Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إنتاج بروتينات IgG فيوجن أعرب عنها بشكل عابر في نيكوتيانا بنثاميانا

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61774
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School
* These authors contributed equally

Summary

نحن نصف هنا طريقة بسيطة للتعبير، واستخراج، وتنقية IgG الإنسان المؤتلف تنصهر إلى GFP في Nicotiana benthamiana. ويمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول لتنقية وتصور العديد من البروتينات التي تستخدم الكروماتوغرافيا العمود. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول قابل للتكيف مع مختبر التدريس الشخصي والكلي الافتراضي، ويوفر الاستكشاف القائم على المشروع.

Abstract

ارتفاع الطلب على الأجسام المضادة كتدخلات علاجية لمختلف الأمراض المعدية، الأيضية، المناعة الذاتية، النيبلاستيك، وغيرها من الأمراض يخلق حاجة متزايدة في تطوير أساليب فعالة لإنتاج الأجسام المضادة المؤتلفة. اعتبارًا من عام 2019 ، كان هناك أكثر من 70 أجسامًا مضادة أحادية النسيلة وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير ، وهناك إمكانات نمو هائلة. وعلى الرغم من وعدهم، فإن العوامل المقيدة للاستخدام على نطاق واسع هي تكاليف التصنيع وتعقيده. من المحتمل أن تقدم النباتات استراتيجيات تصنيع البروتين منخفضة التكلفة وآمنة وسهلة التوسع. لا يمكن للنباتات مثل Nicotiana benthamiana فقط أن تُطوى وتُجمّع بروتينات الثدييات المعقدة، بل يمكنها أيضًا إضافة تعديلات حاسمة بعد الترجمة مماثلة لتلك التي تقدمها ثقافات خلايا الثدييات. في هذا العمل، باستخدام GFP الأصلي وناديل حمض مستقر من البروتين الفلوري (GFP) منصهرة للأجسام المضادة أحادية النسيلة البشرية، كنا قادرين على تصور التعبير المضاد العابر بأكمله وعملية تنقية من N. النباتات بنثامينا. اعتمادا على الغرض من التجربة ، يمكن أن يضمن الاندماج GFP الأصلي تصورًا أسهل أثناء مرحلة التعبير في النباتات ، بينما يسمح دمج GFP المستقر بالأحماض بالتصور أثناء معالجة المصب. يمكن إجراء هذا الإجراء القابل للتحجيم ومباشر من قبل باحث واحد لإنتاج كميات مليغرام من الأجسام المضادة النقية للغاية أو بروتينات الانصهار الأجسام المضادة في غضون أيام باستخدام عدد قليل من النباتات الصغيرة فقط. ويمكن توسيع هذه التقنية إلى تصور أي نوع من عملية تنقية الأجسام المضادة وربما العديد من البروتينات الأخرى، سواء في النباتات أو غيرها من أنظمة التعبير. وعلاوة على ذلك، يمكن لهذه التقنيات أن تستفيد من التعليمات الافتراضية ويتم تنفيذها في مختبر التدريس من قبل طلاب المرحلة الجامعية الذين يمتلكون الحد الأدنى من الخبرة السابقة مع تقنيات البيولوجيا الجزيئية، وتوفير أساس لاستكشاف المشاريع القائمة مع تطبيقات في العالم الحقيقي.

Introduction

وتشير تقارير الصناعة إلى أن ثلاثة عشر من أصل العقاقير العشرين الأكثر دخلاً في الولايات المتحدة كانت بيولوجية (أدوية قائمة على البروتين)، منها تسعة أدوية مضادة. اعتبارا من عام 2019، كان هناك أكثر من 570 الأجسام المضادة (AB) العلاج في مختلف مراحل التنمية السريرية1,2,3. مبيعات AB العالمية الحالية تتجاوز 100 مليار دولار أمريكي، ومن المتوقع أن يحقق سوق العلاجية Ab (mAb) أحادية النسيلة ما يصل إلى 300 مليار دولار أمريكي بحلول عام 20251،4. مع هذا الطلب المرتفع والزيادات المتوقعة في الإيرادات ، يعمل الباحثون على تطوير طرق لإنتاج علاجات Ab على نطاق أكبر من أي وقت مضى ، مع جودة أعلى وتكاليف أقل. نظم التعبير النباتية لديها العديد من المزايا على خطوط الخلايا الثدييات التقليدية لتصنيع بأسعار معقولة وعلى نطاق واسع من العلاجات Ab5،6. إنتاج علاجات البروتين في النباتات ("pharming الجزيئية") لا يتطلب المفاعلات الحيوية باهظة الثمن أو مرافق زراعة الخلايا كما تفعل الثدييات التقليدية تقنيات زراعة الخلايا7,8. لا يمكن للنباتات أن تُسْتَمِر مسببات الأمراض البشرية، مما يقلل من التلوث المحتمل9. ويمكن استخدام كل من التعبير البروتيني النباتي العابر والمحول وراثياً كبدائل أقل تكلفة لنظم إنتاج الثدييات أو البكتيرية10. على الرغم من أن النباتات المعدلة وراثيا هي المفضلة لإنتاج المحاصيل، إنتاج البروتين المؤتلف باستخدام هذه الطريقة يمكن أن تتطلب أسابيع إلى أشهر. التقدم في التعبير العابر باستخدام ناقلات الفيروسية إما عن طريق حقنة أو فراغ الزراعية تصفية تسمح لإنتاج الصغيرة وعلى نطاق واسع، على التوالي، من البروتين المطلوب في أيام11،12،13،14. إنتاج mAbs ضد الإيبولا، حمى الضنك و، زيكا، والعديد من البروتينات المؤتلفة الأخرى، وقد تم إنتاج وتنقيت بسرعة وكفاءة باستخدام التعبير العابر في N. النباتات بنثاميانا 15،16،17،18،19. هذه الظروف تجعل التعبير النباتي العابر خيارا جذابا لتطوير علاجات Ab متعددة والأساليب التي أظهرت في هذا البروتوكول20.

وكان الجيل الأول mAbs من الاشتقاق المورين، مما أدى إلى عدم مناعة محددة عند استخدامها في التجارب البشرية21. مع مرور الوقت، تم إنتاج الشميرك، أنسانية، وفي نهاية المطاف، ABS الإنسان بالكامل لتقليل المناعة الناجمة عن علاجات Ab. للأسف، بعض هذه عبس لا تزال تسبب المُضيف المناعي بسبب الاختلافات في جليكوسيل21. وقد سمحت التطورات في هندسة النباتات لتعديل جليكلان Ab ، وهو أمر ضروري منذ استقرار Ab وظيفة يمكن أن تتأثر بشكل كبير من قبل الدولة glycosylation22. وقد سمحت التطورات الإنتاج في النظم النباتية من التعبير على مستوى عال من mAbs أنس، التي تحتوي على الجليكانات الإنسان ونتيجة لذلك الصفات البيولوجية المطلوبة من الأدوية البشرية المنتجة على نطاق واسع19،21.

بالإضافة إلى عبس المؤتلف، تم استكشاف جزيئات الانصهار Ab (Ab fusions) لأغراض مختلفة في العقود الأخيرة. يتكون الانصهار AB في كثير من الأحيان من جزء Ab أو Ab منصهر لجزيء أو بروتين ومصممة للحصول على استجابات من الخلايا المناعية23. وقد تم إنشاء هذه الجزيئات كتدخلات علاجية محتملة لعلاج الأمراض المختلفة مثل السرطان وأمراض المناعة الذاتية24,25,26,27. المجمعات المناعية المؤتلفة (RICs) هي فئة أخرى من الانصهار Ab التي تم توظيفها كمرشحين للقاح28. RICs الاستفادة من قدرة الجهاز المناعي للتعرف على مناطق Fc من الانصهار Ab وقد تم العثور على تحسين المناعية عند دمجها مع منصات لقاح أخرى29,30,31.

بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) هو بروتين الإنارة الحيوية المستمدة من قناديل البحر Aequorea فيكتوريا، الذي ينبعث الضوء الأخضر عندما متحمس من قبل الأشعة فوق البنفسجية32،33. على مر السنين، وقد توسعت استخدام GFP كعلامة بصرية للتعبير الجيني من التعبير في Escherichia القولونية إلى العديد من أنظمة التعبير البروتين، بما في ذلك N. النباتات بنثاميانا 34،35،36،37،38. وللعلامات المرئية، مثل برنامج التعليم العام، آثار كثيرة في تدريس المفاهيم العلمية وتعلمها. يصف العديد من الطلاب المبتدئين صعوبات في فهم المفاهيم العلمية عندما تكون الفكرة التي يتم تدريسها غير مرئية للعين المجردة ، مثل مفاهيم البيولوجيا الجزيئية والمجالات ذات الصلة39. وبالتالي، يمكن للعلامات البصرية، مثل برنامج العمل العالمي، أن تسهم في معالجة المعلومات المتعلقة بالعمليات العلمية ويمكن أن تساعد في تقليل الصعوبات التي يبلغ عنها الطلاب في تعلم العديد من المفاهيم العلمية.

