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Biology

Produzione di proteine di fusione IgG espresse transitoriamente in Nicotiana benthamiana

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61774
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Descriviamo qui un metodo semplice per l'espressione, l'estrazione e la purificazione dell'IgG umano ricombinante fuso a GFP a Nicotiana benthamiana. Questo protocollo può essere esteso alla purificazione e visualizzazione di numerose proteine che utilizzano la cromatografia delle colonne. Inoltre, il protocollo è adattabile al laboratorio di insegnamento universitario di persona e virtuale, fornendo esplorazione basata su progetti.

Abstract

L'elevata domanda di anticorpi come interventi terapeutici per varie malattie infettive, metaboliche, autoimmuni, neoplastiche e altre malattie crea una crescente necessità nello sviluppo di metodi efficienti per la produzione di anticorpi ricombinanti. A dicembre 2019, c'erano più di 70 anticorpi monoclonali approvati dalla FDA e c'è un potenziale di crescita esponenziale. Nonostante la loro promessa, i fattori limitanti per un uso diffuso sono i costi di produzione e la complessità. Potenzialmente, le piante offrono strategie di produzione proteica a basso costo, sicure e facilmente scalabili. Piante come Nicotiana benthamiana non solo possono piegare e assemblare correttamente proteine mammifere complesse, ma possono anche aggiungere modifiche critiche post-tras traslazione simili a quelle offerte dalle colture cellulari dei mammiferi. In questo lavoro, utilizzando la GFP nativa e una variante stabile all'acido della proteina fluorescente verde (GFP) fusa agli anticorpi monoclonali umani, siamo stati in grado di visualizzare l'intera espressione anticorpale transitoria e il processo di purificazione dalle piante di N. benthamiana. A seconda dello scopo dell'esperimento, la fusione GFP nativa può garantire una visualizzazione più semplice durante la fase di espressione nelle piante, mentre la fusione GFP stabile all'acido consente la visualizzazione durante l'elaborazione a valle. Questa procedura scalabile e diretta può essere eseguita da un singolo ricercatore per produrre quantità di milligrammo di anticorpi altamente puri o proteine di fusione anticorpale in pochi giorni utilizzando solo poche piccole piante. Tale tecnica può essere estesa alla visualizzazione di qualsiasi tipo di processo di purificazione degli anticorpi e potenzialmente di molte altre proteine, sia nei sistemi vegetali che in altri sistemi di espressione. Inoltre, queste tecniche possono beneficiare di istruzioni virtuali ed essere eseguite in un laboratorio didattico da studenti universitari in possesso di una minima esperienza precedente con tecniche di biologia molecolare, fornendo una base per l'esplorazione basata su progetti con applicazioni del mondo reale.

Introduction

I rapporti dell'industria indicano che tredici dei venti farmaci più incassi negli Stati Uniti erano biologici (prodotti farmaceutici a base proteica), di cui nove erano anticorpi. A dicembre 2019, c'erano oltre 570 terapie anticorpali (Ab) in varie fasi di sviluppoclinico 1,2,3. Le attuali vendite globali di Ab superano i 100 miliardi di dollari e il mercato terapeutico monoclonale Ab (mAb) dovrebbe generare fino a 300 miliardi di DOLLARI entro il 20251,4. Con una domanda così elevata e aumenti previsti delle entrate, i ricercatori hanno lavorato per sviluppare modi per produrre terapie Ab su scala sempre più ampia, con una qualità più elevata e costi inferiori. I sistemi di espressione a base vegetale hanno diversi vantaggi rispetto alle tradizionali linee cellulari di mammiferi per la produzione economica e su larga scala di terapie Ab5,6. La produzione di terapie proteiche nelle piante ("pharming molecolare") non richiede costosi bioreattori o strutture di coltura cellulare, così come le tecniche tradizionali di coltura cellulare dei mammiferi7,8. Le piante non possono contrarre agenti patogeni umani, riducendo al minimo la potenzialecontaminazione 9. Sia l'espressione proteica transiente che transgenica a base vegetale può essere utilizzata come alternativa a basso costo ai sistemi di produzione di mammiferi o batteri10. Sebbene le piante transgeniche siano preferite per la produzione vegetale, la produzione di proteine ricombinanti utilizzando questo metodo può richiedere da settimane a mesi. I progressi nell'espressione transitoria utilizzando vettori virali attraverso siringa o agroinfiltrazione sottovuoto consentono, rispettivamente, la produzione su piccola e grande scala della proteina desiderata neigiorni 11,12,13,14. La produzione di mAb contro Ebola, Dengue e, Zika, e numerose altre proteine ricombinanti, sono stati prodotti e purificati in modo rapido ed efficiente utilizzando l'espressione transitoria negli impianti N. benthamiana 15,16,17,18,19. Queste circostanze rendono l'espressione transitoria a base vegetale un'opzione interessante per lo sviluppo di più terapie Ab e dei metodi dimostrati in questo protocollo20.

I mAb di prima generazione erano di derivazione murina, il che ha portato a immunogenicità non specifica se utilizzati in studi sull'uomo21. Nel corso del tempo, gli Abs chimerici, umanizzati e, infine, completamente umani sono stati prodotti per ridurre l'immunogenicità indotta dalle terapie Ab. Sfortunatamente, alcuni di questi Abs causano ancora immunogenicità dell'ospite a causa delle differenze nella glicosilazione21. Gli sviluppi nell'ingegneria impiantistica hanno permesso la modifica degli glicani ab, che è essenziale poiché la stabilità e la funzione di ab possono essere significativamente influenzate dal suo stato di glicosilazione22. I progressi hanno permesso la produzione in sistemi vegetali di espressione di alto livello di mAb umanizzati, contenenti glicani umani e di conseguenza i tratti biologici desiderati di un farmaco umano prodotto inserie 19,21.

Oltre agli Abs ricombinanti, le molecole di fusione Ab (fusioni Ab) sono state esplorate per vari scopi negli ultimi decenni. Le fusioni ab spesso consistono in un frammento ab o ab fuso a una molecola o proteina e sono progettate per suscitare risposte dalle cellule dell'effettore immunitario23. Queste molecole sono state create come potenziali interventi terapeutici per trattare varie patologie come il cancro e le malattie autoimmuni24,25,26,27. I complessi immunitari ricombinanti (RIC) sono un'altra classe di fusioni Ab che sono state impiegate come candidati al vaccino28. I RIC sfruttano la capacità del sistema immunitario di riconoscere le regioni Fc delle fusioni Ab e sono stati trovati per migliorare l'immunogenicità se combinati con altre piattaformevaccinali 29,30,31.

