Summary
Diversos modelos animais de hérnia diafragmática congênita e oclusão traqueal fetal apresentam vantagens e desvantagens em relação a questões éticas, custo, dificuldade cirúrgica, tamanho, taxas de sobrevivência e disponibilidade de ferramentas genéticas. Este modelo fornece uma nova ferramenta para estudar o impacto da oclusão traqueal e do aumento da pressão luminal no desenvolvimento pulmonar.
Abstract
A oclusão traqueal fetal (TO), modalidade de tratamento estabelecida, promove o crescimento pulmonar fetal e a sobrevivência em hérnia diafragmática congênita grave (CDH). Após to, a retenção do fluido epitelial secretado aumenta a pressão luminal e induz o crescimento pulmonar. Vários modelos animais foram definidos para entender a fisiopatologia do CDH e to. Todos têm suas próprias vantagens e desvantagens, como a dificuldade da técnica, o tamanho do animal, o custo, altas taxas de mortalidade e a disponibilidade de ferramentas genéticas. Aqui, um novo modelo transuterino de murine fetal TO é descrito. Camundongos gestantes foram anestesiados, e o útero exposto através de uma laparotomia midline. A traqueia dos fetos selecionados foi amarrada com uma única sutura transuterina colocada atrás da traqueia, uma artéria carótida e uma veia jugular. A barragem foi fechada e autorizada a se recuperar. Fetos foram coletados pouco antes da parturição. A relação peso pulmonar e corporal em TO fetos foi maior do que na relação controle dos fetos. Este modelo fornece aos pesquisadores uma nova ferramenta para estudar o impacto tanto do TO quanto do aumento da pressão luminal no desenvolvimento pulmonar.
Introduction
A hérnia diafragmática congênita (CDH) ocorre em 1:2500 gestações e resulta em hipoplasia pulmonar e hipertensão pulmonar neonatal1,2,3,4,5,6. A oclusão traqueal fetal (TO) é uma terapia pré-natal estabelecida em pacientes graves de CDH envolvendo fetoscopia na 26-30ª semana gestacional em que um balão é colocado logo acima da carina e depois removido na 32ª semana gestacional. Este TO temporário induz o crescimento pulmonar fetal e melhora a sobrevivência. A Síndrome congênita da obstrução das vias aéreas altas é uma condição letal associada à hiperplasia pulmonar, que inspirou os cirurgiões a realizar a oclusão artificial da traqueia para promover a retenção do fluido epitelial secretado. Esta oclusão aumentou a pressão luminal e induziu o crescimento pulmonar7. No entanto, a oclusão deve ser revertida para permitir a maturação das células epiteliais.
Vários modelos animais de CDH e TO - ovino, coelho, rato e rato - foram desenvolvidos para entender a fisiopatologia do CDH e to. Todos têm suas próprias vantagens e desvantagens, como a dificuldade da técnica, o tamanho do animal, o custo, altas taxas de mortalidade e a disponibilidade de ferramentas genéticas. Embora a técnica cirúrgica utilizada para o modelo de ovino seja muito semelhante à usada em humanos e possa ser revertida, as principais desvantagens deste modelo são as despesas do animal, o longo período gestacional e o número limitado de cirurgias possíveis. O modelo coelho tem um período gestacional mais curto e é mais barato que o modelo de ovelhas. No entanto, o modelo coelho é irreversível8,9. O modelo murino tem o menor custo, o maior número de fetos por gravidez, o genoma mais caracterizado e ferramentas amplamente disponíveis para análises celulares e moleculares. No entanto, uma desvantagem fundamental é a falta de reversibilidade do TO, impedindo a compreensão completa do impacto do TO. Aqui, é apresentado um método que combina todas as vantagens dos modelos mencionados anteriormente e cria um modelo fácil, potencialmente reversível e minimamente invasivo de roedor TO.
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Protocol
Todos os experimentos foram cumpridos com o Guia Nacional de Atenção e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publications No. 80023, revisado em 1978). O procedimento foi aprovado com o protocolo IACUC #2016-0068 pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Fundação de Pesquisa Infantil de Cincinnati.