على الرغم من أن GFP غالبا ما يستخدم كعلامة للإشارة إلى الجينات والتعبير في الجسم الحي، فمن الصعب تصور ذلك في العمليات المصب إذا كان استخدام الظروف الحمضية. هذا الظرف هو في المقام الأول لأن GFP لا يحافظ على هيكلها وفلورسنس الناتجة في انخفاض40. وغالبا ما تكون هناك حاجة إلى بيئات حمضية مؤقتة في عمليات تنقية مختلفة، مثل البروتين G، البروتين A، و بروتين L الكروماتوغرافيا، وغالبا ما تستخدم لتنقية Ab41،42،43،44. وقد استخدمت المسوخ GFP للاحتفاظ الفلوريسنس تحت الظروف الحمضية45,46.

هنا نحن وصف طريقة بسيطة للتعبير، واستخراج، وتنقية من البروتينات الانصهار IgG المؤتلف في N. النباتات بنثاميانا. أنتجنا GFP التقليدية تنصهر إلى N-هدفينوس من سلسلة ثقيلة IgG أنساء، وخلق الانصهار GFP-IgG. في الوقت نفسه ، طورنا دمج تسلسل codon المصنع الأمثل لGFP حمض مستقرة (asGFP) إلى N-terminus من سلسلة ثقيلة IgG أنس ، وخلق الانصهار asGFP - IgG. مزايا إنتاج GFP-IgG تشمل القدرة على تصور وجود البروتين المستهدف أثناء التعبير، في حين أن asGFP-IgG يسمح برؤية وجود البروتين المؤتلف ليس فقط في التعبير واستخلاص الخطوات ولكن أيضا في خطوات تنقية البروتين. يمكن تكييف هذا البروتوكول لإنتاج وتنقية وتصور مجموعة من بروتينات الانصهار GFP المنتجة في N. benthamiana وتنقيتها باستخدام تقنيات الكروماتوغرافيا التي تتطلب انخفاض في الحموضة. ويمكن أيضا أن تكون مصممة هذه العملية لكميات مختلفة من مواد ورقة. في حين أن Abs والبروتينات الانصهار الموسومة مع GFP أو asGFP لا يقصد استخدامها للعلاجات ، يمكن أن تكون هذه الأساليب مفيدة كضوابط أثناء التجارب ويمكن أيضا أن تستخدم كأداة تعليمية للبيولوجيا الجزيئية والخلوية والتكنولوجيا الحيوية ، سواء في شخص أو تقريبا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. زراعة N. بنثاميانا النباتات

  1. ضع كريات الخث التربة على صينية وتصب مسلوقة سابقا، لا تزال ساخنة (~ 40-45 درجة مئوية)، والمياه على الكريات الخث للتوسع الكامل. بعد يتم توسيع الكريات بالكامل، مكان 2-3 N. بذور بنثاميانا على كل بيليه الخث باستخدام ملاقط.
  2. صب حوالي 0.5 في الماء لتغطية الجزء السفلي من علبة. تسمية علبة مع تاريخ البذر. الاستمرار في المياه الشتلات يوميا مع كميات مناسبة من الأسمدة. تركيز الأسمدة (الأغذية النباتية القابلة للذوبان في الماء لجميع الأغراض) هو عموما 2.5-2.8 غرام / لتر.
  3. غطي الصينية مع أعلى رطب عند وضعها في غرفة النمو. الحفاظ على الكريات الجفت بذر في غرفة النمو في 23-25 درجة مئوية، مع 16 ساعة photoperiod و 60٪ الرطوبة النسبية.
  4. بعد أسبوع واحد، إزالة النباتات اضافية ترك كل بيليه مع شتلة واحدة فقط.
  5. عندما تكون النباتات 2-3 أسابيع من العمر، نقل كل بيليه الخث إلى وعاء الفردية التي تحتوي على التربة مراقبة الرطوبة. هذه المظاهرة استخدمت معجزة غرو السيطرة على الرطوبة بوتينغ التربة.
  6. المياه يوميا مع 1 غرام / لتر الأسمدة. لا تترك التربة جافة تماماً النباتات جاهزة للتسلل عندما تكون 5-6 أسابيع من العمر.

2- إعداد بكتيريا الجرغتريا للتسلل

ملاحظة: يمكن الحصول على بنيات الانصهار GFP-IgG كما هو موضح في هذه الورقة31. تم الحصول على الجين asGFP والنبات الأمثل من هذه الدراسة45. يجب أن يتم الخطوات التالية بجانب ناسخ بونسن، وينبغي تطبيق التقنيات المطهرة الأساسية لتجنب التلوث.

  1. Streak A. tumefaciens EHA105 إيواء فيروس القزم الأصفر الفول (BeYDV)19 ناقلات التعبير النباتي لكل بناء (asGFP-IgG، GFP-IgG, سلسلة خفيفة) من مخزون الجلسرين على LB agar (10 غرام / لتربتون, 10 غرام / لتر NaCl, 5 استخراج الخميرة 5 ز, 15 غرام / L أجار, 50 ميكروغرام / مل kanamycin) لوحة.
  2. تنمو ليوم واحد في حاضنة 30 درجة مئوية الدائمة. عزل مستعمرة واحدة للتحقق من قبل معيار مستعمرة شاشة بروتوكول PCR.
  3. استخدام مستعمرة التحقق من كل بناء. ملء أنبوب مخروطي مع 10 مل من وسائل الاعلام LB (10 غرام / لترتبتون، 10 غرام / لتر NaCl، 5 غرام من استخراج الخميرة، 50 ميكروغرام / مل). بعد ذلك، إضافة 10 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل kanamycin. إضافة 10 ميكرولتر من 2.5 ميكروغرام / مل rifampicin لمنع التلوث الإشريكية القولونية. احتضان في 30 درجة مئوية و 120-150 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
  4. في اليوم التالي، إذا نمت ثقافة البكتيريا الزراعية إلى600 OD = 0.6-0.9، يمكن استخدامها للتسلل. إذا كان متضخمة (OD600 > 1)، وينبغي نقل 1-2 مل إلى LB الطازجة مع المضادات الحيوية ونمت إلى ODالمطلوبة 600. اعتمادا على تركيز الثقافة الأولية، قد يستغرق يومين لنمو إلى OD600 = 0.6-0.9.
  5. مرة واحدة في ODالمناسبة 600، وضع الثقافات في جهاز طرد مركزي ، بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 4500 × ز لمدة 20 دقيقة ، ودرجة حرارة الغرفة (RT).
  6. افرط من كلا العينتين، ومن ثم إعادة الاعتماد على كل بيليه في 1x حاجز التسلل (10 mM 2-(N-morpholino) حمض ethanesulfonic، 10 mM كبريتات المغنيسيوم، وتعديلها إلى 5.5 مع KOH) للحصول على النهائي OD600 = 0.4. وينبغي أن يستغرق هذا حوالي 15-45 مل من العازلة التسلل، اعتمادا على كثافة الثقافة الأولية. الجمع بين وحدات التخزين على قدم المساواة من كل بناء الانصهار IgG مع بناء سلسلة الضوء للحصول على النهائي OD600 = 0.2 لكل بناء في كل أنبوب.

3. الإبرة أقل حقنة الزراعية الترشيح

  1. اتخاذ مقطع الورق تقويمها و5-6 أسابيع N. بنثاميانا النباتات من الخطوة 1. باستخدام حافة حادة مشبك ورقة، وجعل ثقب صغير في الطبقة البشرة الأولى من ورقة على سطح adaxial. تجنب ثقب كل ذلك من خلال الطريق.
    ملاحظة: الأوراق السفلية هي أسهل للتسلل، في حين أن الأوراق على الجزء العلوي من المصنع هي أصعب. عموما، والتعبير عن البروتينات المؤتلف هو أعلى في الأوراق الموجودة في وسط النبات، وهذه الأوراق أيضا الحصول على أقل نخرية.
  2. ملء حقنة 1 مل، دون إبرة المرفقة، مع حل الزراعية البكتيريا المعدة من الخطوة 2. تغطية ثقب المحرز في الخطوة السابقة مع نهاية الحقنة ودفع ببطء لحقن البكتيريا في ورقة بينما تطبيق ضغط مضاد لطيف من وراء ورقة. مشاهدة ورقة داكنة كما يتم حقن الحل دون ممارسة الكثير من الضغط على الحقنة.
  3. محاولة التسلل إلى معظم منطقة ورقة في الحد الأقصى من 3-4 مرات – تلف ورقة المفرطة قد تعوق الغلة البروتين. ورقة النبات المتسللة سوف تظهر في الغالب الظلام من وجهة النظر السفلية.
    ملاحظة: يجب أن يكون هذا الحل البكتيري كافيًا لما لا يقل عن 3-4 نباتات لكل بناء. اتوماتيف أي محلول بكتيري متبقي قبل التخلص منه.

