Summary
Detta protokoll beskriver användningen av asymmetrisk flödesfält-flödesfraktion i kombination med UV-vis-detektion för bestämning av storleken på ett okänt guldnanopartiklarprov.
Abstract
Partikelstorlek är utan tvekan den viktigaste fysikalisk-kemiska parametern i samband med begreppet nanopartikel. Exakt kunskap om nanopartiklarnas storlek och storleksfördelning är av yttersta vikt för olika tillämpningar. Storleksintervallet är också viktigt, eftersom det definierar den mest "aktiva" komponenten i en nanopartikeldos.
Asymmetrisk flödesfält-flödesfraktion (AF4) är en kraftfull teknik för storleksändring av partiklar i suspension i storleksområdet cirka 1-1000 nm. Det finns flera sätt att härleda storleksinformation från ett AF4-experiment. Förutom att koppla AF4 online med storlekskänsliga detektorer baserade på principerna för multivinklad ljusspridning eller dynamisk ljusspridning, finns det också möjlighet att korrelera storleken på ett prov med dess retentionstid med hjälp av ett väletablerat teoretiskt tillvägagångssätt (FFF-teori) eller genom att jämföra det med retentionstiderna för väldefinierade partikelstorleksstandarder (extern storlekskalibrering).
Vi beskriver här utvecklingen och den interna valideringen av ett standardrutiner (SOP) för storlek av ett okänt guldnanopartiklarprov av AF4 i kombination med UV-vis-detektion med hjälp av extern storlekskalibrering med nanopartiklar av guld i storleksintervallet 20–100 nm. Denna procedur ger en detaljerad beskrivning av det utvecklade arbetsflödet, inklusive provberedning, AF4-instrumentinställning och kvalificering, AF4-metodutveckling och fraktionering av det okända nanopartiklarprovet i guld samt korrelationen mellan de erhållna resultaten och den etablerade kalibreringen av den externa storleken. SOP som beskrivs här validerades så småningom framgångsrikt inom ramen för en interlaboratorisk jämförelsestudie som belyser AF4: s utmärkta robusthet och tillförlitlighet för storleksändring av nanopartikelprover i suspension.
Introduction
Guldnanopartiklar (AuNP) i form av kolloidalt guld hade varit en del av den mänskliga kulturen långt innan det fanns en förståelse för vad nanopartiklar var och innan termen nanopartiklar hade hittat sin väg in i samtida, vetenskaplig vokabulär. Utan distinkt kunskap om deras nanoskala utseende, suspenderad AuNP hade redan använts för medicinska och andra ändamål i antika Kina, Arabien och Indien i V-VI århundradena BC1, och även de gamla romarna utnyttjade sin rubinröda färg för att berömt färga sin keramik i Lycurgus Cup-utställningen i British Museum2. I västvärlden, under århundradena från medeltiden till den moderna eran, användes suspenderade AuNP främst som färgämnen för glas och emalj (Lila av Cassius)3 samt för att behandla en mängd olika sjukdomar (Potable Gold), särskilt syfilis4.
Men alla dessa studier hade främst fokuserat på tillämpningen av suspenderad AuNP och det var upp till Michael Faraday 1857 att införa det första rationella tillvägagångssättet för att undersöka deras bildande, deras natur samt deras egenskaper5. Även om Faraday redan var medveten om att dessa AuNP måste ha mycket minimala dimensioner, var det inte förrän utvecklingen av elektronmikroskopi när explicit information om deras storleksfördelning vartillgänglig 6,7, vilket så småningom möjliggör korrelationen mellan storlek och andra AuNP-egenskaper.
Nuförtiden, tack vare deras ganska enkla och enkla syntes, anmärkningsvärda optiska egenskaper (ytplasmonresonans), god kemisk stabilitet och därmed mindre toxicitet samt deras höga mångsidighet när det gäller tillgängliga storlekar och ytmodifieringar, har AuNP hittat utbredda tillämpningar inom områden som nanoelektronik8,diagnostik 9,cancerbehandling10, eller läkemedelsleverans11. För dessa tillämpningar är naturligtvis exakt kunskap om storleken och storleksfördelningen för den tillämpade AuNP en grundläggande förutsättning för att säkerställa optimaleffekt 12 och det finns en betydande efterfrågan på robusta och tillförlitliga verktyg för att bestämma denna viktiga fysikalisk-kemiska parameter. Idag finns det en uppsjö av analytiska tekniker som kan dimensionera AuNP i suspension inklusive, till exempel UV-vis spektroskopi (UV-vis)13, Dynamic Light Scattering (DLS)14 eller Single Particle Inductively-Coupled Plasma Mass Spectrometry (spICP-MS)15 med Field-Flow Fractionation (FFF) som en nyckelspelare i detta fält16,17,18,19,20.
FFF konceptualiserades första gången 1966 av J. Calvin Giddings21och består av en familj av elueringsbaserade fraktioneringstekniker, där separation sker inom en tunn bandliknande kanal utan en stationär fas22,23. I FFF framkallas separation genom interaktion mellan ett prov och ett externt kraftfält som verkar vinkelrätt mot riktningen för ett laminärt kanalflöde, där provet transporteras nedströms vanligtvis mot respektive in-line-detektorer. Bland dessa relaterade FFF-tekniker har Asymmetrisk flödesfältflödesfraktion (AF4), där ett andra flöde (korsflöde) fungerar som kraftfält, blivit den mest använda undertypen24. I AF4 är kanalbotten (ackumuleringsväggen) utrustad med ett halvgenomsläppligt ultrafiltreringsmembran som kan behålla provet samtidigt som korsflödet kan passera genom membranet och lämna kanalen via ett extra utlopp. På så sätt kan korsflödet driva provet mot ackumuleringsväggen och därigenom motverka dess diffusionsinducerade flöde (brownsk rörelse). I en resulterande jämvikt mellan fält- och diffusionsinducerade flödet. Mindre provbeståndsdelar som uppvisar högre diffusionskoefficienter ligger närmare kanalcentret medan större provbeståndsdelar med lägre diffusionskoefficienter lokaliserar närmare ackumuleringsväggen. På grund av den paraboliska flödesprofilen inuti kanalen transporteras därför mindre provbeståndsdelar i kanalflödets snabbare laminae och eluerar före större provbeståndsdelar. Med hjälp av FFF retentionsparameter och Stokes-Einstein diffusionskoefficientekvationer kan elueringstiden respektive elueringsvolymen för ett prov i AF4 sedan översättas direkt till dess hydrodynamiskastorlek 22. Här hänvisar det beskrivna elueringsbeteendet till det normala elueringsläget och gäller vanligtvis för AF4 inom ett partikelstorleksområde mellan cirka 1–500 nm (ibland upp till 2000 nm beroende på partikelegenskaper och fraktioneringsparametrar) medan sterisk-hyperlayer-eluering vanligtvis inträffar över dennastorlekströskel 25.
Det finns tre vanliga sätt att härleda storleksinformation efter separation av FFF. Eftersom FFF är ett modulärt instrument kan det kombineras nedströms med flera detektorer som storlekskänsliga ljusspridningsdetektorer baserade på principen om multivinklad ljusspridning (MALS)26,27, Dynamic Light Scattering (DLS) 28,29,ellertill och med en kombination av båda för att få ytterligare forminformation30,31. Men eftersom retentionsbeteendet hos ett prov i en FFF-kanal i allmänhet styrs av väldefinierade fysiska krafter, kan storleken också beräknas med hjälp av ett matematiskt tillvägagångssätt (FFF-teori), där en enkel koncentrationsdetektor (t.ex. en UV-vis-detektor) är tillräcklig för att indikera närvaron av ett eluterande prov32,33.