La proteina fluorescente verde (GFP) è una proteina bioluminescente derivata dalla medusa Aequorea Victoria, che emette luce verde quando eccitata dalla luceultravioletta 32,33. Nel corso degli anni, l'uso della GFP come marcatore visivo dell'espressione genica si è esteso dall'espressione in Escherichia coli a numerosi sistemi di espressione proteica, tra cui le piante di N. benthamiana 34,35,36,37,38. I marcatori visibili, come la FPG, hanno abbondanti implicazioni nell'insegnamento e nell'apprendimento di concetti scientifici. Numerosi studenti entry-level descrivono difficoltà a cogliere concetti scientifici quando l'idea insegnata non è visibile ad occhio nudo, come i concetti di biologia molecolare e campi correlati39. I marcatori visivi, come la GFP, possono così contribuire all'elaborazione delle informazioni relative ai processi scientifici e potrebbero contribuire a ridurre le difficoltà che gli studenti segnalano nell'apprendimento di numerosi concetti scientifici.

Sebbene la GFP sia spesso usata come marcatore per indicareil gene e l'espressione in vivo , è difficile visualizzarlo nei processi a valle se si utilizzano condizioni acide. Questa circostanza è principalmente perché GFP non mantiene la sua struttura e la fluorescenza risultante a un basso pH40. Gli ambienti acidi temporanei sono spesso richiesti in vari processi di purificazione, come la proteina G, la proteina A e la cromatografia proteina L, spesso utilizzate per la purificazione Ab41,42,43,44. I mutanti GFP sono stati utilizzati per trattenere la fluorescenza in condizioniacide 45,46.

Nel presente documento descriviamo un metodo semplice per l'espressione, l'estrazione e la purificazione delle proteine di fusione IgG ricombinanti nelle piante di N. benthamiana. Abbiamo prodotto la GFP tradizionale fusa all'N-terminale di una catena pesante IgG umanizzata, creando una fusione GFP-IgG. Contemporaneamente, abbiamo sviluppato la fusione di una sequenza ottimizzata per il codone vegetale per una GFP acido-stabile (asGFP) al N-terminale di una catena pesante IgG umanizzata, creando una fusione asGFP-IgG. I vantaggi della produzione di GFP-IgG includono la capacità di visualizzare la presenza di una proteina bersaglio durante l'espressione, mentre asGFP-IgG consente di vedere la presenza di proteine ricombinanti non solo nelle fasi di espressione ed estrazione ma anche nelle fasi di purificazione della proteina. Questo protocollo può essere adattato per la produzione, la purificazione e la visualizzazione di una gamma di proteine di fusione GFP prodotte in N. benthamiana e purificate utilizzando tecniche di cromatografia che richiedono un basso pH. Il processo può anche essere adattato a varie quantità di materiale fogliare. Mentre l'Abs e le proteine di fusione contrassegnate con GFP o asGFP non sono destinate ad essere utilizzate per le terapie, questi metodi possono essere utili come controlli durante gli esperimenti e possono anche essere ulteriormente utilizzati come strumento di insegnamento per la biologia molecolare e cellulare e la biotecnologia, sia di persona che virtualmente.

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Protocol

1. Coltivare n. piante di benthamiana

  1. Posizionare i pellet di torba del terreno su un vassoio e versare in precedenza bolliti, ancora caldi (~ 40-45 °C), acqua sui pellet di torba per una piena espansione. Dopo che i pellet sono stati completamente espansi, posizionare 2-3 N. semi di benthamiana su ogni pellet di torba utilizzando una pinzetta.
  2. Versare circa 0,5 in acqua per coprire il fondo del vassoio. Etichettare il vassoio con la data di semina. Continuare ad annaffiare le piantine ogni giorno con quantità appropriate di fertilizzante. La concentrazione di fertilizzanti (alimenti vegetali solubili in acqua per tutti gli scopi) è generalmente di 2,5-2,8 g/L.
  3. Coprire il vassoio con un piano umidioma quando posizionato nella camera di crescita. Conservare i pellet di torba seminati nella camera di crescita a 23-25 °C, con un fotoperiodo di 16 ore e un'umidità relativa del 60%.
  4. Dopo una settimana, rimuovere le piante extra lasciando ogni pellet con una sola piantina.
  5. Quando le piante hanno 2-3 settimane, trasferire ogni pellet di torba in una singola pentola contenente terreno di controllo dell'umidità. Questa dimostrazione ha utilizzato il terreno di invaso di controllo dell'umidità Miracle-Gro.
  6. Acqua al giorno con fertilizzante da 1 g/L. Non lasciare mai il terreno completamente asciutto. Le piante sono pronte per l'infiltrazione quando hanno 5-6 settimane.

2. Preparazione di Agrobacterium tumefaciens per l'infiltrazione

NOTA: I costrutti di fusione GFP-IgG possono essere ottenuti come descritto in questo documento31. Il gene asGFP è stato ottenuto e ottimizzato per le piante da questo studio45. I seguenti passaggi devono essere eseguiti accanto a un bruciatore Bunsen e devono essere applicate tecniche asettiche di base per evitare la contaminazione.

  1. Streak A. tumefaciens EHA105 che ospita il virus della nana gialla dei fagioli (BeYDV)19 vettore di espressione delle piante per ogni costrutto (asGFP-IgG, GFP-IgG, catena leggera) da uno stock di glicerolo su agar LB (10 g/L Tripptone, 10 g/L NaCl, 5 g di estratto di lievito, 15 g/L di agar, 50 μg/mL di kanamicina).
  2. Crescere per un giorno in un incubatore in piedi a 30 °C. Isolare una singola colonia per la verifica in base al protocollo PCR standard dello schermo colonia.
  3. Usa la colonia verificata per ogni costrutto. Riempire il tubo conico con 10 ml di mezzi LB (10 g/L di triptono, 10 g/L NaCl, 5 g di estratto di lievito, 50 μg/mL). Aggiungere quindi 10 μL di 100 μg/mL di kanamicina. Aggiungere 10 μL di rifampicina da 2,5 μg/mL per evitare la contaminazione da E. coli. Incubare a 30°C e 120-150 giri/min durante la notte.
  4. Il giorno dopo, se la coltura di Agrobacterium viene coltivata a OD600 = 0,6-0,9, può essere utilizzata per l'infiltrazione. Se è ricoperto di vegetazione (OD600 > 1), 1-2 mL deve essere trasferito in LB fresco con antibiotici e coltivato all'OD600 richiesto. A seconda della concentrazione della coltura iniziale, potrebbero potenzialmente essere necessario due giorni per crescere fino a600 OD = 0,6-0,9.
  5. Una volta appropriato OD600, mettere le colture in una centrifuga e pelletare i batteri per centrifugazione a 4.500 x g per 20 minuti, temperatura ambiente (RT).
  6. Decanto supernatante da entrambi i campioni, quindi rimescolare ogni pellet in 1x tampone di infiltrazione (10 mM 2-(N-morpholino) acido etanolfonico, solfato di magnesio da 10 mM, regolato a pH 5,5 con KOH) per ottenere l'ODfinale 600 = 0,4. Questo dovrebbe richiedere circa 15-45 mL di tampone di infiltrazione, a seconda della densità iniziale della coltura. Combina volumi uguali di ogni costrutto di fusione IgG con il costrutto della catena di luce per ottenere l'ODfinale 600 = 0,2 per costrutto in ogni tubo.