4. تنمو ومراقبة مخترق N. benthamiana

  1. مكان النباتات تسلل مرة أخرى في غرفة النمو والاستمرار في المياه يوميا.
  2. مراقبة أوراق للكلوروز ونخر في المناطق المتسللة. مراقبة النباتات لفلوريسسين GFP (إذا كان GFP موجودًا) تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية طويل وقصير الموجة.
  3. يظهر اليوم 4-5 الفلورس الأعلى من كل من يبني GFP في الأوراق. حصاد جميع الأوراق في 4-5 نقطة في البوصة (أيام بعد التسلل) وزن مجموع المواد ورقة.
  4. استخدمه على الفور لمعالجة المصب أو تخزينه عند -80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزًا للاستخدام.

5. استخراج البروتين

  1. الحفاظ على المخازن المؤقتة وأكواب الخلاط على الجليد أو عند 4 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. إعداد 2-3 مل من الجليد الباردة استخراج العازلة (100 mM تريس-HCl، 50 mM NaCl، 2 mM EDTA، 8 مع HHCL) لكل 1 غرام من المواد النباتية. إضافة 2 mM فينيل ميثيل الفلوريومول (PMSF) من المخزون (100 mM) و 50 mM أسكوبات الصوديوم إلى مخزن الاستخراج قبل الاستخراج.
  3. ضع الأنسجة النباتية من الخطوة 4 في كوب الخلاط المبتدوج. إضافة كمية قياسها من مخزن الاستخراج المبرد إلى كوب الخلاط (كما هو مبين في الخطوة 5.2). ضع كأس الخلاط على الخلاط. خذ ورقة ما قبل القطع من البارا فيلم وتمتد على الجزء العلوي من كوب الخلاط. امزج إلى تجانس مع فواصل زمنية 20 ثانية، مع التحريك بشكل جيد بين دورات المزج حسب الحاجة.
  4. نقل المواد المخلوطة إلى القارق. يُضاف شريط التحريك ويُحرّك في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لتعزيز ذوبان البروتين والسماح بهطول الأمطار من المواد الصلبة.
  5. ضع طبقتين من Miracloth على متنها قارص نظيفة على الجليد وسكب المقتطف من خلاله لإزالة حطام الأوراق الكبيرة. بعد أن يتم سكب كل استخراج، أضعاف Miracloth للضغط على استخراج ورقة المتبقية. يجب أن تظهر استخراج الأخضر الداكن دون الجسيمات مرئية.
  6. نقل 50 ميكرولتر من هذه العينة إلى أنبوب جديد 1.5 مل وتسمية "استخراج المجموع" لتحليلها في وقت لاحق. نقل استخراج إلى أنابيب الطرد المركزي. طرد مركزي ما تبقى من استخراج النبات في 16،000 س ز لمدة 20 دقيقة، 4 درجة مئوية ونقل الماغن إلى أنبوب مخروطي.
  7. تصفية استخراج قابل للذوبان باستخدام حقنة 50 مل ومحقنة مرشح الألياف الزجاجية (0.75 ميكرومتر).
  8. جمع 50 ميكرولتر من عينة بعد الطرد المركزي، تسمية "استخراج قابل للذوبان" لتحليلها في وقت لاحق.

6. بروتين G العمود إجراء الكروماتوغرافيا

ملاحظة: البروتوكول الموصوف هنا هو للجاذبية تدفق اللوني باستخدام بيرس بروتين G الراتنج agarose. إذا كان استخدام راتنج مختلفة، راجع تعليمات الشركة المصنعة للتعديلات. لا تدع الراتنج يجف ويمنع جميع السوائل من التصريف. اِلْصِل المأخذ حسب الحاجة.

  1. إعداد عمود البولي بروبلين الذي يحمل 20 مل من العينة.
  2. تقدير كمية الطين اللازمة اعتمادا على نوع الغلوبولين المناعي المستهدف وتقاربه مع الراتنج. عموما، 3 مل من الطين الكلي مع حجم السرير 1.5 مل كافية لتنقية عدة ملليغرام من Ab.
  3. صب بعناية المبلغ المطلوب من الطين resuspended في العمود توج. افتح منفذ العمود من أسفل العمود واسمح له باستنزفه حتى يختفي معظم المخزن المؤقت.
  4. صب على الفور 10 مل من غسل العازلة 1X PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 مع HCl) على رأس. السماح لها استنزاف وتكرار هذه الخطوة غسل 2x.
  5. تطبيق العينة المصفاة من الخطوة 5 إلى العمود وجمع flowthrough-aliquot 50 μL من flowthrough لتحليل لاحق. حفظ بقية flowthrough في حالة AB لم ربط الراتنج.
    ملاحظة: إعادة تطبيق flowthrough إلى عمود جديد لا ينتج عادةً في عائد جيد; وبالتالي ينصح أن تبدأ مع مادة ورقة جديدة.
  6. غسل الراتنج مرتين مع 10 مل من 1X PBS للحد من الربط غير محددة. إذا رغبت في ذلك، aliquot 50 ميكرولتر من غسل كما المصارف العازلة من خلال العمود للتحقق من أن لا يتم اغص الهدف مع مخزن الغسيل.
  7. إعداد وتسمية خمسة أنابيب مع 125 ميكرولتر من العقيمة 1 م تريس-HCl في 8 pH. هذا هو لتحييد عبس في العازلة elution الحمضية لتجنب التغييرات الهيكلية المحتملة. بدلا من ذلك، إضافة 30 ميكرولتر من 2 M تريس قاعدة للحصول على عينة أقل المخفف.
    تنبيه: أثناء التهيّن، يمكن استخدام الأشعة فوق البنفسجية للتصور. هذا لا يحتاج أن يتمّ طوال المدة من ال elution. إذا كان يتم استخدام الأشعة فوق البنفسجية، تأكد من ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة لتجنب تلف العينين والجلد. لا يحتاج ضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى أن يستخدم خلال خطوة elution.
  8. Elute من عبس عن طريق تطبيق 5 مل من عازلة elution (100 mM الجليسين، 2.5 الرقم الH مع HCl) إلى العمود وجمع 1 كسور مل لكل أنبوب المعينة من الخطوة السابقة.
  9. تجديد العمود فورا عن طريق تطبيق 20 مل من العازلة غسل، تليها 10 مل من العازلة الغسيل. تأكد من عدم ترك الراتنج في بيئة حمضية لفترة طويلة. وينبغي أن تظهر elutions الفلورسنت، وغالبا ما ينظر إلى أعلى fluorescence في elution الثاني ولكن يمكن أن تختلف من استخراج إلى استخراج.
  10. للتخزين، وغسل الراتنج مع 10 مل من 20٪ الإيثانول في برنامج تلفزيوني والسماح لها استنزاف في منتصف الطريق. خلاصة الجزء العلوي، ثم الجزء السفلي من العمود، والحفاظ على تستقيم في 4 °C.
    ملاحظة: عموما، يمكن إعادة استخدام راتنجات البروتين G تصل إلى 10 مرات دون خسارة كبيرة من الكفاءة. راجع إرشادات الشركة المصنعة للحصول على تفاصيل محددة.
  11. حدد تركيز Ab باستخدام مقياس طيفي بقياس الامتصاص عند 280 نانومتر، باستخدام حاجز elution كفراغ. تخزين الذرات في -80 درجة مئوية و aliquot 50 ميكرولتر من كل كسر إلى أنبوب منفصل لمزيد من التحليل.

