Summary
Forskellige dyremodeller af medfødt membran brok og føtal tracheal okklusion udgør fordele og ulemper med hensyn til etiske spørgsmål, omkostninger, kirurgiske vanskeligheder, størrelse, overlevelsesrater og tilgængelighed af genetiske værktøjer. Denne model giver et nyt værktøj til at studere virkningen af både tracheal okklusion og øget luminal pres på lungeudvikling.
Abstract
Føtal tracheal okklusion (TO), en etableret behandling modalitet, fremmer fosterets lungevækst og overlevelse i svær medfødt membran brok (CDH). Efter TO øger fastholdelsen af den udskillede epitelvæske det luminale tryk og fremkalder lungevækst. Forskellige dyremodeller er blevet defineret for at forstå patofysiologien af CDH og TO. Alle har deres egne fordele og ulemper såsom teknikkens sværhedsgrad, dyrets størrelse, omkostninger, høje dødelighed og tilgængeligheden af genetiske værktøjer. Heri beskrives en ny transuterin model af murine føtal TO. Gravide mus blev bedøvet, og livmoderen udsat via en midline laparotomi. Luftrøret af udvalgte fostre blev ligated med en enkelt transuterin sutur placeret bag luftrøret, en halspulsåre, og en halspulsåre. Dæmningen blev lukket og fik lov til at komme sig. Fostre blev indsamlet lige før fødsel. Forholdet mellem lunge og kropsvægt i TO fostre var højere end hos kontrolfostre. Denne model giver forskere et nyt værktøj til at studere virkningen af både TO og øget luminalt pres på lungeudvikling.
Introduction
Medfødt membran brok (CDH) forekommer i 1:2500 graviditeter og resulterer i lungehyperplasi og neonatal pulmonal hypertension1,2,3,4,5,6. Føtal tracheal okklusion (TO) er en etableret prænatal behandling hos alvorlige CDH-patienter, der involverer fetoskopi i den 26-30th svangerskabsuge, hvor en ballon er placeret lige over carinaen og derefter fjernet i 32nd svangerskabsuge. Denne midlertidige TO fremkalder fostrets lungevækst og forbedrer overlevelsen. Medfødt High Airway Obstruktion Syndrom er en dødelig tilstand forbundet med lungehyperplasi, som inspirerede kirurger til at udføre kunstig okklusion af luftrøret for at fremme tilbageholdelsen af den udskillede epitelvæske. Denne okklusion øgede det luminale tryk og inducerede lungevækst7. Okklusionen bør dog vendes for at muliggøre epitelcellemodning.
Forskellige dyremodeller af CDH og TO - får, kanin, rotte og mus - er udviklet til at forstå patofysiologien af CDH og TO. Alle har deres egne fordele og ulemper såsom teknikkens sværhedsgrad, dyrets størrelse, omkostninger, høje dødelighed og tilgængeligheden af genetiske værktøjer. Selvom den kirurgiske teknik, der anvendes til fåremodellen, ligner meget den, der anvendes hos mennesker og kan vendes, er de største ulemper ved denne model bekostning af dyret, den lange svangerskabsperiode og det begrænsede antal mulige operationer. Kaninmodellen har en kortere svangerskabsperiode og er billigere end fåremodellen. Kaninmodellen er dog irreversibel8,9. Murinmodellen har de laveste omkostninger, det højeste antal fostre pr. graviditet, det bedst karakteriserede genom og bredt tilgængelige værktøjer til cellulære og molekylære analyser. En væsentlig ulempe er imidlertid den manglende reversibilitet af to-aftalen, hvilket forhindrer fuld forståelse af to-to-to's virkninger. Heri præsenteres en metode, der kombinerer alle fordelene ved de tidligere nævnte modeller og skaber en let, potentielt reversibel og minimalt invasiv gnaver TO-model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg har været i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 80023, revideret 1978). Proceduren blev godkendt med IACUC protokol #2016-0068 af Cincinnati Children's Research Foundation Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Forberedelse
- At parre aldersmatchede wild-type (WT) C57BL/6 mus, placere dem i samme bur på 6:00 p.m og adskille dem på 9:00 a.m. den næste dag.
- For at bestemme embryonal dag 0 (E0), se på vaginal stikket, som har en homogen ydre zone knyttet til vaginalvæggen og en indre zone, der er fiber og omfatter nogle spermatozoer, der danner sammenfiltrede masser blandet med fibrene i stikmaterialet.
- Registrer musenes vægt på parringstidspunktet.
- Omvej musene på E10 for at sikre løbende graviditet.
- Udfør operationen på E16.5 (tidlig canalicular fase).
- Steriliser de instrumenter, der skal bruges under operationen: saks, nåleholder, pincet, klemmer og kirurgiske knive og håndtag.
