Summary
Bu protokol, bilinmeyen bir altın nanopartikül örneğinin boyutunun belirlenmesi için UV-vis algılaması ile birlikte Asimetrik Akış Alanı Akış Fraksiyonu'nun kullanımını açıklar.
Abstract
Parçacık boyutu, nanopartikül kavramı ile ilişkili tartışmasız en önemli fiziko-kimyasal parametredir. Nanopartiküllerin boyut ve boyut dağılımı hakkında kesin bilgi, çeşitli uygulamalar için son derece önemlidir. Boyut aralığı, nanopartikül dozunun en "aktif" bileşenini tanımladığı için de önemlidir.
Asimetrik Akış Alanı-Akış Fraksiyonasyonu (AF4), süspansiyondaki parçacıkların yaklaşık 1–1000 nm boyut aralığında boyutlandırılması için güçlü bir tekniktir. Bir AF4 deneyinden boyut bilgisi elde etmenin birkaç yolu vardır. AF4'ü Çok Açılı Işık Saçılma veya Dinamik Işık Saçılma ilkelerine dayanan boyuta duyarlı dedektörlerle çevrimiçi olarak bağlamanın yanı sıra, iyi kurulmuş bir teorik yaklaşım (FFF teorisi) kullanarak veya iyi tanımlanmış parçacık boyutu standartlarının (harici boyut kalibrasyonu) tutma süreleriyle karşılaştırarak bir numunenin boyutunu tutma süresiyle ilişkilendirme imkanı da vardır.
Burada, bilinmeyen bir altın nanopartikül örneğinin AF4 tarafından boyutlandırılması için standart bir işletim prosedürünün (SÇP) geliştirilmesini ve şirket içinde doğrulanmasını ve 20-100 nm boyut aralığında altın nanopartikül standartlarına sahip harici boyut kalibrasyonu kullanılarak UV-vis tespiti ile birleştiğinde açıklanmaktadır. Bu prosedür, numune hazırlama, AF4 enstrüman kurulumu ve kalifikasyonu, AF4 yöntemi geliştirme ve bilinmeyen altın nanopartikül örneğinin fraksiyonasyonu ve elde edilen sonuçların yerleşik dış boyut kalibrasyonu ile korelasyonu dahil olmak üzere geliştirilen iş akışının ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Burada açıklanan SÇP, süspansiyondaki nanopartikül örneklerinin boyutlandırılması için AF4'ün mükemmel sağlamlığını ve güvenilirliğini vurgulayan bir detaylandırma karşılaştırma çalışması çerçevesinde başarıyla doğrulandı.
Introduction
Kolloidal altın şeklindeki altın nanopartiküller (AuNP), nanopartiküllerin ne olduğu konusunda bir anlayış olmadan çok önce ve nanopartikül terimi çağdaş, bilimsel kelime hazinesine girmeden çok önce insan kültürünün bir parçasıydı. Nano ölçekli görünümleri hakkında farklı bir bilgi olmadan, askıya alınan AuNP, V-VI yüzyıllar MÖ1'deantik Çin, Arabistan ve Hindistan'da tıbbi ve diğer amaçlar için zaten kullanılmıştır ve ayrıca eski Romalılar, British Museum2'dekiLycurgus Cup sergisinde çömleklerini ünlü bir şekilde lekelemek için yakut kırmızı renklerinden yararlanmışlardı. Batı dünyasında, Orta Çağ'dan Modern Çağ'a kadar yüzyıllar boyunca, askıya alınan AuNP ağırlıklı olarak cam ve emaye (Cassius Moru)3 için renklendirici ajanlar olarak ve ayrıca frengi4başta olmak üzere çeşitli hastalıkları (İçilebilir Altın) tedavi etmek için kullanılmıştır.
Bununla birlikte, tüm bu çalışmalar öncelikle askıya alınmış AuNP uygulamasına odaklanmıştı ve oluşumlarını, doğalarını ve özelliklerini araştırmak için ilk rasyonel yaklaşımı tanıtmak 1857'de Michael Faraday'a bağlıydı5. Faraday, bu AuNP'nin çok dakika boyutlarına sahip olması gerektiğinin zaten farkında olmasına rağmen, boyut dağılımları hakkında açık bilgilereerişilebilen 6,7, sonunda boyut ve diğer AuNP özellikleri arasındaki korelasyonu sağlayan elektron mikroskopisinin geliştirilmesine kadar değildi.
Günümüzde, oldukça kolay ve basit sentezleri, dikkat çekici optik özellikleri (yüzey plazmon rezonansı), iyi kimyasal stabilitesi ve dolayısıyla küçük toksisiteleri ve mevcut boyutlar ve yüzey modifikasyonları açısından yüksek çok yönlülükleri sayesinde, AuNP nanoelektronik8,teşhis9,kanser tedavisi10veya ilaç teslimi11gibi alanlarda yaygın uygulamalar bulmuştur. Açıkçası, bu uygulamalar için, uygulanan AuNP'nin boyut ve boyut dağılımı hakkında kesin bilgi, optimum etkinlik12'yi sağlamak için temel bir ön koşuldur ve bu önemli fiziko-kimyasal parametreyi belirlemek için sağlam ve güvenilir araçlara önemli bir talep vardır. Bugün, aunp'yi süspansiyonda boyutlandırabilen çok sayıda analitik teknik vardır. örneğin, UV-vis Spektroskopisi (UV-vis)13, Dinamik Işık Saçılımı (DLS)14 veya Tek Parçacık Endüktif Olarak Eşleştirilmiş Plazma Kütle Spektrometresi (spICP-MS)15 ile Alan Akış Fraksiyonasyonu (FFF) bu alanda önemli bir oyuncu16,17,18,19,20.
İlk olarak 1966 yılında J. Calvin Giddings21tarafından kavramsallaştırılan FFF, ayırmanın sabit bir faz 22,23olmadan ince, kurdele benzeri bir kanalda gerçekleştiği, elution tabanlı fraksiyonasyon teknikleri bir aileden oluşur. FFF'de ayırma, bir numunenin laminer kanal akışının yönüne dik hareket eden bir dış kuvvet alanıyla etkileşimi ile indüklenen, numunenin genellikle ilgili satır içi dedektörlere doğru aşağı doğru taşındığı yerdir. Bu ilgili FFF teknikleri arasında, ikinci bir akışın (çapraz akış) kuvvet alanı olarak işlev gördüğü Asimetrik Akış Alanı-Akış Fraksiyonasyonu (AF4), en yaygın kullanılan alt tip24 halinegelmiştir. AF4'te, kanal tabanı (biriktirme duvarı), çapraz akışın membrandan geçmesine ve ekstra bir çıkış yoluyla kanaldan ayrılmasına izin verirken numuneyi koruyabilen yarı geçirgen bir ultrafiltrasyon membranı ile donatılmıştır. Bu sayede çapraz akış, numuneyi biriktirme duvarına doğru itebilir ve böylece difüzyon kaynaklı akısına (Brownian hareketi) karşı koyabilir. Alan ve difüzyon kaynaklı akıların ortaya çıkan dengesinde; daha yüksek difüzyon katsayıları sergileyen daha küçük numune bileşenleri kanal merkezine daha yakın hizalanırken, daha düşük difüzyon katsayıları sergileyen daha büyük numune bileşenleri biriktirme duvarına daha yakın bulunur. Kanalın içindeki parabolik akış profili nedeniyle, daha küçük numune bileşenleri bu nedenle kanal akışının daha hızlı laminasında taşınır ve daha büyük numune bileşenlerinden önce elüte edilir. FFF tutma parametresi ve Stokes-Einstein difüzyon katsayısı denklemleri kullanılarak, AF4'teki bir örneğin elüasyon süresi ve sırasıyla elüasyon hacmi doğrudan hidrodinamik boyutuna çevrilebilir22. Burada açıklanan elution davranışı normal elution modunu ifade eder ve genellikle AF4 için yaklaşık 1-500 nm (bazen parçacık özelliklerine ve fraksiyonasyon parametrelerine bağlı olarak 2000 nm'ye kadar) arasında bir parçacık boyutu aralığında geçerlidir, oysa sterik-hiperlayer elution genellikle bu boyuteşiğinin üzerinde gerçekleşir 25.