Som ett tredje alternativ rapporterar vi här tillämpningen av en extern storlekskalibrering34,35 med väldefinierade AuNP-standarder i storleksintervallet 20-100 nm för storlek av ett okänt guldnanopartiklarprov i suspension med AF4 i kombination med UV-vis-detektion. Denna enkla experimentella inställning valdes med flit för att så många laboratorier som möjligt skulle kunna ansluta sig till en internationell interlaboratorisk jämförelse (ILC), som senare utfördes inom ramen för Europaparlamentets Horisont 2020-projekt ACEnano baserat på det protokoll som presenteras här.
Protocol
1. AF4-systeminställning
- Montera AF4-patronen och anslut alla hårdvarukomponenter i AF4-systemet och UV-vis-detektorn(Table of Materials)enligt instruktionerna i tillverkarens handbok.
- Installera alla nödvändiga programvarupaket för kontroll, datainsamling, bearbetning och utvärdering enligt instruktionerna i tillverkarens handbok.
- Se till att alla nödvändiga signalanslutningar mellan AF4-systemet och UV-vis-detektorn har upprättats.
- Se till att de etablerade AF4-UV-vis-anslutningarna är täta och utan läckage genom att spola installationen med ultrapurevatten (UPW) i 15 min (spetsflödeshastighet 1 mL▼min-1,fokusflödeshastighet 1 mL▼min-1och tvärflödeshastighet 1,5 mL▼min-1). För att göra det, öppna AF4-kontrollprogramvaran och ange flödeshastigheterna i respektive paneler till höger på målsidans övre sida. Dra åt respektive kontakter (kopplingar), om det behövs, och upprepa proceduren tills inga läckage kan observeras.
OBS: Det interna systemtrycket under alla mätningar bör övervakas och måste ligga inom 4 till 12 bar. Om trycket är högre eller lägre måste backpressureslangen justeras. Dessutom bör kanaltryckstrenden vara konstant under hela mättiden.
OBS: Om en kanalugn är tillgänglig ställer du in temperaturen på 25 °C för att säkerställa jämförbara mätförhållanden under alla AF4-experiment.
2. Utarbetande av lösningar och suspensioner för AF4-UV-vis-systemkvalificering och provanalys
- Rengöringslösning
- Tillsätt 8 g fast natriumhydroxid (NaOH) och 2 g natriumddecylsulfat (SDS) till 1 L UPW och rör om lösningen tills total upplösning.
- Elueringslösning
- Tillsätt 500 μL filtrerad tensidblandning till 2 L filtrerad och avgasad UPW för att erhålla eluenten (0,025% (v/v), pH runt 9,4).
OBS: En detaljerad beskrivning av föreningarna i tensidblandningen ges i tabell 1 (även materialförteckning ).
- Tillsätt 500 μL filtrerad tensidblandning till 2 L filtrerad och avgasad UPW för att erhålla eluenten (0,025% (v/v), pH runt 9,4).
- Godtycklig AuNP-storleksstandard för massåterställningsbestämning
- Virvel en godtycklig AuNP storlek standard (50 mg▼L-1)för 2 min och späd den 1:4 med UPW för att erhålla en slutlig masskoncentration på 12,5 mg▼L-1. Virvel i ytterligare 2 min efter utspädning för att homogenisera den erhållna suspensionen.
VARNING: Nödvändiga försiktighetsåtgärder och lämplig skyddsutrustning krävs vid arbete med kemikalier, särskilt NaOH pellets.
OBS: Det rekommenderas i allmänhet att avgasa och filtrera alla nödvändiga lösningar (förutom rengöringslösningen) med hjälp av ett 0,1 μm membranfilter (hydrofil PVDF eller liknande) för att säkerställa låga partikelbakgrunder under AF4-UV-vis-experiment. Detta kan fastställas antingen genom en dedikerad vakuumfiltreringsenhet eller genom att använda sprutfilter.
- Virvel en godtycklig AuNP storlek standard (50 mg▼L-1)för 2 min och späd den 1:4 med UPW för att erhålla en slutlig masskoncentration på 12,5 mg▼L-1. Virvel i ytterligare 2 min efter utspädning för att homogenisera den erhållna suspensionen.
3. AF4-UV-vis systemkvalificering
- Använd de programvaruinställningar som beskrivs i steg 1.4 för att spola systemet med rengöringslösningen i 30 min (Spetsflödeshastighet 1 mL▼min-1, Fokusflöde 1 mL▼min-1och Korsflödeshastighet 1,5 mL▼min-1).
- Byt respektive eluentflaska och spola systemet med UPW i 20 min (Spetsflöde 1 mL▼min-1,Fokusflödeshastighet 1 mL▼min-1, och Korsflödeshastighet 1,5 mL▼min-1).
- Byt ut respektive inline-pumpfilter.
- Öppna AF4-patronen och byt ut AF4-membranet. Sätt ihop AF4-patronen igen och anslut den igen till AF4-UV-vis-systemet.
- Spola det rengjorda AF4-UV-vis-systemet med eluenten i minst 30 minuter för att balansera membranet och stabilisera systemet (Spetsflöde 1 mL▼min-1,Fokusflödeshastighet 1 mL▼min-1, och Korsflödeshastighet 1,5 mL▼min-1). Kontrollera om det finns potentiella läckage igen (se steg 1.4).
- Kvalificera AF4-UV-vis-systemet genom att bestämma massåterställning och variation av retentionstid med hjälp av en godtycklig AuNP-storleksstandard.
- Utför en direkt injektionskörning utan applicering av en separationskraft.
- Skapa en ny måttfil genom att öppna | Nya | Kör i AF4-kontrollprogramvaran.
- Definiera exempel- och mätbeskrivningen samt injektionsvolym och exempelnamn på fliken Kör. Mätförhållandena visas i tabell 2.
- Ställ in mätparametrarna i FFF-metoden på andra fliken enligt tabell 2.
- Klicka på knappen Kör för att starta mätningen.
- Utför en fraktioneringskörning med tillämpning av en separationskraft (korsflöde).
- Definiera bråkmetoden enligt beskrivningen i föregående avsnitt med hjälp av de bråkförhållanden som anges i tabell 3.
- Klicka på knappen Kör för att starta mätningen.
- Utför mätningen i fyrdubbelt.
OBS: Den första körningen syftar till att konditionera systemet (dvs. AF4-membranet) och kommer att uteslutas från den slutliga utvärderingen av systemets kvalificeringsresultat.
Obs: Vi rekommenderar att du sparar alla genererade körningsfiler genom att öppna | Spara i AF4-kontrollprogramvaran. - Tänk på AF4-UV-vis-systemet kvalificerat om en massåterställning på >80% och en variation av retentionstid <2% erhålls för den godtyckliga AuNP-storleksstandarden.
- När du använder en autosampler som insprutningssystem, fyll autosamplerns nåltvättbehållareflaska med samma lösning som pumpas genom AF4-UV-vis-systemet (t.ex. rengöringslösning, UPW eller respektive eluent) för att säkerställa optimala körförhållanden. Vid byte av eluent rekommenderas det i allmänhet att följa ombalanseringen av AF4-systemet genom att övervaka UV-vis-detektorsignalen tills dess baslinje förblir stabil på en konstant nivå.
