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Biology

निकोटियाना बेंथामियाना में आईजीजी फ्यूजन प्रोटीन का उत्पादन क्षणिक रूप से व्यक्त किया गया

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61774
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School
* These authors contributed equally

Summary

हम यहां निकोटियाना बेंथामियानामें जीएफपी के लिए अभिव्यक्ति, निष्कर्षण और पुनर्संयोजन मानव आईजीजी की शुद्धि के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल को कई प्रोटीन के शुद्धिकरण और दृश्यीकरण तक बढ़ाया जा सकता है जो कॉलम क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करते हैं। इसके अलावा, प्रोटोकॉल में व्यक्ति और आभासी कॉलेज शिक्षण प्रयोगशाला के लिए अनुकूलनीय है, परियोजना आधारित अंवेषण प्रदान करते हैं ।

Abstract

विभिन्न संक्रामक, मेटाबोलिक, ऑटोइम्यून, नियोप्लास्टिक और अन्य बीमारियों के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेप के रूप में एंटीबॉडी की उच्च मांग पुनः संयोजन एंटीबॉडी उत्पादन के लिए कुशल तरीकों को विकसित करने में बढ़ती आवश्यकता पैदा करती है। 2019 तक, 70 से अधिक एफडीए-अनुमोदित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी थे, और घातीय विकास क्षमता है। अपने वादे के बावजूद, व्यापक उपयोग के लिए सीमित कारक विनिर्माण लागत और जटिलता हैं । संभावित रूप से, पौधे कम लागत, सुरक्षित और आसानी से स्केलेबल प्रोटीन विनिर्माण रणनीतियों की पेशकश करते हैं। निकोटियाना बेंथामियाना जैसे पौधे न केवल जटिल स्तनधारी प्रोटीन को सही ढंग से मोड़ और इकट्ठा कर सकते हैं बल्कि स्तनधारी कोशिका संस्कृतियों द्वारा पेश किए गए महत्वपूर्ण पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों को भी जोड़ सकते हैं। इस काम में, देशी जीएफपी और मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लिए जुड़े हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के एसिड-स्थिर संस्करण का उपयोग करके, हम एन बेंथामियाना पौधों से पूरे क्षणिक एंटीबॉडी अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण प्रक्रिया की कल्पना करने में सक्षम थे। प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर, देशी जीएफपी संलयन पौधों में अभिव्यक्ति चरण के दौरान आसान दृश्य सुनिश्चित कर सकता है, जबकि एसिड-स्थिर जीएफपी संलयन डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के दौरान दृश्य के लिए अनुमति देता है। यह स्केलेबल और सीधी प्रक्रिया केवल कुछ छोटे पौधों का उपयोग करके दिनों के मामले में अत्यधिक शुद्ध एंटीबॉडी या एंटीबॉडी फ्यूजन प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा का उत्पादन करने के लिए एक शोधकर्ता द्वारा की जा सकती है। इस तरह की तकनीक को पौधे और अन्य अभिव्यक्ति प्रणालियों दोनों में एंटीबॉडी शुद्धिकरण प्रक्रिया और संभावित रूप से कई अन्य प्रोटीन के दृश्य तक बढ़ाया जा सकता है। इसके अलावा, इन तकनीकों आभासी निर्देशों को लाभ और स्नातक आणविक जीव विज्ञान तकनीकों के साथ ंयूनतम पूर्व अनुभव रखने के छात्रों द्वारा एक शिक्षण प्रयोगशाला में मार डाला जा सकता है, वास्तविक दुनिया अनुप्रयोगों के साथ परियोजना आधारित अंवेषण के लिए एक नींव प्रदान करते हैं ।

Introduction

उद्योग की रिपोर्टों से संकेत मिलता है कि संयुक्त राज्य अमेरिका में बीस सबसे अधिक कमाई करने वाली दवाओं में से तेरह जीवविज्ञान (प्रोटीन आधारित फार्मास्यूटिकल्स) थे, जिनमें से नौ एंटीबॉडी थे । 2019 तक, विभिन्न नैदानिक विकास चरणों1,2,3में 570 से अधिक एंटीबॉडी (एबी) चिकित्सीय थे। वर्तमान वैश्विक एबी की बिक्री 100 बिलियन अमरीकी डॉलर से अधिक है, और मोनोक्लोनल एबी (एमएबी)चिकित्सीय बाजार 2025 तक1,4तक 300 बिलियन अमरीकी डॉलर तक उत्पन्न होने की उम्मीद है। इस तरह की उच्च मांग और राजस्व में अनुमानित वृद्धि के साथ, शोधकर्ताओं ने उच्च गुणवत्ता और कम लागत के साथ, एक कभी बड़े पैमाने पर एबी चिकित्सा विज्ञान का उत्पादन करने के तरीके विकसित करने के लिए काम कर रहा है । संयंत्र आधारित अभिव्यक्ति प्रणालियों के पास एबी थेराप्यूटिक्स5,6के किफायती और बड़े पैमाने पर निर्माण के लिए पारंपरिक स्तनधारी सेल लाइनों पर कई फायदे हैं। पौधों में प्रोटीन चिकित्सा विज्ञान के उत्पादन ("आणविक pharming") को महंगी बायोरिएक्टर या सेल संस्कृति सुविधाओं की आवश्यकता नहीं होती है जैसा कि पारंपरिक स्तनधारी सेल संस्कृति तकनीक7,8है। पौधे मानव रोगजनकों को अनुबंधित नहीं कर सकते हैं, संभावित संदूषण को कम नहीं करसकते हैं 9। क्षणिक और ट्रांसजेनिक संयंत्र आधारित प्रोटीन अभिव्यक्ति दोनों का उपयोग स्तनधारी या जीवाणु उत्पादन प्रणालियों10के लिए कम लागत वाले विकल्प के रूप में किया जा सकता है । हालांकि ट्रांसजेनिक पौधों को फसल उत्पादन के लिए पसंद किया जाता है, लेकिन इस विधि का उपयोग करके पुनः संयोजन प्रोटीन उत्पादन के लिए हफ्तों से महीनों की आवश्यकता हो सकती है। 11,12, 13, 14दिनों में वांछित प्रोटीन के क्रमशः छोटे और बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए छोटे और बड़े पैमाने पर उत्पादन की अनुमति। इबोला, डेंगू और ज़िका और कई अन्य पुनः संयोजन प्रोटीन के खिलाफ एमएबी का उत्पादन एन बेंथामियाना संयंत्रों15, 16, 17,18,19में क्षणिक अभिव्यक्ति का उपयोग करके जल्दी और कुशलता से शुद्ध किया गया है। ये परिस्थितियां क्षणिक पौधे आधारित अभिव्यक्ति को कई एबी चिकित्सा विज्ञान और इस प्रोटोकॉल20में प्रदर्शित तरीकों को विकसित करने के लिए एक आकर्षक विकल्प बनाती हैं।

पहली पीढ़ी के mAbs मुरीन व्युत्पन्न के थे, जिसके परिणामस्वरूप मानव परीक्षणों में उपयोग किए जाने पर गैर-विशिष्ट इम्यूनोजेनिसिटी21हुई। समय के साथ, चिमरिक, मानवीकृत, और अंततः, एबी चिकित्सा विज्ञान द्वारा प्रेरित इम्यूनोजेनिकिटी को कम करने के लिए पूरी तरह से मानव एब्स का उत्पादन किया गया था। दुर्भाग्य से, इनमें से कुछ एब्स अभी भी ग्लाइकोसिलेशन21में अंतर के कारण मेजबान इम्यूनोजेनिकिटी का कारण बनते हैं। संयंत्र इंजीनियरिंग में विकास ने एबी ग्लाइकन के संशोधन के लिए अनुमति दी है, जो आवश्यक है क्योंकि एबी की स्थिरता और कार्य इसके ग्लाइकोसिलेशन राज्य22से काफी प्रभावित हो सकता है। अग्रिमों ने मानवीकृत एमएबी की उच्च स्तरीय अभिव्यक्ति की पौध प्रणालियों में उत्पादन की अनुमति दी है, जिसमें मानव ग्लाइकन होते हैं और परिणामस्वरूप बड़े पैमाने पर उत्पादित मानव दवा19,21के वांछित जैविक लक्षण होते हैं।

हाल के दशकों में विभिन्न उद्देश्यों के लिए पुनर्संयोजन एब्स के अलावा एबी फ्यूजन अणुओं (एबी फ्यूजन) का पता लगाया गया है । एबी फ्यूजन में अक्सर एक एबी या एबी टुकड़ा होता है जो अणु या प्रोटीन से जुड़ा होता है और प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं से प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने के लिए डिज़ाइन किया जाता है23. इन अणुओं को कैंसर और ऑटोइम्यून रोगों24 , 25 , 26,27जैसी विभिन्न विकृतियों के इलाज के लिए संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेपकेरूप मेंबनायागया है । Recombinant प्रतिरक्षा परिसरों (RICs) एबी संलयन का एक और वर्ग है कि टीका उंमीदवारों के रूप में नियोजित किया गया है28। आरआईसी एबी फ्यूजन के एफसी क्षेत्रों को पहचानने की प्रतिरक्षा प्रणाली की क्षमता का लाभ उठाते हैं और अन्यवैक्सीन प्लेटफार्मों29,30,31के साथ संयुक्त होने पर इम्यूनोजेनिसिटी में सुधार करने के लिए पाए गए हैं।

ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) जेलीफ़िश एक्वारिया विक्टोरिया से प्राप्त एक बायोल्यूमिनेसेंट प्रोटीन है, जो पराबैंगनी प्रकाश32,33से उत्साहित होने पर हरी रोशनी का उत्सर्जन करता है। इन वर्षों में, जीन अभिव्यक्ति के एक दृश्य मार्कर के रूप में जीएफपी का उपयोग एस्चेरिचिया कोलाई में अभिव्यक्ति से कई प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणालियों तक विस्तारित हुआ है, जिसमें एन बेंथामियाना पौधे34,35,36,37,38शामिल हैं। जीएफपी जैसे दृश्यमान मार्कर, वैज्ञानिक अवधारणाओं के शिक्षण और सीखने में प्रचुर मात्रा में निहितार्थ हैं। कई प्रवेश स्तर के छात्रों को वैज्ञानिक अवधारणाओं लोभी कठिनाइयों का वर्णन जब विचार सिखाया जा रहा है नग्न आंखों को दिखाई नहीं है, जैसे आणविक जीव विज्ञान और संबंधित क्षेत्रों की अवधारणाओं के रूप में३९। जीएफपी जैसे दृश्य मार्कर, इस प्रकार वैज्ञानिक प्रक्रियाओं से संबंधित जानकारी के प्रसंस्करण में योगदान दे सकते हैं और कई वैज्ञानिक अवधारणाओं को सीखने में छात्रों की रिपोर्ट में कठिनाइयों को कम करने में मदद कर सकते हैं।

हालांकि जीएफपी का उपयोग अक्सर वीवो मेंजीन और अभिव्यक्ति को इंगित करने के लिए मार्कर के रूप में किया जाता है, लेकिन अम्लीय स्थितियों का उपयोग करने पर डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं में इसकी कल्पना करना मुश्किल होता है। यह परिस्थिति मुख्य रूप से इसलिए है क्योंकि जीएफपी अपनी संरचना को बनाए नहीं रखता है और परिणामस्वरूप कम पीएच40पर फ्लोरेसेंस होता है। विभिन्न शुद्धिकरण प्रक्रियाओं में अस्थायी अम्लीय वातावरण की अक्सर आवश्यकता होती है, जैसे प्रोटीन जी, प्रोटीन ए, और प्रोटीन एल क्रोमेटोग्राफी, अक्सर एबी शुद्धि41, 42,43,44के लिए उपयोग कियाजाताहै। अम्लीय परिस्थितियों में फ्लोरेसेंस बनाए रखने के लिए जीएफपी म्यूटेंट का उपयोग किया गया है45,46.

इसके साथ ही हम एन बेंथामियाना पौधों में पुनर्संयोजन आईजीजी फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति, निष्कर्षण और शुद्धि के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं। हमने एक मानवीकृत आईजीजी भारी श्रृंखला के एन-टर्मिनस के लिए पारंपरिक जीएफपी का उत्पादन किया, जिससे जीएफपी-आईजीजी संलयन पैदा हुआ। इसके साथ ही, हमने एक मानवीकृत आईजीजी भारी श्रृंखला के एन-टर्मिनस के लिए एसिड-स्थिर जीएफपी (एएसजीएफपी) के लिए एक पौधे कोडन-अनुकूलित अनुक्रम का संलयन विकसित किया, जिससे एक एएसजीएफपी-आईजीजी संलयन बन गया। जीएफपी-आईजीजी के उत्पादन के फायदों में अभिव्यक्ति के दौरान लक्षित प्रोटीन की उपस्थिति की कल्पना करने की क्षमता शामिल है, जबकि एएसजीएफपी-आईजीजी न केवल अभिव्यक्ति और निष्कर्षण चरणों में बल्कि प्रोटीन के शुद्धिकरण चरणों में भी पुनः संयोजन प्रोटीन की उपस्थिति को देखने की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल को एन बेंथामियाना में उत्पादित जीएफपी फ्यूजन प्रोटीन की एक श्रृंखला के उत्पादन, शुद्धिकरण और दृश्य के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और क्रोमेटोग्राफी तकनीकों का उपयोग करके शुद्ध किया जा सकता है जिसके लिए कम पीएच की आवश्यकता होती है। इस प्रक्रिया को पत्ती सामग्री की विभिन्न मात्रा के अनुरूप भी किया जा सकता है। जबकि जीएफपी या एएसजीएफपी के साथ टैग किए गए एब्स और फ्यूजन प्रोटीन का उपयोग उपचारों के लिए नहीं किया जाता है, इन तरीकों को प्रयोगों के दौरान नियंत्रण के रूप में उपयोगी किया जा सकता है और इसे आणविक और सेलुलर जीव विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी के लिए एक शिक्षण उपकरण के रूप में आगे भी उपयोग किया जा सकता है, दोनों व्यक्ति और वस्तुतः।

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Protocol

1. एन बेंथामियाना पौधों की खेती करें

  1. एक ट्रे पर मिट्टी पीट छर्रों प्लेस और पहले उबला हुआ डालना, अभी भी गर्म (~ 40-45 डिग्री सेल्सियस), पूर्ण विस्तार के लिए पीट छर्रों पर पानी । छर्रों को पूरी तरह से विस्तारित करने के बाद, चिमटी का उपयोग करके प्रत्येक पीट पेलेट पर 2-3 एन बेंथामियाना बीज रखें।
  2. ट्रे के नीचे कवर करने के लिए पानी के बारे में 0.5 डालो। सीडिंग तिथि के साथ ट्रे लेबल। उर्वरक की उचित मात्रा के साथ दैनिक रोपण पानी जारी रखें। उर्वरक (पानी में घुलनशील सभी उद्देश्य संयंत्र भोजन) एकाग्रता आम तौर पर 2.5-2.8 g/L है ।
  3. विकास कक्ष में रखे जाने पर ट्रे को ह्यूमिडोम टॉप से कवर करें। 16 घंटे फोटोपीरियोड और 60% सापेक्ष आर्द्रता के साथ, विकास कक्ष में वरीयता प्राप्त पीट छर्रों को 23-25 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  4. एक सप्ताह के बाद, प्रत्येक पेलेट को केवल एक अंकुर के साथ छोड़ने वाले अतिरिक्त पौधों को हटा दें।
  5. जब पौधे 2-3 सप्ताह पुराने होते हैं, तो प्रत्येक पीट पेलेट को नमी नियंत्रण मिट्टी वाले एक व्यक्तिगत बर्तन में स्थानांतरित करें। इस प्रदर्शन में चमत्कार-ग्रो नमी नियंत्रण पॉटिंग मिट्टी का इस्तेमाल किया गया ।
  6. 1 ग्राम/एल उर्वरक के साथ दैनिक पानी। मिट्टी को कभी भी पूरी तरह से सूखा न छोड़ें। पौधे 5-6 सप्ताह पुराने होने पर घुसपैठ के लिए तैयार होते हैं।

2. घुसपैठ के लिए एग्रोबैक्टीरियम टमेफैसियंस की तैयारी

नोट: GFP-IgG संलयन निर्माण के रूप में इस कागज31में वर्णित प्राप्त किया जा सकता है । इसअध्ययनसे एएसजीएफपी जीन प्राप्त किया गया था और पौधों को अनुकूलित किया गया था। निम्नलिखित कदम एक Bunsen बर्नर के बगल में किया जाना चाहिए, और बुनियादी aseptic तकनीकों को संदूषण से बचने के लिए लागू किया जाना चाहिए ।

  1. लकीर ए tumefaciens EHA105 शरण बीन पीले बौना वायरस (BeYDV)19 संयंत्र अभिव्यक्ति वेक्टर प्रत्येक निर्माण के लिए (asGFP-IgG, जीएफपी-आईजीजी, लाइट चेन) एलबी एगर (10 ग्राम/एल ट्राइप्टोन, 10 जी/एल एनएसीएल, 5 जी यीस्ट एक्सट्रैक्ट, 15 जी/एल एगर, ५० माइक्रोग्राम/एमएल कनमाइसिन) प्लेट पर ग्लिसरोल स्टॉक से ।
  2. 30 डिग्री सेल्सियस खड़े इनक्यूबेटर में एक दिन के लिए बढ़ें। मानक कॉलोनी स्क्रीन पीसीआर प्रोटोकॉल द्वारा सत्यापन के लिए एक ही कॉलोनी को अलग करें।
  3. प्रत्येक निर्माण के लिए सत्यापित कॉलोनी का उपयोग करें। एलबी मीडिया के 10 एमएल के साथ शंकु नली भरें (10 ग्राम/एल ट्राइप्टोन, 10 ग्राम/एल एनएसीएल, 5 ग्राम खमीर निकालने, ५० μg/mL) । इसके बाद, 100 μg/mL kanamycin के 10 μL जोड़ें । ई. कोलाई संदूषण को रोकने के लिए 2.5 μg/mL rifampicin के 10 μL जोड़ें। रात भर 30 डिग्री सेल्सियस और 120-150 आरपीएम पर इनक्यूबेट।
  4. अगले दिन, यदि एग्रोबैक्टीरियम संस्कृति को ओडी600 = 06-0.9 तक उगाया जाता है, तो इसका उपयोग घुसपैठ के लिए किया जा सकता है। यदि यह अधिक हो गया है (OD600 > 1), 1-2 मिलीएल एंटीबायोटिक दवाओं के साथ ताजा पौंड में स्थानांतरित किया जाना चाहिए और आवश्यक OD600करने के लिए हो गया है। प्रारंभिक संस्कृति की एकाग्रता के आधार पर, यह संभवतः दो दिन लग सकते है OD६०० = 0.6-0.9 को विकसित करने के लिए ।
  5. एक बार उपयुक्त OD600पर, एक अपकेंद्रित्र में संस्कृतियों जगह है, और 20 मिनट, कमरे के तापमान (आरटी) के लिए ४,५०० x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा बैक्टीरिया गोली ।
  6. दोनों नमूनों से डेसेंट सुपरनैंट, और फिर प्रत्येक गोली को 1x घुसपैठ बफर (10 mm 2-(N-morpholino) एथेनेसुल्फोनिक एसिड, 10 एमएम मैग्नीशियम सल्फेट में पुनर्व्यवस्थित करें, कोह के साथ पीएच 5.5 में समायोजित) अंतिम OD600 = 0.4 प्राप्त करने के लिए। यह प्रारंभिक संस्कृति घनत्व के आधार पर घुसपैठ बफर के लगभग 15-45 एमएल लेना चाहिए। प्रत्येक आईजीजी संलयन निर्माण के समान मात्रा को प्रत्येक ट्यूब में अंतिम ओडी600 = 0.2 प्रति निर्माण प्राप्त करने के लिए प्रकाश श्रृंखला निर्माण के साथ मिलाएं।

