Summary
선천성 횡격막 탈장 및 태아 기관 폐색의 다양한 동물 모델은 윤리적 문제, 비용, 수술 어려움, 크기, 생존율 및 유전 도구의 가용성에 관한 장점과 단점을 제시합니다. 이 모델은 기관 폐색과 폐 발달에 대한 증가된 발광 압력의 영향을 연구하는 새로운 도구를 제공합니다.
Abstract
태아 기관 폐색성 (TO), 확립 된 치료 양식, 심한 선천성 다이어프라진 탈장 (CDH)에서 태아 폐 성장과 생존을 촉진. 다음, 분비 된 상피 액의 보존 발광 압력을 증가 하 고 폐 성장을 유도. 다양한 동물 모델은 CDH 및 TO의 병리생리학을 이해하도록 정의되었습니다. 모든 기술의 어려움, 동물의 크기, 비용, 높은 사망률 및 유전 도구의 가용성과 같은 자신의 장점과 단점이 있습니다. 본명, 뮤린 태아 TO의 새로운 트랜스투테린 모델이 설명된다. 임신 한 마우스는 마취되었고, 자궁은 중간 선 복강경 절제술을 통해 노출되었다. 선택된 태아의 기관체는 기관 뒤에 놓인 단일 transuterine 봉합사, 1개의 경동맥 및 1개의 경정맥으로 합리화되었습니다. 댐은 폐쇄되어 복구할 수 있었습니다. 태아는 부분화 직전에 수집되었습니다. 폐대 체중 비율은 대조군 태아보다 높았다. 이 모델은 연구자가 폐 발달에 대한 TO 및 증가된 발광 압력의 영향을 연구하는 새로운 도구를 제공합니다.
Introduction
선천성 횡격막 탈장 (CDH)은 1:2500 임신에서 발생하며 폐 성 저형성증 및 신생아 폐 고혈압1,2,3,4,5,6의결과를 초래한다. 태아 기관 폐색(TO)은 26-30번째 임신 주에 태아검사를 수반하는 중증 CDH 환자에서 확립된 산전 요법으로, 풍선은 카리나 바로 위에 놓인 후32nd 임신 주에 제거된다. 이 임시 TO 태아 폐 성장을 유도 하 고 생존을 향상. 선천성 고기도 방해 증후군은 폐 증식과 관련된 치명적인 상태입니다, 이는 분비 된 상피 액의 보존을 촉진하기 위해 기관의 인공 폐색을 수행하도록 외과 의사영감을. 이러한 폐색은 발광 압력을 증가시키고 폐 성장유도 7. 그러나, 폐색은 상피 세포 성숙을 가능하게 하기 위하여 반전되어야 합니다.
CDH와 TO의 다양한 동물 모델 - 소, 토끼, 쥐 및 마우스 - CDH와 TO의 병리 생리학을 이해하기 위해 개발되었습니다. 모든 기술의 어려움, 동물의 크기, 비용, 높은 사망률 및 유전 도구의 가용성과 같은 자신의 장점과 단점이 있습니다. 오바인 모델에 사용되는 수술 기술은 인간에서 사용되는 것과 매우 유사하며 되돌릴 수 있지만,이 모델의 주요 단점은 동물의 비용, 긴 임신 기간 및 가능한 제한된 수의 수술입니다. 토끼 모델은 임신 기간이 짧고 양 모델보다 저렴합니다. 그러나 토끼 모델은 돌이킬 수 없는8,9. 뮤린 모델은 가장 낮은 비용, 임신 당 태아의 가장 높은 수, 가장 특징적인 게놈, 세포 및 분자 분석을 위한 널리 이용 가능한 공구를 가지고 있습니다. 그러나, 주요 단점은 TO의 가역성의 부족, TO의 영향에 대한 완전한 이해를 방지. 본명, 전술한 모델의 모든 장점을 결합하고 쉽고 잠재적으로 가역적이며 최소침습설치류 TO 모델을 생성하는 방법이 제시된다.