- Utför en direkt injektionskörning utan applicering av en separationskraft.
4. AF4-UV-vis provanalys
- Förbered alla AuNP-storleksstandarder för kalibrering av extern storlek genom att vibrerande respektive AuNP-fjädring (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm, vardera 50 mg. L-1) i 2 min och späd det 1:4 med UPW för att erhålla en slutlig masskoncentration på 12,5 mg▼L-1. Virvel i ytterligare 2 min efter utspädning för att homogenisera de erhållna suspensionerna.
- Förbered det okända AuNP-provet för analys med samma procedur som för de kalibreringsstandarder som beskrivs i steg 4.1.
- Utför en direkt injektionsmätning av alla standarder för AuNP-storlek med af4-metoden som visas i tabell 2.
- Det gör du genom att ange respektive värden som sammanfattas i tabell 2 i tillverkarens programvara på lämpliga positioner för att definiera separations- och exempelparametrarna och trycka på körknappen för att starta experimentet.
- Fraktionera varje AuNP-storleksstandard individuellt med af4-metoden som visas i tabell 3 för att fastställa kalibreringsfunktionen för extern storlek.
- Ange respektive värden som sammanfattas i tabell 3 i tillverkarens programvara på lämpliga positioner. Fraktioneringsmetoden definieras av ett fokuseringssteg, flera elueringssteg och ett sköljsteg. När du har konfigurerat metoden trycker du på körknappen för att starta experimentet.
- Utför en direkt injektionsmätning av det okända AuNP-provet med af4-metoden som visas i tabell 2.
- Utför fraktionering av det okända AuNP-provet genom att utföra AF4-metoden i tabell 3.
- Utför alla mätningar som nämns i avsnitt 3 och 4 i tre exemplar om inte annat anges för att säkerställa meningsfulla och statistiskt relevanta resultat.
- Förvara 50 mg▼L-1 AuNP lagerupphängningar vid 4–8 °C före användning. Utspädda AuNP-suspensioner bereds helst inom 30 minuter före applicering.
OBS: Virvel är vanligtvis tillräckligt och ingen ultraljudsbehandling av suspensionerna är nödvändig. - För att möjliggöra en korrelation mellan retentionstiden för det okända AuNP-provet och de lagringstider som erhållits för AuNP-storleksstandarderna, mät alla prover med samma AF4-metod.
OBS: För att säkerställa konstanta och giltiga separationsförhållanden, inkludera/upprepa det fraktioneringssteg som beskrivs i avsnittet om systemkvalificering (se steg 3.6.2) efter ett definierat antal provmätningar (t.ex. 10 mätningar). Dessutom registrerar systemtryck och UV-vis-detektorns baslinjestabilitet. De bör förbli stabila och konstanta längs en komplett AF4-UV-vis-körning.
OBS: Byt vanligtvis ut ultrafiltreringsmembranet när UV-vis-detektorn (eller MALS-detektorn (Multi Angle Light Scattering), om sådan finns) visar en ökad ljudnivå eller de definierade systemkvalifikationskriterierna som återhämtning, provtoppform eller repeterbarhet missas (eller AF4-UV-vis-systemet utsattes för ett grundligt rengöringsförfarande). Under de förhållanden som beskrivs här är det kvalificerade AF4-UV-vis-systemet vanligtvis stabilt för minst 50 mätningar med samma membran; Antalet möjliga på varandra följande mätningar som uppfyller de definierade kvalitetskriterierna kan dock variera avsevärt beroende på prov, provmatris och eluentkomposition.
- Förvara 50 mg▼L-1 AuNP lagerupphängningar vid 4–8 °C före användning. Utspädda AuNP-suspensioner bereds helst inom 30 minuter före applicering.
5. Utvärdering av uppgifter
- Utför massåterställningsberäkningen med hjälp av antingen datautvärderingsprogram som tillhandahålls av AF4-UV-vis-systemtillverkaren eller kalkylbladsanalysen efter export av alla nödvändiga rådata (dvs. UV-vis toppområde) från respektive programvara för datainsamling enligt instruktionerna i tillverkarens handbok.
- Beräkna aunp-massåtervinningen genom att jämföra områdena under respektive UV-vis-toppar i fraktioneringsmätningen(A-fraktionering)och direktinsprutningsmätningen (Adirektinjektion)med hjälp av följande ekvation:
OBS: Under en direkt injektionsmätning appliceras ingen separationskraft, och därför kan potentiella interaktioner mellan en analytart och ackumuleringsväggen försummas. Området under en respektive UV-vis-topp kan direkt korreleras till AuNP-massan med Beer-Lambert-lagen förutsatt att inga andra arter i provet absorberar vid respektive våglängd och/eller i) eluerar vid en annan retentionstid under fraktioneringsförhållanden ii) avlägsnas genom AF4-membranet. - Importera dat.-filerna som erhållits från både direktinjektionen och fraktioneringskörningen.
- Välj UV-vis-detektorspårningen på fliken Översikt.
- Definiera en intresseregion (ROI) och en baslinje i signal- och baslinjevyn för alla mätningar.
- Sätt in en direktinsprutningskalibrering via skär.
- Välj alla direkta injektionskörningar i vyn Inställningar för direktinsprutning och ange en UV-utdöendeskoefficient.
OBS: Det är viktigt att använda samma UV-vis utrotningskoefficient för både kalibreringen och fraktioneringsmätningen. - Upprätta kalibreringslinjen med hjälp av området under UV-vis-signalspåren i AVKASTNINGEN och den injicerade mängden beräknad från den angivna koncentrationen och injektionsvolymen. Den erhållna kalibreringen visas i det separata fönstret För direktinsprutningskalibreringsfunktion.
- Tilldela kalibreringsfunktionen till respektive fraktioneringsmätningar.
OBS: För varje kalibreringsstorleksstandard och det okända AuNP-provet måste en separat kalibreringsfunktion upprättas på grund av AuNP:s storleksberoende UV-vis-absorbans. Denna nackdel med UV-vis-detektorn kan kringgås med hjälp av en masskänslig detektor som en ICP-MS. - Utför analyserna genom att infoga en beräkning av kvantitativa resultat så visas resultaten i en tabell till höger som koncentrations- och injicerade mängdvärden.
- Beräkna aunp-massåtervinningen genom att jämföra områdena under respektive UV-vis-toppar i fraktioneringsmätningen(A-fraktionering)och direktinsprutningsmätningen (Adirektinjektion)med hjälp av följande ekvation:
- Beräkna variationen i retentionstiden med hjälp av antingen datautvärderingsprogram som tillhandahålls av AF4-systemtillverkaren eller kalkylbladsanalysen efter export av alla nödvändiga rådata (dvs. lagringstider för AuNP-kalibreringsstandarderna vid respektive UV-vis-topp maxima och respektive ogiltiga tider) från respektive programvara för datainsamling enligt instruktionerna i tillverkarens handbok.
- Öppna översiktsfönstret för att visa respektive UV-spår för alla importerade mätningar.
- Toppidentifieringen utförs automatiskt. justera toppdetekteringsparametrarna i signalbearbetningsverktygslådan för att optimera prestandan. Extrahera respektive topp maxima genom att gå igenom alla mätfiler.