7. SDS-PAGE للكشف عن الانصهار GFP-Ig

  1. إعداد كافة العينات قبل إعداد SDS-PAGE.
    1. إضافة 4 ميكرولتر من عينة العازلة (6x تقليل العازلة عينة: 3.0 مل من الجلسرين، 0.93 غرام من DTT، 1 غرام من SDS، 7 مل من 4x تريس (pH 6.8) 0.5 M، 1.2 ملغ من البروموفينول الأزرق)؛ (6x غير تقليل العازلة عينة: 3.0 مل من الجلسرين، 1 غرام من SDS، 7 مل من 4x تريس (pH 6.8) 0.5 M، 1.2 ملغ من بروموفينول الأزرق) إلى 20 ميكرولتر من كل عينة (استخراج الإجمالي، استخراج قابل للذوبان، من خلال التدفق، غسل، جميع الكسور elutions) للتحليل. تأكد من تثبيت أغطية الأنبوب بشكل آمن.
    2. علاج فقط تقليل العينات لمدة 5 دقائق في حمام الماء المغلي، ومن ثم وضع عينات لمدة 5 دقائق على الجليد. تدور عينات في microcentrifuge لمدة ~ 5 S وتحميل 20 ميكرولتر من كل عينة في ترتيب جمع في آبار هلام. تحميل 3 ميكرولتر من سلم البروتين ثنائي اللون في بئر منفصلة.
  2. تشغيل هلام SDS-PAGE في ثابت 100 V لفصل الفرقة البروتين المطلوب; يستغرق حوالي 1.5 ساعة. مراقبة سلم كمؤشر لفصل البروتين.
  3. تصور هلام تحت الأشعة فوق البنفسجية لمراقبة الفلورس GFP.
  4. إذا رغبت في ذلك، وصمة عار مع الجل مع وصمة عار Coomassie لتقييم البروتين الكلي في كل عينة. بدلا من ذلك، تنفيذ لطخة الغربية لتقييم البروتين المستهدف باستخدام ABS محددة.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ كل من تلطيخ Coomassie ولطخة الغربية باتباع البروتوكولات القياسية47،48.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

توضح هذه الدراسة طريقة سهلة وسريعة لإنتاج البروتينات المؤتلفة وتصورها في جميع مراحل عمليات المصب. باستخدام N. benthamiana وبعد البروتوكول المقدمة، يمكن أن يتحقق إنتاج البروتين المؤتلف الموصوف هنا في أقل من أسبوع. يظهر سير العمل الكلي للتعبير النباتي، الاستخراج، والتنقية في الشكل 1. يتم عرض مراحل نمو النباتات من الشتلات القديمة لمدة أسبوعين ، والنباتات القديمة لمدة 4 أسابيع ، والنباتات القديمة لمدة 6 أسابيع في الشكل 1A (1-3) ، على التوالي ، في حين أن الشكل 1B يصور التغيرات المورفولوجية في الأوراق بسبب نخر(الشكل 1B-1)أو chlorosis(الشكل 1B-2). قد يحدث نخر في موقع الحقن بين أيام 3-5 بعد التسلل. تعتمد هذه التغييرات في كثير من الأحيان على خصائص البروتين التي يتم التعبير عنها وصحة النباتات المتسللة (يتم فحصها بشكل أكبر في المناقشة). في الوقت نفسه، يمكن أن تعتمد كلورية أيضا على صحة النباتات المستخدمة (مزيد من الدراسة في المناقشة). وتظهر عملية نمو البكتيريا الزراعية والاستعداد للتسلل في الشكل 1C. الشكل 1C-1 يعرض المستعمرات المعزولة من البكتيريا الزراعية. الأرقام 1C (2-5) عرض الظهور المتوقع وسائل الإعلام بعد تلقيح مع مستعمرة معزولة واحدة. راجع الشكل 3 للحصول على مزيد من التفاصيل حول هذه الخطوات. وتظهر عملية تسلل النبات في الشكل 1D وتبدأ بمصنع غير مخترق وتتبعه عملية التسلل. يتم عرض التعبير والاستخراج والتوضيح من البروتينات النباتية في الشكل 1E. يتم وضع مادة الأوراق في الخلاط وهي متجانسة، كما هو موضح في الأشكال 1E (1-3). ثم يتم أخذ عينة تمثل تجانس إجمالي. ثم يتم تصفيتها من خلال Miracloth (الشاش أو حتى مرشح القهوة يمكن أن تحل محل انخفاض النفقات)، والتعليق أوضح هو الطرد المركزي. يسمح الطرد المركزي لفصل المابير عن المواد المتبقية ، كما هو موضح في الأشكال 1E (4-6). ثم يتم تحميل ناظر أوضح على عمود لوني تقارب البروتين G، الشكل 1F (1-3). بعد أن يتم ربط معظم البروتين، الشكل 1F-4، يتم قذف البروتينات من الشكل الراتنج 1F (5،6).

الجدول 1 يعرض النبات الأمثل تسلسل الحمض النووي المستخدمة لإنتاج asGFP45 (الصف العلوي) في pBY! KEAM-GFPasH ناقلات المستخدمة في هذه الدراسة للتعبير عن الانصهار asGFP-IgG وGFP33 (الصف السفلي) في PBYEAM-GFPHgp ناقلات المستخدمة في هذه الدراسة للتعبير عن الانصهار GFP-IgG. تم فحص تسلسل الحمض النووي باستخدام أداة ترجمة البروتين Expasy (https://web.expasy.org/translate/) لتحديد تسلسل الأحماض الأمينية.

يتم عرض لوحة الزراعية البكتيريا تمثيلية أعدت باستخدام هذا البروتوكول في الشكل 2. يجب أن تظهر المستعمرات المطلوبة مستديرة وموحدة في الشكل واللون. المستعمرات أقرب إلى مركز الصفيحة لديها احتمال أعلى للتعبير عن مقاومة كاناميسين. سيتم إعداد الثقافات السائلة من مستعمرة معزولة واحدة.

يظهر المظهر المتوقع للوسائط التي تحتوي على ثقافات في الشكل 3. بناء على التطعيم الأولي لمستعمرة معزولة، سوف تظهر وسائل الاعلام LB أصفر فاتح وشفّار، كما هو مبين في الشكل 3A. بعد حضانة مستعمرة معزولة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية، سوف تظهر وسائل الإعلام LB عكر. كما هو مبين في الشكل 3B، لا يمكن أن ينظر إلى الكائنات من خلال وسائل الإعلام عندما يكون النمو موجودا في LB. بعد الطرد المركزي، يجب أن تتشكل الكريه في الجزء السفلي من الأنبوب. وسوف يكون الأنبوب فصل واضح من وسائل الإعلام LB فوق بيليه وسوف تظهر صفراء فاتحة وشفافة، كما هو مبين في الشكل 3C. يتم التخلص من وسائط LB الفائقة، ويتم إعادة فرض بيليه في حاجز التسلل. في OD600 من 0.2، سوف تظهر وسائل الإعلام العكر، كما هو مبين في الشكل 3D. وينبغي قياس OD600 كما هو موضح في الأساليب.

الشكل 4 يمثل عملية تسلل الأوراق. وينبغي أن الحث طفيف من ورقة مع مشبك ورقة تسفر عن كسر في البشرة ورقة التي لا تمر تماما من خلال ورقة. وينبغي كسر بالكاد ثقب ورقة بحيث يمكن حقن العازلة التسلل في ورقة، كما هو موضح في الشكل 4A-C. يتم حقن تعليق Agrobacterium والعزلي التسلل مباشرة في كسر في ورقة ويغير قليلا لون ورقة تسلل؛ انظر الشكل 4D-F.

يتم تمثيل مظهر الأوراق التي تعبر عن الانصهار IgG في الشكل 5. فإنه يعرض الأوراق التي تعبر عن اندماجات IgGFP-IgG(الشكل 5A)وGFP-IgG الانصهار(الشكل 5C)تحت الضوء الأبيض. إذا كانت الثوابت في هذا البروتوكول تستخدم، عندما تسللت في 0.2 OD600، يجب أن تظهر أوراق صحية في أيام 1-5 لكلا يترك التعبير عن اندماجات asGFP-IgG ويترك التعبير عن اندماج GFP-IgG. قد يكون هناك ظهور طفيف في مواقع الحقن في اليوم 5 ، والذي يظهر عادة من خلال تفتيح الأنسجة النباتية في تلك المناطق. الشكل 5 يعرض أيضا أوراق التعبير عن asGFP-IgG الانصهار(الشكل 5B)وGFP-IgG الانصهار(الشكل 5D)،على التوالي، تحت موجة طويلة من ضوء الأشعة فوق البنفسجية من عرض ورقة أعلى. الفلوريسنس يزيد في كثافة كما تقدم الأيام لكلا البناء أعرب. الأوراق التي تعبر عن اندماجات asGFP-IgG تميل إلى أن يكون لها فلورا أقل كثافة قليلا من الأوراق التي تعبر عن اندماج GFP-IgG في جميع الأيام.