3. सुई-कम सिरिंज एग्रोइनफिल्ट्रेशन

  1. स्टेप 1 से सीधा पेपर क्लिप और 5-6 हफ्ते पुराने एन बेंथामियाना के पौधे लें । पेपर क्लिप की तेज धार का उपयोग करके, अडक्षीय सतह पर पत्ती की पहली एपिडर्मल परत में एक छोटा पंचर बनाएं। इसे सभी तरह से पंचर करने से बचें।
    नोट: निचली पत्तियों घुसपैठ के लिए आसान कर रहे हैं, जबकि संयंत्र के शीर्ष पर पत्तियों कठिन हैं । आम तौर पर, एक पौधे के बीच में स्थित पत्तियों में पुनर्संयोजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति सबसे अधिक होती है, और ये पत्तियां भी कम गल जाती हैं।
  2. स्टेप 2 से तैयार एग्रोबैक्टीरियम सॉल्यूशन के साथ बिना सुई के 1 एमएल सिरिंज भरें। सिरिंज के अंत के साथ पिछले चरण में बने छेद को कवर करें और पत्ती के पीछे से कोमल प्रतिप्रेशर लागू करते समय बैक्टीरिया को पत्ती में इंजेक्ट करने के लिए धीरे-धीरे धक्का दें। सिरिंज पर बहुत अधिक दबाव लागू किए बिना समाधान इंजेक्शन के रूप में पत्ती को काला देखें।
  3. अधिकतम 3-4 बार में अधिकांश पत्ती क्षेत्र में घुसपैठ करने की कोशिश करें - अत्यधिक पत्ती क्षति प्रोटीन उपज में बाधा डाल सकती है। घुसपैठ संयंत्र पत्ती ज्यादातर नीचे देखने से अंधेरा दिखाई देगा ।
    नोट: यह बैक्टीरियल समाधान प्रति निर्माण कम से कम 3-4 पौधों के लिए पर्याप्त होना चाहिए। त्यागने से पहले किसी भी शेष जीवाणु समाधान को ऑटोक्लेव करें।

4. आगे बढ़ें और घुसपैठ एन बेंथामियाना का निरीक्षण करें

  1. घुसपैठ पौधों को विकास कक्ष में वापस रखें और दैनिक पानी जारी रखें।
  2. घुसपैठ वाले क्षेत्रों में क्लोरोसिस और परिगलन के लिए पत्तियों का निरीक्षण करें। एक लंबी और छोटी लहर यूवी लैंप के तहत GFP फ्लोरेसेंस (यदि GFP मौजूद है) के लिए पौधों का निरीक्षण करें।
  3. दिन 4-5 पत्तियों में दोनों जीएफपी निर्माणों के उच्चतम फ्लोरेसेंस को दर्शाता है। 4-5 डीपीआई (घुसपैठ के बाद दिन) पर सभी पत्तियों को काटें और कुल पत्ती सामग्री का वजन करें।
  4. उपयोग करने के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण या स्टोर के लिए तुरंत इसका उपयोग करें।

5. प्रोटीन निष्कर्षण

  1. बफर और ब्लेंडर कप को बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर इस्तेमाल करने से पहले रखें।
  2. आइस-कोल्ड एक्सट्रैक्टिंग बफर (100 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 50 एमएम एनएसीएल, 2 एमएम ईडीटीए, पीएच 8 एचसीएल के साथ) प्रति 1 ग्राम प्लांट मैटेरियल की 2-3 एमएल तैयार करें। निकासी से ठीक पहले स्टॉक (100 एमएम) और 50 एमएम सोडियम एस्कोर्बेट से 2 एमएम फिनाइलमिथाइलसुल्फोनाइल फ्लोराइड (पीएमएसएफ) जोड़ें।
  3. पौधे के ऊतकों को स्टेप 4 से प्रीचिल्ड ब्लेंडर कप में रखें। ब्लेंडर कप में ठंडा निष्कर्षण बफर की एक मापा मात्रा जोड़ें (जैसा कि चरण 5.2 में इंगित किया गया है)। ब्लेंडर कप को ब्लेंडर पर रखें। पैराफिल्म की प्री-कट शीट लें और इसे ब्लेंडर कप के शीर्ष पर फैलाएं। 20 सेकंड के अंतराल के साथ एकरूपता के लिए मिश्रण, जरूरत के रूप में मिश्रण चक्र के बीच अच्छी तरह से सरगर्मी ।
  4. मिश्रित सामग्री को बीकर में स्थानांतरित करें। प्रोटीन घुलनशीलता बढ़ाने और ठोस की वर्षा की अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए एक हलचल बार जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर हलचल करें।
  5. बर्फ पर एक साफ बीकर पर Miracloth की 2 परतों प्लेस और बड़े पत्ते मलबे को हटाने के लिए इसके माध्यम से निकालने डालना । सभी अर्क डालने के बाद, अवशिष्ट पत्ती निकालने को निचोड़ने के लिए मिराक्लोथ को मोड़ें। एक्सट्रैक्ट को दिखाई देने वाले कणों के बिना गहरे हरे रंग के दिखाई देने चाहिए।
  6. बाद के विश्लेषण के लिए इस नमूने के 50 माइक्रोन को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब और लेबल "कुल अर्क" में स्थानांतरित करें। एक्सट्रैक्ट को सेंट्रलाइज ट्यूब में ट्रांसफर करें। 20 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 16,000 x ग्राम पर पौधे निकालने के शेष को सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को शंकु नली में स्थानांतरित करें।
  7. 50 एमएल सिरिंज और सिरिंज ग्लास फाइबर फिल्टर (0.75 माइक्रोन) का उपयोग करके घुलनशील अर्क को फ़िल्टर करें।
  8. अपकेंद्रित्र के बाद एक नमूना के 50 μL ले लीजिए, लेबल "घुलनशील निकालने" बाद में विश्लेषण के लिए।

6. प्रोटीन जी कॉलम क्रोमेटोग्राफी प्रक्रिया

नोट: यहां वर्णित प्रोटोकॉल पियर्स प्रोटीन जी एगर उठे राल का उपयोग करके गुरुत्वाकर्षण-प्रवाह क्रोमेटोग्राफी के लिए है। यदि एक अलग राल का उपयोग कर रहे हैं, तो समायोजन के लिए निर्माता के निर्देशों का उल्लेख करें। कभी भी राल को सूखा न चलने दें और सभी तरल को बाहर निकालने से रोकें। जरूरत के अनुसार आउटलेट को रीकैप करें।