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Protocol
모든 실험은 실험실 동물의 치료 및 사용을위한 국립 보건 원 가이드 (NIH 간행물 번호 80023, 개정 1978)를 준수했습니다. 절차는 신시내티 아동 연구 재단 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 #2016-0068 IACUC 프로토콜으로 승인되었습니다.
1. 준비
- 연령일치 야생형(WT) C57BL/6 마우스를 짝짓기하려면 6:00 p.m에 같은 케이지에 넣고 다음 날 9:00 a.m에 분리합니다.
- 배아일 0(E0)을 결정하려면, 질 벽에 부착된 균일한 외부 영역과 섬유질이 형성되고 플러그 재료의 섬유와 혼합된 매스를 형성하는 일부 정자를 포함하는 질 플러그를 살펴보십시오.
- 짝짓기 시에 마우스의 무게를 기록합니다.
- 지속적인 임신을 보장하기 위해 E10에 마우스를 다시 무게.
- E16.5 (초기 캐날리큘러 스테이지)에서 수술을 수행하십시오.
- 가위, 바늘 홀더, 집게, 클램프, 수술 용 칼 과 손잡이 : 수술 중에 사용될 악기를 살균.
- 수술 플랫폼을 24°C로 예열하고 수술 전에 따뜻한 식염수(24°C)를 준비한다.
- 회복을 위한 따뜻한 환경을 조성하고 젖은 음식을 케이지 안에 넣어 조기 수유를 합니다.
- 스스로 먹을 수 있을 때까지 수술된 동물들과 함께 지내십시오.
- 수술 후 수술된 마우스를 개별 케이지에 홀로 보관하십시오.
2. 마취
- 시술 전 1시간 전에 임신한 댐에 피하 0.1 mg/kg의 부프레노르핀을 적용하십시오.
- 흡입된 5mL/h의 이소플루란을 유도하고 마취 시술 중에 2mL/h를 지속적으로 사용하십시오.
- 임신 한 마우스의 턱의 움직임을 모니터링합니다.
3. 라파로토미
- 알코올과 포비도요오드로 복부 표면을 청소하십시오. 작동 내내 멸균 상태를 유지합니다.
- 임신 한 댐의 복강경에 대한 수직 절개를 수행합니다. 모든 레이어를 별도로 잘라냅니다.
- 양쪽에 자궁 뿔을 식별합니다.
- 수술 후보 태아를 결정합니다.
참고: 질에 가장 가까운 태아에서 작동하지 마십시오. - 각 측면에 태아의 짝수가있는 경우 각 자궁 경적 (대부분의 4)에 두 개의 태아에 작동하고 자궁의 홀수 (대부분의 경우 3)가있는 경우 각 자궁 경적에서 태아 1 개에 작동합니다.
4. 기관 폐쇄
- 시각화를 위해 2.5배 배율 안경을 사용하십시오.
- 자궁 경적을 횡방향 방식으로 배치합니다.
- 새끼를 위로 향하며 새끼의 눈을 사용하여 두 손가락과 꼬리 사이에 태아를 배치하는 가이드로 가져 가라.
- 강아지의 머리에 부드러운 압력을 가하여 머리를 연장하여 목의 시각화를 허용하십시오.
- TO(도 1)를수행하기 위해 외상성 바늘로 6.0 폴리프로필렌 봉합사를 사용한다. 측면에 태반을 유지하고 바늘의 입구와 출구 지점에서 멀리.
- 바늘을 태반에서 멀리 떨어진 자궁의 측면을 통해 목의 1/3rd 전방 부분을 통해 삽입합니다.
- 바늘을 목의 중간선까지 부드럽게 움직인 다음 앞쪽 부분으로 옮김한 다음 기관 사이의 목과 경동맥 칼집과 자궁 맞은편에서 나옵니다.
- 봉합사를 매듭, 멤브레인과 자궁 벽의 무결성을 유지하기 위해주의, 매듭 동안 안전하게 탯줄을 유지.