عندما يتم إضافة supernatant من استخراج asGFP-IgG إلى عمود G البروتين، وسوف تصبح الراتنج الأخضر قليلا تحت الضوء الأبيض بسبب أصباغ الكلوروفير النباتية (الشكل 6A). إضافة مُنَتَجَّر تحت الموجة القصيرة للأشعة فوق البنفسجية ينتج عنه تراكم الفلوروس في راتنج البروتين G، كما هو مبين في الشكل 6B. لاحظ أن المُنَتَكّن سيكون أيضاً مفلوراً فقط تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. ومع ذلك، من المتوقع أن يكون الفلورسينس أكثر تركيزاً عندما يبدأ الانصهار asGFP-IgG في ربط الراتنج.

بعد مرور من مُنَتَكَل من asGFP-IgG من خلال راتنج G البروتين، ينبغي أن تضيء الراتنج تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية موجة قصيرة، كما هو مبين في الشكل 7A. عند هذه النقطة، فإن معظم IgG تكون ملزمة إلى الراتنج. عند إضافة العازلة elution، فإن الفلوريسين الواردة في بروتين الراتنج G لا تزال مرئية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية موجة قصيرة وسوف تبدأ في فقدان كثافة كما أكثر عازلة elution من انخفاض درجة حري يمر من خلال الراتنج. سوف تبدأ الفلوريسنس في التراكم في الدوات (الشكل 7B). سوف تختلف كسور الجزيئات في الفلور. كما رأينا في الشكل 8، fluorescence هو أدنى كثافة في أول elution وكثافة أعلى في الثانية والثالثة يُستفد. قد تختلف النتائج، حيث أن الفلورس يعتمد على تعبير البروتين، ومواد الأوراق المقطوعة، وغيرها من الظروف المستخدمة في التجربة.

بعد الانتهاء من عملية تنقية، يتم تحليل العينات على 10٪ SDS-PAGE هلام في ظل تقليل الظروف (عينة العازلة يحتوي على DTT وعينات تم غليها لمدة 5 دقائق) والظروف غير الحد (عينة العازلة لا تحتوي على DTT وعينات لم يتم غليها). كما هو مبين في الشكل 9A، فإن العينات غير التناقصية فقط ، كما هو الحال في Elution 2 NR حارة ، سوف تفلور عندما تتعرض للضوء الأشعة فوق البنفسجية الموجة القصيرة. هذا الشريط الأول هو التألق في حجم المنتج الكامل المتوقع ~ 200 كيلو ندى ، مشيرا إلى أن asGFP لا يزال صحيحا conformationally. الشرائط الفلورية بالقرب من الجزء السفلي من هلام هي صبغ من الحد الأدنى. لاحظ أن asGFP يفقد الفلورسين عندما يتعرض لدرجات الحرارة عند أو أعلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ هذا يختلف عن eGFP (تعزيز GFP) ، والتي من شأنها الحفاظ على بعض fluorescence تحت نفس الشروط49،50. شريطين من السلم ، 75 كيلو Da و 25 كيلو ا. ، الفلوري أيضا. يمثل الشكل 9B وصمة عار Coomassie من نفس هلام في الشكل 9A. وقد تم إعداد عمليات التوابع في الممرات 6-9 في ظل ظروف مخفّض. عند تشغيل على هلام وCoomassie الملطخة، يجب أن تعرض هذه العينات مكونات الانصهار asGFP-IgG بشكل منفصل. وتشمل هذه المكونات سلسلة الثقيلة تنصهر إلى GFP (~ 75 كيلو Da)، وسلسلة الثقيلة وحدها (50 كيلو Da)، وسلسلة الضوء (25 كيلو Da)، وsgFP نفسها (27 كيلو Da). تم تضمين العينة غير المتناقصة في الممر الأخير من الجل لأغراض المقارنة ويجب أن تعرض نطاقًا واحدًا كبيرًا (~200 كيلو Da) ، والذي يجب أن يتكون من سلسلتين ثقيلتين تنصت على asGFP وسلاسل الإضاءة الخاصة بها. بالإضافة إلى ذلك، من المحتمل أن تكون الشرائط الصغيرة سببها proteases الأصلية. ويمكن منع هذا الانقسام مع إضافة مثبطات البروتياز والحفاظ على استخراج البروتين الباردة في جميع الأوقات, بما في ذلك عند تنفيذ تنقية العمود. لن تكون المكونات الفردية للبروتين الاندماجي IgG قابلة للتمييز في العينات غير المتناقصة على جل Coomassie.

Figure 1
الشكل 1: سير عمل عمليات التعبير عن النباتات واستخراجها وتنقيتها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تسلسل النيوكليوتيدات المستخدمة تسلسل الأحماض الأمينية
تسلسل
تستخدم ل
ASGFP في
pBY! KEAM
-GFPasH
المتجه
المستخدمة في
الـ
التعبير
من
asGFP-IgG
الانصهار		 ATGGTGTCCAAGGGGGAAGCGCTTCTGGAAGAGCCTTTTC
CAGTACCCTATGACTTCTAAAATCGAGTTGAGGCGAGATCA
ACGGAAAGAAGTTTAAGGTTGCTGGGGGGGGGGTTTCACCCCTCT
ATCTGGAAGATTCAATATGCACGCTTACTGTACTACCGGAGAC
TTGCCTATGTCCTGGGGTTATAGTCCCCGCGCCAGTACGG
GTTTCACATGTTTGCCCACTACCGAGGGATATCCACTCTCTT
CCAAGAATGTTTTCCTGGCTTATTATACTCTCGACAGAACTTTGA
GGATGGAGGGAGACGGTACCTTTACTCACCACCACGGTACTC
CCTTGAGGACGGTTGCGTTACTTCCAAGACTTTGAACGCTT
CTGGATTCGACCCCAAGAGCCTATGACTAAGTCTTTCGT
CAAACAGCCCCAAACGAGTCAAAAAAAATCCCACACGGGCCA
AATGGTATTAGACTTACTTCCACTGTTCTACCTTAAGGGA
CGGAACTATGATCGGAACTCAAGAGCATGCATCGTTACCCCA
GTTGGCAGAAAAGTTACTCAGCCTAAGGCTCCTCTCT
ATACTCAGATCATTCAGAAGAGAGACACAACGAGAG
ATCACATCGTTCAGACTGAGCGCCGCTGCTGCTAAATCTG
GCACGGCATGGATGAGCTTTACAAGA		 MVSKGEEASGRALF
QYPMTSKIELNGEI
NGKKFKVAGEGFTP
SSGRFNMHAYCTT
GDLPMSWVVIASPL
QYGFHMFAHYPEDI
THFFQECFPGSYTL
DRTLRMEGDGTLTT
HHEYSLEDGCVTSK
TTLNASGFDPKGAT
MTKSFKQLPNEVK
ITPHGPNGIRLTSTV
LYLKEDGTIQTQD
CIVTPVGGRKVTQP
KAHFLHTQIIQKKDP
NDTRDHIVQTELAV
AGNLWHGMDELY
ك
تسلسل
تستخدم ل
GFP في
pBYEAMGFPHgp
المتجه
المستخدمة في
الـ
التعبير
من GFP-IgG
الانصهار		 ATGGCTAACACACCTCTTGTCTCTTCTTCCTTGTGCTCCTT
GGTCTTTCTCTCTCTTGCTTCTGCTGTATGTATGTGGGGGGCGCGGCG
AGGAGCTTTACCGGGGTGCCCATCCTGTCGAGCTGG
ACGGCGACGTAAACGGCCACAAGCAGCGTGTGTCCGGCGAGG
GCGGCGATGCCACCTACGCAAGCTGACCCTGAAGTTCA
TCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGCCGCCGCCGCCGCCCACCCCACCCTCGT
GACCTTCATACGGCGTGGGGGCGCCGCTCC
GACCACATGAAGGGCACGACTTCTCCAAGTCCGCCATGCCCG
AAGGCTACGTGGGAGCGCACCATCTTTCTTCTCAGGACGACGG
CAACTACAAGACCCGCGCCGGGGGGGGGGGTTCGAGGGCGACAC
CCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAGGCATCGACTTCAGA
GGACCAACATCCTGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAA
CAGCCACAACGTCTATTATCATGGCCGACACAGCAGAACGG
CATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACAACGAGGGGC
AGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCATCG
GCGACGGCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCAC
CCAGTCCGCCGCTGAAAAGAACACGAGAAGCGCGATCA
CATGGTCCTGCTGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCAC
GGCATGGACGAGCTGTACAAGA		 مانكللسلفلفل
GLSASLASGMVSKG
EELFTGVVPILPILVELD
GDVNGHKFSVSGE
GEGDATYGKLKLKFI
CTTGKLPVPWPTLV
TTFSYGVQCFSRYP
DHMKQHDFFKSA
MPEGYVQERTIFFK
DDGNYKTRAEVKFE
GDTLVNRIELKGIDF
كيدغنيلغكلين
YNSHNVYIMADKQ
KNGIKVNFKIRHNIE
DGSVQLADHYQQN
TPIGDGPVLLPDNH
YLSTQSALSKDPNEK
RDHMVLVLVTAA
GITH