3. Agroinfiltrazione di siringhe senza ago

  1. Prendi una graffetta raddrizzare e piante di N. benthamiana di 5-6 settimane dal passaggio 1. Utilizzando il bordo affilato della graffetta, fare una piccola puntura nel primo strato epidermico della foglia sulla superficie adassiale. Evita di forarla fino in fondo.
    NOTA: Le foglie inferiori sono più facili per l'infiltrazione, mentre le foglie sulla parte superiore della pianta sono più dure. Generalmente, l'espressione delle proteine ricombinanti è più alta nelle foglie situate nel mezzo di una pianta, e queste foglie divengono anche meno necrotiche.
  2. Riempire una siringa da 1 ml, senza un ago attaccato, con la soluzione agrobatterio preparata del passo 2. Coprire il foro fatto nel passaggio precedente con l'estremità della siringa e spingere lentamente per iniettare i batteri nella foglia mentre si applica una delicata contropressione da dietro la foglia. Guarda la foglia scurirsi mentre la soluzione viene iniettata senza applicare troppa pressione sulla siringa.
  3. Cerca di infiltrarti nella maggior parte dell'area fogliare a un massimo di 3-4 volte: un danno eccessivo alle foglie può ostacolare la resa proteica. La foglia vegetale infiltrata apparirà per lo più scura dalla vista inferiore.
    NOTA: Questa soluzione batterica dovrebbe essere sufficiente per almeno 3-4 piante per costrutto. Autoclavare qualsiasi soluzione batterica rimanente prima di scartare.

4. Crescere e osservare l'infiltrato N. benthamiana

  1. Riposizionare le piante infiltrate nella camera di crescita e continuare ad annaffiare ogni giorno.
  2. Osservare le foglie per la clorosi e la necrosi nelle aree infiltrate. Osservare le piante per la fluorescenza GFP (se gfp è presente) sotto una lampada UV a onde lunghe e corte.
  3. Il giorno 4-5 mostra la più alta fluorescenza di entrambi i costrutti GFP nelle foglie. Raccogliere tutte le foglie a 4-5 dpi (giorni post-infiltrazione) e pesare il materiale fogliare totale.
  4. Utilizzarlo immediatamente per la lavorazione a valle o conservare a -80 °C fino a quando non è pronto per l'uso.

5. Estrazione di proteine

  1. Conservare tamponi e tazze di frullatore sul ghiaccio o a 4 °C prima dell'uso.
  2. Preparare 2-3 mL di tampone di estrazione ghiaccio-freddo (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 con HCl) per 1 g di materiale vegetale. Aggiungere 2 mM di fenilmetilsolfonil fluoruro (PMSF) dallo stock (100 mM) e 50 mM di ascorbato di sodio al tampone di estrazione poco prima dell'estrazione.
  3. Posizionare il tessuto vegetale dal passaggio 4 nella tazza del frullatore prechilled. Aggiungere una quantità misurata di tampone di estrazione refrigerato alla tazza del frullatore (come indicato al passaggio 5.2). Posizionare la tazza del frullatore sul frullatore. Prendi un foglio di parafilm pretagliato e allungalo sopra la parte superiore della tazza del frullatore. Frullare all'omogeneità con intervalli di 20 secondi, mescolando bene tra i cicli di miscelazione in base alle esigenze.
  4. Trasferire il materiale miscelato in un becher. Aggiungere una barra di agitazione e mescolare a 4 °C per 30 min per migliorare la solubilità proteica e consentire la precipitazione dei solidi.
  5. Posizionare 2 strati di Miracloth su un becher pulito sul ghiaccio e versare l'estratto attraverso di esso per rimuovere grandi detriti fogliari. Dopo aver versato tutto l'estratto, piegare il Miracloth per spremere l'estratto residuo delle foglie. L'estratto dovrebbe apparire verde scuro senza particelle visibili.
  6. Trasferire 50 μL di questo campione su un nuovo tubo da 1,5 ml ed etichettare "estratto totale" per un'analisi successiva. Trasferire l'estratto in tubi di centrifuga. Centrifugare il resto dell'estratto vegetale a 16.000 x g per 20 min, 4 °C e trasferire il supernatante in un tubo conico.
  7. Filtrare l'estratto solubile utilizzando una siringa da 50 ml e un filtro in fibra di vetro per siringhe (0,75 μm).
  8. Raccogliere 50 μL di un campione dopo la centrifugazione, etichettare "estratto solubile" per un'analisi successiva.

6. Procedura di cromatografia della colonna G proteica

NOTA: Il protocollo qui descritto è per la cromatografia a flusso gravitazionale utilizzando la resina di agarosio Pierce Protein G. Se si utilizza una resina diversa, fare riferimento alle istruzioni del produttore per le regolazioni. Non lasciare mai asciugare la resina e impedire che tutto il liquido si scarichi. Riacquisiamo l'uscita in base alle esigenze.