FFF tarafından ayrıldıktan sonra boyut bilgilerini türetmenin üç yaygın yolu vardır. FFF modüler bir cihaz olduğundan, ek şekil bilgileri elde etmek için Çok Açılı Işık Saçılma (MALS)26 , 27, Dinamik Işık Saçılma (DLS)28,29ve hatta her ikisinin bir kombinasyonuna dayanan boyuta duyarlı ışık saçılma dedektörleri gibi birden fazla dedektörle aşağı akışta birleştirilebilir 30,31. Bununla birlikte, bir örneğin FFF kanalındaki tutma davranışı genellikle iyi tanımlanmış fiziksel kuvvetler tarafından yönetildiği için, boyut, basit bir konsantrasyon dedektörünün (örneğin, bir UV-vis dedektörü)32 , 33.
Üçüncü bir seçenek olarak,burada,UV-vis algılaması ile birlikte AF4 kullanılarak süspansiyonda bilinmeyen bir altın nanopartikül örneğinin boyutlandırılması için 20-100 nm boyut aralığında iyi tanımlanmış AuNP standartları kullanılarak harici boyut kalibrasyonu 34,35 uygulamasını rapor ediyoruz. Bu basit deneysel kurulum, daha sonra burada sunulan protokole dayanarak Avrupa Birliği Horizon 2020 projesi ACEnano çerçevesinde gerçekleştirilen uluslararası bir detay karşılaştırmasına (ILC) mümkün olduğunca çok laboratuvarın katılmasına izin vermek için bilerek seçildi.
Protocol
1. AF4 sistem kurulumu
- AF4 kartuşunu monte edin ve af4 sisteminin tüm donanım bileşenlerini ve UV-vis dedektörünü(Malzeme Masası)üretici kılavuzunda verilen talimatları izleyerek bağlayın.
- Üretici kılavuzunda verilen talimatları izleyerek kontrol, veri toplama, işleme ve değerlendirme için gerekli tüm yazılım paketlerini yükleyin.
- AF4 sistemi ile UV-vis dedektörü arasında gerekli tüm sinyal bağlantılarının kurulduğundan emin olun.
- Kurulu AF4-UV-vis bağlantılarının sıkı ve sızıntı olmadan olduğundan emin olun, kurulumu 15 dakika boyunca ultra saf su (UPW) ile yıkayın (uç akış hızı 1 mL⭐dk-1, odak akış hızı 1 mL⭐dk-1ve çapraz akış hızı 1,5 mL min-1). Bunu yapmak için AF4 kontrol yazılımını açın ve açılış sayfasının sağ üst tarafındaki ilgili panellere akış hızlarını girin. Gerekirse ilgili konektörleri (bağlantı parçaları) sıkın ve sızıntı gözlenemeyene kadar prosedürü tekrarlayın.
NOT: Tüm ölçümler sırasında dahili sistem basıncı izlenmeli ve 4 ila 12 bar içinde olmalıdır. Basıncın daha yüksek veya daha düşük olması durumunda, geri basınç tüpünün ayarlanması gerekir. Ayrıca, kanal basıncı eğilimi tam ölçüm süresi boyunca sabit olmalıdır.
NOT: Bir kanal fırını varsa, tüm AF4 denemeleri boyunca karşılaştırılabilir ölçüm koşulları sağlamak için sıcaklığını 25 °C olarak ayarlayın.
2. AF4-UV-vis sistem kalifikasyonu ve numune analizi için çözeltilerin ve süspansiyonların hazırlanması
- Temizleme çözümü
- 1 L UPW'ye 8 g katı sodyum hidroksit (NaOH) ve 2 g sodyum dodecyl sülfat (SDS) ekleyin ve çözeltiyi tamamen çözünene kadar karıştırın.
- Eluent
- Unu elde etmek için 2 L filtrelenmiş ve gazsız UPW'ye 500 μL filtrelenmiş yüzey aktif madde karışımı ekleyin (%0,025 (v/v), pH yaklaşık 9,4).
NOT: Yüzey aktif madde karışımının bileşiklerinin ayrıntılı bir açıklaması Tablo 1'de (ayrıca Malzeme Tablosu) verilmiştir.
- Unu elde etmek için 2 L filtrelenmiş ve gazsız UPW'ye 500 μL filtrelenmiş yüzey aktif madde karışımı ekleyin (%0,025 (v/v), pH yaklaşık 9,4).
- Toplu kurtarma belirleme için rastgele AuNP boyut standardı
- Vortex 2 dakika boyunca rastgele bir AuNP boyutu standardı (50 mg⭐L-1)ve 12.5 mg⭐L -1 nihai kütle konsantrasyonu elde etmek için UPW ile1:4seyreltin. Elde edilen süspansiyonu homojenize etmek için seyreltmeden sonra 2 dakika daha girdap.
DİkKAT: Kimyasallarla, özellikle NaOH peletleriyle çalışırken gerekli ihtiyati tedbirler ve uygun koruyucu ekipman gereklidir.
NOT: AF4-UV-vis-deneyleri sırasında düşük partikül arka planları sağlamak için genellikle 0,1 μm membran filtresi (hidrofilik PVDF veya benzeri) kullanarak gerekli tüm çözeltilerin (temizleme çözeltisi hariç) gazdan arındırılması ve filtrelenmeniz önerilir. Bu, özel bir vakum filtrasyon ünitesi veya şırınna filtreleri kullanılarak kurulabilir.
- Vortex 2 dakika boyunca rastgele bir AuNP boyutu standardı (50 mg⭐L-1)ve 12.5 mg⭐L -1 nihai kütle konsantrasyonu elde etmek için UPW ile1:4seyreltin. Elde edilen süspansiyonu homojenize etmek için seyreltmeden sonra 2 dakika daha girdap.
3. AF4-UV-vis sistem yeterliliği
- Sistemi 30 dakika boyunca temizleme çözümüyle yıkamak için 1.4 adımında açıklanan yazılım ayarlarını kullanın (Uç akış hızı 1 mL⭐dk-1, Odak akış hızı 1 mL⭐min-1ve Çapraz akış hızı 1.5 mL⭐dk-1).
- İlgili yılan balığı şişesini değiştirin ve sistemi 20 dakika boyunca UPW ile yıkayın (Uç akış hızı 1 mL⭐dk-1, Odak akış hızı 1 mL⭐dk-1ve Çapraz akış hızı 1,5 mL⭐dk-1).
- İlgili satır içi pompa filtrelerini değiştirin.
- AF4 kartuşunu açın ve AF4 zarını değiştirin. AF4 kartuşunu yeniden bir araya alıp AF4-UV-vis sistemine yeniden bağlayın.
- Temizlenen AF4-UV-vis sistemini, membranı dengelemek ve sistemi stabilize etmek için en az 30 dakika boyunca elüent ile yıkayın (Uç akış hızı 1 mL⭐dk-1, Odak akış hızı 1 mL⭐dk-1ve Çapraz akış hızı 1,5 mL min-1). Olası sızıntıları tekrar denetleyin (bkz. adım 1.4).
- Rasgele bir AuNP boyutu standardı kullanarak kütle kurtarma ve tutma süresinin değişimini belirleyerek AF4-UV-vis sistemini niteleyebilirsiniz.
- Ayırma kuvveti uygulamadan doğrudan enjeksiyon çalışması gerçekleştirin.
- Dosya |'nı açarak yeni bir ölçüm dosyası oluşturma Yeni | AF4 kontrol yazılımında çalıştırın.
- Örnek ve ölçüm açıklamasının yanı sıra çalıştırma sekmesindeki ekleme hacmini ve örnek adını tanımlayın. Ölçüm koşulları Tablo 2'de görüntülenir.
- İkinci sekme FFF yöntemindeki ölçüm parametrelerini Tablo 2'ye göre ayarlayın.
- Ölçümü başlatmak için Çalıştır düğmesini tıklatın.
- Ayırma kuvveti (Çapraz akış) uygulamasıyla kesirli bir çalışma gerçekleştirin.
- Tablo 3'tebelirtilen kesir koşullarını kullanarak önceki bölümde açıklandığı gibi kesir yöntemini tanımlayın.
- Ölçümü başlatmak için Çalıştır düğmesini tıklatın.
- Ölçümü dört katına çıkar.
NOT: İlk çalıştırma sistemi (yani AF4 zarını) şartlandırmayı amaçlamaktadır ve sistem yeterlilik sonuçlarının nihai değerlendirmesinin dışında kalacaktır.
NOT: Dosya |'i açarak oluşturulan tüm çalıştırma dosyalarını kaydetmeniz önerilir AF4 kontrol yazılımına kaydedin. - Rasgele AuNP boyut standardı için >%80 toplu kurtarma ve tutma süresi <2% varyasyonu elde edilirse AF4-UV-vis-sisteminin nitelikli olduğunu düşünün.