الجدول 1: التسلسلات المستخدمة لإنشاء asGFP وGFP

Figure 2
الشكل 2: مستعمرات البكتيريا الزراعية التي نمت على لوحة LB التي تحتوي على الكاناميسين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: ظهور وسائل الإعلام في جميع أنحاء النمو وتجهيز Agrobacterium. (أ) ظهور وسائل الإعلام LB مباشرة بعد تلقيح مستعمرة البكتيريا الزراعية المعزولة. (ب) وجود وسائل الإعلام بعد حضانة ليلة وضحاها من مستعمرة معزولة في 30 درجة مئوية (C) ظهور وسائل الإعلام بعد نسج الثقافات أسفل لمدة 20 دقيقة في 4500 x ز( D) بيليه resuspended في العازلة التسلل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: عملية تسلل النباتات N. benthamiana. (ألف - باء) بدس قليلا نتائج ورقة في حفرة خفية في الجزء العلوي من ورقة. (جيم - دال) حقن تعليق Agrobacterium في ورقة. (هـ) ورقة النباتات المخترقة من المنظر العلوي. (و) النبات مع أوراق متعددة تسللت من وجهة نظر أعلى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: التصور من الأوراق التي تحتوي على asGFP-IgG الانصهار وGFP-IgG الانصهار تبدأ في اليوم 1 بعد التسلل (dpi) في الصف الأول، مما يؤدي إلى اليوم 5 نقطة في البوصة في الصف الأخير لجميع الظروف. أ) asGFP-IgG الانصهار تحت الضوء الأبيض. ب) asGFP-IgG الانصهار تحت موجة طويلة من الأشعة فوق البنفسجية. ج) GFP-IgG الانصهار تحت الضوء الأبيض. د) GFP-IgG الانصهار تحت موجة طويلة من الأشعة فوق البنفسجية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: اِضافة مستخلص asGFP-IgG إلى عمود البروتين G. أ) إضافة تحت الضوء الأبيض. ب) إضافة تحت موجة قصيرة الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: بروتين G الراتنج تحت الموجة القصيرة الأشعة فوق البنفسجية الضوء بعد supernatant من asGFP-IgG استخراج تم تشغيلها من خلال العمود. أ) بروتين G الراتنج تحت الموجة القصيرة الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة. ب) بروتين G الراتنج على الاستلوث من البروتينات في ظل ظروف منخفضة PH. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: الرغات المنقية من asGFP-IgG التي تم الحصول عليها بعد التعرض لظروف منخفضة من الحموضة من خلال تنقية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: SDS-PAGE من عينات الأعمدة. العينات المسماة بـ "R" هي في تقليل الشروط، والعينات المسماة بـ "NR" في ظروف غير متناقصة. A) تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية، فقط غير خفض عينات الفلوريس في هلام بولي أكريلاميد 10٪ ، كما رأينا في Elution 2 NR حارة. 75 كيلو Da و 25 كيلو ا. ب) تلطيخ Coomassie من نفس هلام يكشف عن وجود جميع البروتينات في العينة. في elutions انخفاض، والانصهار IgG دون سلسلة الضوء، سلسلة الثقيلة، سلسلة الضوء، وربما المتدهورة GFP موجودة في ~ 75 كيلو ادا، ~ 50 كيلو ادا، ~ 25 كيلو ادا، و ~ 10 كيلو ادا، على التوالي. في المقابل، في elutions غير مخفضة، واحد الفرقة البارزة موجودة، بما يتفق مع حجم كامل asGFP-IgG الانصهار (~ 200 كيلو ندى). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقق البصرية من أي أب المؤتلف أو البروتين المؤتلف المنتجة في N. بنثاميانا النباتات، بما في ذلك تلك التي تتطلب التعرض المؤقت للبيئات الحمضية لأغراض تنقية العمود42،43،44. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون دمج asGFP إلى البروتينات الأخرى في أنظمة التعبير المختلفة أداة مفيدة للتصور التجريبي والتعليم. ويمكن زيادة تحجيم البروتوكول هنا إلى كميات أكبر وأصغر من المواد الورقية لإنتاج الكمية المطلوبة من البروتين المؤتلف. الأساليب الموصوفة الاستفادة من الدراسات السابقة التي حددت وجعلت إصدارات من GFP التي لا تزال مستقرة في ظل الظروف الحمضية46. وقد خلقت الدراسات السابقة الشاملة مجالات الغلوبولين المناعي تنصهر على البروتين من الفائدة، وغالبا ما يطلق عليه IgG-الانصهار، والتي يمكن أن تستوعب هذا البروتوكول أيضا28. من خلال إنشاء والتعبير عن IgG-الانصهار تتألف من IgG1 أنصهرت إلى GFP وsGFP، كنا قادرين على تصور وجود البروتين المطلوب أثناء التعبير، الاستخراج، وعمليات التطهير.

إذا اتبع باحث ماهر هذا البروتوكول ، سيبدأ الأوراق في عرض علامات النخر في مواقع التسلل بين 4-5 أيام. ومع ذلك، عند استخدام ناقلات وصفها، وينبغي أن المناطق تسلل الأوراق تظهر صحية حتى اليوم 5 مع الرعاية المناسبة. من المهم أن نلاحظ أن العدوى الزراعية البكتيريا من تلقاء نفسها سوف يؤدي في نهاية المطاف في نخر من أوراق النبات بسبب تراكم أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) كجزء من استجابة الخلايا النباتية المناعية51,52. هذه الاستجابة المناعية والمستوى الناتج من نخر يمكن أن تختلف استناداً إلى عدة عوامل51، بما في ذلك استهداف الخلوية ، وموقع البروتين ، ونوع البروتين الذي يجري إنتاجه ، ناقلات التعبير ، وسلالة من Agrobacterium المستخدمة53،54. أيضا، يمكن أن تؤثر الاختلافات في الكثافة البصرية (OD600)من البكتيريا الزراعية المستخدمة للتسلل على مستويات نخر55. العديد من ناقلات التعبير استخدام البروتينات التي تربط بروتين الرتينوبلاستوما للحفاظ على الخلايا النباتية في توليف (S)-المرحلة وزيادة انقسام الخلايا والتحول تردد56,57. الزيادات في إنتاج البروتين، مثل تلك التي تسببها ملزمة لبروتين الورم الأرومي الشبكي، يمكن أن يؤدي إلى نخر56،57. التقدم في تصميم ناقلات، مثل تلك المستخدمة في الإصدارات المعدلة من الرارات BeYDV الجوزاء المستخدمة في هذا البروتوكول، قد قللت من نخر مع الحفاظ على مستويات التعبير عالية البروتين58. أيضا، الانتاءات BeYDV هي غير المتنافسة، وتوفير التعبير عن البروتينات متعددة على كاسيت واحد دون قيود حجم معروف53،59.

تؤثر عدة عوامل على نمو النبات قبل وبعد التسلل، مما قد يؤدي في نهاية المطاف إلى انخفاض غلة البروتين. عندما النباتات البذر، يمكن أن يؤدي الكثير من البذور لكل بيليه النبات في العديد من براعم النباتات الصغيرة مما يؤدي إلى نمو أكثر تواضعا النبات. وبالتالي، فإن تقليل عدد البذور في بيليه الخث وإزالة براعم إضافية بعد أسبوع سيؤدي إلى نمو أفضل للنباتات. 10- إن الحفاظ على رطوبة التربة السليمة عامل آخر يؤثر على صحة النبات عموماً. الإفراط في المياه، تحت الماء، إضافة الكثير أو القليل جدا من الأسمدة قد تسهم في كلورية وتؤثر على صحة النبات60،61،62. يمكن بالإضافة إلى ذلك نخر والكلور يكون سبب إنتاج البروتين الذي يسبب إجهاد الخلية. وقد شهدت هذه الظاهرة عدة مرات مع التعبير عن المجمعات المناعية المؤتلف (RIC)56. لقد لاحظنا أن التغيرات في بنية البروتين وانصهار البروتينات يمكن أن تساعد في تقليل نخر; ومع ذلك، يمكن أن تبقى بعض البروتينات سامة للنباتات حتى بعد التعديلات المختلفة. إذا كان استخدام ناقلات التعبير المبينة هنا، استخراج البروتين يمكن أن يؤديها في وقت مبكر وقبل ظهور نخر كبير، مما أدى إلى ارتفاع غلة البروتين56.