- Beräkna den relativa standardavvikelsen för alla mätningar med hjälp av följande ekvation:
Beräkningen kan också utföras med hjälp av ett respektive kalkylbladsprogram.
- Utför storleksbestämning med hjälp av antingen datautvärderingsprogram som tillhandahålls av tillverkaren eller kalkylbladsanalys efter export av alla nödvändiga rådata (retentionstid vid UV-vis-topp maximalt analyt och respektive ogiltigtid) från respektive programvara för dataförvärv enligt instruktionerna i tillverkarens handbok. En kalibreringsfunktion för extern storlek kan fastställas genom att fastställa de korrigerade retentionstiderna för ogiltigtid (nettoretentionstider, se tabell 5) i AuNP-storleksstandarderna (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) mot deras hydrodynamiska storlekar som erhållits från tidigare utförda DLS-mätningar (se tabell 4).
OBS: DLS-mätningarna bör utföras idealiskt samma dag som respektive fraktioneringsmätningar för att säkerställa jämförbara provegenskaper.- När du har .dat filerna visas alla mått på fliken Översikt. Välj UV-vis-detektorsignalen från detektorlistan, som visas under överläggsfönstret. Definiera en ROI och baslinje för varje mått, som kan justeras i signal- och baslinjevyn. Använd signalbearbetningsverktygslådan till höger för att jämna ut bullriga signaler. Använd funktionen Tilldela bearbetningsparametrar till andra körningar för att tillåta att parametrarna allokeras till andra mätningar respektive signaler.
- Välj kalibrering av partikelstorlek på fliken Infoga.
- Välj alla kalibreringskörningar genom att klicka på respektive mått i tabellen Välj referenser för kalibrering längst upp till höger. Alla valda mått visas i en tabell nedan. Ange den hydrodynamiska radien för alla kalibreringsmätningar som anges i tabell 4. Funktionen visas i partikelstorlekskalibreringen – Funktionsfönstret och ekvationen visas också.
OBS: Korrelationskoefficienten (R2)för den etablerade storlekskalibreringsfunktionen måste ≥0.990. - Tilldela kalibreringsfunktionen till mätningarna av det okända AuNP-exemplet genom att välja respektive fraktioner i listan Välj körningar för tilldelning.
- Visa resultaten genom att öppna en beräkning av partikelstorleksfördelningen på fliken Infoga. Den tidigare skapade partikelstorlekskalibreringen listas som kalibrering för de okända AuNP-provmätningarna, som visas i rätt fönsterinställningar. Den beräknade storleken visas i storleksfördelningsfönstret som är märkt till maximalt topp. Markera kryssrutan Genomsnittliga signaler för prov om du vill medelvärdet av alla mätningar av ett exempel och ange resultatet i den maximala toppetiketten.
- Rita dessutom kalibreringslinjen över fraktogrammet genom att markera kryssrutan Visa kalibreringskurva. En kumulativ storleksfördelning är tillgänglig genom att markera kryssrutan Visa ackumulerad distribution.
OBS: När du använder tillverkarens programvara för datautvärdering rekommenderas att lägga till alla resultat i en rapport, som kan genereras genom att klicka på Rapportera på fliken Infoga. Knappen Rapport lägger till alla resultat, tabeller och diagram i ett dokument. Under fliken Rapport kan rapportinställningarna ändras genom att öppna rapportinställningarna i avsnittet Dokument.
Representative Results
För det första fraktionerades AuNP-storleksstandarderna av AF4 och upptäcktes av UV-vis som mätte AuNP:s absorbans vid en våglängd på 532 nm (aunp:s ytplasmonsonans). Ett överlägg av de erhållna fraktogrammen presenteras i figur 1. Retentionstiderna för varje AuNP vid dess respektive UV-vis-topp som erhålls vid triplicatemätningar anges i tabell 5. Den relativa standardavvikelsen för alla retentionstider var under 1,1% med en minskande mätavvikelse med ökande storlek. Sammantaget uppnåddes en utmärkt repeterbarhet. En konstant separation kraft tillämpades, vilket resulterade i ett linjärt förhållande av eluering tid och hydrodynamisk storlek. Kalibreringslinjen för extern storlek fastställdes genom att den angivna hydrodynamiska radien ritades mot den korrigerade elueringstiden (nettoretentionstid). En linjär regressionsanalys resulterade i en linjär kalibreringsfunktion med en intercept a = -3,373 nm ± 1,716 nm och en lutning b = 1,209 nm▼min-1 ± 0,055 nm▼min-1. Elutions linjära beteende bekräftades med en kvadratisk korrelationskoefficient R2 av 0,9958. Respektive kalibreringsfunktion visas visuellt i figur 2.
Den andra delen handlade om analysen av det okända AuNP-provet. Tre alikvoter av provet utarbetades i enlighet med förfarandet i protokollavsnittet(avsnitt 4.2). Var och en av de tre alikvoterna undersöktes i tre exemplar med samma AF4-fraktioneringsmetod som också tillämpades för AuNP-storleksstandarderna. Alla de nio AF4-UV-vis-fraktogram som erhölls från det okända AuNP-provet presenteras i figur 3 och deras respektive utvärderingar sammanfattas i tabell 6. Den relativa standardavvikelsen för respektive retentionstid var signifikant låg och varierade mellan 0,1% och 0,5%. Med hjälp av kalibreringsfunktionen för partikelstorlek som erhålls genom fraktionering av AuNP-storleksstandarderna och korrelera den med de erhållna retentionstiderna för det okända AuNP-provet vid UV-vis-toppen maximalt, kan en total genomsnittlig hydrodynamisk radie på 29,4 nm ± 0,2 nm beräknas. Dessutom erhölls en rimlig massåtervinning på 83,1% ± 1,2% som inte indikerar någon signifikant tätbebyggelse eller upplösning av AuNP-provet eller betydande adsorption av partiklar på membranytan. Figur 4 visar den erhållna partikelstorleksfördelningen med alla nio UV-vis-signalspår som i genomsnitt belyser den tillämpade AF4-metodens utmärkta robusthet.
Figur 1: AF4-UV-vis fraktogram erhållna från trelicatanalys av de fyra individuella kalibreringsstandarderna i AuNP-storlek med normaliserade signalintensiteter och applicerad konstant tvärflödeshastighet (svart linje). Tomrumstoppen markeras i grått på cirka 5,9 min. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Erhållna kalibreringsfunktionen för extern storlek, inklusive felstaplar som härrör från respektive standardavvikelser iDLS-mätningarna (tabell 4)och avvikelser i de erhållna AF4-retentionstiderna(tabell 5), efter att ha ritat den angivna hydrodynamiska radien mot retentionstiden för varje enskild kalibreringsstandard för AuNP-storlek vid dess respektive högsta maximum. En linjär kalibreringsfunktion med standardfel i form av y = a + bx med a = -3,373 nm ± 1,716 nm och b = 1,209 nm·min-1 ± 0,055 nm·min-1 beräknades från en linjär regressionsanalys. En kvadratisk korrelationskoefficient med R2 = 0,9958 fastställdes, vilket indikerar ett linjärt förhållande. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: AF4-UV-vis fractograms av tre alikvoter som visar den okända AuNP. Det applicerade konstanta korsflödet under mättiden illustreras som en svart linje. Tomrumstoppen på cirka 5,9 min markeras i grått. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Överlagring av den erhållna genomsnittliga partikelstorleksfördelningen (röd) av det okända AuNP-provet och den applicerade linjära kalibreringsfunktionen (prickad linje). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Komponent | CAS-nr | Vikt (%) | |
| Vatten | 7732-18-5 | 88.8 | |
| 9-Octadecenoic syra (Z)-, förening med 2,2',2'-nitrilotris[etanol](1:1) | 2717-15-9 | 3.8 | |
| Natriumkarbonat | 497-19-8 | 2.7 | |
| Alkoholer, C12-14-sekundära, etoxylaterade | 84133-50-6 | 1.8 | |
| Tetranatrium EDTA | 64-02-8 | 1.4 | |
| Polyetylenglykol | 25322-68-3 | 0.9 | |
| Natriumoleat | 143-19-1 | 0.5 | |
| Natriumbikarbonat | 144-55-8 | 0.1 | |
Tabell 1: Lista över komponenterna i den tensidblandning som används för att förbereda eluenten (se även Materialförteckning ).