- Enjeksiyon sistemi olarak bir otosampler kullanırken, optimum çalışma koşulları sağlamak için otomatik örnekleyicinin iğne yıkama rezervuar şişesini AF4-UV-vis sisteminden pompalanan çözeltiyle (örneğin, temizleme çözeltisi, UPW veya ilgili elüent) doldurun. Eluent değiştirilirken, genellikle UV-vis-dedektör sinyalini sabit bir seviyede sabit kalana kadar izleyerek AF4 sisteminin yeniden dengelenmesine uyulması önerilir.
- Ayırma kuvveti uygulamadan doğrudan enjeksiyon çalışması gerçekleştirin.
4. AF4-UV-vis numune analizi
- İlgili AuNP süspansiyonunu (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm, her 50 mg) girdaplayarak harici boyut kalibrasyonu için tüm AuNP boyut standartlarını hazırlayın. L-1) 2 dakika boyunca ve 12,5 mg⭐L -1 nihai kütle konsantrasyonu elde etmek için UPW ile1:4seyreltin. Elde edilen süspansiyonları homojenize etmek için seyreltmeden sonra 2 dakika daha girdap.
- Bilinmeyen AuNP örneğini, adım 4.1'de açıklanan kalibrasyon standartlarıyla aynı prosedürü uygulayarak analize hazırlayın.
- Tablo 2'degörüntülenen AF4 yöntemini kullanarak tüm AuNP boyut standartlarının doğrudan enjeksiyon ölçümünü gerçekleştirin.
- Bunu yapmak için, ayırma ve örnek parametreleri tanımlamak için uygun konumlarda üreticinin yazılımına Tablo 2'de özetlenen ilgili değerleri girin ve denemeyi başlatmak için Çalıştır düğmesine basın.
- Harici boyut kalibrasyon işlevini oluşturmak için Tablo 3'te görüntülenen AF4 yöntemini kullanarak her AuNP boyutu standardını ayrı ayrı kesirlendir.
- Tablo 3'te özetlenen ilgili değerleri uygun konumlarda üreticinin yazılımına girin. Kesirleme yöntemi bir odaklama adımı, birkaç elution adımı ve bir durulama adımı ile tanımlanır. Yöntemi ayarladıktan sonra, denemeyi başlatmak için Çalıştır düğmesine basın.
- Tablo 2'degörüntülenen AF4 yöntemini kullanarak bilinmeyen AuNP örneğinin doğrudan enjeksiyon ölçümünü gerçekleştirin.
- Tablo 3'te listelenen AF4 yöntemini yürüterek bilinmeyen AuNP örneğinin kesirlemesini gerçekleştirin.
- Anlamlı ve istatistiksel olarak ilgili sonuçlar elde etmek için aksi belirtilmedikçe Bölüm 3 ve 4'te belirtilen tüm ölçümleri üç taraflı olarak gerçekleştirin.
- Kullanmadan önce 50 mg⭐L-1 AuNP stok süspansiyonlarını 4–8 °C'de saklayın. Seyreltilmiş AuNP süspansiyonlar uygulamadan önce 30 dakika içinde ideal olarak hazırlanır.
NOT: Girdap genellikle yeterlidir ve süspansiyonların ultrasonikasyonu gerekli değildir. - Bilinmeyen AuNP örneğinin saklama süresinin AuNP boyut standartları için elde edilen saklama süreleriyle ilişkilendirilmesini sağlamak için, aynı AF4 yöntemini kullanarak tüm örnekleri ölçün.
NOT: Sabit ve geçerli ayırma koşullarını sağlamak için, sistem yeterlilik bölümünde açıklanan kesir adımını (bkz. adım 3.6.2) tanımlanmış sayıda örnek ölçümden (ör. 10 ölçüm) sonra ekleyin/tekrarlayın. Buna ek olarak, kayıt sistemi basıncı ve UV-vis dedektör taban çizgisi stabilitesi. Tam bir AF4-UV-vis çalıştırması boyunca sabit ve sabit kalmalıdırlar.
NOT: Genellikle, UV-vis dedektörü (veya varsa Çok Açılı Işık Saçılma (MALS) dedektörü) artan bir gürültü seviyesi gösterdiğinde veya kurtarma, numune tepe şekli veya tekrarlanabilirlik gibi tanımlanmış sistem yeterlilik kriterleri kaçırıldığında (veya AF4-UV-vis-sistemi kapsamlı bir temizleme prosedürüne tabi tutulduğunda) ultrafiltrasyon membranını değiştirin. Burada açıklanan koşullar altında, nitelikli AF4-UV-vis sistemi genellikle aynı membran kullanılarak en az 50 ölçüm için kararlıdır; ancak, tanımlanan kalite kriterlerini karşılayan olası ardışık ölçümlerin sayısı numune, numune matrisi ve elüent bileşimine bağlı olarak önemli ölçüde değişebilir.
- Kullanmadan önce 50 mg⭐L-1 AuNP stok süspansiyonlarını 4–8 °C'de saklayın. Seyreltilmiş AuNP süspansiyonlar uygulamadan önce 30 dakika içinde ideal olarak hazırlanır.
5. Veri değerlendirmesi
- Af4-UV-vis sistem üreticisi tarafından sağlanan veri değerlendirme yazılımını veya üretici kılavuzunda verilen talimatları izleyerek ilgili veri toplama yazılımından gerekli tüm ham verilerin (yani UV-vis tepe alanı) dışa aktarılmasından sonra elektronik tablo analizini kullanarak toplu kurtarma hesaplamasını gerçekleştirin.
- Aşağıdaki denklemi kullanarak kesir ölçümünün (Afraksiyonasyonu)ve doğrudan enjeksiyon ölçümünün(Doğrudan enjeksiyon)ilgili UV-vis tepeleri altındaki alanları karşılaştırarak AuNP kütle geri kazanımını hesaplayın:
NOT: Doğrudan enjeksiyon ölçümü sırasında ayırma kuvveti uygulanmaz ve bu nedenle bir analit türünün biriktirme duvarı ile potansiyel etkileşimleri ihmal edilebilir. İlgili bir UV-vis zirvesi altındaki alan, örnekteki başka hiçbir türün ilgili dalga boyunda emilmeyeceği ve/veya i) fraksiyonasyon koşulları altında başka bir tutma zamanında elutes ii) AF4 zarı aracılığıyla çıkarıldığı varsayılarak Bira-Lambert yasası kullanılarak AuNP kütlesi ile doğrudan ilişkilendirilebilir. - Hem doğrudan ekleme hem de kesirleme çalıştırmasından elde edilen dat.
- Genel Bakış sekmesinde UV-vis dedektör izlemesini seçin.
- Tüm ölçümler için sinyal ve taban çizgisi görünümünde bir İlgi Alanı (YG) ve bir taban çizgisi tanımlayın.
- Insert ile Doğrudan Enjeksiyon Kalibrasyonu takın.
- Doğrudan Enjeksiyon Kalibrasyon Ayarları görünümünde tüm doğrudan enjeksiyon çalıştırmalarını seçin ve bir UV yok olma katsayısı girin.
NOT: Hem kalibrasyon hem de fraksiyon ölçümü için aynı UV-vis yok olma katsayısının kullanılması önemlidir. - Yatırım getirisi içindeki UV-vis sinyal izlemesi altındaki alanı ve girilen konsantrasyondan ve enjeksiyon hacminden hesaplanan enjekte edilen miktarı kullanarak kalibrasyon hattını kurun. Elde edilen kalibrasyon ayrı Doğrudan Enjeksiyon Kalibrasyon İşlevi penceresinde gösterilecektir.
- Kalibrasyon işlevini ilgili kesir ölçümlerine atayın.
NOT: Her kalibrasyon boyutu standardı ve bilinmeyen AuNP numunesi için, AuNP'nin boyuta bağlı UV-vis absorbansı nedeniyle ayrı bir kalibrasyon fonksiyonu kurulması gerekir. UV-vis dedektörünün bu dezavantajı, ICP-MS gibi kütleye duyarlı bir dedektör kullanılarak atlatılabilir. - Nicel Sonuçlar hesaplaması ekleyerek analizleri gerçekleştirin ve sonuçlar sağdaki bir tabloda konsantrasyon ve enjekte edilen miktar değerleri olarak görüntülenir.
