Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Produktion af IgG Fusion Proteiner Transiently Udtrykt i Nicotiana benthamiana

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61774
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver her en simpel metode til udtryk, ekstraktion og rensning af rekombinant menneskelige IgG smeltet til GFP i Nicotiana benthamiana. Denne protokol kan udvides til rensning og visualisering af mange proteiner, der udnytter kolonnekromatografi. Desuden er protokollen kan tilpasses til in-person og virtuelle college undervisning laboratorium, der giver projektbaseret udforskning.

Abstract

Stor efterspørgsel efter antistoffer som terapeutiske indgreb for forskellige smitsomme, metaboliske, autoimmune, neoplastiske og andre sygdomme skaber et stigende behov for at udvikle effektive metoder til rekombinant antistofproduktion. Fra 2019 var der mere end 70 FDA-godkendte monoklonale antistoffer, og der er eksponentielt vækstpotentiale. På trods af deres løfte, begrænsende faktorer for udbredt brug er produktionsomkostninger og kompleksitet. Potentielt tilbyder planter billige, sikre og let skalerbare proteinfremstillingsstrategier. Planter som Nicotiana benthamiana ikke kun kan korrekt folde og samle komplekse pattedyr proteiner, men også kan tilføje kritiske post-translationelle ændringer svarende til dem, der tilbydes af pattedyr cellekulturer. I dette arbejde, ved hjælp af indfødte GFP og en syre-stabil variant af grønne fluorescerende protein (GFP) smeltet til menneskelige monoklonale antistoffer, vi var i stand til at visualisere hele forbigående antistof udtryk og rensning proces fra N. benthamiana planter. Afhængigt af eksperimentets formål kan oprindelig GFP-fusion sikre lettere visualisering i ekspressionsfasen i planterne, mens syresabil GFP-fusion giver mulighed for visualisering under downstream-behandling. Denne skalerbare og enkle procedure kan udføres af en enkelt forsker til at producere milligram mængder af meget rent antistof eller antistof fusion proteiner i løbet af få dage ved hjælp af kun et par små planter. En sådan teknik kan udvides til visualisering af enhver form for antistofrensningsproces og potentielt mange andre proteiner, både i plante- og andre ekspressionssystemer. Desuden kan disse teknikker gavne virtuelle instruktioner og blive udført i et undervisningslaboratorium af bachelorstuderende, der besidder minimal forudgående erfaring med molekylærbiologiske teknikker, hvilket giver et fundament for projektbaseret udforskning med applikationer fra den virkelige verden.

Introduction

Industri rapporter viser, at tretten ud af de tyve mest ekstrapolationsfaktoren narkotika i USA var biologi (protein-baserede lægemidler), hvoraf ni var antistoffer. Fra og med 2019 var der over 570 antistof (Ab) terapeutiske lægemidler i forskellige kliniskeudviklingsfaser 1,2,3. Det nuværende globale Ab-salg overstiger 100mia. Med så stor efterspørgsel og forventede stigninger i indtægterne, forskere har arbejdet på at udvikle måder at producere Ab terapeutiske på en stadig større skala, med højere kvalitet og lavere omkostninger. Plantebaserede ekspressionssystemer har flere fordele i forhold til traditionelle pattedyrcellelinjer til økonomisk overkommelig og storstilet fremstilling af Ab therapeutics5,6. Produktion af proteinterapeuter i planter ("molekylær pharming") kræver ikke dyre bioreaktorer eller cellekulturfaciliteter som traditionelle pattedyrcellekulturteknikker7,8. Planter kan ikke indgå kontrakter med humane patogener, hvilket minimerer potentielforurening 9. Både forbigående og forbigående plantebaseret proteinudtryk kan anvendes som billigere alternativer til pattedyr eller bakterieproduktionssystemer10. Selvom transgene planter foretrækkes til afgrødeproduktion, kan rekombinant proteinproduktion ved hjælp af denne metode kræve uger til måneder. Fremskridt i forbigående udtryk ved hjælp af virale vektorer gennem enten sprøjte eller vakuumagroinfiltrering giver mulighed for henholdsvis små og store produktioner af det ønskede protein idag 11,12,13,14. Produktion af mAbs mod ebola, Dengue og, Zika, og mange andre rekombinant proteiner, er blevet produceret og renset hurtigt og effektivt ved hjælp af forbigående udtryk i N. benthamiana planter15,16,17,18,19. Disse omstændigheder gør forbigående plantebaseret udtryk til en attraktiv mulighed for at udvikle flere Ab-behandlingsformer og de metoder , der er demonstreret i denneprotokol 20.

Første generations mAbs var af murinafledning, hvilket resulterede i ikke-specifik immunogenicitet, når de blev anvendt i forsøg medmennesker 21. Over tid, kimære, humaniseret, og i sidste ende, fuldt menneskelige Abs blev produceret for at mindske immunogenicitet induceret af Ab terapeutiske. Desværre, nogle af disse Abs stadig forårsage vært immunogenicitet på grund af forskelle i glycosylering21. Udviklingen inden for anlægsteknik har gjort det muligt at ændre Ab glycans, hvilket er afgørende, da ab's stabilitet og funktion i væsentlig grad kan påvirkes af dens glycosylationstilstand22. Fremskridt har gjort det muligt at producere i plantesystemer af højt niveau udtryk for humaniserede mAbs, der indeholder menneskelige glycaner og deraf følgende de ønskede biologiske træk af en masseproduceret humanfarmaceutisk 19,21.