| AF4-UV-vis parametrar | Enhet | Värde |
| Distanstjocklek | Μm | 350 |
| Detektorns flöde | mL min-1 | 0.5 |
| Korsflöde | mL min-1 | 0 (konstant i 8 min) |
| Fokusflödeshastighet | mL min-1 | 0 |
| Fördröjningstid/stabiliseringstid | Min | 0 |
| Injektionsflöde | mL min-1 | 0.5 |
| Övergångstid | Min | 0 |
| Injektionstid | Min | 0.1 |
| Elution steg | Min | 8 |
| Skölj stegtid | Min | 0.1 |
| Skölj stegflödet | mL min-1 | 0.1 |
| Injektionsvolym | Μl | 10 |
| Provkoncentration | mg L-1 | 12.5 |
| Membrantyp | Regenererad cellulosa | |
| Membran molekylvikt cut-off | Kda | 10 |
| Elueringslösning | 0.025% (v/v) tensidblandning | |
| UV-vis våglängd | Nm | 532 |
| UV-vis känslighet | - | 0.001 |
Tabell 2: Sammanfattning av parametrarna för AF4-UV-vis-fraktioneringsmetoden för att utföra direktinsprutningskörning utan applicering av en separationskraft.
| AF4-UV-vis parametrar | Enhet | Värde |
| Distanstjocklek | Μm | 350 |
| Detektorns flöde | mL min-1 | 0.5 |
| Korsflöde | mL min-1 | 1 (60 min konstant, 10 min linjär) |
| Fokusflödeshastighet | mL min-1 | 1.3 |
| Fördröjningstid/stabiliseringstid | Min | 2 |
| Injektionsflöde | mL min-1 | 0.2 |
| Övergångstid | Min | 0.2 |
| Injektionstid | Min | 5 |
| Elution steg | Min | 70 (60 min konstant, 10 min linjär) |
| Skölj steg | Min | 9 |
| Skölj stegflödet | mL min-1 | 0.5 |
| Injektionsvolym | Μl | 50 |
| Provkoncentration | mg L-1 | 12.5 |
| Membrantyp | Regenererad cellulosa | |
| Membran molekylvikt cut-off | Kda | 10 |
| Elueringslösning | 0.025% (v/v) tensidblandning | |
| UV-vis våglängd | Nm | 532 |
| UV-vis känslighet | - | 0.001 |
Tabell 3: Sammanfattning av parametrarna för AF4-UV-vis-fraktioneringsmetoden för att utföra fraktioneringskörningen med tillämpning av ett korsflöde som separationskraft.
| Kalibreringsstandard | Capping agent | Medelstorlek (TEM) (nm) | CV (medelstorlek TEM) (%) | Zeta potential (mV) | SD (zetapotential) (mV) | Hydrodynamisk radie (DLS) (nm) | SD (hydrodynamisk radie) (nm) | Pdi | SD (PDI) |
| AuNP 20 nm | Citrat | 20.1 | ≤ 8 | -48.9 | 1.5 | 10.95 | 0.12 | 0.082 | 0.009 |
| AuNP 40 nm | Citrat | 40.8 | ≤ 8 | -30.4 | 1.0 | 20.30 | 0.13 | 0.127 | 0.006 |
| AuNP 80 nm | Citrat | 79.2 | ≤ 8 | -51.5 | 1.3 | 38.85 | 0.23 | 0.138 | 0.013 |
| AuNP 100 nm | Citrat | 102.2 | ≤ 8 | -50.9 | 0.9 | 52.30 | 0.37 | 0.078 | 0.009 |
Tabell 4: Sammanfattning av de fysikalisk-kemiska parametrarna i de tillämpade AuNP-kalibreringsstandarderna, inklusive kapningsmedel, TEM-medelstorlek, Zeta-potential som bestäms i den ursprungliga suspensionen samt DLS hydrodynamiska radie och polydispersitetsindex (PDI) som bestäms i eluenten.
| Kalibreringsstandard | Köra | Retentionstid vid maximalt topp (min) | Nettoretentionstid vid maximalt topp (min) | Genomsnittlig nettoretentionstid (min) | SD (%) (netto kvarhållningstid) | SD (min) (netto kvarhållningstid) |
| AuNP 20 nm | 1 | 17.368 | 11.468 | 11.56 | 1.02 | 0.12 |
| 2 | 17.409 | 11.509 | ||||
| 3 | 17.589 | 11.689 | ||||
| AuNP 40 nm | 1 | 25.316 | 19.416 | 19.49 | 0.68 | 0.13 |
| 2 | 25.32 | 19.42 | ||||
| 3 | 25.548 | 19.648 | ||||
| AuNP 80 nm | 1 | 42.095 | 36.195 | 36.29 | 0.23 | 0.08 |
| 2 | 42.219 | 36.319 | ||||
| 3 | 42.257 | 36.357 | ||||
| AuNP 100 nm | 1 | 50.975 | 45.075 | 45.06 | 0.07 | 0.03 |
| 2 | 50.924 | 45.024 | ||||
| 3 | 50.986 | 45.086 |
Tabell 5: Retentionstider för AuNP-kalibreringsstandarderna vid respektive UV-Vis-topp som härrör från respektive AF4-UV-vis-fraktogram med den metod som beskrivs i tabell 3.
| Aliquote (aliquote) | Köra | Maximal retentionstid (min) | Genomsnittlig retentionstid vid maximalt toppvärde (min) | Nettoretentionstid vid maximalt topp (min) | SD (%) lagringstid | Hydrodynamisk radie (nm) | Återhämtning (%) |
| 1 | 1 | 32.689 | 32.70 | 26.789 | 0.07 | 29.03 | 85.34 |
| 2 | 32.687 | 26.787 | |||||
| 3 | 32.719 | 26.819 | |||||
| 2 | 1 | 32.989 | 33.08 | 27.089 | 0.37 | 29.49 | 81.73 |
| 2 | 33.073 | 27.173 | |||||
| 3 | 33.187 | 27.287 | |||||
| 3 | 1 | 33.053 | 33.14 | 27.153 | 0.49 | 29.56 | 82.14 |
| 2 | 33.071 | 27.171 | |||||
| 3 | 33.291 | 27.391 |
Tabell 6: Sammanfattning av retentionstiderna vid respektive maximal UV-Vis-topp, den hydrodynamiska radien beräknad utifrån den yttre storlekskalibreringen (figur 2) och återvinningshastigheten för det okända AuNP-provet som erhållits från AF4-UV-vis-analysen.