- Aşağıdaki denklemi kullanarak kesir ölçümünün (Afraksiyonasyonu)ve doğrudan enjeksiyon ölçümünün(Doğrudan enjeksiyon)ilgili UV-vis tepeleri altındaki alanları karşılaştırarak AuNP kütle geri kazanımını hesaplayın:
- Af4 sistem üreticisi tarafından sağlanan veri değerlendirme yazılımını veya gerekli tüm ham verilerin (örneğin, AuNP kalibrasyon standartlarının ilgili UV-vis peak maxima ve ilgili boşluk sürelerinde saklama süreleri) üretici kılavuzunda verilen talimatları izleyerek ilgili veri toplama yazılımından dışa aktarılmasından sonra elektronik tablo analizini kullanarak saklama süresinin varyasyonunu hesaplayın.
- İçe aktarılan tüm ölçümler için ilgili UV izlemelerini görüntülemek üzere Genel Bakış penceresini açın.
- Pik algılama otomatik olarak gerçekleştirilecektir; performansı optimize etmek için sinyal işleme araç kutusundaki tepe algılama parametrelerini ayarlayın. Tüm ölçüm dosyalarını gözden geçirerek ilgili tepe maxima'yı ayıklayın.
- Aşağıdaki denklemi kullanarak tüm ölçümler için göreli standart sapması hesaplayın:
Hesaplama, ilgili bir elektronik tablo yazılımı kullanılarak da gerçekleştirilebilir.
- Üretici kılavuzunda verilen talimatları izleyerek ilgili veri toplama yazılımından gerekli tüm ham verilerin (UV-vis tepe maksimum analit ve ilgili boşluk süresinde saklama süresi) dışa aktarmasından sonra üretici tarafından sağlanan veri değerlendirme yazılımını veya elektronik tablo analizini kullanarak boyut belirleme gerçekleştirin. Daha önce yapılan DLS ölçümlerinden elde edilen hidrodinamik boyutlarına karşı AuNP boyut standartlarının (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) boşluk süresi düzeltilmiş saklama süreleri (net saklama süreleri, bkz. Tablo 5)çizilerek harici bir boyut kalibrasyon fonksiyonu oluşturulabilir (bkz. Tablo 4).
NOT: DLS ölçümleri, karşılaştırılabilir numune özelliklerini sağlamak için ilgili kesir ölçümleriyle aynı gün ideal olarak yapılmalıdır.- .dat dosyaları içe aktarıldıktan sonra tüm ölçümler Genel Bakış sekmesinde görüntülenir. Kaplama penceresinin altında görüntülenen dedektörler listesinden UV-vis dedektör sinyalini seçin. Her ölçüm için Sinyal ve Taban Çizgisi görünümünde ayarlanabilen bir yatırım getirisi ve taban çizgisi tanımlayın. Gürültülü sinyalleri yumuşatmak için sağdaki Sinyal işleme araç kutusunu kullanın. Parametrelerin sırasıyla sinyaller gibi diğer ölçümlere ayrılmasına izin vermek için İşleme Parametrelerini Diğer Çalıştırmalara Ata işlevini kullanın.
- Ekle sekmesinden Parçacık Boyutu Kalibrasyonu'nun öğesini seçin.
- Sağ üst taraftaki Kalibrasyon referanslarını seç tablosundaki ilgili ölçüme tıklayarak tüm kalibrasyon çalıştırmalarını seçin. Seçilen tüm ölçümler aşağıdaki tabloda görüntülenecektir. Tablo 4'tebelirtilen tüm kalibrasyon ölçümleri için hidrodinamik yarıçapı girin. İşlev Parçacık boyutu kalibrasyonu – fonksiyon penceresinde görüntülenecek ve denklem de gösterilecektir.
NOT: Kurulan boyut kalibrasyon fonksiyonunun korelasyon katsayısı (R2)0,990 ≥ olmalıdır. - Atama için Çalıştırmaları Seç listesindeki ilgili kesirleri seçerek kalibrasyon işlevini bilinmeyen AuNP örneğinin ölçümlerine atayın.
- Ekleme sekmesinde parçacık boyutu dağıtım hesaplaması açarak sonuçları görüntüleyin. Daha önce oluşturulan parçacık boyutu kalibrasyonu, sağ pencere ayarlarındagörüntülenen bilinmeyen AuNP numune ölçümleri için Kalibrasyon olarak listelenir. Hesaplanan boyut, en tepeye etiketlenmiş boyut dağıtım penceresinde gösterilir. Bir örneğin tüm ölçümlerini ortalamak ve sonucu en yüksek maksimum etikette listelemek için Örnek için Ortalama Sinyaller onay kutusunu seçin.
- Ayrıca, Kalibrasyon eğrisini göster onay kutusunu seçerek kalibrasyon çizgisini fraktogramın üzerine çizin. Kümülatif dağılım göster onay kutusu seçilerek bir kümülatif boyut dağılımı kullanılabilir.
NOT: Veri değerlendirmesi için üreticinin yazılımını kullanırken, Ekle sekmesinin içindeki Rapor'a tıklayarak oluşturulabilecek tüm sonuçların bir rapora eklenmesi önerilir. Rapor düğmesi belgeye tüm sonuçları, tabloları ve diyagramları ekler. Rapor sekmesinin altında, Rapor kurulumu Belge bölümünde açılarak rapor ayarları değiştirilebilir.
Representative Results
İlk olarak, AuNP boyut standartları AF4 ile kesirlendi ve 532 nm dalga boyunda (AuNP'nin yüzey plazmon rezonansı) AuNP'nin emiciliğini ölçen UV-vis ile tespit edildi. Elde edilen fraktogramların yer paylaşımı Şekil 1'desunulmuştur. Her AuNP'nin triplikat ölçümlerinden elde edilen ilgili UV-vis tepe maksimumunda tutma süreleri Tablo 5'telistelenmiştir. Tüm saklama sürelerinin göreli standart sapması, artan boyutla azalan ölçüm farkı ile % 1,1'in altındaydı. Genel olarak, mükemmel bir tekrarlanabilirlik elde edildi. Elution süresi ve hidrodinamik boyutun doğrusal bir ilişkisi ile sonuçlanan sabit bir ayırma kuvveti uygulandı. Dış boyut kalibrasyon hattı, belirtilen hidrodinamik yarıçapın, düzeltilen boş işleme süresine (net tutma süresi) karşı çizilmesiyle kurulmuştur. Doğrusal regresyon analizi, a = -3.373 nm ± 1.716 nm ve eğim b = 1.209 nm⭐dk-1 ± 0.055 nm min-1ile doğrusal kalibrasyon fonksiyonu ile sonuçlandı. Elution'ın doğrusal davranışı 0.9958'in kare korelasyon katsayısı R2 ile doğrulandı. İlgili kalibrasyon fonksiyonu Şekil 2'degörsel olarak görüntülenir.
İkinci bölümde bilinmeyen AuNP örneğinin analizi ele alındı. Protokol bölümünde(bölüm 4.2)açıklanan prosedüre göre numunenin üç aliquots hazırlandı. Üç aliquot'un her biri, AuNP boyut standartları için de uygulanan aynı AF4 fraksiyonasyon yöntemi kullanılarak üç taraflı olarak araştırılmıştır. Bilinmeyen AuNP örneğinin elde edilen dokuz AF4-UV-vis fraktogramının tümü Şekil 3'te sunulmuştur ve ilgili değerlendirmeleri Tablo 6'daözetlenmiştir. İlgili saklama sürelerinin göreli standart sapması önemli ölçüde düşüktü ve% 0.1 ile% 0.5 arasında değişiyordu. AuNP boyut standartlarının kesirlenmesinden elde edilen parçacık boyutu kalibrasyon fonksiyonu kullanılarak ve UV-vis tepe maksimumda bilinmeyen AuNP örneğinin elde edilen tutma süreleriyle ilişkilendirilerek, 29,4 nm ± 0,2 nm'lik genel ortalama bir hidrodinamik yarıçap hesaplanabilir. Ayrıca, AuNP örneğinin önemli bir aglomera veya çözünmesi veya parçacıkların membran yüzeyine önemli ölçüde adsorpsiyonu olmadığını gösteren% 83.1 ±% 1.2'lik makul bir kütle geri kazanımı elde edildi. Şekil 4, elde edilen parçacık boyutu dağılımını, uygulanan AF4 yönteminin mükemmel sağlamlığını vurgulayan ortalama dokuz UV-vis sinyal izinin tümüyle görüntüler.