  1. एक पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम सेट करें जिसमें 20 एमएल का नमूना हो।
  2. लक्ष्य इम्यूनोग्लोबुलिन प्रकार और राल के लिए अपनी आत्मीयता के आधार पर आवश्यक घोल की मात्रा का अनुमान लगाएं। आम तौर पर, 1.5 एमएल बिस्तर की मात्रा के साथ कुल घोल का 3 एमएल एबी के कई मिलीग्राम के शुद्धिकरण के लिए पर्याप्त है।
  3. ध्यान से कैप्ड कॉलम में पुनर् निलंबित घोल की आवश्यक राशि डालें। कॉलम के नीचे से कॉलम आउटलेट खोलें और इसे तब तक निकालने की अनुमति दें जब तक कि अधिकांश बफर न हो जाए।
  4. तुरंत 10 एमएल वॉश बफर 1x पीबीएस (137 एमएम एनएसीएल, 2.7 एमएम केसीएल, 10 एमएम एनए2एचपीओ4,1.8 एमएम केएच2पीओ4,पीएच 7.4 एचसीएल के साथ) टॉप पर डालें। इसे छानने दें और इस वॉश स्टेप 2x को दोहराएं।
  5. फ़िल्टर किए गए नमूने को चरण 5 से कॉलम में लागू करें और बाद के विश्लेषण के लिए प्रवाह के 50 माइक्रोन को इकट्ठा करें। बाकी फ्लो को तब तक बचाएं, जब एबी ने राल को बांधा नहीं।
    नोट: एक नए कॉलम में प्रवाह को फिर से लागू करने से आमतौर पर अच्छी उपज नहीं होती है; इसलिए नई पत्ती सामग्री के साथ शुरू करने की सलाह दी जाती है।
  6. गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को कम करने के लिए 1x पीबीएस के 10 एमएल के साथ राल को दो बार धोएं। यदि वांछित है, तो कॉलम के माध्यम से बफर नालियों के रूप में धोने के 50 μL को सत्यापित करने के लिए कि लक्ष्य एबी को वॉश बफर के साथ नहीं किया जाता है।
  7. पीएच 8 में बाँझ 1 एम ट्रिस-एचसीएल के 125 माइक्रोन के साथ पांच ट्यूबों को सेट और लेबल करें। यह संभावित संरचनात्मक परिवर्तनों से बचने के लिए अम्लीय एल्यूशन बफर में एब्स को बेअसर करना है। वैकल्पिक रूप से, कम पतला नमूना प्राप्त करने के लिए 2 एम ट्रिस बेस के 30 माइक्रोन जोड़ें।
    सावधानी: योग के दौरान, यूवी प्रकाश का उपयोग दृश्य के लिए किया जा सकता है। यह एल्यूशन की अवधि के लिए किए जाने की आवश्यकता नहीं है। यदि यूवी का उपयोग किया जा रहा है, तो आंखों और त्वचा को नुकसान से बचने के लिए उपयुक्त पीपीई पहनना सुनिश्चित करें। एल्यूशन स्टेप के दौरान यूवी लाइट का इस्तेमाल करने की जरूरत नहीं होती है।
  8. एब्स को कॉलम में एल्यूशन बफर (100 m m ग्लाइसिन, पीएच 2.5 एचसीएल के साथ) लागू करके और पिछले चरण से प्रत्येक नामित ट्यूब में 1 एमएल अंश एकत्र करके।
  9. तुरंत वॉश बफर के 20 एमएल लगाकर कॉलम को पुनर्जीवित करें, इसके बाद वॉश बफर के 10 एमएल करें। सुनिश्चित करें कि राल एक विस्तारित समय के लिए एक अम्लीय वातावरण में नहीं छोड़ा जाता है। एल्यूशन फ्लोरोसेंट दिखाई देना चाहिए, अक्सर सबसे अधिक फ्लोरेसेंस दूसरे एल्यूशन में देखा जाता है लेकिन निष्कर्षण से निष्कर्षण तक भिन्न हो सकता है।
  10. भंडारण के लिए, पीबीएस में 20% इथेनॉल के 10 मिलील के साथ राल धोएं और इसे आधे रास्ते से निकाल दें। शीर्ष को फिर से संक्षिप्त करें, फिर कॉलम के नीचे, और 4 डिग्री सेल्सियस पर सीधा रखें।
    नोट: आम तौर पर, प्रोटीन जी रेजिन दक्षता के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना 10 बार तक पुनः उपयोग किया जा सकता है । विशिष्ट विवरण के लिए निर्माता के दिशानिर्देशों को देखें।
  11. 280 एनएम पर अवशोषण को मापने के द्वारा एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके एबी एकाग्रता का निर्धारण करें, एक खाली के रूप में एल्यूशन बफर का उपयोग करें। आगे के विश्लेषण के लिए एक अलग ट्यूब के लिए प्रत्येक अंश के -80 डिग्री सेल्सियस और aliquot 50 μL में eluates स्टोर करें।

7. जीएफपी-आईजी फ्यूजन डिटेक्शन के लिए एसडीएस-पेज

  1. एसडीएस-पेज स्थापित करने से पहले सभी नमूने तैयार करें।
    1. नमूना बफर के 4 माइक्रोन जोड़ें (6x कम नमूना बफर: ग्लाइसरोल का 3.0 मिलीएल, डीटीटी का 0.93 ग्राम, एसडीएस का 1 ग्राम, 4x ट्रिस का 7 एमएल (पीएच 6.8) 0.5 एम, 1.2 मिलीग्राम ब्रोमोफेनॉल ब्लू); (6x गैर कम करने वाले नमूना बफर: ग्लाइसरोल के 3.0 एमसीएल, एसडीएस के 1 ग्राम, 4x ट्रिस (पीएच 6.8) 0.5 एम, 1.2 मिलीग्राम ब्रोमोफेनॉल ब्लू के 7 एमएल) विश्लेषण के लिए प्रत्येक नमूने (कुल अर्क, घुलनशील अर्क, प्रवाह, वॉश, सभी एल्यूशन अंश) के 20 μL तक। सुनिश्चित करें कि ट्यूब टोपियां सुरक्षित रूप से बांधा जाता है।
    2. उबलते पानी के स्नान में 5 मिनट के लिए केवल नमूनों को कम करने का इलाज करें, और फिर बर्फ पर 5 मिनट के लिए नमूने डालें। ~ 5 एस के लिए एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज में नमूने स्पिन करें और जेल कुओं में संग्रह के क्रम में प्रत्येक नमूने के 20 माइक्रोल लोड करें। एक अलग कुएं में दोहरी रंग प्रोटीन सीढ़ी के 3 μL लोड करें।
  2. वांछित प्रोटीन बैंड जुदाई के लिए एक निरंतर 100 वी पर एसडीएस-पेज जेल चलाएं; इसमें लगभग 1.5 घंटे लगते हैं। प्रोटीन पृथक्करण के संकेतक के रूप में सीढ़ी की निगरानी करें।
  3. जीएफपी फ्लोरेसेंस का निरीक्षण करने के लिए यूवी के तहत जेल की कल्पना करें।
  4. यदि वांछित है, तो प्रत्येक नमूने में कुल प्रोटीन का आकलन करने के लिए कूमासी दाग के साथ जेल को दाग दें। वैकल्पिक रूप से, विशिष्ट एबीएस का उपयोग करके लक्षित प्रोटीन का मूल्यांकन करने के लिए पश्चिमी दाग करें।
    नोट: कूमासी स्टेनिंग और पश्चिमी दाग दोनों मानक प्रोटोकॉल47,48का पालन करके किया जा सकता है।

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Representative Results

यह अध्ययन पुनर्संयोजन प्रोटीन का उत्पादन करने और डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं में उन्हें कल्पना करने के लिए एक आसान और तेज विधि को दर्शाता है। एन बेंथामियाना का उपयोग करना और प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का पालन करना, यहां वर्णित पुनः संयोजन प्रोटीन उत्पादन एक सप्ताह से भी कम समय में प्राप्त किया जा सकता है। पौधे की अभिव्यक्ति, निष्कर्षण और शुद्धिकरण का समग्र कार्यप्रवाह चित्र 1में दिखाया गया है। 2 सप्ताह पुराने रोपण, 4 सप्ताह पुराने पौधों, और 6 सप्ताह पुराने पौधों से पौधों की वृद्धि के चरणों को क्रमशः चित्रा 1ए (1-3) में प्रदर्शित किया जाता है, जबकि चित्रा 1 बी में परक्रोसिस(चित्रा 1बी-1)या क्लोरोसिस(चित्रा 1बी-2)के कारण पत्ती रूपात्मक परिवर्तनों को दर्शाया गया है। घुसपैठ के बाद 3-5 दिनों के बीच इंजेक्शन साइट पर नेक्रोसिस हो सकता है। ये परिवर्तन अक्सर प्रोटीन के गुणों को व्यक्त किए जा रहे हैं और घुसपैठ किए गए पौधों के स्वास्थ्य (आगे चर्चा में जांच) पर निर्भर करते हैं। इसके साथ ही, क्लोरोसिस पौधों के स्वास्थ्य पर भी भरोसा कर सकता है (आगे चर्चा में जांच की गई)। एग्रोबैक्टीरियम विकास और घुसपैठ की तैयारी की प्रक्रिया को चित्र 1सीमें दिखाया गया है । चित्रा 1सी-1 एग्रोबैक्टीरियमकी अलग-अलग कॉलोनियों को प्रदर्शित करता है। आंकड़े 1C (2-5) मीडिया की अपेक्षित उपस्थिति प्रदर्शित करने के बाद यह एक अलग कॉलोनी के साथ टीका लगाया है । इन चरणों पर अधिक जानकारी के लिए चित्रा 3 को देखें। संयंत्र घुसपैठ प्रक्रिया चित्रा 1 डी में दिखाया गया है और एक संयुक्त राष्ट्र घुसपैठ संयंत्र के साथ शुरू होता है और घुसपैठ की प्रक्रिया के बाद किया जाता है । पौधे के प्रोटीन की अभिव्यक्ति, निष्कर्षण और स्पष्टीकरण चित्रा 1Eमें प्रदर्शित होते हैं। पत्ती सामग्री को ब्लेंडर में रखा जाता है और इसे समरूप बनाया जाता है, जो आंकड़े 1E (1-3) में दिखाया गया है। इसके बाद कुल समरूप का प्रतिनिधित्व करने वाला नमूना लिया जाता है । यह तो एक Miracloth के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है (धुंध या यहां तक कि एक कॉफी फिल्टर कम खर्च के लिए विकल्प कर सकते हैं), और स्पष्ट निलंबन अपकेंद्रित्र है । अपकेंद्रित्र शेष सामग्रियों से सुपरनैंट के पृथक्करण के लिए अनुमति देता है, जैसा कि आंकड़े 1E (4-6)में दिखाया गया है। स्पष्ट सुपरनैटिनिस्ट को प्रोटीन जी एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी कॉलम, चित्रा 1एफ (1-3) पर लोड किया जाताहै। अधिकांश प्रोटीन के बंधे होने के बाद, चित्रा 1एफ-4,प्रोटीन राल चित्रा 1 एफ(5,6)से एल्यूट किया जाताहै।