Discussion
Den hydrodynamiska storleken på en okänd AuNP bedömdes noggrant av AF4 tillsammans med en UV-vis-detektor med väldefinierade AuNP-storleksstandarder som sträcker sig från 20 nm till 100 nm. Den utvecklade AF4-metoden optimerades med hjälp av en konstant tvärflödesprofil för att upprätta ett linjärt samband mellan uppmätt retentionstid och AuNP-storlek, vilket möjliggör en enkel storleksbestämning från linjär regressionsanalys. Särskilt fokus låg också på att uppnå tillräckligt höga återvinningsgrader som inte tyder på någon betydande provförlust under fraktionering, och att den utvecklade AF4-metoden, inklusive den applicerade eluenten och membranet matchade väl med alla fraktionerade AuNP-prover.
Metodutveckling är utan tvekan det mest kritiska steget i AF4 och flera parametrar, inklusive kanaldimensioner, flödesparametrar samt eluent, membran, distanshöjd och till och med provegenskaper måste beaktas för att förbättra fraktionering inom ett givet elueringstidsfönster. Syftet med det här stycket är att vägleda läsaren genom de kritiska steg som optimerades för att framgångsrikt bestämma storleken på det okända AuNP-exemplet som diskuteras här. För en mer detaljerad beskrivning av hur man generellt utvecklar en AF4-metod hänvisas läsaren till AF4-avsnittet "ISO/TS21362:2018 - Nanoteknik - Analys av nanoobjekt med asymmetriskt flöde och centrifugalfältflödesfraktion"25. Med en närmare titt på de tillämpade fraktioneringsförhållandena i tabell 3är det första kritiska steget införandet och avslappningen av AuNP-provet i AF4-kanalen. Detta steg styrs av injektionsflödet, fokusflödet och korsflödet, vars samspel tvingar provet att lokalisera nära membranytan och koncentrera det i ett smalt band nära insprutningsporten på AF4-kanalen som i princip definierar fraktioneringens startpunkt. En tillräcklig avslappning av provet är obligatorisk eftersom provbeståndsdelar av olika storlekar under detta steg lokaliserar i olika höjder på AF4-kanalen och därigenom utgör grunden för en framgångsrik storleksfraktion. Ofullständig provavslappning är vanligtvis synlig genom ett ökat tomrum toppområde som härrör från oreda (dvs. icke-avslappnade) provbeståndsdelar. Denna effekt kan mildras genom att öka injektionstiden och/eller det applicerade korsflödet. Båda parametrarna behöver dock noggrann optimering, särskilt för prover som är benägna att tätbebyggelse och adsorption på AF4-membranet, och kan övervakas av respektive återvinningsgrad som erhållits för olikaparameterinställningar 36,37. Den applicerade injektionstiden på 5 min tillsammans med ett korsflöde på 1,0 mL▼min-1 visade återvinningshastigheter >80% för alla AuNP-prover och ett försumbart tomrum toppområde som indikerar nästan optimala avslappningsförhållanden. Efter tillräcklig avslappning av AuNP-provet stoppades fokusflödet och provtransport längs AF4-kanallängden till respektive UV-vis-detektor initierades som representerar det andra kritiska steget. För att säkerställa tillräckligt hög fraktioneringseffekt vid rimliga analystider tillämpades en konstant tvärflödeshastighet på1,0 mL▼min -1 i 30–50 min (beroende på respektive fraktionerad AuNP-storleksstandard) följt av ett 10 minuters linjärt korsflödesförfall med en detektorflödeshastighet på 0,5 mL.min-1. Med hjälp av en konstant korsflödesprofil över separationen av alla Standarder för AuNP-storlek visade ett linjärt samband mellan retentionstid och AuNP-storlek efter FFF-teori22, vilket möjliggör storleksbestämning av det okända AuNP-provet genom enkel linjär regressionsanalys. Men andra profiler än ett konstant korsflöde har också utnyttjats för storleksstorlek av nanopartiklar, vilket i slutändan leder till ett icke-linjärt förhållande mellan retentionstid ochpartikelstorlek 38,39. Dessutom är storleksbestämning i AF4 med hjälp av väldefinierade storleksstandarder inte begränsad till AuNP, utan kan också tillämpas på nanopartiklar med andra storlekar och elementär sammansättning (t.ex. silver38,40 eller kiseldioxidnanopartiklar41,42). Dessutom, när man arbetar med utspädda prover, är ICP-MS en mycket känslig elementär detektor, som kan kopplas till AF4, vilket ökar mångsidigheten i denna analytiska metod för dimensionering av ett stort antal nanopartiklar i suspension.
Trots sin utbredda tillämpning har kalibrering av extern storlek med väldefinierade storleksstandarder i AF4 vissa särdrag som måste beaktas när man använder den för korrekt storlek av okända prover. För det första är den starkt beroende av tillämpningen av jämförbara villkor under fraktionering av respektive storleksnormer och det faktiska urvalet. I det fall som presenteras här är det därför obligatoriskt att både AuNP-storleksstandarderna och det okända AuNP-provet fraktioneras med samma AF4-metod samt samma eluent och samma membran vilket gör detta tillvägagångssätt ganska oflexibelt. Eftersom det inte finns några storlekskänsliga detektorer, t.ex. Detta gäller särskilt för okända prover som uppvisar mycket breda storleksfördelningar, där det fortfarande är oklart om alla provbeståndsdelar följer det normala elueringsmönstret: fraktionering från mindre till större partiklar, eller om större provbeståndsdelar redan eluerar i steriskt hyperlagerläge och därmed potentiellt co-eluting med mindreprovbeståndsdelar 43,44. Dessutom har även om FFF-teorin betonar att AF4 separerar enbart baserat på skillnader i hydrodynamisk storlek med partiklar som betraktas som punktmassor utan några interaktioner med deras miljö22, kan verkligheten spela en annan historia med partikel-partikel- och partikelmembraninteraktioner (såsom elektrostatisk attraktion / repulsion eller van-der-Waals-attraktion) spela en betydande roll och kan potentiellt införa en mätbar partiskhet i storleksbestämningar via extern storlekskalibrering45,46. Det rekommenderas därför att använda storleksstandarder som idealiskt matchar sammansättningen och ytegenskaperna (Zeta-potentialen) hos den partikel som är av intresse40,42 eller, Om dessa inte är tillgängliga, använd åtminstone väl karakteriserade partikelstorleksstandarder (t.ex. polystyren latexpartiklar) och noggrant utvärdera deras jämförbarhet med den intressepartikel som är särskilt när det gäller deras yta Zeta potential i respektive miljö, där analysen ska utföras41,47.
Mångsidigheten hos AF4 anses ofta vara dess största styrka, eftersom den erbjuder ett applikationsintervall som går utöver de flesta andra vanliga storlekstekniker inom detta område22,48,49. Samtidigt, på grund av dess associerade förmodligen komplexitet, kan det också betraktas som dess mest betydande nackdel, särskilt mot snabba och skenbart lättanvända storlekstekniker som DLS, Nanopartikelspårningsanalys eller enstaka partikel ICP-MS. Men när AF4 sätts i perspektiv med dessa populära storlekstekniker blir det tydligt att alla tekniker har sina för- och nackdelar, men alla bidrar till en mer omfattande förståelse för nanopartiklarnas fysikalisk-kemiska karaktär och bör därför betraktas som komplementära snarare än konkurrenskraftiga.