Şekil 1: Normalleştirilmiş sinyal yoğunlukları ve uygulanan sabit çapraz akış hızı (siyah çizgi) ile dört ayrı AuNP boyut kalibrasyon standardının triplikat analizinden elde edilen AF4-UV-vis fraktogramlar. Boşluk zirvesi yaklaşık 5,9 dk'da gri renkle vurgulanır.
Şekil 2: DLS ölçümlerinin ilgili standart sapmalarından (Tablo 4) elde edilen hata çubukları ve elde edilen AF4 saklama sürelerindeki farklılıklar (Tablo 5) dahil olmak üzere, belirtilen hidrodinamik yarıçapı her bir AuNP boyut kalibrasyon standardının tutma süresine göre çizildikten sonra elde edilen harici boyut kalibrasyon fonksiyonu. Doğrusal regresyon analizinden y = a + bx, = -3.373 nm ± 1.716 nm ve b = 1.209 nm·dk-1 ± 0.055 nm·dk-1 şeklinde standart hatalar içeren doğrusal kalibrasyon fonksiyonu hesaplanmıştır. Doğrusal bir ilişkiyi gösteren R2 = 0.9958 ile kare korelasyon katsayısı belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bilinmeyen AuNP'yi gösteren üç aliquot'un üç taraflı ölçümlerinin AF4-UV-vis fraktogramları. Ölçüm süresi boyunca uygulanan sabit çapraz akış hızı siyah bir çizgi olarak gösterilmiştir. Yaklaşık 5,9 dakikadaki boşluk zirvesi gri renkle vurgulanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Bilinmeyen AuNP örneğinin elde edilen ortalama partikül boyutu dağılımının (kırmızı) ve uygulanan doğrusal kalibrasyon işlevinin (noktalı çizgi) yer paylaşımı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Bileşen | CAS-Hayır | Ağırlık (%) | |
| Su | 7732-18-5 | 88.8 | |
| 9-Oktandesnoik asit (Z)-, bileşik ile 2,2',2''-nitrilotris[etanol](1:1) | 2717-15-9 | 3.8 | |
| Sodyum karbonat | 497-19-8 | 2.7 | |
| Alkoller, C12-14-sekonder, etoksilatlı | 84133-50-6 | 1.8 | |
| Tetrasosyum EDTA | 64-02-8 | 1.4 | |
| Polietilen glikol | 25322-68-3 | 0.9 | |
| Sodyum oleat | 143-19-1 | 0.5 | |
| Sodyum bikarbonat | 144-55-8 | 0.1 | |
Tablo 1: Eluent hazırlamak için kullanılan yüzey aktif madde karışımının bileşenlerinin listesi (ayrıca bkz. Malzeme Tablosu).
| AF4-UV-vis parametreleri | Birim | Değer |
| Aralayıcı kalınlığı | Μm | 350 |
| Dedektör akış hızı | mL min-1 | 0.5 |
| Çapraz akış hızı | mL min-1 | 0 (8 dakika sabit) |
| Odak akış hızı | mL min-1 | 0 |
| Gecikme süresi / stabilizasyon süresi | Dk | 0 |
| Enjeksiyon akış hızı | mL min-1 | 0.5 |
| Geçiş zamanı | Dk | 0 |
| Enjeksiyon süresi | Dk | 0.1 |
| Elution adımı | Dk | 8 |
| Durulama adım süresi | Dk | 0.1 |
| Adım akış hızını durula | mL min-1 | 0.1 |
| Enjeksiyon hacmi | μL | 10 |
| Numune konsantrasyonu | mg L-1 | 12.5 |
| Membran tipi | Rejenere selüloz | |
| Membran moleküler ağırlık kesme | Kartal | 10 |
| Eluent | %0,025 (v/v) yüzey aktif madde karışımı | |
| UV-vis dalga boyu | Nm | 532 |
| UV-vis hassasiyeti | - | 0.001 |
Tablo 2: Bir ayırma kuvveti uygulamadan doğrudan enjeksiyon çalışmasını gerçekleştirmek için AF4-UV-vis fraksiyonasyon yöntemi parametrelerinin özeti.
| AF4-UV-vis parametreleri | Birim | Değer |
| Aralayıcı kalınlığı | Μm | 350 |
| Dedektör akış hızı | mL min-1 | 0.5 |
| Çapraz akış hızı | mL min-1 | 1 (60 dk sabit, 10 dk doğrusal) |
| Odak akış hızı | mL min-1 | 1.3 |
| Gecikme süresi / stabilizasyon süresi | Dk | 2 |
| Enjeksiyon akış hızı | mL min-1 | 0.2 |
| Geçiş zamanı | Dk | 0.2 |
| Enjeksiyon süresi | Dk | 5 |
| Elution adımı | Dk | 70 (60 dk sabit, 10 dk doğrusal) |
| Durulama adımı | Dk | 9 |
| Adım akış hızını durula | mL min-1 | 0.5 |
| Enjeksiyon hacmi | μL | 50 |
| Numune konsantrasyonu | mg L-1 | 12.5 |
| Membran tipi | Rejenere selüloz | |
| Membran moleküler ağırlık kesme | Kartal | 10 |
| Eluent | %0,025 (v/v) yüzey aktif madde karışımı | |
| UV-vis dalga boyu | Nm | 532 |
| UV-vis hassasiyeti | - | 0.001 |
Tablo 3: Kesirleme çalışmasını ayırma kuvveti olarak çapraz akış uygulamasıyla gerçekleştirmek için AF4-UV-vis fraksiyonasyon yöntemi parametrelerinin özeti.
| Kalibrasyon standardı | Kapatma aracısı | Ortalama Boyut (TEM) (nm) | CV (ortalama boyut TEM) (%) | Zeta potansiyeli (mV) | SD (zeta potansiyeli) (mV) | Hidrodinamik Yarıçap (DLS) (nm) | SD (hidrodinamik yarıçap) (nm) | Pdı | SD (PDI) |
| AuNP 20 nm | Sitrat | 20.1 | ≤ 8 | -48.9 | 1.5 | 10.95 | 0.12 | 0.082 | 0.009 |
| AuNP 40 nm | Sitrat | 40.8 | ≤ 8 | -30.4 | 1.0 | 20.30 | 0.13 | 0.127 | 0.006 |
| AuNP 80 nm | Sitrat | 79.2 | ≤ 8 | -51.5 | 1.3 | 38.85 | 0.23 | 0.138 | 0.013 |
| AuNP 100 nm | Sitrat | 102.2 | ≤ 8 | -50.9 | 0.9 | 52.30 | 0.37 | 0.078 | 0.009 |
Tablo 4: Kapaklama maddesi, TEM ortalama boyutu, yerel süspansiyonda belirlenen Zeta potansiyeli ve sıvıda belirlenen DLS hidrodinamik yarıçapı ve polidispersite indeksi (PDI) dahil olmak üzere uygulanan AuNP kalibrasyon standartlarının fiziko-kimyasal parametrelerinin özeti.
| Kalibrasyon standardı | Çalıştırmak | En yüksek maksimumda saklama süresi (min) | En yüksek (min) net saklama süresi | Ortalama net saklama süresi (min) | SD (%) (net saklama süresi) | SD (min) (net saklama süresi) |
| AuNP 20 nm | 1 | 17.368 | 11.468 | 11.56 | 1.02 | 0.12 |
| 2 | 17.409 | 11.509 | ||||
| 3 | 17.589 | 11.689 | ||||
| AuNP 40 nm | 1 | 25.316 | 19.416 | 19.49 | 0.68 | 0.13 |
| 2 | 25.32 | 19.42 | ||||
| 3 | 25.548 | 19.648 | ||||
| AuNP 80 nm | 1 | 42.095 | 36.195 | 36.29 | 0.23 | 0.08 |
| 2 | 42.219 | 36.319 | ||||
| 3 | 42.257 | 36.357 | ||||
| AuNP 100 nm | 1 | 50.975 | 45.075 | 45.06 | 0.07 | 0.03 |
| 2 | 50.924 | 45.024 | ||||
| 3 | 50.986 | 45.086 |
Tablo 5: AuNP kalibrasyon standartlarının, Tablo 3'teaçıklanan yöntem kullanılarak ilgili AF4-UV-vis fraktogramlardan elde edilen ilgili UV-Vis zirvesindeki tutma süreleri maksimum.
| Aliquote | Çalıştırmak | Saklama süresi en yüksek (min) | En yüksek maksimumda ortalama saklama süresi (min) | En yüksek (min) net saklama süresi | SD (%) saklama süresi | Hidrodinamik yarıçap (nm) | Kurtarma (%) |
| 1 | 1 | 32.689 | 32.70 | 26.789 | 0.07 | 29.03 | 85.34 |
| 2 | 32.687 | 26.787 | |||||
| 3 | 32.719 | 26.819 | |||||
| 2 | 1 | 32.989 | 33.08 | 27.089 | 0.37 | 29.49 | 81.73 |
| 2 | 33.073 | 27.173 | |||||
| 3 | 33.187 | 27.287 | |||||
| 3 | 1 | 33.053 | 33.14 | 27.153 | 0.49 | 29.56 | 82.14 |
| 2 | 33.071 | 27.171 | |||||
| 3 | 33.291 | 27.391 |
Tablo 6: İlgili UV-Vis tepe maksimumundaki tutma sürelerinin özeti, dış boyut kalibrasyonundan hesaplanan hidrodinamik yarıçap (Şekil 2) ve AF4-UV-vis analizinden elde edilen bilinmeyen AuNP örneğinin geri kazanım oranı.