도 1: 기관 폐색. (A)목을 통과하는 트랜스테르인 봉합사. (B)봉합사가 매듭을 통과한 후 구조물의 회로도 표현. 약어: C = 경동맥; J = 경정맥; T = 기관체; E = 식도; V = 척추. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 복벽 폐쇄
- 복부에 자궁 경적을 교체합니다.
- 닫기 전에 복막 구멍에 따뜻한 멸균 식염수 2mL를 주입하십시오.
- 5/0 폴리글락틴 봉합사를 넣어 복벽을 닫고, 비실행 실크 봉합사로 피부를 닫습니다.
- 진통에 대 한 peritoneonehperoneh의 0.1 mg/kg를 적용 하 고 따뜻한 인큐베이터에서 댐의 복구를 허용.
6. 수확
- 임신 한 댐에 마취를 적용하고 제왕 절개에 의해 E18.5에서 모든 태아를 수확하십시오.
- 태아의 움직임을 보면서 태아의 생존 가능성을 확인하십시오.
- 안락사에 대 한 적어도 두 개의 다른 기술을 사용: 이산화탄소 부당 및 자궁 경부 탈구.
- 수의학 실험실의 규정에 따라 시체를 제거합니다.
- 모든 태아의 무게를 측정합니다.
- 흉부 절제술을 위해 흉부에 수직 절개를 수행하여 폐를 제거합니다.
- 배아의 폐를 해부하고 체중 비율(LBWR =(왼쪽 폐 중량 + 오른쪽 폐 중량)/체중 x100)에 대한 총 폐를 계산하도록 무게를 측정합니다.
7. 히스토로지
- 액체 질소, 최적의 절삭 온도 화합물 및 드라이 아이스에서 조직을 스냅 동결합니다.
- 극저온을 사용하여 10 μm 섹션의 샘플을 잘라 폴리 리신 코팅 슬라이드에 장착합니다.
- 하룻밤 사이에 60°C에서 슬라이드를 굽고, 와이드필드 현미경을 사용하여 10-20배 배율로 이미지 획득을 위해 장착하기 전에 헤마톡슬린과 에오신으로 구운 슬라이드를 얼룩지게 합니다.
8. 단백질 및 DNA 분석을 위한 조직 처리
- 해부된 태아 폐를 스냅 동결하고, 방사성 면역 침전 분석 분석 버퍼의 300 μL에서 균질화한다. 원심분리기는 4°C에서 18,000× g에서5분 동안.
- 단백질, DNA 및 RNA10,12를추출하고 정량화한다.
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Representative Results
이 연구 결과는 37개의 태아를 검토했습니다: 20 (54.1%) TO vs. 17 (45.9%) 제어로. 기관으로 폐색 될 수 없습니다 4 TO 그룹에 태아, 그들은 연구에서 제외 되었다. 두 그룹에서 사망률에 큰 차이가 없었다: 4 태아 (25%) TO 그룹에서 2 태아 (12%) 대조군(p=0.334, 확률비율(OR) 2.5, 95% 신뢰구간(CI) 0.39-16.05). 평균 체중, 폐 중량 및 폐대 체중 비율(LBWR)은 대조군(표1)보다TO 그룹에서 더 높았다. TO와 대조군 사이에 는 LBWR(p=0.006)에 큰 차이가 있었다.
DNA, RNA 및 단백질은 LBWR(도2)의차이에 대한 이유를 결정하기 위해 정량화되었다. 폐 DNA 양과 DNA/단백질 비율은 TO 그룹에서 더 높았으며, 폐 RNA에서 차이가 관찰되지 않았으며, 단백질 양은 대조군보다 TO 그룹에서 더 낮았으며, 이전에 토끼 TO 모델에서 관찰된 바와 같이 상피 증식증이12개에 주목되었다. TO 그룹에서 기도의 직경도 증가를 보였다.