Standarddriftsförfarandet (SOP) som presenteras här belyser af4-UV-vis utmärkt tillämplighet med extern storlekskalibrering för storleksändring av ett okänt AuNP-prov i suspension och tillämpades så småningom som en rekommenderad riktlinje för AF4-analys av ett okänt AuNP-prov inom en internationell interlaboratorisk jämförelse (ILC) som genomfördes inom ramen för Horizon 2020-projektet, ACEnano (resultatet av detta ILC kommer att bli föremål för en framtida publikation). Detta protokoll bidrar därför till de uppmuntrande och pågående internationella ansträngningarna för att validera och standardisera AF4-metoderna25,50,51,52 som understryker AF4:s lovande potential på området nanopartikelkarakterisering.
Disclosures
Alla författare till detta manuskript är anställda på Postnova Analytics GmbH, vars produkter används i detta protokoll.
Acknowledgments
Författarna vill tacka hela ACEnano-konsortiet för givande diskussioner i alla skeden av utarbetandet av protokollet som presenteras här. Författarna uppskattar också finansieringen från Europeiska unionens Horisont 2020-program (H2020) enligt bidragsavtal nr 720952 inom ramen för ACEnano-projektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 µm Membrane Filters (hydrophilic PVDF) | Postnova Analytics GmbH | Z-FIL-TEF-002 | Used for filtration of aqueous solutions |
| 0.22 µm PVDF Syringe Filter (d = 33 mm) | Merck Millipore | Durapore Millex | Used for filtration of NovaChem100 |
| Adjustable Volume Pipettes (1000 µL) | Eppendorf AG | Research Plus | Used to prepare diluted AuNP suspensions |
| AF4 cartridge | Postnova Analytics GmbH | AF2000 MF - AF4 Analytical Channel | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| AF4 Membrane - Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO) | Postnova Analytics GmbH | Z-AF4-MEM-612-10KD | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Analytical Balance (0.1 mg precision) | Sartorius | ENTRIS124I-1S | Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution |
| Autosampler | Postnova Analytics GmbH | PN5300 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Channel Oven | Postnova Analytics GmbH | PN4020 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Crossflow Module | Postnova Analytics GmbH | AF2000 MF Control Module | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Disposable Pipette Tips (1000 µL) | Eppendorf AG | ep T.I.P.S | Used to prepare diluted AuNP suspensions |
| Flasks (e.g. 2 liter volume) | neoLab | 1-0199 | Used for eluent storage |
| Focus Pump | Postnova Analytics GmbH | PN1131 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) | Postnova Analytics GmbH | VIA-002 | Used for sample storage |
| Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) | Postnova Analytics GmbH | NovaCal Gold | 50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function |
| Magnetic Stirrer | IKA | VIBRAX-VXR | Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW |
| Personal Computer (PC) | Dell Technologies | / | Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual |
| Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.) | / | / | In accordance with respective laboratory’s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials |
| Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) | Postnova Analytics GmbH | Z-VIA-09150868 | Used for sample storage |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), ≥99 %, Blotting Grade | Carl Roth GmbH & Co KG | 2326.1 | Used for the preparation of the cleaning solution |
| Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, ≥98 %, p.a | Carl Roth GmbH & Co KG | 6771.1 | Used for the preparation of the cleaning solution |
| Software Package for Control and Data Acquisition | Postnova Analytics GmbH | NovaFFF AF2000 Software | Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual |
| Software Package for Data Evaluation | Postnova Analytics GmbH | NovaAnalysis Software | Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual |
| Software Package for final Data Processing | OriginLab Corporation | Origin 2019 | Used for final data processing |
| Solvent Degasser | Postnova Analytics GmbH | PN7520 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Solvent Selector | Postnova Analytics GmbH | PN7310 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Solvent Organizer | Postnova Analytics GmbH | PN7140 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Surfactant Mixture | Postnova Analytics GmbH | NovaChem100 | Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation |
| Tip Pump | Postnova Analytics GmbH | PN1130 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Unknown AuNP sample | BBI Solutions | EM.GC60 | 60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function |
| UV-vis Detector | Postnova Analytics GmbH | PN3211 | UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system |
| Vacuum Filtration Unit | Postnova Analytics GmbH | Eluent Filtration System | Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions |
| Vortex | IKA | Vortex Genie 2 | Used for homogenization of diluted AuNP suspensions |
| Water Purification System | Merck Millipore | Milli-Q Integral 5 | Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 MΩcm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions |
References
- Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Gold nanoparticles in biology and medicine: recent advances and prospects. Acta Naturae. 3 (2), 34-55 (2011).
- Wagner, F. E., et al. Before striking gold in gold-ruby glass. Nature. 407 (6805), 691-692 (2000).
- Hunt, L. B. The true story of Purple of Cassius. Gold Bulletin. 9 (4), 134-139 (1976).
- Higby, G. J. Gold in medicine. Gold Bulletin. 15 (4), 130-140 (1982).
- Faraday, M. X. The Bakerian Lecture. -Experimental relations of gold (and other metals) to light. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 147, 145-181 (1857).
- Borries, B. v, Kausche, G. A. Übermikroskopische Bestimmung der Form und Größenverteilung von Goldkolloiden. Kolloid-Zeitschrift. 90 (2), 132-141 (1940).
- Turkevich, J., Hillier, J. Electron Microscopy of Colloidal Systems. Analytical Chemistry. 21 (4), 475-485 (1949).
- Homberger, M., Simon, U. On the application potential of gold nanoparticles in nanoelectronics and biomedicine. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical, and Engineering Sciences. 368 (1915), 1405-1453 (2010).
- Cordeiro, M., Ferreira Carlos, F., Pedrosa, P., Lopez, A., Baptista, P. V. Gold Nanoparticles for Diagnostics: Advances towards Points of Care. Diagnostics. 6 (4), Basel, Switzerland. 43 (2016).
- Vines, J. B., Yoon, J. H., Ryu, N. E., Lim, D. J., Park, H. Gold Nanoparticles for Photothermal Cancer Therapy. Frontiers in Chemistry. 7, 167 (2019).
- Dreaden, E. C., Austin, L. A., Mackey, M. A., El-Sayed, M. A. Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery. Therapeutic Delivery. 3 (4), 457-478 (2012).
- Safh, B. P., Antosh, M. Effect of size on gold nanoparticles in radiation therapy: Uptake and survival effects. Journal of Nanomedicine. 2 (1), 1013-1020 (2019).
- Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of size and concentration of gold nanoparticles from UV-Vis spectra. Analytical Chemistry. 79 (11), 4215-4221 (2007).
- Zheng, T., Bott, S., Huo, Q. Techniques for accurate sizing of gold nanoparticles using dynamic light scattering with particular application to chemical and biological sensing based on aggregate formation. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (33), 21585-21594 (2016).
- Liu, J., Murphy, K. E., MacCuspie, R. I., Winchester, M. R. Capabilities of single particle inductively coupled plasma mass spectrometry for the size measurement of nanoparticles: a case study on gold nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (7), 3405-3414 (2014).
- Contado, C., Argazzi, R. Size sorting of citrate reduced gold nanoparticles by sedimentation field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1216 (52), 9088-9098 (2009).
- Calzolai, L., Gilliland, D., Garcìa, C. P., Rossi, F. Separation and characterization of gold nanoparticle mixtures by flow-field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1218 (27), 4234-4239 (2011).