1. Preparação
- Para acasalar os ratos C57BL/6 (C57BL/6) com idade, coloque-os na mesma gaiola às 18:00.m. e separe-os às 9:00 da .m. no dia seguinte.
- Para determinar o dia 0 (E0), olhe para o plugue vaginal, que tem uma zona externa homogênea ligada à parede vaginal e uma zona interna que é fibrosa e inclui alguns espermatozoides que formam massas emaranhadas misturadas com as fibras do material plugue.
- Regissuor dos ratos no momento do acasalamento.
- Repesar os camundongos no E10 para garantir a gravidez contínua.
- Realizar a cirurgia em E16,5 (estágio canalicular precoce).
- Esterilize os instrumentos que serão utilizados durante a cirurgia: tesoura, porta agulha, fórceps, grampos e facas cirúrgicas e alças.
- Pré-aqueça a plataforma de cirurgia a 24 °C e prepare soro fisiológico quente (24 °C) antes da cirurgia.
- Crie um ambiente quente para recuperação e deixe comida molhada dentro da gaiola para a alimentação precoce.
- Fique com os animais operados até que eles possam se alimentar sozinhos.
- Mantenha os ratos operados sozinhos em suas gaiolas individuais após a cirurgia.
2. Anestesia
- Aplique 0,1 mg/kg de buprenorfina nas barragens grávidas 1h antes do procedimento.
- Use inalado 5 mL/h de isoflurane para indução e 2 mL/h continuamente durante o procedimento para anestesia.
- Monitore os movimentos dos queixos dos camundongos grávidas.
3. Laparotomia
- Limpe a superfície abdominal com álcool e povidone-iodo. Mantenha condições estéreis durante toda a operação.
- Realize uma incisão vertical para a laparotomia de barragens grávidas. Corte todas as camadas separadamente.
- Identifique chifres uterinos de cada lado.
- Determine os fetos candidatos para a cirurgia.
NOTA: Não opere os fetos mais próximos da vagina. - Opere em dois fetos em cada chifre uterino se houver um número par de fetos em cada lado (4 na maior parte do tempo), e em 1 feto em cada chifre uterino se houver um número ímpar do útero (3 na maioria das vezes).
4. Oclusão traqueal
- Use óculos de ampliação de 2,5x para visualização.
- Posicione o chifre uterino de forma transversal.
- Leve os filhotes, voltados para cima, entre dois dedos usando os olhos dos filhotes e a cauda como guia para posicionar o feto.
- Aplique pressão suave na cabeça do filhote para permitir a extensão da cabeça e, portanto, visualização do pescoço.
- Use uma sutura de polipropileno 6.0 com uma agulha atraumática para realizar TO (Figura 1). Mantenha a placenta ao lado e longe dos pontos de entrada e saída da agulha.
- Insira a agulha transversalmente através do lado do útero longe da placenta através da parte 1/3 anterior do pescoço.
- Mova a agulha suavemente até a linha média do pescoço e direcione-a para a parte anterior, em seguida, saia do pescoço entre a traqueia e em frente à bainha carótida e no útero.
- Ateie a sutura, tomando o cuidado de manter a integridade das membranas e da parede uterina, e mantenha o cordão umbilical seguro durante o nó.
Figura 1: Oclusão traqueal. (A) A sutura transuterina que passa pelo pescoço. (B) Representação esquemática das estruturas após a sutura passar e antes do nó. Abreviaturas: C = Artéria carótida; J = Veia jugular; T =Traquea; E = Esôfago; V = Vértebra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Fechamento da parede abdominal
- Substitua o chifre uterino no abdômen.
- Injete 2 mL de soro estéril quente na cavidade peritoneal antes do fechamento.
- Coloque uma sutura de poliglactina de 5/0 para fechar a parede abdominal e feche a pele com uma sutura de seda não funcionando.
- Aplique 0,1 mg/kg de buprenorfina intraperitonealmente para analgesia, e permita a recuperação da barragem em uma incubadora quente.
6. Colheita
- Aplique anestesia na represa grávida e colde todos os fetos em E18,5 por cesariana.
- Verifique a viabilidade dos fetos observando os movimentos dos fetos.