Discussion
Bilinmeyen bir AuNP'nin hidrodinamik boyutu, AF4 tarafından 20 nm ila 100 nm arasında iyi tanımlanmış AuNP boyut standartları kullanılarak bir UV-vis dedektörü ile birlikte doğru bir şekilde değerlendirildi. Geliştirilen AF4 yöntemi, ölçülen tutma süresi ile AuNP boyutu arasında doğrusal bir ilişki kurmak için sabit bir çapraz akış profili kullanılarak optimize edildi ve böylece doğrusal regresyon analizinden basit bir boyut belirlemesi sağladı. Özellikle odak noktası, fraksiyonasyon sırasında önemli bir numune kaybı olmadığını gösteren yeterince yüksek geri kazanım oranları elde etmek ve uygulanan yılan balığı ve membran da dahil olmak üzere geliştirilen AF4 yönteminin tüm fraksiyone edilmiş AuNP örnekleriyle iyi eşleşmesiydi.
Yöntem geliştirme, AF4'teki tartışmasız en kritik adımdır ve belirli bir elüasyon süresi penceresinde fraksiyonasyonu iyileştirmek için kanal boyutları, akış parametrelerinin yanı sıra atık su, membran, ara parça yüksekliği ve hatta örnek özellikleri de dahil olmak üzere çeşitli parametrelerin dikkate alınması gerekir. Bu paragrafın amacı, burada tartışılan bilinmeyen AuNP örneğinin boyutunu başarıyla belirlemek için en iyi duruma getirilmiş kritik adımlarda okuyucuya rehberlik etmektir. Genellikle bir AF4 yönteminin nasıl geliştirileceği hakkında daha ayrıntılı bir açıklama için, okuyucu 'ISO/ TS21362:2018 - Nanoteknolojiler - Asimetrik akış ve santrifüj alan akışı fraksiyonasyonu kullanılarak nano nesnelerin analizi'25'inAF4 bölümüne atıfta bulunulmaktadır. Tablo 3'te verilen uygulanan fraksiyonasyon koşullarına daha yakından bakmak , ilk kritik adım AF4 kanalındaki AuNP örneğinin tanıtılması ve gevşemesidir. Bu adım, etkileşimi örneği membran yüzeyine yakın bulmaya ve temelde fraksiyonun başlangıç noktasını tanımlayan AF4 kanalının enjeksiyon portuna yakın dar bir bantta konsantre etmeye zorlayan enjeksiyon akışı, odak akışı ve çapraz akış tarafından yönetilir. Bu adım sırasında, farklı boyutlardaki örnek bileşenlerin AF4 kanalının farklı yüksekliklerinde bulunması ve böylece başarılı bir boyut fraksiyonasyonu için temel oluşturması nedeniyle numunenin yeterli bir şekilde gevşetilmesi zorunludur. Tamamlanmamış numune gevşemesi genellikle boyanmamış (yani rahat olmayan) örnek bileşenlerden kaynaklanan artan bir boşluk tepe alanı ile görülebilir. Bu etki enjeksiyon süresi ve/veya uygulanan çapraz akış hızı artırılarak azaltılabilir. Bununla birlikte, her iki parametre de özellikle AF4 membranına aglomerasyon ve adsorpsiyona eğilimli numuneler için dikkatli optimizasyona ihtiyaç duyar ve farklı parametre ayarları36,37için elde edilen ilgili kurtarma oranları ile izlenebilir. 5 dakikalık uygulanan enjeksiyon süresi ve 1,0 mL⭐dk-1 çapraz akış hızı, tüm AuNP örnekleri için geri kazanım oranlarını >%80 ve neredeyse optimum gevşeme koşullarını gösteren ihmal edilebilir bir boşluk tepe alanını ortaya çıkardı. AuNP örneğinin yeterli gevşemesinin ardından odak akışı durduruldu ve AF4 kanal uzunluğu boyunca ikinci kritik adımı temsil eden ilgili UV-vis dedektörüne numune taşınması başlatıldı. Makul analiz sürelerinde yeterince yüksek fraksiyonasyon gücü sağlamak için, 30-50 dakika boyunca (ilgili fraksiyone AuNP boyut standardına bağlı olarak) 1,0 mL/dk-1 sabit çapraz akış hızı ve ardından 0,5 mL.dk -1 dedektör akış hızında10 dk doğrusal çapraz akış bozunması uygulanmıştır. Tüm AuNP boyut standartlarının ayrımı boyunca sabit bir çapraz akış profili kullanmak, FFF-teorisi22'yitakiben tutma süresi ile AuNP boyutu arasında doğrusal bir ilişki ortaya çıkardı, böylece bilinmeyen AuNP örneğinin basit doğrusal regresyon analizi ile boyut belirlemesini sağladı. Bununla birlikte, sabit bir çapraz akış dışındaki profiller de nanopartiküllerin boyutlandırılması için sömürülmüştür ve sonuçta tutma süresi ile parçacık boyutu38,39arasında doğrusal olmayan bir ilişkiye yol açmaktadır. Ek olarak, AF4'te iyi tanımlanmış boyut standartları kullanılarak boyut belirleme AuNP ile sınırlı değildir, ancak diğer boyutlarda ve element bileşiminde (örneğin, gümüş38, 40 veya silika nanopartiküller41,42)nanopartiküllere de uygulanabilir. Ek olarak, seyreltilmiş numunelerle çalışırken, ICP-MS, AF4 ile birleşebilen ve süspansiyondaki çok çeşitli nanopartiküllerin boyutlandırılması için bu analitik yaklaşımın çok yönlülüğüne katkıda bulunan son derece hassas bir elementel dedektördür.
Yaygın uygulamasına rağmen, AF4'te iyi tanımlanmış boyut standartları kullanılarak dış boyut kalibrasyonu, bilinmeyen numunelerin doğru boyutlandırılması için kullanırken dikkate alınması gereken bazı özelliklere sahiptir. Her şeyden önce, büyük ölçüde ilgili boyut standartlarının ve gerçek numunenin fraksiyonasyonu sırasında karşılaştırılabilir koşulların uygulanmasına dayanır. Burada sunulan durumda, hem AuNP boyut standartlarının hem de bilinmeyen AuNP örneğinin aynı AF4 yönteminin yanı sıra aynı eluent ve aynı membranın bu yaklaşımı oldukça esnek olmayan hale getirmesi zorunludur. Ayrıca, örneğin hafif saçılma (MALS ve DLS) gibi boyuta duyarlı dedektörler olmadan, boyut standartlarını kullanan ilgili bir AF4 yönteminin yeterince iyi çalışıp çalışmadığını belirlemek zordur. Bu, özellikle çok geniş boyutlu dağılımlar sergileyen bilinmeyen örnekler için geçerlidir, burada tüm örnek bileşenlerin normal elution desenini izleyip izlemediği belirsizliğini korur: daha küçük parçacıklardan daha büyük parçacıklara fraksiyonasyon veya daha büyük örnek bileşenlerin sterik-hiperlayer modunda zaten elute olup olmadığı ve böylece potansiyel olarak daha küçük örnek bileşenleri43,44ile birlikte elde edilip edilmediği. Buna ek olarak, FFF-teorisi AF4'ü sadece hidrodinamik boyuttaki farklılıklara dayanarak ayırdığını ve parçacıkların çevreleriyle herhangi bir etkileşimde bulunmadan nokta kütleleri olarak kabul edildiğini vurgulasa da22, gerçeklik parçacık-parçacık ve parçacık-mem ile farklı bir hikaye anlatır beyin etkileşimleri (elektrostatik çekim/itme veya van-der-Waals cazibesi gibi) önemli bir rol oynayabilir ve harici boyut kalibrasyonu45,46aracılığıyla boyut belirlemelerine ölçülebilir bir önyargı getirebilir. Bu nedenle, ilgi çekici parçacığın bileşimine ve yüzey özelliklerine (Zeta potansiyeli) ideal olarak uyan boyut standartlarının kullanılması önerilir40,42 veya, bunlar mevcut değilse, en azından iyi karakterize edilmiş partikül boyutu standartlarını (örneğin, polistiren lateks parçacıklar) kullanın ve özellikle analizinyapılacağıilgili ortamdaki yüzey Zeta potansiyeli açısından ilgi parçacıkları ile karşılaştırılılabilirliklerini dikkatlice değerlendirin.