- Schmidt, B., et al. Quantitative characterization of gold nanoparticles by field-flow fractionation coupled online with light scattering detection and inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (7), 2461-2468 (2011).
- Mekprayoon, S., Siripinyanond, A. Performance evaluation of flow field-flow fractionation and electrothermal atomic absorption spectrometry for size characterization of gold nanoparticles. Journal of Chromatography. A. , (2019).
- López-Sanz, S., Rodríguez Fariñas, N., Zougagh, M., Rios, A., Rodriguez Martín-Doimeadios, R. C. C. AF4-ICP-MS as a powerful tool for the separation of gold nanorods and nanospheres. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. , Advance Article (2020).
- Giddings, C. J. A new separation concept based on a coupling of concentration and flow nonuniformities. Separation Science. 1 (1), 123-125 (1966).
- Schimpf, M. E., Caldwell, K., Giddings, J. C. Field-flow fractionation handbook. , Wiley-Interscience. (2000).
- Contado, C. Field flow fractionation techniques to explore the "nano-world". Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (10), 2501-2518 (2017).
- Wahlund, K. G., Giddings, J. C. Properties of an asymmetrical flow field-flow fractionation channel having one permeable wall. Analytical Chemistry. 59 (9), 1332-1339 (1987).
- ISO. ISO /TS 21362:2018 Nanotechnologies - of nano-objects using asymmetrical-flow and centrifugal field-flow fractionation. ISO. , (2018).
- Gogos, A., Kaegi, R., Zenobi, R., Bucheli, T. D. Capabilities of asymmetric flow field-flow fractionation coupled to multi-angle light scattering to detect carbon nanotubes in soot and soil. Environmental Science: Nano. 6 (1), 584-594 (2014).
- Müller, D., et al. Integration of inverse supercritical fluid extraction and miniaturized asymmetrical flow field-flow fractionation for the rapid analysis of nanoparticles in sunscreens. Analytical Chemistry. 90 (5), 3189-3195 (2018).
- Capomaccio, R., et al. Gold nanoparticles increases UV and thermal stability of human serum albumin. Biointerphases. 11 (4), (2016).
- Levak, M., et al. Effect of protein corona on silver nanoparticle stabilization and ion release kinetics in artificial seawater. Environmental Science & Technology. 51 (3), 1259-1266 (2017).
- Mehn, D., et al. Larger or more? Nanoparticle characterisation methods for recognition of dimers. RSC Advances. 7 (44), 27747-27754 (2017).
- Sogne, V., Meier, F., Klein, T., Contado, C. Investigation of zinc oxide particles in cosmetic products by means of centrifugal and asymmetrical flow field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1515, 196-208 (2017).
- Cumberland, S. A., Lead, J. R. Particle size distributions of silver nanoparticles at environmentally relevant conditions. Journal of Chromatography. A. 1216 (52), 9099-9105 (2009).
- de Carsalade du pont, V., et al. Asymmetric field flow fractionation applied to the nanoparticles characterization: Study of the parameters governing the retention in the channel. International Congress of Metrology. , (2019).
- Loeschner, K., et al. Optimization and evaluation of asymmetric flow field-flow fractionation of silver nanoparticles. Journal of Chromatography. A. 1272, 116-125 (2013).
- Mudalige, T. K., Qu, H., Linder, S. W. An improved methodology of asymmetric flow field flow fractionation hyphenated with inductively coupled mass spectrometry for the determination of size distribution of gold nanoparticles in dietary supplements. Journal of Chromatography. A. 1420, 92-97 (2015).
- Dubascoux, S., Von Der Kammer, F., Le Hécho, I., Gautier, M. P., Lespes, G. Optimisation of asymmetrical flow field flow fractionation for environmental nanoparticles separation. Journal of Chromatography. A. 1206 (2), 160-165 (2008).
- Hagendorfer, H., et al. Application of an asymmetric flow field flow fractionation multi-detector approach for metallic engineered nanoparticle characterization - and limitations demonstrated on Au nanoparticles. Analytica Chimica Acta. 706 (2), 367-378 (2011).
- Geiss, O., Cascio, C., Gilliland, D., Franchini, F., Barrero-Moreno, J. Size and mass determination of silver nanoparticles in an aqueous matrix using asymmetric flow field flow fractionation coupled to inductively coupled plasma mass spectrometer and ultraviolet-visible detectors. Journal of Chromatography. A. 1321, 100-108 (2013).
- Makselon, J., Siebers, N., Meier, F., Vereecken, H., Klumpp, E. Role of rain intensity and soil colloids in the retention of surfactant-stabilized silver nanoparticles in soil. Environmental Pollution. 238, 1027-1034 (2018).
- Bolea, E., Jiménez-Lamana, J., Laborda, F., Castillo, J. R. Size characterization and quantification of silver nanoparticles by asymmetric flow field-flow fractionation coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (9), 2723-2732 (2011).
- Barahona, F., et al. Simultaneous determination of size and quantification of silica nanoparticles by asymmetric flow field-flow fractionation coupled to ICPMS using silica nanoparticles standards. Analytical Chemistry. 87 (5), 3039-3047 (2015).
- Aureli, F., D'Amato, M., Raggi, A., Cubadda, F. Quantitative characterization of silica nanoparticles by asymmetric flow field flow fractionation coupled with online multiangle light scattering and ICP-MS/MS detection. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30, 1266-1273 (2015).
- Myers, M. N., Giddings, J. C. Properties of the transition from normal to steric field-flow fractionation. Analytical Chemistry. 54 (13), 2284-2289 (1982).
- Giddings, J. C. Retention (steric) inversion in field-flow fractionation: practical implications in particle size, density and shape analysis. Analyst. 118 (12), 1487-1494 (1993).
- Wahlund, K. G. Flow field-flow fractionation: Critical overview. Journal of Chromatography. A. 1287, 97-112 (2013).
- Bendixen, N. L., Adlhart, S., Lattuada, C., Ulrich, A. Membrane-particle interactions in an asymmetric flow field flow fractionation channel studied with titanium dioxide nanoparticles. Journal of Chromatography A. 1334, 92-100 (2014).
- Qu, H., Quevedo, I. R., Linder, S. W., Fong, A., Mudalige, T. K. Importance of material matching in the calibration of asymmetric flow field-flow fractionation: material specificity and nanoparticle surface coating effects on retention time. Journal of Nanoparticle Research. 18 (10), 292 (2016).
- Giddings, J. C. Field-flow fractionation: analysis of macromolecular, colloidal, and particulate materials. Science. 260 (5113), 1456-1465 (1993).
- Cascio, C., Gilliland, D., Rossi, F., Calzolai, L., Contado, C. Critical experimental evaluation of key methods to detect, size and quantify nanoparticulate silver. Analytical Chemistry. 86 (24), 12143-12151 (2014).
- Caputo, F., et al. Measuring particle size distribution by asymmetric flow field flow fractionation: a powerful method for the pre-clinical characterisation of lipid-based nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 756-767 (2019).
- Parot, J., Caputo, F., Mehn, D., Hackley, V. A., Calzolai, L. Physical characterization of liposomal drug formulations using multi-detector asymmetrical-flow field flow fractionation. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 320, 495-510 (2020).
- ASTM. ASTM WK68060 - New Test Method for Analysis of Liposomal Drug Formulations using Multidetector Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation (AF4). ASTM. , (2019).