- Use pelo menos duas técnicas diferentes para a eutanásia: insuflar dióxido de carbono e luxação cervical.
- Remova os corpos de acordo com a regulação do laboratório veterinário.
- Pesar todos os fetos.
- Realize uma incisão vertical no tórax para toracotomia para remover os pulmões.
- Dissecar os pulmões dos embriões e pesá-los para calcular a razão total de peso pulmonar/corporal (LBWR = (peso pulmonar esquerdo + peso pulmonar direito)/peso corporal x100).
7. Histologia
- Congele os tecidos em nitrogênio líquido, composto de temperatura de corte ideal e gelo seco.
- Corte as amostras em seções de 10 μm usando um criostat e monte-as em lâminas revestidas de poli-lise.
- Asse os slides a 60 °C durante a noite, e manche os slides assados com hematoxilina e eosina antes de montá-los para aquisição de imagem em ampliação de 10-20x usando um microscópio widefield.
8. Processamento de tecidos para análises de proteínas e DNA
- Congele os pulmões fetais dissecados e homogeneize-os em 300 μL de tampão de ensaio radioimunoprecipitação. Centrífuga a 4 °C por 5 min a 18.000 × g.
- Extrair e quantificar proteína, DNA e RNA10,12.
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Representative Results
Este estudo analisou 37 fetos: 20 (54,1%) como TO vs. 17 (45,9%) como controle. Como a traqueia não poderia ser ocluída em 4 fetos do grupo TO, elas foram excluídas do estudo. Não houve diferença significativa na mortalidade em ambos os grupos: 4 fetos (25%) no grupo TO e 2 fetos (12%) no grupo controle (p=0,334, razão de odds (OR) 2,5, intervalo de confiança de 95% (IC) 0,39-16,05). A relação peso corporal médio, peso pulmonar e peso pulmonar/corporal (LBWR) foi maior no grupo TO do que no grupo controle(Tabela 1). Houve diferença significativa no LBWR (p=0,006) entre os grupos TO e controle.
DNA, RNA e proteína foram quantificados para determinar a razão da diferença no LBWR (Figura 2). As quantidades de DNA pulmonar e a razão DNA/proteína foram maiores no grupo TO, não foi observada diferença no RNA pulmonar, e as quantidades de proteínas foram menores no grupo TO do que no grupo controle, como observado anteriormente no modelo coelho TO no qual foi observada hiperplasia epitelial12. Os diâmetros das vias aéreas do grupo TO também demonstraram aumento.
Análises histológicas dos pulmões E18,5 mostraram o estágio canalicular/inicial tardio do desenvolvimento pulmonar com espaços aéreos em desenvolvimento e interstício espessado entre superfícies epiteliais nas amostras de controle, enquanto os pulmões do grupo TO tinham espaços aéreos centrais e distais dilatados com números subjetivamente maiores de núcleos(Figura 2). Esse aumento da celularidade é consistente com o notável aumento na quantidade de DNA pulmonar.
Figura 2: Características dos grupos. (A) Razão de peso pulmonar e feto normalizada,(B) DNA pulmonar para proporção de proteína,(C) Conteúdo de DNA pulmonar normalizado para peso pulmonar, (D) Teor de RNA pulmonar normalizado para peso pulmonar, e (E) Teor de proteína pulmonar normalizado para peso pulmonar. (F) Imagens representativas de hematoxilina e eosina de pulmões C57BL/6 E18,5 sem (barra de escala = 50 μm) e (G) com oclusão traqueal transuterina fetal mostrando hiperplasia de condução de vias aéreas e aumento do tamanho dos espaços aéreos distais; barra de escala = 100 μm. A comparação do controle (n=9) e oclusão traqueal (TO) (n=6) foi realizada utilizando-se o teste tdo Aluno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tabela 1: Resultados morfométricos dos grupos | |||
| Para | Controle | P | |
| Peso do feto (mg) | 1100,52 ± 229,38 | 1087,15 ± 172,32 | 0.896 |
| Peso pulmonar (mg) | 28.41 ± 5.87 | 23.38 ± 3.09 | 0.043 |
| LBWR | 0,0259 ± 0,0021 | 0.0217 ± 0,0028 | 0.006* |
| Valores expressos como meios ± desvios padrão. Abreviaturas: LBWR = Razão de peso do pulmão para o corpo fetal; TO = oclusão traqueal. | |||
| *Intervalo de Confiança de 95% 0,0222-0,0249. Grupos comparados com o teste t do Student. | |||
Tabela 1: Resultados morfométricos dos grupos
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Discussion
Este método descreve um procedimento cirúrgico de oclusão traqueal fetal em camundongos e seu impacto no desenvolvimento pulmonar. Existem algumas etapas críticas no protocolo que devem ser cuidadosamente realizadas para o sucesso da TO. O calor da plataforma em que a cirurgia ocorre e o soro fisiológico introduzido na cavidade peritoneal é crucial para a progressão da gravidez. Além disso, uma leve pressão deve ser aplicada na cabeça dos filhotes para garantir a exposição do pescoço.