AF4'ün çok yönlülüğü genellikle en büyük gücü olarak kabul edilir, çünkü bu alandaki diğer yaygın boyutlandırma tekniklerinin çoğunun ötesine geçen bir uygulama aralığı sunar22,48,49. Aynı zamanda, ilişkili muhtemel karmaşıklığı nedeniyle, özellikle DLS, Nanopartikül İzleme Analizi veya tek parçacıklı ICP-MS gibi hızlı ve görünürde kullanımı kolay boyutlandırma tekniklerine karşı en önemli dezavantajı olarak da kabul edilebilir. Bununla birlikte, AF4'ü bu popüler boyutlandırma teknikleri ile perspektife koyarken, tüm tekniklerin artıları ve eksileri olduğu açıktır, ancak hepsi nanopartiküllerin fiziko-kimyasal doğasının daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunur ve bu nedenle rekabetçi değil tamamlayıcı olarak kabul edilmelidir.
Burada sunulan standart çalışma prosedürü (SÇP), BILINMEYEN bir AuNP örneğinin süspansiyonda boyutlandırılması için harici boyut kalibrasyonu ile AF4-UV-vis'in mükemmel uygulanabilirliğini vurgular ve sonunda Horizon 2020 projesi ACEnano (bu ILC'nin sonucu gelecekteki bir yayına konu olacaktır) çerçevesinde yürütülen uluslararası bir detaylandırma karşılaştırması (ILC) içinde bilinmeyen bir AuNP örneğinin AF4 analizi için önerilen bir kılavuz olarak uygulanmıştır. Bu nedenle, bu protokol, AF4'ün nanopartikül karakterizasyonu alanındaki umut verici potansiyelinin altını çizen AF4 metodolojileri25,50,51,52'yi doğrulamak ve standartlaştırmak için teşvik edici ve devam eden uluslararası çabalara katkıda bulunur.
Disclosures
Bu makalenin tüm yazarları, ürünleri bu protokolde kullanılan Postnova Analytics GmbH çalışanlarıdır.
Acknowledgments
Yazarlar, burada sunulan protokolün hazırlanmasının tüm aşamalarında verimli tartışmalar için tüm ACEnano konsorsiyumuna teşekkür eder. Yazarlar ayrıca ACEnano projesi çerçevesinde nº 720952 hibe anlaşması kapsamında Avrupa Birliği Horizon 2020 Programı'ndan (H2020) fon sağlamayı takdir etmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 µm Membrane Filters (hydrophilic PVDF) | Postnova Analytics GmbH | Z-FIL-TEF-002 | Used for filtration of aqueous solutions |
| 0.22 µm PVDF Syringe Filter (d = 33 mm) | Merck Millipore | Durapore Millex | Used for filtration of NovaChem100 |
| Adjustable Volume Pipettes (1000 µL) | Eppendorf AG | Research Plus | Used to prepare diluted AuNP suspensions |
| AF4 cartridge | Postnova Analytics GmbH | AF2000 MF - AF4 Analytical Channel | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| AF4 Membrane - Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO) | Postnova Analytics GmbH | Z-AF4-MEM-612-10KD | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Analytical Balance (0.1 mg precision) | Sartorius | ENTRIS124I-1S | Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution |
| Autosampler | Postnova Analytics GmbH | PN5300 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Channel Oven | Postnova Analytics GmbH | PN4020 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Crossflow Module | Postnova Analytics GmbH | AF2000 MF Control Module | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Disposable Pipette Tips (1000 µL) | Eppendorf AG | ep T.I.P.S | Used to prepare diluted AuNP suspensions |
| Flasks (e.g. 2 liter volume) | neoLab | 1-0199 | Used for eluent storage |
| Focus Pump | Postnova Analytics GmbH | PN1131 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) | Postnova Analytics GmbH | VIA-002 | Used for sample storage |
| Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) | Postnova Analytics GmbH | NovaCal Gold | 50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function |
| Magnetic Stirrer | IKA | VIBRAX-VXR | Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW |
| Personal Computer (PC) | Dell Technologies | / | Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual |
| Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.) | / | / | In accordance with respective laboratory’s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials |
| Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) | Postnova Analytics GmbH | Z-VIA-09150868 | Used for sample storage |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), ≥99 %, Blotting Grade | Carl Roth GmbH & Co KG | 2326.1 | Used for the preparation of the cleaning solution |
| Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, ≥98 %, p.a | Carl Roth GmbH & Co KG | 6771.1 | Used for the preparation of the cleaning solution |
| Software Package for Control and Data Acquisition | Postnova Analytics GmbH | NovaFFF AF2000 Software | Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual |
| Software Package for Data Evaluation | Postnova Analytics GmbH | NovaAnalysis Software | Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual |
| Software Package for final Data Processing | OriginLab Corporation | Origin 2019 | Used for final data processing |
| Solvent Degasser | Postnova Analytics GmbH | PN7520 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Solvent Selector | Postnova Analytics GmbH | PN7310 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Solvent Organizer | Postnova Analytics GmbH | PN7140 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Surfactant Mixture | Postnova Analytics GmbH | NovaChem100 | Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation |
| Tip Pump | Postnova Analytics GmbH | PN1130 | Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript |
| Unknown AuNP sample | BBI Solutions | EM.GC60 | 60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function |
| UV-vis Detector | Postnova Analytics GmbH | PN3211 | UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system |
| Vacuum Filtration Unit | Postnova Analytics GmbH | Eluent Filtration System | Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions |
| Vortex | IKA | Vortex Genie 2 | Used for homogenization of diluted AuNP suspensions |
| Water Purification System | Merck Millipore | Milli-Q Integral 5 | Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 MΩcm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions |
References
- Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Gold nanoparticles in biology and medicine: recent advances and prospects. Acta Naturae. 3 (2), 34-55 (2011).
- Wagner, F. E., et al. Before striking gold in gold-ruby glass. Nature. 407 (6805), 691-692 (2000).
- Hunt, L. B. The true story of Purple of Cassius. Gold Bulletin. 9 (4), 134-139 (1976).
- Higby, G. J. Gold in medicine. Gold Bulletin. 15 (4), 130-140 (1982).
- Faraday, M. X. The Bakerian Lecture. -Experimental relations of gold (and other metals) to light. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 147, 145-181 (1857).
- Borries, B. v, Kausche, G. A. Übermikroskopische Bestimmung der Form und Größenverteilung von Goldkolloiden. Kolloid-Zeitschrift. 90 (2), 132-141 (1940).
- Turkevich, J., Hillier, J. Electron Microscopy of Colloidal Systems. Analytical Chemistry. 21 (4), 475-485 (1949).
- Homberger, M., Simon, U. On the application potential of gold nanoparticles in nanoelectronics and biomedicine. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical, and Engineering Sciences. 368 (1915), 1405-1453 (2010).
- Cordeiro, M., Ferreira Carlos, F., Pedrosa, P., Lopez, A., Baptista, P. V. Gold Nanoparticles for Diagnostics: Advances towards Points of Care. Diagnostics. 6 (4), Basel, Switzerland. 43 (2016).
- Vines, J. B., Yoon, J. H., Ryu, N. E., Lim, D. J., Park, H. Gold Nanoparticles for Photothermal Cancer Therapy. Frontiers in Chemistry. 7, 167 (2019).
- Dreaden, E. C., Austin, L. A., Mackey, M. A., El-Sayed, M. A. Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery. Therapeutic Delivery. 3 (4), 457-478 (2012).