E18.5 폐의 조직학적 분석은 TO 군의 폐가 주관적으로 더 많은 수의핵(그림 2)으로중앙 및 황실 영공을 팽창시켰을 때 대조군 샘플에서 상피 표면 사이의 상피 표면 과 두껍게 한 간질및 개발의 후기 캐날리큘러/초기 반구 단계를 보여주었다. 이 증가된 세포성은 폐 DNA의 양에 있는 주의된 증가와 일치합니다.
그림 2: 그룹의 특징. (A)태아 의 체중 비율에 대한 폐를 정상화하고,(B)폐 DNA 대 단백질 비,(C)폐 DNA 함량은 폐 중량으로 정상화되고,(D)폐 RNA 함량은 폐 중량으로 정상화되고,(E)폐 단백질 함량은 폐 중량으로 정상화된다. (F)C57BL/6 E18.5 폐의 대표적인 헤마톡시린 및 에오신 이미지(스케일 바 = 50 μm) 및(G)태아 경피기관 폐색을 통해 기도의 증식과 탈구 비행공간의 증가된 크기를 보여주는; 스케일 바 = 100 μm. 대조군(n=9) 및 기관 폐색(TO) (n=6)의 비교는 학생의 t-test를사용하여 수행하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 표 1: 그룹의 형태별 결과 | |||
| 받는 사람 | 제어 | p | |
| 태아 무게 (mg) | 1100.52 ± 229.38 | 1087.15 ± 172.32 | 0.896 |
| 폐 중량 (mg) | 28.41 ± 5.87 | 23.38 ± 3.09 | 0.043 |
| LBWR | 0.0259 ± 0.0021 | 0.0217 ± 0.0028 | 0.006* |
| 표준 편차를 ± 의미로 표현된 값입니다. 약어: LBWR = 폐에서 태아 체중 비율; TO = 기관 폐색. | |||
| *95% 신뢰구간 0.0222-0.0249. 학생의 t-시험에 비해 그룹. | |||
표 1: 그룹의 형태별 결과
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Discussion
이 방법은 마우스에 있는 태아 기관 폐색의 외과 절차 및 폐 발달에 그것의 충격을 기술합니다. 성공적인 TO를 위해 신중하게 수행해야 하는 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 수술이 일어나는 플랫폼의 따뜻함과 복막 구멍에 도입 된 식염수는 임신의 진행에 매우 중요합니다. 또한, 목의 노출을 보장하기 위해 새끼의 머리에 약간의 압력을 가해야 한다.
6.0 폴리프로필렌 봉합사는 이 기술에 사용할 수 있는 유일한 봉합사입니다. 6.0보다 큰 봉합사의 바늘은 두껍고 목의 기관 주위의 구조를 파괴하여 태아의 손실을 초래합니다. 얇은 봉합사의 바늘은 매우 짧고 E16.5 새끼 (초기 캐날리큘러 스테이지)의 목을 통과 할 수 없습니다. 또한, 커팅 바늘은 인접한 구조물을 파괴할 수 있기 때문에 적절하지 않다.
이 모델에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 쥐와 인간 사이의 폐 발달 단계 및 임신 기간의 상관 관계에 차이가 있다. 둘째, 마우스에서 CDH를 개발하기가 어렵고 마지막으로, 혈역학 적 연구는 마우스 모델에서 수행하기 어렵다. 그러나, 이 연구 결과에 있는 짧은 학습 곡선은 태아 사망률에 있는 극적인 감소 귀착되었습니다. 앞서 언급했듯이, 동물의 비용뿐만 아니라 그들의 유지 보수, 임신 당 태아의 수, 임신 기간의 길이, 유전 도구의 제한된 가용성은 토끼와 양 모델의 주요 제한 요인입니다.