Uma sutura de polipropileno 6.0 é a única sutura que pode ser usada para esta técnica. As agulhas de suturas maiores que 6.0 são mais grossas e destroem as estruturas ao redor da traqueia no pescoço, resultando na perda do feto. As agulhas das suturas mais finas são muito curtas e não podem passar pelo pescoço de um filhote de E16,5 (estágio canalicular inicial). Além disso, uma agulha de corte não é apropriada, pois pode destruir as estruturas adjacentes.
Este modelo tem algumas limitações. Em primeiro lugar, há uma diferença na correlação dos estágios de desenvolvimento pulmonar e período gestacional entre camundongos e humanos. Em segundo lugar, é difícil desenvolver CDH em camundongos e, finalmente, estudos hemodinâmicos são difíceis de realizar em modelos de camundongos. No entanto, a curta curva de aprendizagem neste estudo resultou em uma redução dramática da taxa de mortalidade fetal. Como dito anteriormente, o custo dos animais, bem como sua manutenção, o número de fetos por gravidez, a duração do período de gravidez e a disponibilidade limitada de ferramentas genéticas são os principais fatores limitantes nos modelos de coelhos e ovinos.
A primeira vantagem desse modelo de camundongo é que ele elimina a necessidade de histerotomia para TO e tem potencial para ser revertido noútero 11, o que explica as baixas taxas de mortalidade observadas neste estudo. Em segundo lugar, a redução do custo dos animais e sua manutenção e um período de gravidez mais curto facilita uma maior gama de experimentos. Em terceiro lugar, as causas não técnicas de complicações, como hipotermia e anestesia, são evitadas pela curta duração da cirurgia. Finalmente, a grande variedade de ferramentas genéticas disponíveis em camundongos levará a mais estudos para entender a fisiopatologia do CDH. A remoção da sutura transuterina com o nascimento vivo do feto nos modelos nitrofen e knockout de CDH serão as futuras aplicações desta técnica.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa não recebeu nenhuma subvenção específica de agências de fomentamento nos setores público, comercial ou sem fins lucrativos. Todos os autores fizeram contribuições substanciais para a concepção e elaboração do estudo, aquisição, análise e interpretação dos dados, elaboração do artigo e revisão para conteúdo intelectual importante e aprovação final da versão a ser submetida. Os autores agradecem a Can Sabuncuoğlu por seus esforços gentis na produção da obra de arte da técnica cirúrgica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | For regional anesthesia |
| Isoflurane | Halocarbon Life Sciences | NDC 66794-017-25 | For general anesthesia |
| Magnification glasses | USA Medical-Surgical | SLR-250LBLK | At least 2.5x |
| Nikon 90i microscope | Nikon | 3417 | Motorized Fluorescence |
| Nucleospin Tissue Kit | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 740952.5 | DNA isolation |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher, IL, USA | 23225 | Protein quantification |
| Polyglactin suture | Ethicon | VCP451H | 4-0, 24 mm, cutting |
| Polylysine slides | VWR | 48382-117 | Microscope adhesion slides |
| Polypropylene suture | Ethicon | Y432H | 6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | R0278-50ml | Protein isolation |
| Silk suture | Ethicon | VCP682G | 4-0, 24 mm, cutting |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation |
References
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