तालिका 1 पीबीवाई में एस्पेएफपी45 (ऊपरी पंक्ति) का उत्पादन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पौधे अनुकूलित न्यूक्लिक एसिड दृश्यों को प्रदर्शित करता है! KEAM-GFPasH वेक्टर इस अध्ययन में इस्तेमाल के लिए asGFP-IgG संलयन और GFP३३ (निचली पंक्ति) PBYEAM में व्यक्त-GFPHGP वेक्टर इस अध्ययन में इस अध्ययन में इस्तेमाल के लिए GFP-IgG संलयन व्यक्त करते हैं । न्यूक्लिक एसिड दृश्यों की जांच की गई थी एक्सपैसी प्रोटीन अनुवाद उपकरण (https://web.expasy.org/translate/) का उपयोग करके अमीनो एसिड दृश्यों का निर्धारण करने के लिए।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार एक प्रतिनिधि एग्रोबैक्टीरियम प्लेट को चित्र 2में दिखाया गया है । वांछित उपनिवेशों को आकार और रंग में गोल और समान दिखाई देना चाहिए। प्लेट के केंद्र के करीब उपनिवेशों में कानमाइसिन प्रतिरोध व्यक्त करने की अधिक संभावना होती है। तरल संस्कृतियों को एक ही अलग कॉलोनी से तैयार किया जाएगा।

संस्कृतियों वाले मीडिया की अपेक्षित उपस्थिति चित्र 3में दिखाई गई है । एक अलग कॉलोनी के प्रारंभिक टीका पर, एलबी मीडिया हल्के पीले और पारदर्शी दिखाई देगा, जैसा कि चित्र 3 एमें दिखाया गया है। 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक अलग कॉलोनी के इनक्यूबेशन के बाद, एलबी मीडिया टर्बिड दिखाई देगा। जैसा कि चित्रा 3 बीमें दिखाया गया है, जब विकास एलबी में मौजूद होता है तो वस्तुओं को मीडिया के माध्यम से नहीं देखा जा सकता है। अपकेंद्रित्र के बाद, ट्यूब के नीचे एक गोली बननी चाहिए। ट्यूब में गोली के ऊपर पौंड मीडिया का स्पष्ट पृथक्करण होगा और यह हल्के पीले और पारदर्शी दिखाई देगा, जैसा कि चित्रा 3 सीमें दिखाया गया है। पौंड मीडिया सुपरनेट का निपटारा किया जाता है, और घुसपैठ बफर में गोली को फिर से निलंबित कर दिया जाता है। ०.२ के एक ओडी ६०० पर, मीडिया टर्बिड दिखाई देगा, जैसा कि चित्रा 3 डीमें दिखाया गया है । ओडी600 के रूप में तरीकों में वर्णित मापा जाना चाहिए.

चित्रा 4 पत्ती घुसपैठ की प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है। पेपरक्लिप के साथ पत्ते का एक मामूली प्रोड पत्ती एपिडर्मिस में एक ब्रेक उत्पीड़ित करना चाहिए जो पूरी तरह से पत्ते के माध्यम से नहीं गुजरता है। तोड़ मुश्किल से पत्ती छेदना चाहिए तो घुसपैठ बफर पत्ती में इंजेक्शन किया जा सकता है, चित्रा 4ए-सीमें दिखाया गया है । एग्रोबैक्टीरियम और घुसपैठ बफर का निलंबन सीधे पत्ते में तोड़ने में इंजेक्ट किया जाता है और घुसपैठ किए गए पत्ते के रंग को थोड़ा बदल देता है; चित्रा 4डी एफदेखें ।

आईजीजी फ्यूजन व्यक्त करने वाली पत्तियों की उपस्थिति का प्रतिनिधित्व चित्र 5में किया जाता है । यह सफेद प्रकाश के तहत asGFP-IgG संलयन(चित्रा 5A)और GFP-IgG संलयन(चित्रा 5C)व्यक्त करने वाले पत्तों को प्रदर्शित करता है । यदि इस प्रोटोकॉल में निर्माण का उपयोग किया जाता है, जब 0.2 ओडी600पर घुसपैठ की जाती है, तो पत्तियों को 1-5 दिनों में स्वस्थ दिखाई देना चाहिए क्योंकि दोनों पत्तियां एएसजीएफपी-आईजीजी फ्यूजन व्यक्त करती हैं और जीएफपी-आईजीजी फ्यूजन व्यक्त करती हैं। 5 दिन पर इंजेक्शन साइटों पर एक मामूली परिगलित उपस्थिति हो सकती है, जो आमतौर पर उन क्षेत्रों में पौधे के ऊतकों के बिजली से स्पष्ट होती है। चित्रा 5 पत्ते के शीर्ष दृश्य से लंबी लहर यूवी प्रकाश के तहत क्रमशः asGFP-IgG संलयन(चित्रा 5B)और GFP-IgG संलयन(चित्रा 5D)व्यक्त पत्तियों को भी प्रदर्शित करता है । दोनों निर्माणों के लिए दिन की प्रगति के रूप में फ्लोरेसेंस तीव्रता में बढ़ जाती है। asGFP-IgG संलयन व्यक्त करने वाले पत्ते सभी दिनों में जीएफपी-आईजीजी संलयन व्यक्त करने वाली पत्तियों की तुलना में थोड़ा कम तीव्र फ्लोरेसेंस होते हैं।

जब एएसजीएफपी-आईजीजी एक्सट्रैक्ट का सुपरनैंट प्रोटीन जी कॉलम में जोड़ा जाता है, तो पौधे क्लोरोफिल पिगमेंट(चित्रा 6 ए)के कारण राल सफेद प्रकाश के नीचे थोड़ा हरा हो जाएगा। शॉर्ट-वेव यूवी लाइट के तहत सुपरनेट के अलावा प्रोटीन जी राल में फ्लोरेसेंस का संचय होता है, जैसा कि चित्र 6बीमें दिखाया गया है। ध्यान रहे कि यूवी लाइट के तहत सुपरनेट भी अकेले फ्लोरोसेंट होगा। फिर भी, फ्लोरेसेंस को अधिक केंद्रित होने की उम्मीद है जब एएसजीएफपी-आईजीजी संलयन राल से बांधना शुरू कर देता है।

प्रोटीन जी राल के माध्यम से ASGFP-IgG के सुपरनैंट के निधन के बाद, राल को शॉर्ट वेव यूवी लाइट के नीचे रोशन करना चाहिए, जैसा कि चित्र 7 एमें दिखाया गया है। इस बिंदु पर, अधिकांश आईजीजी राल के लिए बाध्य होंगे। एल्यूशन बफर को जोड़ने पर, प्रोटीन जी राल में निहित फ्लोरेसेंस अभी भी शॉर्ट-वेव यूवी लाइट के तहत दिखाई देगा और तीव्रता खोना शुरू कर देगा क्योंकि कम पीएच का अधिक एल्यूशन बफर राल से गुजरता है। फ्लोरेसेंस एलुट्स(चित्रा 7B)में जमा होना शुरू हो जाएगा। फ्लोरेसेंस में एलुएट अंश अलग-अलग होंगे। जैसा कि चित्र 8में देखा गया है, फ्लोरेसेंस पहले एल्यूशन में सबसे कम तीव्रता और दूसरे और तीसरे एलुएट्स में उच्चतम तीव्रता है। परिणाम भिन्न हो सकते हैं, क्योंकि फ्लोरेसेंस प्रोटीन की अभिव्यक्ति, काटा गया पत्ता सामग्री और प्रयोग में उपयोग की जाने वाली अन्य स्थितियों पर निर्भर करेगा।