يمكن أن تؤدي ظروف النمو المختلفة إلى إبطاء نمو البكتيريا الزراعية أو حتى تثبيطه. Agrobacterium ينمو على النحو الأمثل في 28 درجة مئوية - 30 درجة مئوية ، والخبرات صدمة الحرارة عندما احتضنت فوق 30 درجة مئوية ، وإنتاج أخطاء انقسام الخلية62. يمكن أيضا أن يعوق النمو من خلال إضافة الكثير من ريفامبيسين، كما سلالات مختلفة من البكتيريا الزراعية هي أكثر أو أقل مقاومة طبيعية لهذا المضادات الحيوية62. الثقافة البكتيرية أعدت للتسلل مع أعلى بكثير OD600 من الموصى بها من المرجح أن يسبب نخر55. A600 600 1 OD أعلى قليلا من الثقافة عادة لا يؤثر على العائد، ولكن إذا كان أقل من 0.1، قد يكون انخفاض كبير في العائد البروتين. تراكم الخلايا الميتة يمكن أن يحدث في ظل ظرفين; 1) كانت الثقافة متضخمة ، مما أدى إلى جزء كبير من OD يجري الخلايا الميتة ، و 2) إتلاف / قتل البكتيريا الزراعية بعد النمو ، مثل مع بقايا كيميائية أو سرعات عالية للطرد المركزي. قد عمليات التسلل باستخدام عدد متزايد من الخلايا الميتة في الثقافة يقلل من التعبير البروتين. وعلاوة على ذلك، ثقب الأوراق عن طريق تطبيق الكثير من الضغط يمكن أن تلحق الضرر الأوراق، وبالتالي قد يؤدي إلى نخر سابق لأوانه. النظر في هذه العوامل المحتملة عند التعبير عن البروتينات المؤتلف في نيكوتيانا بنثاميانا، يمكن أن يؤدي إلى زيادة إنتاج البروتين.

يمكن الحصول على انخفاض غلة البروتين يكون بسبب بعض القضايا في خطوات الاستخراج والتنقية. أولا، قد تحتاج العازلة استخراج الأمثل اعتمادا على البروتين من الفائدة. أثناء المزج، يجب أن تكون المواد النباتية متجانسة دون أي قطع ورقة مرئية. بعد ذلك، تتطلب بعض البروتينات منظفات لل solubilization في العازلة استخراج، مثل توين-20 أو تريتون. قد تحتاج البروتينات الأخرى اليوريا بتركيزات عالية ~ 7.5 M ل solubilization، في حين يمكن استخراج بعض مع برنامج تلفزيوني فقط. يمكن أن يحدث تدهور البروتين إذا لم يتم الاحتفاظ بالمخازن، والأنسجة النباتية، وأجهزة الطرد المركزي، وما إلى ذلك، باردة أثناء عملية الاستخراج. كما أن عدم وجود مثبطات البروتياز وسجربات الصوديوم أو المواد الكيميائية المماثلة في مخزن الاستخراج يمكن أن يسبب أيضاً تدهوراً أو تجميعاً. بعض مثبطات البروتياز مثل PMSF تتحلل بسرعة، وascorbate الصوديوم يستغرق بعض الوقت لتصبح مائي. بشكل عام، يجب على الباحثين تحديد الظروف المثلى للبروتين الذي يهتمون به.

تنقية IgG-الانصهار يتضمن خطوات قليلة التي قد تحتاج إلى تعديلات إذا تم الحصول على انخفاض الغلة البروتين. تحليل aliquots عينة التي تم جمعها خلال العملية برمتها من قبل SDS-PAGE والغربية سوف تساعد على تحديد خطأ من الأساليب. على سبيل المثال، إذا كان flowthrough يحتوي على كمية كبيرة من البروتين، ثم يمكن تسهيل ربط البروتين عن طريق تغيير درجة الH من العازلة. استخدام تركيزات عالية من المنظفات أثناء عملية الاستخراج قد يؤثر على خاصية الربط من الراتنج، وخاصة إذا كان يتم إعادة استخدام الراتنج عدة مرات. التخزين السليم للراتنج، كما هو موضح في الأساليب، أمر حيوي لعمر الراتنج. وعلاوة على ذلك، إذا كانت الخطوة غسل يزيل البروتين من الفائدة من الراتنج، قد تحتاج إلى أن تكون مجددة من أجل حل هذه المشكلة. قد تكون القضايا الأخرى مع تنقية البروتين بسبب البروتينات المُعدَّة أو المُتحللة، والتي قد تتطلب المزيد من التحليل للتصميم الكلي للبروتين. قد يؤدي الرجوع إلى استكشاف الأخطاء وإصلاحها الموضحة إلى زيادة كفاءة تنقية باستخدام هذا البروتوكول.

إن تنقية الانصهار GFP-IgG الموصوفة مفيدة في بيئة تعليمية. التصور هو أساسي لتعليم العلوم لأنه يسمح للمتعلمين لفهم المفاهيم بسهولة أكبر39. الطلاب غالبا ما يبلغ سوء الفهم بالإضافة إلى صعوبة فهم المفاهيم على المستوى الجزيئي39. على وجه الخصوص، يمكن تعديل التجارب التي تتطلب فهم موقع البروتين المحدد في كل خطوة عن طريق وضع علامات البروتين من الفائدة مع جزيئات الفلورسنت. لذلك، يمكن استخدام GFP أو asGFP، اعتمادا على البيئة المستخدمة في مجال استخراج الHH، لتسخير الفلوريس لتسهيل توضيح تقنية تنقية البروتين للطلاب.

باختصار، نحن وصف طريقة بسيطة للتعبير وتنقية أب المؤتلف تنصهر إلى GFP في N. benthamiana النباتات. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتنقية AB تنصهر على أي البروتين المستهدف المطلوب. يمكن تحرير العملية لاستيعاب كميات مختلفة من مواد الأوراق ويسمح لتحديد البصرية وجود البروتين قبل وأثناء وبعد الانتهاء من عملية استخراج البروتين وتنقيته. يمكن أن تكون هذه الأساليب مفيدة كضوابط ويمكن أن تكون الغرض لتقنيات التدريس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر ماريا بيا ديبالما على تحرير الفيديو. كما نشكر مكتب التوعية التعليمية والخدمات الطلابية في جامعة ولاية أريزونا على مساعدتهم السخية في رسوم النشر. وقد دعمت البحث لهذا البروتوكول من قبل كلية علوم الحياة، جامعة ولاية أريزونا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL syringe any N/A
50 mL syringe any N/A
Agar SIGMA-ALDRICH A5306
Blender with cups any N/A
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404
DTT (DL-Dithiothreitol) MP BIOMEDICALS 219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid SIGMA-ALDRICH E-6760
Ethanol any N/A
Glycerol G-Biosciences BTNM-0037
Glycine SIGMA-ALDRICH G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid) EMD MILLIPORE CORPORATION HX0603-4
Heating block any reputable supplier N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets Hummert International 14237000
Kanamycin Gold Biotechnology Inc K-120-100
KCl (Potassium Chloride) SIGMA-ALDRICH P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate) J.t.baker 3248-05
KOH (Potassium Hydroxide) VWR BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate SIGMA-ALDRICH M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) SIGMA-ALDRICH M8250
Miracloth Millipore 4 75855-1R
Moisture control potting mix Miracle-Gro 755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate) J.t.baker 3827-01
NaCl (Sodium Chloride) Santa Cruz Biotechnology sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds any reputable supplier N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) G-Biosciences 786-787
Polypropylene Column any N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 1610394
Protein G resin Thermo Fisher Scientific 20399
Rifampicin Gold Biotechnology Inc R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) G-Biosciences DG093
Sodium Ascorbate SIGMA-ALDRICH A7631-500G
Spectrophotometer any reputable supplier N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter ThermoScientific 40725-GM
Tray for peat pellets with dome any N/A
TRIS Base J.t.baker 4109-02
Tris-HCl Amresco M108-1KG
Tryptone SIGMA-ALDRICH 17221
UV lamp any N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2000992
Yeast extract SIGMA-ALDRICH 9182