- Forvarm operationsplatformen til 24 °C, og forbered varm saltvand (24 °C) inden operationen.
- Skab et varmt miljø for genopretning, og lad våd mad inde i buret til tidlig fodring.
- Bliv hos de opererede dyr, indtil de kan fodre sig selv.
- Hold de opererede mus alene i deres individuelle bure efter operationen.
2. Anæstesi
- Der påføres subkutane 0,1 mg/kg buprenorphin på de gravide dæmninger 1 time før proceduren.
- Der anvendes inhaleret 5 mL/h isofluran til induktion og 2 mL/h kontinuerligt under anæstesiproceduren.
- Overvåg bevægelserne af hagerne hos de gravide mus.
3. Laparotomi
- Rengør abdominal overflade med alkohol og povidone-jod. Opretholde sterile forhold under hele operationen.
- Udfør et lodret snit til laparotomi af gravide dæmninger. Skær alle lag separat.
- Identificer livmoderhorn på hver side.
- Bestem kandidat fostrene til operationen.
BEMÆRK: Brug ikke på fostrene, der er tættest på skeden. - Operere på to fostre i hvert livmoderhorn, hvis der er et lige antal fostre på hver side (4 det meste af tiden), og på 1 foster i hvert livmoderhorn, hvis der er et ulige antal livmoderen (3 det meste af tiden).
4. Tracheal okklusion
- Brug 2,5x forstørrelsesbriller til visualisering.
- Placer livmoderhornet på en tværgående måde.
- Tag hvalpene, der vender opad, mellem to fingre ved hjælp af hvalpenes øjne og halen som en guide til at placere fosteret.
- Påfør blidt tryk på hvalpens hoved for at tillade udvidelse af hovedet og derfor visualisering af nakken.
- Brug en 6,0 polypropylen sutur med en atraumatic nål til at udføre TIL (Figur 1). Hold moderkagen på siden og langt fra nålens indgangs- og udgangssteder.
- Sæt nålen tværgående gennem siden af livmoderen væk fra moderkagen gennem 1/3rd forreste del af halsen.
- Flyt nålen forsigtigt, indtil midterlinjen af halsen og direkte den til den forreste del, derefter forlade halsen mellem luftrøret og overfor halspulstiden kappe og livmoder.
- Knude suturen, pas på at opretholde membranernes og livmodervæggens integritet, og hold navlestrengen sikker under knuder.
Figur 1: Tracheal okklusion. (B) Skematisk repræsentation af strukturerne efter suturen passerer gennem og før knuden. Forkortelser: C = Halspulsåren; J = Halspulsåre; T =Luftrør; E = Spiserøret; V = Ryghvirvel. Klik her for at se en større version af dette tal.
5. Lukning af mavevæggen
- Udskift livmoderhornet i maven.
- Der injiceres 2 mL varm steril saltvand i peritonealhulen inden lukning.
- Sæt en løbende 5/0 polyglactin sutur for at lukke bugvæggen, og luk huden med en ikke-kørende silke sutur.
- Påfør 0,1 mg/kg buprenorphin intraperitoneally for analgesi, og lad genopretningen af dæmningen i en varm inkubator.
6. Høst
- Påfør anæstesi til den gravide dæmning, og høst alle fostre på E18.5 ved kejsersnit.
- Kontroller fostrenes levedygtighed ved at se fostrenes bevægelser.
- Brug mindst to forskellige teknikker til aktiv dødshjælp: kuldioxid insufflation og livmoderhalskræft dislokation.
- Fjern ligene i henhold til veterinærlaboratoriets regulering.
- Vejer alle fostre.
- Udfør et lodret snit på brystkassen for thoracotomi for at fjerne lungerne.
- Dissekere lungerne af embryoner, og veje dem til at beregne den samlede lunge til kropsvægt ratio (LBWR = (venstre lungevægt + højre lungevægt) / kropsvægt x100).
7. Histologi
- Snap-fryse væv i flydende nitrogen, optimal skæretemperatur sammensatte, og tøris.
- Prøverne skæres i 10 μm sektioner ved hjælp af en kryostat, og montere dem på poly-lysin-coatede dias.
- Bag rutsjebanerne ved 60 °C natten over, og plette de bagte dias med hematoxylin og eosin, før du monterer dem til billedopsamling ved 10-20x forstørrelse ved hjælp af et widefield mikroskop.
8. Vævsbehandling til protein- og DNA-analyser
- Snap-fryse dissekeret foster lunger, og homogenisere dem i 300 μL af radioimmunoprecipitation assay buffer. Centrifuge ved 4 °C i 5 min ved 18.000 × g.