शुद्धिकरण प्रक्रिया को खत्म करने के बाद, नमूनों को कम करने की शर्तों के तहत 10% SDS-पेज जेल पर विश्लेषण कर रहे है (नमूना बफर डीटीटी होता है और नमूने 5 मिनट के लिए उबला हुआ था) और गैर कम करने की स्थिति (नमूना बफर डीटीटी शामिल नहीं है और नमूने उबला हुआ नहीं थे) । जैसा कि चित्रा 9Aमें दिखाया गया है, केवल गैर-कम करने वाले नमूने, जैसे कि एल्यूशन 2 एनआर लेन में, शॉर्ट वेव यूवी लाइट के संपर्क में आने पर फ्लोरेसेस होगा। इस लेन का पहला बैंड पूर्ण उत्पाद के अपेक्षित आकार ~ 200 केडीए पर फ्लोरेस्किंग कर रहा है, जो यह दर्शाता है कि एएसजीएफपी अभी भी अनुरूप रूप से सही है। जेल के नीचे के पास फ्लोरोसेंट बैंड को कम करने वाले बफर से डाई किया जाता है। ध्यान दें कि एएसजीएफपी 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर या उससे ऊपर के तापमान के संपर्क में आने पर फ्लोरेसेंस खो देता है; यह ईजीएफपी (संवर्धित जीएफपी) से अलग है, जो एक ही शर्तों49,50के तहत कुछ फ्लोरेसेंस बनाए रखेगा। सीढ़ी के दो बैंड, 75 केडीए और 25 केडीए में भी फ्लोरोसेंस है। चित्रा 9B चित्रा 9Aमें एक ही जेल के एक Coomassie दाग का प्रतिनिधित्व करता है । गलियों में एलयूशन 6-9 को कम करने की शर्तों के तहत तैयार किया गया है । जब एक जेल और Coomassie-दाग पर चलाने के लिए, इन नमूनों asGFP-IgG संलयन घटकों को अलग से प्रदर्शित करना चाहिए । इन घटकों में जीएफपी (~ 75 केडीए), अकेले भारी श्रृंखला (50 केडीए), लाइट चेन (25 केडीए), और एएसजीएफपी में ही (27 केडीए) के लिए हैवी चेन शामिल हैं। गैर-कम करने वाले नमूने को तुलना उद्देश्यों के लिए जेल की अंतिम लेन में शामिल किया गया था और एक बड़े बैंड (~ 200 केडीए) को प्रदर्शित करना चाहिए, जिसे एएसजीएफपी और संबंधित प्रकाश श्रृंखलाओं से जुड़े दो भारी श्रृंखलाओं से बना होना चाहिए। इसके अतिरिक्त, छोटे बैंड की संभावना देशी प्रोटीज के कारण होती है। इस दरार को प्रोटीज अवरोधकों के अलावा और हर समय प्रोटीन निकालने को ठंडा रखने के साथ रोका जा सकता है, जिसमें कॉलम शुद्धिकरण करते समय शामिल है। आईजीजी फ्यूजन प्रोटीन के व्यक्तिगत घटक कूमासी जेल पर कम न होने वाले नमूनों में अलग-अलग नहीं होंगे।

Figure 1
चित्रा 1: पौधे की अभिव्यक्ति, निष्कर्षण और शुद्धिकरण प्रक्रियाओं का कार्यप्रवाह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

न्यूक्लियोटाइड सीक्वेंस का इस्तेमाल किया अमीनो एसिड सीक्वेंस
दृश्यों
के लिए इस्तेमाल किया
asGFP में
pBY! केयम
-GFPasH
वायुपथ
में इस्तेमाल किया
के
अभिव्यक्ति
की
एएसजीएफपी-आईजीजी
परमाणु-संलयन		 ATGGTGTCCAAGAAGAAGAAGCCTCTGAGAAGAGCCTTTTTTC
CAGTACCCTATGATGATGATTCTAAAATCGAGGATGAATGGGGATCA
एसीजीजीएगागट्टाजीटीटीसीसी
ATCTGGAGAAGACAATATGCACGCTTACTTTACCGGAGAC
टीटीजीसीसीटीटीजीटीसीटीसीटीजीटीटीसीटीसीसीसीसीटीसीटीसीटीजीजी
जीटीटीसीसीएकैटटीटीटीजीसीसीसीएक्टैकैक्टगगेटटीसीएक्टटीसीटी
CCAAGAATTTTTCCTGGGTCTTATACTCTCGACAGAATGA
GGATGGAGAGACGGTACTACTACTACTACCACGAGTACTC
CCTTGAGGACGGTTGGTTTTACTTCCAAGACTTGACCTT
CTGGATTCGACCCCAAGAGCCACTATAAGTCTCTTT
CAAACAGCTCCCAAACGAGGTCAAAATCCCCCCACACGGGCCA
AATGGTATTAGACTTACTTCCACTGTCTCTCCCTACCTAGAGGA
CGGAACTATCCAGATCGGAACTCAAGACTGCATCGTTACCCA
जीटीजीजीसीजीजीसीएएगटैक्टैगटीसी
ATACTCAGATCATTCAGAAGACCCAAACAGAACCAAGAAGAG
ATCACATCGTTCAGACTGCTTGCCGTTTTTTTTTATATCTTTTTTTTTTTTTTTTTG
GCACGGCATCATGGGCTTTACAAGA		 एमवीएसकेजीअग्रेल्फ
QYPMTSKIELNGEI
एनजीकेकेएफकेवीजीएफटीपी
SSGRFNMHAYCTT
GDLPMSWVVIASPL
QYGFHMFAHYPEDI
THFFQECFPGSYTL
डीआरटीएलआरएमईजीजीटीएलटी
एचहेस्लेडजीसीवीटीएसके
टीटीएलएनसजीएफडीपीकेएटी
MTKSFVKQLPNEVK
ITPHGPNGIRLTSTV
LYLKEDGTIQIGTQD
CIVTPVGGRKVTQP
KAHFLHTQIIQKKDP
एनडीटीआरडीएचआईवीक्यूटेलाव
AGNLWHGMDELY
कश्मीर
दृश्यों
के लिए इस्तेमाल किया
जीएफपी में
pBYEAMGFPHGP
वायुपथ
में इस्तेमाल किया
के
अभिव्यक्ति
जीएफपी-आईजीजी की
परमाणु-संलयन		 एटीजीसीसीएएसीसीटीसीटीटीटीसीटीटीसीटी
जीजीटीसीटीटीसीटीजी
एजीजीसीटीसीटीसीजीटीसीटीसीजी
ACGGCGACGTAACGGCACAAGTTCAGGTGTCCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG
GCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAGATCTGACCCTGATTCA
TCTGCACCACCCCCAAGCTGCCCCGTGCCCCCCCCCCTCGT
GACCACCCCCAGCTACGGCGTGGGTTTCTCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC
GACCACATGAAGCAGCACGACTTCTCCAAGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC
AAGGCTACGTCCAGGAGCCACCATCTCCTTCAAGGGGGGG
CAACTACAAGACCCGGGGGTGAGGGCAC
CCTGGTGAACCGCATCGGCTGAGCATCATCCCATCCCCAAGGA
GGACGGCAACATCCGGCAAGCACTGGTAAACTACA
CAGCCACAACCGTCTATATCATGGCCCAAGAAGAAGAACGG
CATCAAGGTGAACTTCAAGATCCCCCCACACCATCGAGGACGGC
AGCGTGCAGCTCGCCCCCCACTACCAGCAGAACCCCCATCG
GCGACGGCCCCCCGTCTGCTGCCCCCCCAACCACTACCTGAGCAC
सीसीएजीसीसीजीसीसीटीसीजीसीएएएगागागेकागगागगागाटकेगासीए
कैटजीटीसीटीसीटीजीटीजीजीटीसीटीसीजीटीसीजीसीसीजीसीसीजीएटीसीएक्स्कैकैक
GGCATGGACGGCTTACAAGA		 मैनखएसएलएसएलवीएलएल
GLSASLASGMVSKG
ईएलएफटीजीवीवीपिल्वल्ड
जीडीवीएनजीएचकेएफएसवीजीई
GEGDATYGKLTLKFI
सीटीटीजीकेएलएलपीवीपीडब्ल्यूपीटलवी
टीटीएफएसवाईजीवीक्यूसीएफएसवाईपी
DHMKQHDFFKSA
MPEGYVQERTIFFK
DDGNYKTRAEVKFE
GDTLVNRIELKGIDF
केडग्निल्घक्लिन
YNSHNVYIMADKQ
KNGIKVNFKIRHNIE
डीजीएसवीक्यूक्यूएलध्यादक्यूक्यूकन
टीपीजीडीजीपीवीएलएलपीडीएनएच
YLSTQSALSKDPNEK
RDHMVLLEFVTAA
जीआईथ