  1. Impostare una colonna di polipropilene contenente 20 mL di campione.
  2. Stimare la quantità di liquami necessari a seconda del tipo di immunoglobulina bersaglio e della sua affinità con la resina. Generalmente, 3 mL di liquame totale con volume del letto di 1,5 mL sono sufficienti per la purificazione di diversi milligrammi di Ab.
  3. Versare con cura la quantità richiesta di liquami rimorsi nella colonna limitata. Aprire la presa di colonna dalla parte inferiore della colonna e lasciare che si scarichi fino a quando la maggior parte del buffer non è sparita.
  4. Versare immediatamente 10 mL di tampone di lavaggio 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 con HCl) in cima. Lasciare scolare e ripetere questo passaggio di lavaggio 2x.
  5. Applicare il campione filtrato dal passaggio 5 alla colonna e raccogliere il flusso- aliquota 50 μL di flusso per un'analisi successiva. Salvare il resto del flusso nel caso in cui l'Ab non si sia legato alla resina.
    NOTA: la riapplicazione del flusso a una nuova colonna di solito non si traducono in una buona resa; quindi si consiglia di iniziare con nuovo materiale fogliare.
  6. Lavare la resina due volte con 10 mL di 1x PBS per ridurre la legatura non specifica. Se lo si desidera, aliquota 50 μL di lavaggio mentre il tampone scorre attraverso la colonna per verificare che il target Ab non sia eluitato con un tampone di lavaggio.
  7. Impostare ed etichettare cinque tubi con 125 μL di Tris-HCl sterile da 1 M a pH 8. Questo per neutralizzare gli Abs nel tampone di eluizione acida per evitare potenziali cambiamenti strutturali. In alternativa, aggiungere 30 μL di base Tris da 2 M per ottenere un campione meno diluito.
    ATTENZIONE: Durante l'eluizione, la luce UV può essere utilizzata per la visualizzazione. Ciò non deve essere fatto per tutta la durata dell'eluizione. Se si utilizza l'UV, assicurarsi di indossare DPI appropriati per evitare danni agli occhi e alla pelle. Non è necessario utilizzare una luce UV durante la fase di eluizione.
  8. Elute gli Abs applicando 5 ml di tampone di eluizione (glicina da 100 mM, pH 2,5 con HCl) alla colonna e raccogliere 1 mL di frazioni a ciascun tubo designato dal passo precedente.
  9. Rigenerare immediatamente la colonna applicando 20 mL di tampone di lavaggio, seguiti da 10 mL di tampone di lavaggio. Assicurarsi che la resina non sia lasciata in un ambiente acido per un lungo periodo di tempo. Le eluizioni dovrebbero apparire fluorescenti, spesso la fluorescenza più alta è vista nella seconda eluizione ma può variare dall'estrazione all'estrazione.
  10. Per lo stoccaggio, lavare la resina con 10 mL di 20% di etanolo in PBS e lasciarla drenare a metà strada. Riacquisire la parte superiore, quindi la parte inferiore della colonna, e mantenere in posizione verticale a 4 °C.
    NOTA: Generalmente, le resine proteiche G possono essere riutilizzate fino a 10 volte senza una significativa perdita di efficienza. Fare riferimento alle linee guida del produttore per dettagli specifici.
  11. Determinare la concentrazione ab utilizzando uno spettrofotometro misurando l'assorbanza a 280 nm, utilizzando il buffer di eluizione come vuoto. Conservare gli eluati in -80 °C e aliquota 50 μL di ogni frazione in un tubo separato per ulteriori analisi.

7. SDS-PAGE per il rilevamento della fusione GFP-Ig

  1. Preparare tutti gli esempi prima di configurare SDS-PAGE.
    1. Aggiungere 4 μL di tampone del campione (6x tampone di campione riducente: 3,0 mL di glicerolo, 0,93 g di DTT, 1 g di SDS, 7 mL di Tris 4x (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg di blu bromofenolo); (6x tampone campione non riducente: 3,0 mL di glicerolo, 1 g di SDS, 7 mL di Tris 4x (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg di blu bromofenolo) a 20 μL di ciascun campione (estratto totale, estratto solubile, flusso, lavaggio, tutte le frazioni di eluizione) per l'analisi. Assicurarsi che i tappi dei tubi siano fissati saldamente.
    2. Trattare solo riducendo i campioni per 5 minuti in un bagno d'acqua bollente, quindi mettere campioni per 5 minuti sul ghiaccio. Spin campioni in un microcentrifugo per ~5 s e caricare 20 μL di ciascun campione nell'ordine di raccolta nei pozzi di gel. Caricare 3 μL di scala proteica a doppio colore in un pozzo separato.
  2. Eseguire il gel SDS-PAGE a una separazione costante da 100 V a banda proteica desiderata; ci vogliono circa 1,5 ore. Monitorare la scala come indicatore di separazione proteica.
  3. Visualizza il gel sotto l'UV per osservare la fluorescenza GFP.
  4. Se lo si desidera, macchiare il gel con la macchia di Coomassie per valutare la proteina totale in ogni campione. In alternativa, eseguire western blot per valutare le proteine bersaglio utilizzando abs specifici.
    NOTA: Sia la colorazione Coomassie che la macchia occidentale possono essere eseguite seguendo i protocolli standard47,48.

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Representative Results

Questo studio dimostra un metodo facile e veloce per produrre proteine ricombinanti e visualizzarle durante i processi a valle. Utilizzando N. benthamiana e seguendo il protocollo fornito, la produzione di proteine ricombinanti qui descritta può essere raggiunta in meno di una settimana. Il flusso di lavoro complessivo dell'espressione, dell'estrazione e della purificazione dell'impianto è illustrato nella figura 1. Le fasi di crescita delle piante delle piantine di 2 settimane, delle piante vecchie di 4 settimane e delle piante di 6 settimane sono esposte rispettivamente nella figura 1A (1-3), mentre la figura 1B descrive i cambiamenti morfologici delle foglie dovuti alla necrosi(figura 1B-1)o alla clorosi(figura 1B-2). La necrosi può verificarsi nel sito di iniezione tra i giorni 3-5 dopo l'infiltrazione. Questi cambiamenti dipendono spesso dall'espressa proprietà della proteina e dalla salute delle piante infiltrate (ulteriormente esaminate nella discussione). Allo stesso tempo, la clorosi può anche fare affidamento sulla salute delle piante utilizzate (ulteriormente esaminate nella discussione). Il processo di crescita e preparazione dell'Agrobacterium per l'infiltrazione è mostrato nella figura 1C. La figura 1C-1 mostra colonie isolate di Agrobacterium. Le figure 1C (2-5) mostrano l'aspetto previsto del supporto dopo che è stato inoculato con una singola colonia isolata. Per ulteriori informazioni su questi passaggi, fare riferimento alla figura 3. Il processo di infiltrazione della pianta è mostrato nella figura 1D e inizia con una pianta non infiltrata ed è seguito dal processo di infiltrazione. L'espressione, l'estrazione e la chiarificazione delle proteine vegetali sono visualizzate nella figura 1E. Il materiale fogliare è posto in un frullatore ed è omogeneizzato, mostrato nelle figure 1E (1-3). Viene quindi prelevato un campione che rappresenta l'omogeneato totale. Viene quindi filtrato attraverso un Miracloth (una garza o anche un filtro da caffè può sostituire spese ridotte) e la sospensione chiarificato viene centrifugata. La centrifugazione consente la separazione del supernatante dai materiali rimanenti, come mostrato nelle figure 1E (4-6). Il supernatante chiarificato viene quindi caricato su una colonna di cromatografia di affinità proteina G, Figura 1F (1-3). Dopo che la maggior parte della proteina è stata legata, figura 1F-4, le proteine vengono eluite dalla resina Figura 1F (5,6).

La tabella 1 mostra le sequenze di acido nucleico ottimizzate per le piante utilizzate per produrre asGFP45 (fila superiore) nel pBY! Vettore KEAM-GFPasH utilizzato in questo studio per esprimere la fusione asGFP-IgG e GFP33 (riga inferiore) nel vettore PBYEAM-GFPHgp utilizzato in questo studio per esprimere la fusione GFP-IgG. Le sequenze di acido nucleico sono state esaminate utilizzando lo strumento di traslazione delle proteine Expasy (https://web.expasy.org/translate/) per determinare le sequenze di amminoacidi.

Una piastra di Agrobacterium rappresentativa preparata con questo protocollo è illustrata nella figura 2. Le colonie desiderate dovrebbero apparire rotonde e uniformi nella forma e nel colore. Le colonie più vicine al centro della piastra hanno una maggiore probabilità di esprimere resistenza alla kanamicina. Le colture liquide saranno preparate da una singola colonia isolata.

L'aspetto previsto dei supporti contenenti impostazioni cultura è illustrato nella figura 3. Al momento dell'inoculazione iniziale di una colonia isolata, i supporti LB appariranno giallo chiaro e traslucidi, come mostrato nella figura 3A. Dopo l'incubazione di una colonia isolata durante la notte a 30 °C, i supporti LB appariranno torbidi. Come illustrato nella figura 3B, gli oggetti non possono più essere visualizzati attraverso i supporti quando la crescita è presente nell'LB. Dopo la centrifugazione, un pellet dovrebbe formarsi nella parte inferiore del tubo. Il tubo avrà una netta separazione dei supporti LB sopra il pellet e apparirà giallo chiaro e traslucido, come mostrato nella figura 3C. Il supernatante per supporti LB viene smaltito e il pellet viene rimescolato nel tampone di infiltrazione. Con un OD600 di 0,2, il supporto apparirà torbido, come mostrato nella figura 3D. L'OD600 deve essere misurato come descritto nei metodi.

La figura 4 rappresenta il processo di infiltrazione fogliare. Un leggero pungolo della foglia con una graffetta dovrebbe produrre una rottura nell'epidermide fogliare che non passa interamente attraverso la foglia. La rottura dovrebbe perforare a malapena la foglia in modo che il tampone di infiltrazione possa essere iniettato nella foglia, mostrato nella figura 4A-C. La sospensione dell'Agrobacterium e del tampone di infiltrazione viene iniettata direttamente nella rottura nella foglia e altera leggermente il colore della foglia infiltrata; cfr. figura 4D-F.

L'aspetto delle foglie che esprimono fusioni IgG è rappresentato nella figura 5. Visualizza le fusioni asGFP-IgG(Figura 5A) e le fusioni GFP-IgG (Figura 5C) sotto luce bianca. Se i costrutti in questo protocollo vengono utilizzati, quando si infiltrano in un 0.2 OD600, le foglie dovrebbero apparire sane nei giorni 1-5 per entrambe le foglie che esprimono fusioni asGFP-IgG e foglie che esprimono fusioni GFP-IgG. Ci può essere un leggero aspetto necrotico nei siti di iniezione il giorno 5, che di solito è evidente dall'alleggerimento del tessuto vegetale in quelle aree. La figura 5 mostra anche le foglie che esprimono fusioni asGFP-IgG (Figura 5B) e fusioni GFP-IgG (Figura 5D), rispettivamente, sotto la luce UV a onde lunghe dalla vista dall'alto della foglia. La fluorescenza aumenta di intensità man mano che i giorni progrediscono per entrambi i costrutti espressi. Le foglie che esprimono fusioni asGFP-IgG tendono ad avere una fluorescenza leggermente meno intensa rispetto alle foglie che esprimono fusioni GFP-IgG in tutti i giorni.

Quando il supernatante dell'estratto di asGFP-IgG viene aggiunto alla colonna Protein G, la resina diventerà leggermente verde sotto la luce bianca a causa dei pigmenti di clorofilla vegetale(Figura 6A). L'aggiunta di supernatante sotto la luce UV ad onde corte si traduce nell'accumulo di fluorescenza nella resina proteina G, come mostrato nella figura 6B. Si noti che il supernatante sarà anche fluorescente da solo sotto la luce UV. Tuttavia, si prevede che la fluorescenza sarà molto più concentrata quando la fusione asGFP-IgG inizierà a legarsi alla resina.

Dopo il passaggio del supernatante di asGFP-IgG attraverso la resina proteica G, la resina dovrebbe illuminarsi sotto la luce UV ad onde corte, come mostrato nella figura 7A. A questo punto, la maggior parte dell'IgG sarà legata alla resina. Dopo aver aggiunto il tampone di eluizione, la fluorescenza contenuta nella resina G proteica sarà ancora visibile sotto la luce UV a onde corte e inizierà a perdere intensità man mano che un maggiore buffer di eluizione di basso pH passa attraverso la resina. La fluorescenza inizierà ad accumularsi negli eluati (Figura 7B). Le frazioni eluate varieranno in fluorescenza. Come si vede nella figura 8, la fluorescenza è l'intensità più bassa nella prima eluizione e l'intensità più alta nella seconda e terza eluati. I risultati possono variare, poiché la fluorescenza dipenderà dall'espressione della proteina, dal materiale fogliare raccolto e da altre condizioni utilizzate nell'esperimento.

Dopo aver terminato il processo di purificazione, i campioni vengono analizzati sul gel SDS-PAGE al 10% in condizioni di riduzione (il tampone del campione contiene DTT e i campioni sono stati bolliti per 5 minuti) e condizioni non riducente (il tampone del campione non contiene DTT e i campioni non sono stati bolliti). Come mostrato nella figura 9A, solo i campioni non riducenti, ad esempio nella corsia Elution 2 NR, si fluorescenza quando esposti alla luce UV a onde corte. La prima banda di questa corsia sta fluorescenza alla dimensione prevista del prodotto completo ~ 200 kDa, indicando che l'asGFP è ancora conforme alla conformità corretta. Le bande fluorescenti vicino al fondo del gel sono coloranti dal tampone riducente. Si noti che asGFP perde fluorescenza se esposto a temperature o superiori a 95 °C per 5 minuti; questo è diverso da eGFP (enhanced GFP), che manterrebbe una certa fluorescenza nelle stesse condizioni49,50. Anche due bande della scala, 75 kDa e 25 kDa, fluoresce. La figura 9B rappresenta una macchia coomassia dello stesso gel nella figura 9A. Le eluizioni nelle corsie 6-9 sono state preparate in condizioni di riduzione. Quando vengono eseguiti su un gel e macchiati di Coomassie, questi campioni devono visualizzare separatamente i componenti di fusione asGFP-IgG. Questi componenti includono la catena pesante fusa alla GFP (~75 kDa), la catena pesante da sola (50 kDa), la catena leggera (25 kDa) e l'asGFP stesso (27 kDa). Il campione non riducente è stato incluso nell'ultima corsia del gel a scopo di confronto e dovrebbe visualizzare una singola banda grande (~ 200 kDa), che dovrebbe essere composta da due catene pesanti fuse all'asGFP e alle rispettive catene leggere. Inoltre, le bande più piccole sono probabilmente causate da proteasi native. Questa scissione può essere prevenuta con l'aggiunta di inibitori della proteasi e mantenendo l'estratto proteico freddo in ogni momento, anche quando si esegue la purificazione della colonna. I singoli componenti della proteina di fusione IgG non saranno distinguibili nei campioni non riducente sul gel Coomassie.

Figure 1
Figura 1: Flusso di lavoro dei processi di espressione, estrazione e purificazione dell'impianto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Sequenza nucleotidica utilizzata Sequenza amminoacido
Sequenze
utilizzato per
asGFP in
PBY! Keam
-GFPasH
Vettore
utilizzato in
Le
Espressione
della
asGFP-IgG
Fusione		 ATGGTGTCCAAGGGAGAGGAAGCTTCTGGAAGAGCCTTGTTC
CAGTACCCTATGACTTCTAAATCGAGTTGAATGGCGAGATCA
ACGGAAAGAAGTTTAAGGTTGCTGGAGAGGGTTTCACCCCTTC
ATCTGGAAGATTCAATATGCACGCTTACTGTACTACCGGAGAC
TTGCCTATGTCCTGGGTTGTTATAGCTTCCCCGCTTCAGTACGG
GTTTCACATGTTTGCCCACTACCCTGAGGATATCACTCACTTCTT
CCAAGAATGTTTTCCTGGGTCTTATACTCTCGACAGAACTTTGA
GGATGGAGGGACGGTACTCTTACTACTCACCACGAGTACTC
CCTTGAGGACGGTTGCGTTACTTCCAAGACTACTTTGAACGCTT
CTGGATTCGACCCCAAGGGAGCCACTATGACTAAGTCTTTCGT
CAAACAGCTCCCAAACGAGGTCAAAATCACCCCACACGGGCCA
AATGGTATTAGACTTACTTCCACTGTTCTACCTTAAGGAGGA
CGGAACTATCCAGATCGGAACTCAAGACTGCATCGTTACCCCA
GTTGGCGGCAGAAAAGTTACTCAGCCTAAGGCTCACTTTCTTC
ATACTCAGATCATTCAGAAGAAGGACCCAAACGACACCAGAG
ATCACATCGTTCAGACTGAGCTTGCCGTTGCTGGAAATCTTTG
GCACGGCATGGATGAGCTTTACAAGA		 MVSKGEEASGRALF
QYPMTSKIELNGEI
NGKKFKVAGEGFTP
SSGRFNMHAYCTT
GDLPMSWVVIASPL
QYGFHMFAHYPEDI
THFFQECFPGSYTL
DRTLRMEGDGTLTT
HHEYSLEDGCVTSK
TTLNASGFDPKGAT
MTKSFVKQLPNEVK
ITPHGPNGIRLTSTV
LYLKEDGTIQIGTQD
CIVTPVGGRKVTQP
KAHFLHTQIIQKKDP
NDTRDHIVQTELAV
AGNLWHGMDELY
K
Sequenze
utilizzato per
GFP in
PBYEAMGFPHgp
Vettore
utilizzato in
Le
Espressione
di GFP-IgG
Fusione		 ATGGCTAACAAGCACCTCTCATTGTCTCTTCCTTGTGCTCCTT
GGTCTTTCTGCTTCTTGCTTCTGGTATGGTGAGCAAGGGCG
AGGAGCTGTTCACCGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGG
ACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGG
GCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCA
TCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGT
GACCACCTTCAGCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCC
GACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCG
AAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGG
CAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACAC
CCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGA
GGACGGCAACATCCTGGCAAGCTGGAGTAACTACAA
CAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGG
CATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGC
AGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCG
GCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCAC
CCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCA
CATGGTCCTGCTGGAGTGTGTGACCGCCGCCGGGATCACTCAC
GGCATGGACGAGCTGTACAAGA		 MANKHLSLSLFLVLL
GLSASLASGMVSKG
EELFTGVVPILVELD
GDVNGHKFSVSGE
GEGDATYGKLTLKFI
CTTGKLPVPWPTLV
TTFSYGVQCFSRYP
DHMKQHDFFKSA
MPEGYVQERTIFFK
DDGNYKTRAEVKFE
GDTLVNRIELKGIDF
KEDGNILGHKLEYN
YNSHNVYJMADKQ
KNGIKVNFKIRHNIE
DGSVQLADHYQQN
TPIGDGPVLLPDNH
YLSTQSALSKDPNEK
RDHMVLLEFVTAA
GITH

Tabella 1: Sequenze utilizzate per creare asGFP e GFP

Figure 2
Figura 2: Colonie di agrobatteri coltivate su lastra LB contenente kanamicina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Comparsa di mezzi durante la crescita e la lavorazione dell'Agrobacterium. (A) La comparsa di supporti LB immediatamente dopo l'inoculazione di colonia isolata di Agrobacterium. (B) La presenza di mezzi dopo l'incubazione notturna di una colonia isolata a 30°C. (C) La comparsa di mezzi dopo colture è spensata per 20 minuti a 4.500 x g. (D) Pellet rimosorsi nel tampone di infiltrazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Processo di infiltrazione delle piante di N. benthamiana. (A-B) Frugando leggermente la foglia si traduce in un sottile foro nella parte superiore della foglia. (C-D) Iniezione di sospensione agrobatterio in foglia. (E) Foglia di pianta infiltrata dalla vista dall'alto. (F) Pianta con più foglie infiltrate dalla vista dall'alto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: La visualizzazione delle foglie contenenti fusione asGFP-IgG e fusione GFP-IgG inizia il giorno 1 dopo l'infiltrazione (dpi) in prima fila, portando fino al giorno 5 dpi nell'ultima riga per tutte le condizioni. A) fusione asGFP-IgG sotto luce bianca. B) fusione asGFP-IgG sotto UV a onde lunghe. C) Fusione GFP-IgG sotto luce bianca. D) Fusione GFP-IgG sotto UV a onde lunghe. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Supernatante dell'estratto asGFP-IgG aggiunto alla colonna Protein G. A) Aggiunta sotto luce bianca. B) Aggiunta sotto luce UV ad onde corte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Resina proteica G sotto luce UV ad onde corte dopo che il supernatante dell'estratto asGFP-IgG è stato eseguito attraverso la colonna. A) Resina proteica G sotto luce UV a onde corte. B) Resina proteica G al momento dell'eluizione delle proteine in condizioni di PH basso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Eluizioni purificate di asGFP-IgG ottenute dopo l'esposizione a basse condizioni di pH attraverso la purificazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: SDS-PAGE degli esempi di colonna. I campioni etichettati con "R" sono in condizioni di riduzione e i campioni etichettati con "NR" sono in condizioni non riducente. A) Sotto la luce UV, solo i campioni non riducenti fluoresce nel gel di poliacrilammide al 10%, come si vede nella corsia Elution 2 NR. Anche le fasce a scala da 75 kDa e 25 kDa fluoresce. B) La colorazione coomassie dello stesso gel rivela la presenza di tutte le proteine nel campione. Nelle eluizioni ridotte, la fusione IgG senza catena leggera, la catena pesante, la catena leggera e la GFP possibilmente degradata sono presenti rispettivamente a ~ 75 kDa, ~ 50 kDa, ~ 25 kDa e ~ 10 kDa. Al contrario, nelle eluizioni non ridotte, è presente una banda prominente, coerente con le dimensioni dell'intera fusione asGFP-IgG (~200 kDa). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo può essere utilizzato per la verifica visiva di qualsiasi ab ricombinante o proteina ricombinante prodotta nelle piante di N. benthamiana, comprese quelle che richiedono un'esposizione temporanea ad ambienti acidi ai fini della purificazione dellecolonne 42,43,44. Inoltre, la fusione di asGFP con altre proteine in diversi sistemi di espressione può essere uno strumento utile per la visualizzazione sperimentale e l'educazione. Il protocollo qui presente può essere ulteriormente ridimensionato a quantità sempre più grandi di materiale fogliare per produrre la quantità desiderata di proteine ricombinanti. I metodi descritti sfruttano studi precedenti che hanno identificato e realizzato versioni di FPG che rimangono stabili in condizioni acide46. Studi preliminari completi hanno creato domini di immunoglobulina fusi a una proteina di interesse, spesso definita fusioni IgG, che questo protocollo può ospitare anche28. Creando ed esprimendo una fusione IgG composta da un IgG1 umanizzato fuso ad una GFP e asGFP, siamo stati in grado di visualizzare la presenza della proteina desiderata durante i processi di espressione, estrazione e purificazione.

Se un ricercatore qualificato segue questo protocollo, le foglie inizieranno a mostrare segni di necrosi nei siti di infiltrazione tra i giorni 4-5. Tuttavia, quando si utilizzano i vettori descritti, le aree infiltrate delle foglie dovrebbero apparire sane fino al giorno 5 con cura adeguata. È importante notare che l'infezione da Agrobacterium da sola alla fine si tradurrà in necrosi delle foglie della pianta a causa dell'accumulo di specie reattive di ossigeno (ROS) come parte della risposta immunitaria delle cellule vegetali51,52. Questa risposta immunitaria e il livello di necrosi risultante possono variare in base a diversifattori 51,tra cui il targeting cellulare, la posizione della proteina, il tipo di proteina prodotta, il vettore di espressione e il ceppo di Agrobacterium utilizzato 53,54. Inoltre, le variazioni nella densità ottica (OD600) dell'Agrobatterio utilizzato per l'infiltrazione possono influenzare i livelli di necrosi55. Molti vettori di espressione utilizzano proteine che legano la proteina del retinoblastoma per mantenere le cellule vegetali in fase di sintesi (S) e aumentare la divisione cellulare e la frequenzadi trasformazione 56,57. L'aumento della produzione proteica, come quelli causati dal legame con la proteina del retinoblastoma, può portare allanecrosi 56,57. I progressi nella progettazione vettoriale, come quelli utilizzati nelle versioni modificate delle repliche BeYDV del geminivirus utilizzate in questo protocollo, hanno ridotto al minimo la necrosi mantenendo alti livelli di espressione proteica58. Inoltre, le repliche BeYDV non sono in competizione, fornendo espressione di più proteine su una singola cassetta senza limitazioni di dimensionenote 53,59.

Diversi fattori influenzano la crescita delle piante prima e dopo l'infiltrazione, che potrebbe alla fine portare a una bassa resa proteica. Quando si seminano piante, troppi semi per pellet vegetale possono causare molti piccoli germogli vegetali che portano a una crescita delle piante più modesta. Pertanto, ridurre il numero di semi per pellet di torba e rimuovere i germogli extra dopo una settimana si tradurrà in una migliore crescita delle piante. Mantenere una corretta umidità del suolo è un altro fattore che influisce sulla salute generale delle piante. L'acqua troppo, sott'acqua, l'aggiunta di troppo o troppo poco fertilizzante potrebbero contribuire alla clorosi e influenzare lasalute delle piante 60,61,62. Necrosi e clorosi possono inoltre essere causate dalla produzione di una proteina che causa stress cellulare. Questo fenomeno è stato visto molte volte con l'espressione di complessi immunitari ricombinanti (RIC)56. Abbiamo osservato che i cambiamenti nella struttura proteica e nella fusione delle proteine possono aiutare a ridurre al minimo la necrosi; tuttavia, alcune proteine possono rimanere tossiche per le piante anche dopo varie modifiche. Se si utilizzano i vettori di espressione descritti nel presente documento, l'estrazione di proteine può essere eseguita precocemente e prima dell'inizio di una necrosi significativa, con conseguente elevata resaproteica 56.

Diverse condizioni di crescita possono rallentare o addirittura inibire la crescita dell'Agrobacterium. L'agrobatterio cresce in modo ottimale a 28 °C-30 °C e sperimenta uno shock termico quando viene incubato sopra i 30 °C, producendo errori di divisionecellulare 62. La crescita può anche essere ostacolata dall'aggiunta di troppa rifampicina, poiché diversi ceppi di Agrobacterium sono più o meno naturalmente resistenti a questoantibiotico 62. La coltura batterica preparata per l'infiltrazione con OD600 significativamente più alto di quanto raccomandato causerà probabilmente necrosi55. Un OD600 leggermente più alto della coltura di solito non influisce sulla resa, ma se è inferiore a 0,1, la resa proteica potrebbe essere notevolmente ridotta. L'accumulo di cellule morte può verificarsi in due circostanze; 1) la coltura era ricoperta di vegetazione, portando ad una frazione significativa dell'OD essendo cellule morte, e 2) danneggiando /uccidendo l'Agrobacterium dopo la crescita, come con residui chimici o alte velocità di centrifuga. Le infiltrazioni che usano un numero maggiore di cellule morte nella coltura potrebbero ridurre l'espressione proteica. Inoltre, forare le foglie applicando troppa pressione può danneggiare le foglie e quindi portare a necrosi prematura. Considerando questi possibili fattori quando si esprimono proteine ricombinanti in Nicotiana benthamiana, può portare a una maggiore produzione proteica.

Ottenere una bassa resa proteica potrebbe essere dovuto ad alcuni problemi nelle fasi di estrazione e purificazione. In primo luogo, il buffer di estrazione potrebbe aver bisogno di ottimizzazione a seconda della proteina di interesse. Durante la miscelazione, il materiale vegetale deve essere omogeneo senza pezzi fogliari visibili. Successivamente, alcune proteine richiedono detergenti per la solubilizzazione nel tampone di estrazione, come Tween-20 o Tritone. Altre proteine potrebbero aver bisogno di urea ad alte concentrazioni ~ 7,5 M per la solubilizzazione, mentre alcune possono essere estratte solo con PBS. La degradazione delle proteine può verificarsi se tamponi, tessuti vegetali, centrifughe, ecc. non vengono mantenuti freschi durante il processo di estrazione. La mancanza di inibitori della proteasi e ascorbato di sodio o sostanze chimiche simili nel tampone di estrazione può anche causare degradazione o aggregazione. Alcuni inibitori della proteasi come il PMSF si degradano rapidamente e l'ascorbato di sodio impiega del tempo per diventare acquoso. Nel complesso, i ricercatori dovrebbero determinare le condizioni ottimali per la loro proteina di interesse.

La purificazione delle fusioni IgG include pochi passaggi che potrebbero richiedere modifiche se si ottiene una bassa resa proteica. L'analisi delle aliquote campione raccolte durante l'intero processo da SDS-PAGE e Western aiuterà a identificare l'errore dei metodi. Ad esempio, se il flusso contiene una notevole quantità di proteine, il legame della proteina può essere facilitato cambiando il pH del tampone. L'uso di alte concentrazioni di detergenti durante il processo di estrazione potrebbe influire sulla proprietà legante della resina, specialmente se la resina viene riutilizzata più volte. Una corretta conservazione della resina, come descritto nei metodi, è vitale per la durata della resina. Inoltre, se la fase di lavaggio rimuove la proteina di interesse dalla resina, i tamponi potrebbero dover essere rifatti per risolvere questo problema. Altri problemi con la purificazione delle proteine potrebbero essere dovuti a proteine mal piegate o degradate, che potrebbero richiedere un'ulteriore analisi del design generale delle proteine. Fare riferimento alla risoluzione dei problemi descritta può aumentare l'efficienza della purificazione utilizzando questo protocollo.

La depurazione della fusione GFP-IgG descritta è utile in un ambiente didattico. La visualizzazione è fondamentale per l'educazione scientifica perché consente agli studenti di comprendere i concetti più facilmente39. Gli studenti spesso segnalano incomprensioni oltre alla difficoltà di comprendere i concetti a livellomolecolare 39. In particolare, gli esperimenti che richiedono una comprensione della posizione specifica delle proteine in ogni fase possono essere modificati etichettando proteine di interesse con molecole fluorescenti. Pertanto, GFP o asGFP, a seconda dell'ambiente di pH utilizzato, possono essere utilizzati per sfruttare la loro fluorescenza per facilitare la spiegazione della tecnica di purificazione delle proteine per gli studenti.

In sintesi, descriviamo un metodo semplice per l'espressione e la purificazione di un Ab ricombinante fuso ad una GFP nelle piante di N. benthamiana. Questo protocollo può essere utilizzato per la purificazione di un Ab fuso a qualsiasi proteina bersaglio desiderata. Il processo può essere modificato per ospitare varie quantità di materiale fogliare e consente la determinazione visiva della presenza proteica prima, durante e dopo la conclusione del processo di estrazione e purificazione delle proteine. Questi metodi possono essere utili come controlli e possono essere utilizzati per le tecniche di insegnamento.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Maria Pia DiPalma per aver modificato il video. Ringraziamo anche l'Office of Educational Outreach and Student Services dell'Arizona State University per la loro generosa assistenza alle tasse di pubblicazione. La ricerca per questo protocollo è stata supportata dalla School of Life Sciences, Arizona State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL syringe any N/A
50 mL syringe any N/A
Agar SIGMA-ALDRICH A5306
Blender with cups any N/A
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404
DTT (DL-Dithiothreitol) MP BIOMEDICALS 219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid SIGMA-ALDRICH E-6760
Ethanol any N/A
Glycerol G-Biosciences BTNM-0037
Glycine SIGMA-ALDRICH G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid) EMD MILLIPORE CORPORATION HX0603-4
Heating block any reputable supplier N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets Hummert International 14237000
Kanamycin Gold Biotechnology Inc K-120-100
KCl (Potassium Chloride) SIGMA-ALDRICH P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate) J.t.baker 3248-05
KOH (Potassium Hydroxide) VWR BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate SIGMA-ALDRICH M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) SIGMA-ALDRICH M8250
Miracloth Millipore 4 75855-1R
Moisture control potting mix Miracle-Gro 755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate) J.t.baker 3827-01
NaCl (Sodium Chloride) Santa Cruz Biotechnology sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds any reputable supplier N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) G-Biosciences 786-787
Polypropylene Column any N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 1610394
Protein G resin Thermo Fisher Scientific 20399
Rifampicin Gold Biotechnology Inc R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) G-Biosciences DG093
Sodium Ascorbate SIGMA-ALDRICH A7631-500G
Spectrophotometer any reputable supplier N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter ThermoScientific 40725-GM
Tray for peat pellets with dome any N/A
TRIS Base J.t.baker 4109-02
Tris-HCl Amresco M108-1KG
Tryptone SIGMA-ALDRICH 17221
UV lamp any N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2000992
Yeast extract SIGMA-ALDRICH 9182

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biologia Numero 167 anticorpo anticorpo monoclonale pharming molecolare agroinfiltrazione espressione transitoria Nicotiana benthamiana proteinafluorescente verde proteina fluorescente verde stabile all'acido fusione anticorpale fusione IgG purificazione proteina G
Produzione di proteine di fusione IgG espresse transitoriamente in <em>Nicotiana benthamiana</em>
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Kamzina, A. S., DiPalma, M. P., Hunter, J. G. L., Diamos, A. G., Armer, B., Mor, T. S., Mason, H. S. Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana. J. Vis. Exp. (167), e61774, doi:10.3791/61774 (2021).

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