- Ekstrakt og kvantificere protein, DNA og RNA10,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne undersøgelse undersøgte 37 fostre: 20 (54,1%) som TO mod 17 (45,9%) som kontrol. Da luftrøret ikke kunne medregnes i 4 fostre i TO-gruppen, blev de udelukket fra undersøgelsen. Der var ingen signifikant forskel i dødeligheden i begge grupper: 4 fostre (25%) i TO-gruppen og 2 fostre (12 %) i kontrolgruppen (p=0,334, odds ratio (OR) 2,5, 95% konfidensinterval (CI) 0,39-16,05). Den gennemsnitlige kropsvægt, lungevægt og forholdet mellem lunge og kropsvægt (LBWR) var højere i TO-gruppen end i kontrolgruppen(tabel 1). Der var en betydelig forskel i LBWR (p=0,006) mellem TO og kontrolgrupperne.
DNA, RNA og protein blev kvantificeret for at bestemme årsagen til forskellen i LBWR (Figur 2). Lunge-DNA-mængder og DNA/protein-forholdet var højere i TO-gruppen, der blev ikke observeret nogen forskel i lunge-RNA, og proteinmængderne var lavere i TO-gruppen end i kontrolgruppen, som tidligere observeret i kanin-TO-modellen, hvor epitelhyperplasi blev bemærket12. Luftvejenes diameter i TO-gruppen viste også en stigning.
Histologiske analyser af E18.5 lungerne viste den sene canalicular/early saccular fase af lungeudvikling med udvikling af luftrummet og fortykket interstitium mellem epiteloverflader i kontrolprøverne, mens lungerne i TO-gruppen havde udvidet det centrale og distale luftrum med subjektivt højere antal kerner (Figur 2). Denne øgede cellulæritet er i overensstemmelse med den noterede stigning i mængden af lunge-DNA.
Figur 2: Gruppernes karakteristika. (A) Normaliseret vægtforhold mellem lunge og foster (B) Forholdet mellem lunge-DNA og protein (C) Lunge-DNA-indhold normaliseret til lungevægt, (D) Lunge-RNA-indhold normaliseret til lungevægt og (E) Lungeproteinindhold normaliseret til lungevægt. f) repræsentative hematoxylin- og eosinbilleder af C57BL/6 E18.5 lunger uden (skalastang = 50 μm) og (G) med føtal transuterin tracheal okklusion, der viser hyperplasi af ledende luftveje og øget størrelse af distale luftrum; skalastang = 100 μm. Sammenligning af kontrol (n=9) og tracheal okklusion (TO) (n=6) blev udført ved hjælp af Student's t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Tabel 1: Morphometriske resultater for grupper | |||
| til | kontrol | P. | |
| Fostervægt (mg) | 1100,52 ± 229,38 | 1087.15 ± 172.32 | 0.896 |
| Lungevægt (mg) | 28.41 ± 5.87 | 23.38 ± 3.09 | 0.043 |
| LBWR | 0,0259 ± 0,0021 | 0,0217 ± 0,0028 | 0,006* |
| Værdier udtrykt som middel ± standardafvigelser. Forkortelser: LBWR = Forholdet mellem lunge og føtal kropsvægt; TO = tracheal okklusion. | |||
| *95% Konfidensinterval 0,0222-0,0249. Grupper sammenlignet med Student's t-test. | |||
Tabel 1: Morphometriske resultater for grupper
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode beskriver en kirurgisk procedure for føtal tracheal okklusion hos mus og dens indvirkning på lungeudvikling. Der er nogle kritiske trin i protokollen, der skal udføres omhyggeligt for at få succes med to. Varmen fra den platform, hvor operationen finder sted, og saltvandet, der indføres i peritonealhulen, er afgørende for graviditetens progression. Derudover skal der påføres et lille tryk på hvalpenes hoved for at sikre eksponering af nakken.
En 6,0 polypropylen sutur er den eneste sutur, der kan bruges til denne teknik. Nålene af suturer større end 6,0 er tykkere og ødelægger strukturerne omkring luftrøret i nakken, hvilket resulterer i tab af fosteret. Nålene på de tyndere suturer er meget korte og kan ikke passere gennem nakken på en E16.5 hvalp (tidlig canalicular fase). Desuden er en skærenål ikke hensigtsmæssig, da den kan ødelægge de tilstødende strukturer.
Denne model har nogle begrænsninger. For det første er der en forskel i sammenhængen mellem lungeudviklingsstadierne og svangerskabsperioden mellem mus og mennesker. For det andet er det svært at udvikle CDH hos mus, og endelig er hæmodynamiske undersøgelser vanskelige at gennemføre i musemodeller. Den korte indlæringskurve i denne undersøgelse resulterede imidlertid i et dramatisk fald i fosterdødeligheden. Som tidligere nævnt er omkostningerne ved dyrene såvel som deres vedligeholdelse, antallet af fostre pr. graviditet, længden af graviditetsperioden og begrænset tilgængelighed af genetiske værktøjer de vigtigste begrænsende faktorer i kanin- og fårmodeller.