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
  2. Kaplon, H., Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2019. mAbs. 11 (2), 219-238 (2019).
  3. The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePharma. , Available from: https://www.fiercepharma.com/special-report/top-20-drugs-by-2018-u-s-sales (2018).
  4. Grilo, A. L., Mantalaris, A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends in Biotechnology. 37 (1), 9-16 (2019).
  5. Kim, M. -Y., et al. Novel vaccination approach for dengue infection based on recombinant immune complex universal platform. Vaccine. 33 (15), 1830-1838 (2015).
  6. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Transgenic plants in the biopharmaceutical market. Expert Opinion on Emerging Drugs. 10 (1), 185-218 (2005).
  7. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. -C. Plant Molecular Pharming for the Treatment of Chronic and Infectious Diseases. Annual Review of Plant Biology. 65 (1), 743-768 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and Bioengineering. 109 (10), 2575-2588 (2012).
  9. Yao, J., Weng, Y., Dickey, A., Wang, K. Y. Plants as factories for human pharmaceuticals: Applications and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28549-28565 (2015).
  10. Mor, T. S., Moon, Y. -S., Palmer, K. E., Mason, H. S. Geminivirus vectors for high-level expression of foreign proteins in plant cells. Biotechnology and Bioengineering. 81 (4), 430-437 (2003).
  11. Hefferon, K. L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology. 433 (1), 1-6 (2012).
  12. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Scientific Reports. 8 (1), 4755 (2018).
  13. Zhong, G. Y., et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Molecular Breeding. 5 (4), 345-356 (1999).
  14. Giddings, G., Allison, G., Brooks, D., Carter, A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 18 (11), 1151-1155 (2000).
  15. Fulton, A., Lai, H., Chen, Q., Zhang, C. Purification of monoclonal antibody against Ebola GP1 protein expressed in Nicotiana benthamiana. Journal of Chromatography A. 1389, 128-132 (2015).
  16. Diamos, A., et al. A highly expressing, soluble, and stable plant-made IgG fusion carrying Zika virus envelope domain III elicits potent immunogenic responses in mice without adjuvant. Frontiers in immunology. 3140 (11), (2020).
  17. Hunter, J. G. L., et al. Evaluation of a toxoid fusion protein vaccine produced in plants to protect poultry against necrotic enteritis. PeerJ. 2019 (3), 6600 (2019).
  18. Dent, M., et al. Plant-produced anti-dengue virus monoclonal antibodies exhibit reduced antibody-dependent enhancement of infection activity. Journal of General Virology. 97 (12), 3280-3290 (2016).
  19. Diamos, A. G., et al. High Level Production of Monoclonal Antibodies Using an Optimized Plant Expression System. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 472 (2020).
  20. Olinger, G. G., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 18030-18035 (2012).
  21. Mastrangeli, R., Palinsky, W., Bierau, H. Glycoengineered antibodies: towards the next-generation of immunotherapeutics. Glycobiology. 29 (3), 199-210 (2019).
  22. Montero-Morales, L., Steinkellner, H. Advanced Plant-Based Glycan Engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 81 (2018).
  23. Joosten, V., Lokman, C., vanden Hondel, C. A. M. J. J., Punt, P. J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 2 (1), 1-15 (2003).
  24. Müller, D. Antibody fusions with immunomodulatory proteins for cancer therapy. Pharmacology and Therapeutics. 154, 57-66 (2015).
  25. Bootz, F., Neri, D. Immunocytokines: A novel class of products for the treatment of chronic inflammation and autoimmune conditions. Drug Discovery Today. 21 (1), 180-189 (2016).
  26. Jafari, R., Zolbanin, N. M., Rafatpanah, H., Majidi, J., Kazemi, T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 24 (12), (2017).
  27. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. mAbs. 9 (2), 182-212 (2017).
  28. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  29. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  30. Diamos, A. G., et al. Vaccine synergy with virus-like particle and immune complex platforms for delivery of human papillomavirus L2 antigen. Vaccine. 37 (1), 137-144 (2019).
  31. Diamos, A. G., et al. Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity. Vaccine. 38 (18), 3455-3463 (2020).
  32. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  33. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  34. Palm, M., Baumstark-Khan, C., Horneck, G. Green Fluorescent Protein (GFP) Expression in Mammalian Cells After UV-Irradiation. Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation. , 311-316 (1999).
  35. Paemeleire, K., et al. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26. Molecular Biology of the Cell. 11 (5), 1815-1827 (2000).
  36. Harper, B. K., Stewart, C. N. Patterns of Green Fluorescent Protein Expression in Transgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 18 (2), 141 (2000).
  37. Kaishima, M., Ishii, J., Matsuno, T., Fukuda, N., Kondo, A. Expression of varied GFPs in Saccharomyces cerevisiae: Codon optimization yields stronger than expected expression and fluorescence intensity. Scientific Reports. 6, (2016).
  38. Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21772029/ (2020).
  39. Mnguni, L. E. The theoretical cognitive process of visualization for science education. SpringerPlus. 3 (1), 1-9 (2014).
  40. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  41. Bjorck, L., Kronvall, G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-Binding reagent. The Journal of Immunology. 133 (2), (1984).
  42. Andrew, S. M., Titus, J. A. Purification of Immunoglobulin G. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 1-12 (2001).
  43. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 848 (1), 40-47 (2007).
  44. Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Björck, L., Mariani, M. Recombinant proteins L and LG: efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 668 (2), 209-218 (1995).
  45. Shinoda, H., Ma, Y., Nakashima, R., Sakurai, K., Matsuda, T., Nagai, T. Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa. Cell Chemical Biology. 25 (3), 330-338 (2018).
  46. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  47. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  48. Mahmood, T., Western Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  49. Vessoni Penna, T. C., Ishii, M., Cholewa, O., de Souza, L. C. Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted from Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 38 (2), 135-139 (2004).
  50. Kang, S. J., Park, E. A., Lee, D. H., Hong, K. W. Comparison of the stability of eGFP displayed on the Bacillus subtilis spore surface using CotB and C-terminally truncated CotB proteins as an anchoring motif under extreme conditions. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 41 (2019).
  51. Kuta, D. D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4 (8), 752-757 (2005).
  52. Qiusheng, Z., Bao, J., Likun, L., Xianhua, X. Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea) explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (1), 83-90 (2005).
  53. Diamos, A. G., Rosenthal, S. H., Mason, H. S. H.S. 5' and 3' Untranslated Regions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 7, 200 (2016).
  54. Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 706-714 (2009).
  55. Diamos, A. G., Mason, H. S. Modifying the Replication of Geminiviral Vectors Reduces Cell Death and Enhances Expression of Biopharmaceutical Proteins in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 9, 1974 (2019).
  56. Gordon-Kamm, W., et al. Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11975-11980 (2002).
  57. Villemont, E., Dubois, F., Sangwan, R. S., Vasseur, G., Bourgeois, Y., Sangwan-Norreel, B. S. Role of the host cell cycle in the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Petunia: Evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta. 201 (2), 160-172 (1997).
  58. Regnard, G. L., Halley-Stott, R. P., Tanzer, F. L., Hitzeroth, I. I., Rybicki, E. P. High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector. Plant Biotechnology Journal. 8 (1), 38-46 (2010).
  59. Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Human Vaccines. 7 (3), 331-338 (2011).
  60. Morton, T. G., Gold, A. J., Sullivan, W. M. Influence of Overwatering and Fertilization on Nitrogen Losses from Home Lawns. Journal of Environmental Quality. 17 (1), 124-130 (1988).
  61. Brown, J. C. Iron Chlorosis in Plants. Advances in Agronomy. 13, 329-369 (1961).
  62. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory Maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , CHAPTER, Unit3D.1 (2012).

Tags

علم الأحياء، العدد 167، الأجسام المضادة، الأجسام المضادة أحادية النسيلة، الفرمنج الجزيئي، الترشيح الزراعي، التعبير العابر، Nicotiana benthamiana، البروتين الفلورسنت الأخضر، حمض مستقر البروتين الفلورسنت، الانصهار الأجسام المضادة، IgG-الانصهار، بروتين G تنقية
إنتاج بروتينات IgG فيوجن أعرب عنها بشكل عابر في <em>نيكوتيانا بنثاميانا</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kamzina, A. S., DiPalma, M. P.,… More

Kamzina, A. S., DiPalma, M. P., Hunter, J. G. L., Diamos, A. G., Armer, B., Mor, T. S., Mason, H. S. Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana. J. Vis. Exp. (167), e61774, doi:10.3791/61774 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter