Summary
Olika djurmodeller av medfödda diaphragmatic bråck och fetala trakeal ocklusion presenterar fördelar och nackdelar när det gäller etiska frågor, kostnad, kirurgisk svårighet, storlek, överlevnad och tillgång till genetiska verktyg. Denna modell ger ett nytt verktyg för att studera effekten av både trakeal ocklusion och ökat luminalt tryck på lungutvecklingen.
Abstract
Fetala trakeal ocklusion (TO), en etablerad behandling modalitet, främjar fetala lung tillväxt och överlevnad i allvarliga medfödda diaphragmatic bråck (CDH). Efter TO ökar retentionen av den utsöndrade epitelvätskan luminaltrycket och inducerar lungtillväxt. Olika djurmodeller har definierats för att förstå patofysiologin hos CDH och TO. Alla har sina egna fördelar och nackdelar som teknikens svårighetsgrad, djurets storlek, kostnad, hög dödlighet och tillgången på genetiska verktyg. Häri beskrivs en ny transuterin modell av murin fetala TO. Gravida möss bedövades, och livmodern exponeras via en midline laparotomy. Luftstrupen hos utvalda foster var ligated med en enda transuterin sutur placeras bakom luftstrupen, en halsartären och en halsven. Dammen stängdes och fick återhämta sig. Foster samlades in strax före förlossningen. Lung-till-kroppsvikt förhållandet i TO foster var högre än det i kontroll foster. Denna modell ger forskare ett nytt verktyg för att studera effekten av både TO och ökat luminalt tryck på lungutvecklingen.
Introduction
Medfödda diaphragmatic bråck (CDH) förekommer i 1:2500 graviditeter och resulterar i pulmonell hypoplasi och neonatal pulmonell hypertoni1,2,3,4,5,6. Fetala trakeal ocklusion (TO) är en etablerad prenatala terapi i allvarliga CDH patienter omfattar fetoskopi i 26-30th graviditetslängd veckan där en ballong placeras strax ovanför carina och sedan tas bort i den 32: a graviditetslängd veckan. Denna tillfälliga TO inducerar fetala lungtillväxt och förbättrar överlevnaden. Medfödda High Airway Obstruction Syndrome är ett dödligt tillstånd i samband med lunghyperplasi, som inspirerade kirurger att utföra konstgjord ocklusion av luftstrupen för att främja retention av den utsöndrade epitelvätskan. Denna ocklusion ökade luminal tryck och inducerad lungtillväxt7. Ocklusion bör dock vändas för att möjliggöra epitelcellsmognad.
Olika djurmodeller av CDH och TO - får, kanin, råtta och mus - har utvecklats för att förstå patofysiologin hos CDH och TO. Alla har sina egna fördelar och nackdelar som teknikens svårighetsgrad, djurets storlek, kostnad, hög dödlighet och tillgången på genetiska verktyg. Även om den kirurgiska tekniken som används för fårmodellen är mycket lik den som används hos människor och kan vändas, är de stora nackdelarna med denna modell kostnaden för djuret, den långa graviditetsperioden och det begränsade antalet operationer som är möjliga. Kaninmodellen har en kortare graviditetsperiod och är billigare än fårmodellen. Kaninmodellen är dock oåterkallelig8,9. Murinmodellen har den lägsta kostnaden, det högsta antalet foster som genomser graviditet, det bäst karakteriserade genomet och allmänt tillgängliga verktyg för cellulära och molekylära analyser. En viktig nackdel är dock bristen på reversibilitet hos TO, vilket förhindrar full förståelse för effekterna av TO. Häri presenteras en metod som kombinerar alla fördelar med de tidigare nämnda modellerna och skapar en enkel, potentiellt reversibel och minimalt invasiv gnagare TO-modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök har följt De nationella hälsoinstituten för vård och användning av laboratoriedjur (NIH Publications Nr. 80023, reviderad 1978). Förfarandet godkändes med IACUC-protokoll #2016-0068 av Cincinnati Children's Research Foundation Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Förberedelse
- För att para åldersmatchade vilda (WT) C57BL/6 möss, placera dem i samma bur klockan 18:00.m. och separera dem klockan 9:00.m. nästa dag.
- För att bestämma embryonal dag 0 (E0), titta på vaginalpluggen, som har en homogen yttre zon fäst vid vaginalväggen och en inre zon som är fibrös och innehåller några spermatozoer som bildar intrasslade massor blandade med pluggmaterialets fibrer.
- Registrera mössens vikt vid parningstiden.
- Väg mössen på E10 igen för att säkerställa pågående graviditet.
- Utför operationen på E16.5 (tidigt kanalikelstadium).
- Sterilisera de instrument som ska användas under operationen: sax, nålhållare, tång, klämmor och kirurgiska knivar och handtag.
- Förvärm operationsplattformen till 24 °C och förbered varm saltlösning (24 °C) före operationen.
- Skapa en varm miljö för återhämtning och lämna våt mat inuti buret för tidig utfodring.
- Stanna hos de opererade djuren tills de kan mata sig själva.
- Håll de opererade mössen ensamma i sina individuella burar efter operationen.
2. Anestesi
- Applicera subkutan 0,1 mg/kg buprenorfin på de gravida dammarna 1 timme före ingreppet.
- Använd inhalerad 5 ml/h isofluran för induktion och 2 ml/h kontinuerligt under förfarandet för anestesi.
- Övervaka rörelserna hos de gravida mössens hakor.
3. Laparotomy (på andra)
- Rengör bukytan med alkohol och povidone-jod. Håll sterila förhållanden under hela operationen.
- Utför ett vertikalt snitt för laparotomy av gravida dammar. Skär alla lager separat.
- Identifiera livmoderhorn på varje sida.
- Bestäm kandidatfostren för operationen.
OBS: Operera inte fosteren som är närmast slidan. - Operera två foster i varje livmoderhorn om det finns ett jämnt antal foster på varje sida (4 för det mesta) och på 1 foster i varje livmoderhorn om det finns ett udda antal livmoder (3 för det mesta).
4. Trakeal ocklusion
- Använd 2,5x förstoringsglas för visualisering.
- Placera livmoderhornet på ett tvärgående sätt.
- Ta valparna, vända uppåt, mellan två fingrar med valparna och svansen som en guide för att placera fostret.
- Applicera försiktigt tryck på valpens huvud för att möjliggöra förlängning av huvudet och därför visualisering av nacken.
- Använd en 6,0 polypropylen sutur med en atraumatisk nål för att utföra TO (Bild 1). Håll placentan på sidan och långt från nålens in- och utgångspunkter.
- För in nålen tvärs över hela livmodern genom livmoderns sida bort från placentan genom den främre delen av nacken på 1/3rd.
- Flytta nålen försiktigt tills nackens mittlinje och rikta den mot den främre delen och lämna sedan nacken mellan luftstrupen och mittemot halspulsådern och livmodern.
- Knut suturen, var noga med att upprätthålla membranens och livmoderväggens integritet och håll navelsträngen säker under knutning.
Bild 1: Trakeal ocklusion. B)Schematisk representation av strukturerna efter suturen passerar genom och före knuten. Förkortningar: C = Halspulsåder; J = Halsven; T =Luftstrupe; E = Matstrupen; V = Ryggkota. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
5. Stängning av bukvägg
- Byt ut livmoderhornet i buken.
- Injicera 2 ml varm steril saltlösning i bukhonealhålan före stängning.
- Sätt en löpande 5/0 polyglactin sutur för att stänga bukväggen och stäng huden med en icke-löpande silkessutur.
- Applicera 0,1 mg/kg buprenorfin intraperitoneally för analgesi och låt dammen återhämta sig i en varm inkubator.
6. Skörd
- Applicera anestesi på den gravida dammen och skörda alla foster på E18.5 genom kejsarsnitt.
- Kontrollera fostrets livskraft genom att titta på fosterens rörelser.
- Använd minst två olika tekniker för dödshjälp: koldioxidsufflation och förskjutning av livmoderhalscancer.
- Ta bort kropparna enligt veterinärlaboratoriets förordning.
- Väg alla foster.
- Utför ett vertikalt snitt på bröstkorgen för thoracotomy för att ta bort lungorna.
- Dissekera embryonas lungor och väg dem för att beräkna det totala förhållandet mellan lunga och kroppsvikt (LBWR = (vänster lungvikt + höger lungvikt)/kroppsvikt x100).
7. Histologi
- Snäpp-frys vävnaderna i flytande kväve, optimal skärtemperaturförening och torris.
- Skär proverna i 10 μm sektioner med en kryostat och montera dem på poly-lysinbelagda diabilder.
- Grädda rutschkanorna vid 60 °C över natten och färga de bakade rutschkanorna med hematoxylin och eosin innan du monterar dem för bildförvärv vid 10-20x förstoring med hjälp av ett widefieldmikroskop.
8. Vävnadsbehandling för protein- och DNA-analyser
- Snap-frysa dissekerade fetala lungor och homogenisera dem i 300 μL radioimmunoprecipitation analysbuffert. Centrifug vid 4 °C i 5 min vid 18 000 × g.
- Extrahera och kvantifiera protein, DNA och RNA10,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie undersöktes 37 foster: 20 (54,1 %) jämfört med 17 (45,9 %) som kontroll. Eftersom luftstrupen inte kunde ocklusuderas i 4 foster i TO-gruppen uteslöts de från studien. Det fanns ingen signifikant skillnad i dödlighet i båda grupperna: 4 foster (25%) i TO-gruppen och 2 foster (12%) i kontrollgruppen (p=0,334, oddskvot (OR) 2,5, 95% konfidensintervall (CI) 0,39-16,05). Medelvikten, lungvikten och förhållandet mellan lungvikt och kroppsvikt (LBWR) var högre i TO-gruppen än i kontrollgruppen (tabell 1). Det fanns en betydande skillnad i LBWR (p=0,006) mellan TO och kontrollgrupper.
DNA, RNA och protein kvantifierades för att fastställa orsaken till skillnaden i LBWR (figur 2). Lung-DNA-mängder och DNA/proteinförhållandet var högre i TO-gruppen, ingen skillnad observerades i lung-RNA och proteinmängderna var lägre i TO-gruppen än i kontrollgruppen, vilket tidigare observerats i kaninen TO-modellen där epitelhyperplasinoterades 12. Luftvägarnas diametrar i TO-gruppen uppvisade också en ökning.
Histologiska analyser av E18,5 lungorna visade det sena canalicular/tidiga saccular stadiet av lung utveckling med utvecklande luftrum och förtjockade interstitium mellan epitelial ytor i kontrollproverna medan lungorna i TO gruppen hade dilaterade centrala och distala luftrum med subjektivt högre antal atomkärnor (figur 2). Denna ökade cellularity är förenlig med den noterade ökningen av mängden lung-DNA.
Figur 2: Gruppernas egenskaper. A)Normaliserat förhållande mellan lungvikt och fostrets vikt,(B)Lung-DNA till proteinförhållande,(C)Lung-DNA-innehåll normaliserat till lungvikt,(D)Lung-RNA-halt normaliserat till lungvikt och (E) Lungproteininnehåll normaliserat till lungvikt. F)Representativa hematoxylin- och eosinbilder av C57BL/6 E18,5 lungor utan (skalstreck = 50 μm) och (G) med fetal transuterin trakeal ocklusion som visar hyperplasi av ledande luftvägar och ökad storlek på distala luftrum. skalstång = 100 μm. Jämförelse av kontroll (n=9) och trakeal ocklusion (TO) (n=6) utfördes med hjälp av Studentenst-test. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Tabell 1: Morfometriska resultat av grupper | |||
| till | kontroll | S. | |
| Fostrets vikt (mg) | 1100.52 ± 229.38 | 1087.15 ± 172.32 | 0.896 |
| Lungvikt (mg) | 28.41 ± 5.87 | 23.38 ± 3.09 | 0.043 |
| LBWR (lbwr) | 0.0259 ± 0.0021 | 0.0217 ± 0.0028 | 0.006* |
| Värden uttryckta som ± standardavvikelser. Förkortningar: LBWR = Lung till fetala kroppsviktsförhållande; TO = trakeal ocklusion. | |||
| *95% Konfidensintervall 0,0222–0,0249. Grupper jämfört med Deltagarens t-test. | |||
Tabell 1: Morfometriska resultat av grupper
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod beskriver ett kirurgiskt ingrepp av fetala trakeal ocklusion hos möss och dess inverkan på lung utveckling. Det finns några kritiska steg i protokollet som bör utföras noggrant för framgångsrik TO. Värmen i plattformen där operationen äger rum och saltlösningen som införs i bukhhålan är avgörande för graviditetens utveckling. Dessutom måste ett litet tryck appliceras på valparna för att säkerställa exponering av nacken.
En 6,0 polypropylen sutur är den enda suturen som kan användas för denna teknik. Nålarna av suturer större än 6,0 är tjockare och förstör strukturerna runt luftstrupen i nacken, vilket resulterar i förlust av fostret. Nålarna på de tunnare suturerna är mycket korta och kan inte passera genom nacken på en E16,5-valp (tidigt kanalikelstadium). Dessutom är en skärnål inte lämplig eftersom den kan förstöra de intilliggande strukturerna.