तालिका 1: asGFP और GFP बनाने के लिए इस्तेमाल किया दृश्यों

Figure 2
चित्रा 2: एलबी प्लेट पर उगाई जाने वाली एग्रोबैक्टीरियम कॉलोनियां जिसमें कानमाइसिन होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: एग्रोबैक्टीरियमके विकास और प्रसंस्करण के दौरान मीडिया की उपस्थिति। (क) अलग-थलग एग्रोबैक्टीरियम कॉलोनी के टीका लगाने के तुरंत बाद एलबी मीडिया की उपस्थिति । (ख) 30 डिग्री सेल्सियस (ग) एक अलग कॉलोनी के रातोंरात इनक्यूबेशन के बाद मीडिया की उपस्थिति संस्कृतियों के बाद मीडिया की उपस्थिति 20 मिनट के लिए ४,५०० x g.g. (D) गोली घुसपैठ बफर में फिर से निलंबित पर 20 मिनट के लिए नीचे घूमती हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एन बेंथामियाना संयंत्रों की घुसपैठ की प्रक्रिया। (ए-बी) पत्ती को थोड़ा पोकिंग करने से पत्ती के शीर्ष पर एक सूक्ष्म छेद होता है। (सी-डी) पत्ती में एग्रोबैक्टीरियम निलंबन का इंजेक्शन। (ङ) शीर्ष दृश्य से घुसपैठ की गई पौधे का पत्ता । (च) शीर्ष दृश्य से घुसपैठ की गई कई पत्तियों वाला संयंत्र । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एएसजीएफपी-आईजीजी फ्यूजन और जीएफपी-आईजीजी फ्यूजन युक्त पत्तियों का दृश्य पहली पंक्ति में घुसपैठ के बाद (डीपीआई) दिन पर शुरू होता है, जो सभी शर्तों के लिए अंतिम पंक्ति में 5 डीपीआई दिन तक अग्रणी होता है। ए) सफेद रोशनी के तहत asGFP-IgG संलयन । B) लॉन्ग-वेव यूवी के तहत एस्पिग्र-आईजीजी फ्यूजन। ग) सफेद रोशनी के तहत जीएफपी-आईजीजी फ्यूजन। D) लॉन्ग-वेव यूवी के तहत जीएफपी-आईजीजी फ्यूजन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: एएसजीएफपी-आईजीजी अर्क का सुपरनिटेंट प्रोटीन जी कॉलम में जोड़ा जा रहा है। ए) सफेद प्रकाश के तहत इसके अलावा । ख) शॉर्ट वेव यूवी लाइट के तहत इसके अलावा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: ASGFP-IgG निकालने के सुपरनिटेंट के बाद शॉर्ट-वेव यूवी लाइट के तहत प्रोटीन जी राल कॉलम के माध्यम से चलाया गया था । ए) शॉर्ट-वेव यूवी लाइट के तहत प्रोटीन जी राल। ख) कम पीएच स्थितियों के तहत प्रोटीन के उन्मूलन पर प्रोटीन जी राल । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्र 8: शुद्धिकरण के माध्यम से कम पीएच स्थितियों के संपर्क में आने के बाद प्राप्त asGFP-IgG के शुद्ध elutions । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: कॉलम नमूनों का एसडीएस-पेज। "आर" के साथ लेबल नमूने शर्तों को कम करने में हैं, और "एनआर" के साथ लेबल नमूने गैर कम करने की स्थिति में हैं । ए) यूवी लाइट के तहत, 10% पॉलीएक्रेलैमाइड जेल में केवल गैर-कम करने वाले नमूने फ्लोरेसेस, जैसा कि एल्यूशन 2 एनआर लेन में देखा गया है। 75 केडीए और 25 केडीए सीढ़ी बैंड भी फ्लोरोस है। ख) एक ही जेल के Coomassie धुंधला नमूने में सभी प्रोटीन की उपस्थिति का पता चलता है । कम एल्यूशन्स में, लाइट चेन के बिना आईजीजी फ्यूजन, हैवी चेन, लाइट चेन और संभवतः अपमानित जीएफपी क्रमशः ~ 75 केडीए, ~ 50 केडीए, ~ 25 केडीए और ~ 10 केडीए में मौजूद हैं। इसके विपरीत, गैर-कम एल्यूशन में, एक प्रमुख बैंड मौजूद है, जो पूरे एएसजीएफपी-आईजीजी फ्यूजन (~ 200 केडीए) के आकार के अनुरूप है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का उपयोग एन बेंथामियाना संयंत्रों में उत्पादित किसी भी पुनर्संयोजन एबी या पुनर्संयोजन प्रोटीन के दृश्य सत्यापन के लिए किया जा सकता है, जिसमें वे लोग शामिल हैं जिन्हें कॉलम शुद्धिकरण प्रयोजनों के लिए अम्लीय वातावरण के लिए अस्थायी जोखिम की आवश्यकता होती है42,43,44. इसके अलावा, विभिन्न अभिव्यक्ति प्रणालियों में अन्य प्रोटीन के लिए ASGFP का संलयन प्रयोगात्मक दृश्य और शिक्षा के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है। यहां प्रोटोकॉल को पुनर्संयोजन प्रोटीन की वांछित मात्रा का उत्पादन करने के लिए पत्ती सामग्री की बड़ी और छोटी मात्रा में बढ़ाया जा सकता है। वर्णित तरीके पिछले अध्ययनों का लाभ उठाते हैं जिन्होंने जीएफपी के उन संस्करणों की पहचान की है और उन्हें बनाया है जो अम्लीय परिस्थितियोंमेंस्थिर रहते हैं । व्यापक पूर्व अध्ययनों ने इम्यूनोग्लोबुलिन डोमेन बनाए हैं जो रुचि के प्रोटीन से जुड़े हुए हैं, जिसे अक्सर आईजीजी-फ्यूजन कहा जाता है, जिसे यह प्रोटोकॉल28को भी समायोजित कर सकता है। जीएफपी और एस्प़एफपी से जुड़े एक मानवीय IgG1 से बना आईजीजी-फ्यूजन बनाकर, हम अभिव्यक्ति, निष्कर्षण और शुद्धिकरण प्रक्रियाओं के दौरान वांछित प्रोटीन की उपस्थिति की कल्पना करने में सक्षम थे।

यदि एक कुशल शोधकर्ता इस प्रोटोकॉल का पालन करता है, तो पत्तियां 4-5 दिनों के बीच घुसपैठ स्थलों पर परिगलन संकेत प्रदर्शित करना शुरू कर देंगी। हालांकि, वर्णित वैक्टर का उपयोग करते समय, पत्तियों के घुसपैठ वाले क्षेत्रों को उचित देखभाल के साथ 5 दिन तक स्वस्थ दिखाई देना चाहिए। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एग्रोबैक्टीरियम संक्रमण के परिणामस्वरूप पौधे की कोशिका प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया51,52के हिस्से के रूप में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के संचय के कारण पौधे की पत्तियों का परिगलन हो जाएगा। यह प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और परिगलन का परिणामी स्तर कई कारकों के आधार पर भिन्न हो सकताहै,जिसमें सेलुलर टार्गेटिंग, प्रोटीन का स्थान, प्रोटीन का प्रकार, उत्पादित प्रोटीन का प्रकार, अभिव्यक्ति वेक्टर, और एग्रोबैक्टीरियम के तनाव का उपयोग53,54शामिल हैं। इसके अलावा, घुसपैठ के लिए इस्तेमाल होने वाले एग्रोबैक्टीरियम के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी600)में भिन्नता परक्रासिस55के स्तर को प्रभावित कर सकती है। कई अभिव्यक्ति वैक्टर प्रोटीन का उपयोग करते हैं जो पौधों की कोशिकाओं को संश्लेषण (एस) चरण में रखने के लिए रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन को बांधते हैं और कोशिका विभाजन और परिवर्तन आवृत्ति56,57में वृद्धि करते हैं। प्रोटीन उत्पादन में वृद्धि, जैसे कि रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन के लिए बाध्यकारी के कारण, परिगलन56, 57हो सकता है। वेक्टर डिजाइन में प्रगति, जैसे कि इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले मिथुनवायरस बेयडीवी रिप्लिक्स के संशोधित संस्करणों में उपयोग किए जाने वाले, ने उच्च प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर58को बनाए रखते हुए परिगलन को कम किया है। इसके अलावा, BeYDV replicons गैर प्रतिस्पर्धा कर रहे हैं, ज्ञात आकार सीमाओं के बिना एक ही कैसेट पर कई प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रदान५३,५९।

कई कारक घुसपैठ से पहले और बाद में पौधों के विकास को प्रभावित करते हैं, जिससे अंततः प्रोटीन की कम पैदावार हो सकती है। पौधों को बोने पर, प्रति पौधे गोली बहुत सारे बीजों के परिणामस्वरूप कई छोटे पौधे अंकुरित हो सकते हैं जिससे अधिक मामूली पौधे विकास हो सकते हैं। इसलिए, प्रति पीट गोली बीज संख्या को कम करने और एक सप्ताह के बाद अतिरिक्त अंकुरित को हटाने से पौधों की बेहतर वृद्धि होगी। उचित मिट्टी की नमी बनाए रखना एक और कारक समग्र पौधे के स्वास्थ्य को प्रभावित करता है। पानी के नीचे, पानी के नीचे, बहुत अधिक या बहुत कम उर्वरक जोड़ने से क्लोरोसिस में योगदान हो सकता है और पौधे के स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकते हैं60,61,62। नेक्रोसिस और क्लोरोसिस अतिरिक्त रूप से एक प्रोटीन के उत्पादन के कारण हो सकता है जो सेल तनाव का कारण बनता है। इस घटना को कई बार रीकॉम्बिनेंट प्रतिरक्षा परिसरों (आरआईसी)56की अभिव्यक्ति के साथ देखा गया है। हमने देखा है कि प्रोटीन संरचना में परिवर्तन और प्रोटीन के संलयन से परिगलन को कम करने में मदद मिल सकती है; हालांकि, विभिन्न संशोधनों के बाद भी कुछ प्रोटीन पौधों के लिए जहरीले रह सकते हैं। यदि यहां उल्लिखित अभिव्यक्ति वैक्टर का उपयोग करते हैं, तो प्रोटीन की निकासी जल्दी और महत्वपूर्ण परिगलन की शुरुआत से पहले की जा सकती है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च प्रोटीन उपज56हो सकती है।