- Safh, B. P., Antosh, M. Effect of size on gold nanoparticles in radiation therapy: Uptake and survival effects. Journal of Nanomedicine. 2 (1), 1013-1020 (2019).
- Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of size and concentration of gold nanoparticles from UV-Vis spectra. Analytical Chemistry. 79 (11), 4215-4221 (2007).
- Zheng, T., Bott, S., Huo, Q. Techniques for accurate sizing of gold nanoparticles using dynamic light scattering with particular application to chemical and biological sensing based on aggregate formation. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (33), 21585-21594 (2016).
- Liu, J., Murphy, K. E., MacCuspie, R. I., Winchester, M. R. Capabilities of single particle inductively coupled plasma mass spectrometry for the size measurement of nanoparticles: a case study on gold nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (7), 3405-3414 (2014).
- Contado, C., Argazzi, R. Size sorting of citrate reduced gold nanoparticles by sedimentation field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1216 (52), 9088-9098 (2009).
- Calzolai, L., Gilliland, D., Garcìa, C. P., Rossi, F. Separation and characterization of gold nanoparticle mixtures by flow-field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1218 (27), 4234-4239 (2011).
- Schmidt, B., et al. Quantitative characterization of gold nanoparticles by field-flow fractionation coupled online with light scattering detection and inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (7), 2461-2468 (2011).
- Mekprayoon, S., Siripinyanond, A. Performance evaluation of flow field-flow fractionation and electrothermal atomic absorption spectrometry for size characterization of gold nanoparticles. Journal of Chromatography. A. , (2019).
- López-Sanz, S., Rodríguez Fariñas, N., Zougagh, M., Rios, A., Rodriguez Martín-Doimeadios, R. C. C. AF4-ICP-MS as a powerful tool for the separation of gold nanorods and nanospheres. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. , Advance Article (2020).
- Giddings, C. J. A new separation concept based on a coupling of concentration and flow nonuniformities. Separation Science. 1 (1), 123-125 (1966).
- Schimpf, M. E., Caldwell, K., Giddings, J. C. Field-flow fractionation handbook. , Wiley-Interscience. (2000).
- Contado, C. Field flow fractionation techniques to explore the "nano-world". Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (10), 2501-2518 (2017).
- Wahlund, K. G., Giddings, J. C. Properties of an asymmetrical flow field-flow fractionation channel having one permeable wall. Analytical Chemistry. 59 (9), 1332-1339 (1987).
- ISO. ISO /TS 21362:2018 Nanotechnologies - of nano-objects using asymmetrical-flow and centrifugal field-flow fractionation. ISO. , (2018).
- Gogos, A., Kaegi, R., Zenobi, R., Bucheli, T. D. Capabilities of asymmetric flow field-flow fractionation coupled to multi-angle light scattering to detect carbon nanotubes in soot and soil. Environmental Science: Nano. 6 (1), 584-594 (2014).
- Müller, D., et al. Integration of inverse supercritical fluid extraction and miniaturized asymmetrical flow field-flow fractionation for the rapid analysis of nanoparticles in sunscreens. Analytical Chemistry. 90 (5), 3189-3195 (2018).
- Capomaccio, R., et al. Gold nanoparticles increases UV and thermal stability of human serum albumin. Biointerphases. 11 (4), (2016).
- Levak, M., et al. Effect of protein corona on silver nanoparticle stabilization and ion release kinetics in artificial seawater. Environmental Science & Technology. 51 (3), 1259-1266 (2017).
- Mehn, D., et al. Larger or more? Nanoparticle characterisation methods for recognition of dimers. RSC Advances. 7 (44), 27747-27754 (2017).
- Sogne, V., Meier, F., Klein, T., Contado, C. Investigation of zinc oxide particles in cosmetic products by means of centrifugal and asymmetrical flow field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1515, 196-208 (2017).
- Cumberland, S. A., Lead, J. R. Particle size distributions of silver nanoparticles at environmentally relevant conditions. Journal of Chromatography. A. 1216 (52), 9099-9105 (2009).
- de Carsalade du pont, V., et al. Asymmetric field flow fractionation applied to the nanoparticles characterization: Study of the parameters governing the retention in the channel. International Congress of Metrology. , (2019).
- Loeschner, K., et al. Optimization and evaluation of asymmetric flow field-flow fractionation of silver nanoparticles. Journal of Chromatography. A. 1272, 116-125 (2013).
- Mudalige, T. K., Qu, H., Linder, S. W. An improved methodology of asymmetric flow field flow fractionation hyphenated with inductively coupled mass spectrometry for the determination of size distribution of gold nanoparticles in dietary supplements. Journal of Chromatography. A. 1420, 92-97 (2015).
- Dubascoux, S., Von Der Kammer, F., Le Hécho, I., Gautier, M. P., Lespes, G. Optimisation of asymmetrical flow field flow fractionation for environmental nanoparticles separation. Journal of Chromatography. A. 1206 (2), 160-165 (2008).
- Hagendorfer, H., et al. Application of an asymmetric flow field flow fractionation multi-detector approach for metallic engineered nanoparticle characterization - and limitations demonstrated on Au nanoparticles. Analytica Chimica Acta. 706 (2), 367-378 (2011).
- Geiss, O., Cascio, C., Gilliland, D., Franchini, F., Barrero-Moreno, J. Size and mass determination of silver nanoparticles in an aqueous matrix using asymmetric flow field flow fractionation coupled to inductively coupled plasma mass spectrometer and ultraviolet-visible detectors. Journal of Chromatography. A. 1321, 100-108 (2013).
- Makselon, J., Siebers, N., Meier, F., Vereecken, H., Klumpp, E. Role of rain intensity and soil colloids in the retention of surfactant-stabilized silver nanoparticles in soil. Environmental Pollution. 238, 1027-1034 (2018).
- Bolea, E., Jiménez-Lamana, J., Laborda, F., Castillo, J. R. Size characterization and quantification of silver nanoparticles by asymmetric flow field-flow fractionation coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (9), 2723-2732 (2011).
- Barahona, F., et al. Simultaneous determination of size and quantification of silica nanoparticles by asymmetric flow field-flow fractionation coupled to ICPMS using silica nanoparticles standards. Analytical Chemistry. 87 (5), 3039-3047 (2015).
- Aureli, F., D'Amato, M., Raggi, A., Cubadda, F. Quantitative characterization of silica nanoparticles by asymmetric flow field flow fractionation coupled with online multiangle light scattering and ICP-MS/MS detection. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30, 1266-1273 (2015).
- Myers, M. N., Giddings, J. C. Properties of the transition from normal to steric field-flow fractionation. Analytical Chemistry. 54 (13), 2284-2289 (1982).
- Giddings, J. C. Retention (steric) inversion in field-flow fractionation: practical implications in particle size, density and shape analysis. Analyst. 118 (12), 1487-1494 (1993).
- Wahlund, K. G. Flow field-flow fractionation: Critical overview. Journal of Chromatography. A. 1287, 97-112 (2013).
- Bendixen, N. L., Adlhart, S., Lattuada, C., Ulrich, A. Membrane-particle interactions in an asymmetric flow field flow fractionation channel studied with titanium dioxide nanoparticles. Journal of Chromatography A. 1334, 92-100 (2014).
- Qu, H., Quevedo, I. R., Linder, S. W., Fong, A., Mudalige, T. K. Importance of material matching in the calibration of asymmetric flow field-flow fractionation: material specificity and nanoparticle surface coating effects on retention time. Journal of Nanoparticle Research. 18 (10), 292 (2016).
- Giddings, J. C. Field-flow fractionation: analysis of macromolecular, colloidal, and particulate materials. Science. 260 (5113), 1456-1465 (1993).
- Cascio, C., Gilliland, D., Rossi, F., Calzolai, L., Contado, C. Critical experimental evaluation of key methods to detect, size and quantify nanoparticulate silver. Analytical Chemistry. 86 (24), 12143-12151 (2014).
- Caputo, F., et al. Measuring particle size distribution by asymmetric flow field flow fractionation: a powerful method for the pre-clinical characterisation of lipid-based nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 756-767 (2019).
- Parot, J., Caputo, F., Mehn, D., Hackley, V. A., Calzolai, L. Physical characterization of liposomal drug formulations using multi-detector asymmetrical-flow field flow fractionation. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 320, 495-510 (2020).
- ASTM. ASTM WK68060 - New Test Method for Analysis of Liposomal Drug Formulations using Multidetector Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation (AF4). ASTM. , (2019).