Den här modellen har vissa begränsningar. För det första finns det en skillnad i korrelationen mellan lungutvecklingsstadierna och graviditetsperioden mellan möss och människor. För det andra är det svårt att utveckla CDH hos möss och slutligen är hemodynamiska studier svåra att genomföra i musmodeller. Den korta inlärningskurvan i denna studie resulterade dock i en dramatisk minskning av fosterdödligheten. Som nämnts tidigare är kostnaden för djuren samt deras underhåll, antalet foster som genomser graviditet, graviditetsperiodens längd och begränsad tillgång till genetiska verktyg de viktigaste begränsande faktorerna i kanin- och fårmodeller.
Den första fördelen med denna musmodell är att den eliminerar behovet av hysterotomi för TO och har potential att vändas i utero11, vilket står för låg dödlighet som observerats i denna studie. För det andra underlättar minskningen av djurens kostnader och deras underhåll och en kortare graviditetsperiod ett större utbud av experiment. För det tredje förhindras icke-tekniska orsaker till komplikationer, såsom hypotermi och anestesi, av den korta varaktigheten av kirurgi. Slutligen kommer det stora utbudet av genetiska verktyg som finns tillgängliga hos möss att leda till fler studier för att förstå patofysiologin hos CDH. Avlägsnandet av transuterin sutur med fostrets levande födelse i nitrofen och knockout-modellerna av CDH kommer att vara de framtida tillämpningarna av denna teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning fick inget särskilt bidrag från finansiärer inom den offentliga, kommersiella eller ideella sektorn. Alla författare har lämnat betydande bidrag till utformningen och utformningen av studien, förvärv, analys och tolkning av data, utarbetande av artikeln och översyn av den för viktigt intellektuellt innehåll och slutligt godkännande av den version som ska lämnas in. Författarna tackar Can Sabuncuoğlu för hans vänliga ansträngningar för produktion av konstverket av den kirurgiska tekniken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | For regional anesthesia |
| Isoflurane | Halocarbon Life Sciences | NDC 66794-017-25 | For general anesthesia |
| Magnification glasses | USA Medical-Surgical | SLR-250LBLK | At least 2.5x |
| Nikon 90i microscope | Nikon | 3417 | Motorized Fluorescence |
| Nucleospin Tissue Kit | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 740952.5 | DNA isolation |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher, IL, USA | 23225 | Protein quantification |
| Polyglactin suture | Ethicon | VCP451H | 4-0, 24 mm, cutting |
| Polylysine slides | VWR | 48382-117 | Microscope adhesion slides |
| Polypropylene suture | Ethicon | Y432H | 6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | R0278-50ml | Protein isolation |
| Silk suture | Ethicon | VCP682G | 4-0, 24 mm, cutting |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation |
References
- Wright, N. J. Global PaedSurg Research Collaboration. Management and outcomes of gastrointestinal congenital anomalies in low, middle and high income countries: protocol for a multicentre, international, prospective cohort study. BMJ Open. 9, 030452 (2019).
- Aydin, E. Current approach for prenatally diagnosed congenital anomalies that requires surgery. Turkish Clinics Journal of Gynecology and Obstetrics. 27, 193-199 (2016).
- Nolan, H., et al. Hemorrhage after on-ECMO repair of CDH is equivalent for muscle flap and prosthetic patch. Journal of Pediatric Surgery. 54 (10), 2044-2047 (2019).
- Aydin, E., et al. Congenital diaphragmatic hernia: the good, the bad, and the tough. Pediatric Surgery International. 35 (3), 303-313 (2019).
- Aydın, E., Özler, O., Burns, P., Lim, F. Y., Peiró, J. L. Left congenital diaphragmatic hernia-associated musculoskeletal deformities. Pediatric Surgery International. 35 (11), 1265-1270 (2019).
- Aydın, E., et al. When primary repair is not enough: a comparison of synthetic patch and muscle flap closure in congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 36 (4), 485-491 (2020).
- Wilson, M., Difiore, J. W., Peters, C. A. Experimental fetal tracheal ligation prevents the pulmonary hypoplasia associated with fetal nephrectomy: Possible application for congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 28 (11), 1433-1440 (1993).
- Mudri, M., et al. The effects of tracheal occlusion on Wnt signaling in a rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 54 (5), 937-944 (2019).
- Khan, P. A., Cloutier, M., Piedboeuf, B. Tracheal occlusion: a review of obstructing fetal lungs to make them grow and mature. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 145 (2), 125-138 (2007).
- Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
- Beurskens, N., Klaassens, M., Rottier, R., De Klein, A., Tibboel, D. Linking animal models to human congenital diaphragmatic hernia. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 79 (8), 565-572 (2007).
- Varisco, B. M., et al. Excessive reversal of epidermal growth factor receptor and ephrin signaling following tracheal occlusion in rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Molecular Medicine. 22, 398-411 (2016).
