया
निलंबन में गोल्ड नैनोकणों के आकार के लिए विषम प्रवाह क्षेत्र-प्रवाह अंश
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Drexel, R., Sogne, V., Dinkel, M.,… More

Drexel, R., Sogne, V., Dinkel, M., Meier, F., Klein, T. Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension. J. Vis. Exp. (163), e61757, doi:10.3791/61757 (2020).

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