विभिन्न विकास की स्थिति एग्रोबैक्टीरियम विकास को धीमा या बाधित भी कर सकती है। एग्रोबैक्टीरियम 28 डिग्री सेल्सियस-30 डिग्री सेल्सियस पर बेहतर बढ़ता है और 30 डिग्री सेल्सियस से ऊपर इनक्यूबेटेड होने पर गर्मी के झटके का अनुभव करता है, जिससे सेल डिवीजन की त्रुटियां62होती हैं। विकास को बहुत अधिक रिफाम्पिकिन के अलावा भी बाधित किया जा सकता है, क्योंकि विभिन्न एग्रोबैक्टीरियम उपभेद कमोबेश स्वाभाविक रूप से इस एंटीबायोटिक62के लिए प्रतिरोधी हैं। अनुशंसित से काफी अधिक ओडी600 के साथ घुसपैठ के लिए तैयार बैक्टीरियल कल्चर से परिगलन55होने की संभावना होगी . संस्कृति का थोड़ा अधिक ओडी600 आमतौर पर उपज को प्रभावित नहीं करता है, लेकिन यदि यह 0.1 से कम है, तो प्रोटीन की उपज काफी कम हो सकती है। मृत कोशिकाओं का संचय दो परिस्थितियों में हो सकता है; 1) संस्कृति ऊंचा हो गया था, ओडी मृत कोशिकाओं जा रहा है का एक महत्वपूर्ण अंश के लिए अग्रणी है, और 2) हानिकारक/ संस्कृति में मृत कोशिकाओं की बढ़ी हुई संख्या का उपयोग कर घुसपैठ प्रोटीन अभिव्यक्ति को कम कर सकता है । इसके अलावा, बहुत अधिक दबाव लगाने से पत्तियों को पंचर करने से पत्तियों को नुकसान पहुंच सकता है और इसलिए समय से पहले परिगलन हो सकता है। निकोटियाना बेंथामियानामें रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन व्यक्त करते समय इन संभावित कारकों को ध्यान में रखते हुए, प्रोटीन उत्पादन में वृद्धि हो सकती है।

कम प्रोटीन उपज प्राप्त करना निष्कर्षण और शुद्धिकरण चरणों में कुछ मुद्दों के कारण हो सकता है। सबसे पहले, निष्कर्षण बफर को ब्याज के प्रोटीन के आधार पर अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। सम्मिश्रण के दौरान, पौधे की सामग्री बिना किसी दृश्यमान पत्ते के टुकड़ों के समरूप होनी चाहिए। इसके बाद, कुछ प्रोटीन को निष्कर्षण बफर में घुलनशीलता के लिए डिटर्जेंट की आवश्यकता होती है, जैसे ट्वीन-20 या ट्राइटन। अन्य प्रोटीन को घुलनशीलता के लिए उच्च सांद्रता ~ 7.5 मीटर पर यूरिया की आवश्यकता हो सकती है, जबकि कुछ को केवल पीबीएस के साथ निकाला जा सकता है। प्रोटीन का क्षरण हो सकता है यदि निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान बफर, पौधे के ऊतक, अपकेंद्रित्र आदि को ठंडा नहीं रखा जाता है। एक्सट्रैक्ट बफर में प्रोटीज अवरोधकों और सोडियम एस्कॉर्बेट या इसी तरह के रसायनों की कमी भी गिरावट या एकत्रीकरण का कारण बन सकती है। पीएमएसएफ जैसे कुछ प्रोटीज अवरोधक जल्दी नीचा दिखाते हैं, और सोडियम एस्पॉर्बेट को जलीय बनने में कुछ समय लगता है। कुल मिलाकर, शोधकर्ताओं को अपने ब्याज के प्रोटीन के लिए इष्टतम शर्तों का निर्धारण करना चाहिए ।

आईजीजी-फ्यूजन के शुद्धिकरण में कुछ कदम शामिल हैं जिन्हें कम प्रोटीन उपज प्राप्त होने पर संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है। एसडीएस-पेज और वेस्टर्न द्वारा पूरी प्रक्रिया के दौरान एकत्र किए गए नमूने एलिकोट्स का विश्लेषण करने से तरीकों की गलती की पहचान करने में मदद मिलेगी। उदाहरण के लिए, यदि प्रवाह में पर्याप्त मात्रा में प्रोटीन होता है, तो बफर के पीएच को बदलकर प्रोटीन के बंधन को सुगम बनाया जा सकता है। निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान डिटर्जेंट की उच्च सांद्रता का उपयोग राल की बाध्यकारी संपत्ति को प्रभावित कर सकता है, खासकर यदि राल का कई बार पुन: उपयोग किया जाता है। राल का उचित भंडारण, जैसा कि तरीकों में वर्णित है, राल की उम्र के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यदि वाशिंग स्टेप राल से ब्याज के प्रोटीन को हटा देता है, तो इस समस्या को हल करने के लिए बफ़र्स को फिर से बनाने की आवश्यकता हो सकती है। प्रोटीन शुद्धिकरण के साथ अन्य मुद्दे गलत मुड़ा हुआ या अपमानित प्रोटीन के कारण हो सकते हैं, जिसके लिए समग्र प्रोटीन डिजाइन के आगे विश्लेषण की आवश्यकता हो सकती है। वर्णित समस्या निवारण को संदर्भित करने से इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके शुद्धि की दक्षता बढ़ सकती है।

वर्णित जीएफपी-आइजी फ्यूजन शुद्धि शिक्षण वातावरण में सहायक है। दृश्य विज्ञान शिक्षा के लिए मौलिक है क्योंकि यह शिक्षार्थियों को अवधारणाओं को अधिक आसानी से समझने की अनुमतिदेताहै । छात्र अक्सर आणविक स्तर39पर अवधारणाओं को समझने में कठिनाई के अलावा गलतफहमी की रिपोर्ट करते हैं । विशेष रूप से, जिन प्रयोगों के लिए प्रत्येक चरण में विशिष्ट प्रोटीन स्थान की समझ की आवश्यकता होती है, उन्हें फ्लोरोसेंट अणुओं के साथ ब्याज के प्रोटीन को टैग करके संशोधित किया जा सकता है। इसलिए, जीएफपी या एएसजीएफपी, पीएच पर्यावरण के आधार पर, छात्रों के लिए प्रोटीन शुद्धिकरण तकनीक की स्पष्टता को सुविधाजनक बनाने के लिए उनके फ्लोरेसेंस का उपयोग करने के लिए किया जा सकता है।

संक्षेप में, हम एन बेंथामियाना पौधों में जीएफपी में एक पुनर्संयोजन एबी की अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए एक सरल विधि का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी वांछित लक्ष्य प्रोटीन के लिए फ्यूज किए गए एबी के शुद्धिकरण के लिए किया जा सकता है। इस प्रक्रिया को पत्ती सामग्री की विभिन्न मात्रा को समायोजित करने के लिए संपादित किया जा सकता है और प्रोटीन निष्कर्षण और शुद्धिकरण प्रक्रिया के समापन से पहले, दौरान और बाद में प्रोटीन उपस्थिति के दृश्य निर्धारण के लिए अनुमति देता है। इन तरीकों को नियंत्रण के रूप में उपयोगी हो सकता है और शिक्षण तकनीकों के लिए उद्देश्य किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम वीडियो संपादन के लिए मारिया पिया DiPalma शुक्रिया अदा करते हैं । हम भी उनके उदार प्रकाशन शुल्क सहायता के लिए एरिजोना राज्य विश्वविद्यालय में शैक्षिक आउटरीच और छात्र सेवाओं के कार्यालय का शुक्रिया अदा करते हैं । इस प्रोटोकॉल के लिए अनुसंधान जीवन विज्ञान, एरिजोना राज्य विश्वविद्यालय के स्कूल द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL syringe any N/A
50 mL syringe any N/A
Agar SIGMA-ALDRICH A5306
Blender with cups any N/A
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404
DTT (DL-Dithiothreitol) MP BIOMEDICALS 219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid SIGMA-ALDRICH E-6760
Ethanol any N/A
Glycerol G-Biosciences BTNM-0037
Glycine SIGMA-ALDRICH G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid) EMD MILLIPORE CORPORATION HX0603-4
Heating block any reputable supplier N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets Hummert International 14237000
Kanamycin Gold Biotechnology Inc K-120-100
KCl (Potassium Chloride) SIGMA-ALDRICH P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate) J.t.baker 3248-05
KOH (Potassium Hydroxide) VWR BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate SIGMA-ALDRICH M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) SIGMA-ALDRICH M8250
Miracloth Millipore 4 75855-1R
Moisture control potting mix Miracle-Gro 755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate) J.t.baker 3827-01
NaCl (Sodium Chloride) Santa Cruz Biotechnology sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds any reputable supplier N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) G-Biosciences 786-787
Polypropylene Column any N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 1610394
Protein G resin Thermo Fisher Scientific 20399
Rifampicin Gold Biotechnology Inc R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) G-Biosciences DG093
Sodium Ascorbate SIGMA-ALDRICH A7631-500G
Spectrophotometer any reputable supplier N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter ThermoScientific 40725-GM
Tray for peat pellets with dome any N/A
TRIS Base J.t.baker 4109-02
Tris-HCl Amresco M108-1KG
Tryptone SIGMA-ALDRICH 17221
UV lamp any N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2000992
Yeast extract SIGMA-ALDRICH 9182

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निकोटियाना <em>बेंथामियाना</em> में आईजीजी फ्यूजन प्रोटीन का उत्पादन क्षणिक रूप से व्यक्त किया गया
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Kamzina, A. S., DiPalma, M. P., Hunter, J. G. L., Diamos, A. G., Armer, B., Mor, T. S., Mason, H. S. Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana. J. Vis. Exp. (167), e61774, doi:10.3791/61774 (2021).

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