이 마우스 모형의 첫번째 이점은 TO를 위한 히스테리절제술을 위한 필요를 제거하고 이 연구 결과에서 관찰된 낮은 사망률을 차지하는 자궁11에서반전될 가능성이 있다는 것입니다. 둘째, 동물의 비용과 유지 보수 및 짧은 임신 기간의 감소는 더 넓은 범위의 실험을 용이하게합니다. 셋째, 저체온증 및 마취와 같은 합병증의 비기술적 원인은 수술 기간이 짧아 예방됩니다. 마지막으로, 마우스에서 사용할 수있는 유전 도구의 다양한 CDH의 병리 생리학을 이해하는 더 많은 연구로 이어질 것입니다. CDH의 니트로펜 및 녹아웃 모델에서 태아의 생생한 탄생과 함께 트랜스 투테린 봉합사의 제거는이 기술의 미래 응용 프로그램이 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 공공, 상업 또는 비영리 부문의 자금 조달 기관으로부터 특별한 보조금을 받지 못했습니다. 모든 저자는 데이터의 연구, 수집, 분석 및 해석의 개념 및 설계에 상당한 기여를했으며, 기사를 작성하고 중요한 지적 콘텐츠와 제출 할 버전의 최종 승인을 위해 수정했습니다. 저자는 수술 기술의 작품의 생산에 자신의 친절한 노력에 대한 칸 사툰쿠울루 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | For regional anesthesia |
| Isoflurane | Halocarbon Life Sciences | NDC 66794-017-25 | For general anesthesia |
| Magnification glasses | USA Medical-Surgical | SLR-250LBLK | At least 2.5x |
| Nikon 90i microscope | Nikon | 3417 | Motorized Fluorescence |
| Nucleospin Tissue Kit | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 740952.5 | DNA isolation |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher, IL, USA | 23225 | Protein quantification |
| Polyglactin suture | Ethicon | VCP451H | 4-0, 24 mm, cutting |
| Polylysine slides | VWR | 48382-117 | Microscope adhesion slides |
| Polypropylene suture | Ethicon | Y432H | 6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | R0278-50ml | Protein isolation |
| Silk suture | Ethicon | VCP682G | 4-0, 24 mm, cutting |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation |
References
- Wright, N. J. Global PaedSurg Research Collaboration. Management and outcomes of gastrointestinal congenital anomalies in low, middle and high income countries: protocol for a multicentre, international, prospective cohort study. BMJ Open. 9, 030452 (2019).
- Aydin, E. Current approach for prenatally diagnosed congenital anomalies that requires surgery. Turkish Clinics Journal of Gynecology and Obstetrics. 27, 193-199 (2016).
- Nolan, H., et al. Hemorrhage after on-ECMO repair of CDH is equivalent for muscle flap and prosthetic patch. Journal of Pediatric Surgery. 54 (10), 2044-2047 (2019).
- Aydin, E., et al. Congenital diaphragmatic hernia: the good, the bad, and the tough. Pediatric Surgery International. 35 (3), 303-313 (2019).
- Aydın, E., Özler, O., Burns, P., Lim, F. Y., Peiró, J. L. Left congenital diaphragmatic hernia-associated musculoskeletal deformities. Pediatric Surgery International. 35 (11), 1265-1270 (2019).
- Aydın, E., et al. When primary repair is not enough: a comparison of synthetic patch and muscle flap closure in congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 36 (4), 485-491 (2020).
- Wilson, M., Difiore, J. W., Peters, C. A. Experimental fetal tracheal ligation prevents the pulmonary hypoplasia associated with fetal nephrectomy: Possible application for congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 28 (11), 1433-1440 (1993).
- Mudri, M., et al. The effects of tracheal occlusion on Wnt signaling in a rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 54 (5), 937-944 (2019).
- Khan, P. A., Cloutier, M., Piedboeuf, B. Tracheal occlusion: a review of obstructing fetal lungs to make them grow and mature. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 145 (2), 125-138 (2007).
- Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
- Beurskens, N., Klaassens, M., Rottier, R., De Klein, A., Tibboel, D. Linking animal models to human congenital diaphragmatic hernia. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 79 (8), 565-572 (2007).
- Varisco, B. M., et al. Excessive reversal of epidermal growth factor receptor and ephrin signaling following tracheal occlusion in rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Molecular Medicine. 22, 398-411 (2016).