Den første fordel ved denne musemodel er, at den eliminerer behovet for hysterotomi for TO og har potentialet til at blive vendt i livmoder11, hvilket tegner sig for lave dødelighedsrater observeret i denne undersøgelse. For det andet letter reduktionen i dyrenes omkostninger og vedligeholdelse og en kortere graviditetsperiode et større udvalg af forsøg. For det tredje, ikke-tekniske årsager til komplikationer, såsom hypotermi og anæstesi, er forhindret af den korte varighed af operationen. Endelig vil den brede vifte af genetiske værktøjer, der er tilgængelige i mus, føre til flere undersøgelser for at forstå CDH's patofysiologi. Fjernelsen af den transuterin sutur med fostrets levende fødsel i nitrofen- og knockout-modellerne af CDH vil være de fremtidige anvendelser af denne teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning modtog ikke noget specifikt tilskud fra finansieringsorganer i den offentlige, kommercielle eller almennyttige sektor. Alle forfattere har ydet betydelige bidrag til udformningen og udformningen af undersøgelsen, erhvervelsen, analysen og fortolkningen af data, udarbejdelsen af artiklen og revisionen af den for vigtigt intellektuelt indhold og endelig godkendelse af den version, der skal indsendes. Forfatterne takker Can Sabuncuoğlu for hans venlige indsats på produktionen af illustrationen af den kirurgiske teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | For regional anesthesia |
| Isoflurane | Halocarbon Life Sciences | NDC 66794-017-25 | For general anesthesia |
| Magnification glasses | USA Medical-Surgical | SLR-250LBLK | At least 2.5x |
| Nikon 90i microscope | Nikon | 3417 | Motorized Fluorescence |
| Nucleospin Tissue Kit | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 740952.5 | DNA isolation |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher, IL, USA | 23225 | Protein quantification |
| Polyglactin suture | Ethicon | VCP451H | 4-0, 24 mm, cutting |
| Polylysine slides | VWR | 48382-117 | Microscope adhesion slides |
| Polypropylene suture | Ethicon | Y432H | 6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | R0278-50ml | Protein isolation |
| Silk suture | Ethicon | VCP682G | 4-0, 24 mm, cutting |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation |
References
- Wright, N. J. Global PaedSurg Research Collaboration. Management and outcomes of gastrointestinal congenital anomalies in low, middle and high income countries: protocol for a multicentre, international, prospective cohort study. BMJ Open. 9, 030452 (2019).
- Aydin, E. Current approach for prenatally diagnosed congenital anomalies that requires surgery. Turkish Clinics Journal of Gynecology and Obstetrics. 27, 193-199 (2016).
- Nolan, H., et al. Hemorrhage after on-ECMO repair of CDH is equivalent for muscle flap and prosthetic patch. Journal of Pediatric Surgery. 54 (10), 2044-2047 (2019).
- Aydin, E., et al. Congenital diaphragmatic hernia: the good, the bad, and the tough. Pediatric Surgery International. 35 (3), 303-313 (2019).
- Aydın, E., Özler, O., Burns, P., Lim, F. Y., Peiró, J. L. Left congenital diaphragmatic hernia-associated musculoskeletal deformities. Pediatric Surgery International. 35 (11), 1265-1270 (2019).
- Aydın, E., et al. When primary repair is not enough: a comparison of synthetic patch and muscle flap closure in congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 36 (4), 485-491 (2020).
- Wilson, M., Difiore, J. W., Peters, C. A. Experimental fetal tracheal ligation prevents the pulmonary hypoplasia associated with fetal nephrectomy: Possible application for congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 28 (11), 1433-1440 (1993).
- Mudri, M., et al. The effects of tracheal occlusion on Wnt signaling in a rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 54 (5), 937-944 (2019).
- Khan, P. A., Cloutier, M., Piedboeuf, B. Tracheal occlusion: a review of obstructing fetal lungs to make them grow and mature. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 145 (2), 125-138 (2007).
- Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
- Beurskens, N., Klaassens, M., Rottier, R., De Klein, A., Tibboel, D. Linking animal models to human congenital diaphragmatic hernia. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 79 (8), 565-572 (2007).
- Varisco, B. M., et al. Excessive reversal of epidermal growth factor receptor and ephrin signaling following tracheal occlusion in rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Molecular Medicine. 22, 398-411 (2016).