Ud over rekombinant Abs, Ab fusion molekyler (Ab fusioner) er blevet undersøgt til forskellige formål i de seneste årtier. Ab fusioner består ofte af et Ab- eller Ab-fragment, der smeltes sammen med et molekyle eller protein, og er designet til at fremkalde reaktioner fra immuneffektorceller23. Disse molekyler er blevet skabt som potentielle terapeutiske indgreb til behandling af forskellige patologier såsom kræft og autoimmune sygdomme24,25,26,27. Rekombinant immunkomplekser (FC) er en anden klasse af Ab fusioner, der har været ansat som vaccine kandidater28. RIA'er udnytter immunsystemets evne til at genkende Fc-regioner ab fusioner og har vist sig at forbedre immunogeniciteten, når det kombineres med andre vaccineplatforme29,30,31.

Green Fluorescerende Protein (GFP) er et bioluminescerende protein fra vandmænd Aequorea Victoria, som udsender grønt lys, når ophidset af ultraviolet lys32,33. I årenes løb har GFP's brug som en visuel markør for genekspression udvidet fra udtryk i Escherichia coli til talrige proteinudsetrykssystemer, herunder N. benthamiana planter34,35,36,37,38. Synlige markører, såsom GFP, har rigelige konsekvenser i undervisningen og læring af videnskabelige begreber. Talrige entry-level studerende beskriver vanskeligheder gribe videnskabelige begreber, når den idé, der undervises ikke er synlig for det blotte øje, såsom begreberne molekylærbiologi ogbeslægtede områder 39. Visuelle markører, som GFP, kan således bidrage til behandlingen af oplysninger i forbindelse med de videnskabelige processer og kan bidrage til at mindske de vanskeligheder, de studerende rapporterer i at lære en lang række videnskabelige begreber.

Selvom GFP ofte bruges som markør til at angive gene og ekspression in vivo, er det vanskeligt at visualisere det i downstream-processerne, hvis der anvendes sure tilstande. Denne omstændighed skyldes primært , at GFP ikke bevarer sin struktur og deraf følgende fluorescens ved en lav pH40. Midlertidige sure miljøer er ofte påkrævet i forskellige rensningsprocesser, såsom protein G, protein A, og protein L kromatografi, ofte udnyttet til Abrensning 41,42,43,44. GFP-mutanter er blevet anvendt til at bevare fluorescens under sure forhold45,46.

Heri beskriver vi en simpel metode til udtryk, ekstraktion og rensning af rekombinant IgG fusion proteiner i N. benthamiana planter. Vi producerede traditionelle GFP smeltet til N-endinus af en humaniseret IgG tung kæde, hvilket skaber en GFP-IgG fusion. Samtidig udviklede vi sammensmeltning af en fabriks codon-optimeret sekvens for en syre-stabil GFP (asGFP) til N-endinus af en humaniseret IgG tung kæde, hvilket skaber en asGFP-IgG fusion. Fordelene ved at producere GFP-IgG omfatter evnen til at visualisere tilstedeværelsen af et målprotein under ekspression, mens asGFP-IgG tillader at se tilstedeværelsen af rekombinant protein i ikke kun udtrykket og ekstraktionstrinene, men også i rensningstrinnene af proteinet. Denne protokol kan tilpasses til produktion, rensning og visualisering af en række GFP fusionsproteiner produceret i N. benthamiana og renses ved hjælp af kromatografiteknikker, der kræver lav pH. Processen kan også skræddersys til forskellige mængder bladmateriale. Mens Abs og fusion proteiner mærket med GFP eller asGFP ikke er beregnet til at blive brugt til behandlinger, disse metoder kan være nyttige som kontrol under eksperimenter og kan også yderligere udnyttes som et pædagogisk redskab til molekylær og cellulær biologi og bioteknologi, både in-person og næsten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Dyrk N. benthamiana planter

  1. Placer jord tørv pellets på en bakke og hæld tidligere kogt, stadig varm (~ 40-45 °C), vand over tørv pellets for fuld ekspansion. Efter pellets er fuldt udvidet, sted 2-3 N. benthamiana frø på hver tørv pellet ved hjælp af pincet.
  2. Hæld omkring 0,5 i vand til at dække bunden af bakken. Mærkning af bakken med såningsdatoen. Fortsæt med at vande planterne dagligt med passende mængder gødning. Gødning (vandopløselige alle formål plante fødevarer) koncentration er generelt 2,5-2,8 g / l.
  3. Dæk bakken med en humidome top, når den placeres i vækstkammeret. Hold de seedede tørvepiller i vækstkammeret ved 23-25 °C med en 16 h fotoperiode og 60% relativ luftfugtighed.
  4. Efter en uge, fjerne ekstra planter forlader hver pellet med kun én kimplante.
  5. Når planterne er 2-3 uger gamle, overføre hver tørv pellet til en individuel gryde, der indeholder fugt kontrol jord. Denne demonstration brugte Miracle-Gro fugt kontrol potteplante jord.
  6. Vand dagligt med 1 g/L gødning. Lad aldrig jorden være helt tør. Planter er klar til infiltration, når de er 5-6 uger gamle.

2. Forberedelse af Agrobacterium tumefaciens til infiltration

BEMÆRK: GFP-IgG fusion konstruktioner kan opnås som beskrevet i dette papir31. AsGFP-genet blev opnået og planteoptimeret fra denne undersøgelse45. Følgende trin skal udføres ved siden af en Bunsen-brænder, og der bør anvendes grundlæggende aseptiske teknikker for at undgå kontaminering.

  1. Stribe A. tumefaciens EHA105 huser bønnegul dværgvirus (BeYDV)19 planteudtryksvektor for hver konstruktion (asGFP-IgG, GFP-IgG, lyskæde) fra et glycerollager på LB agar (10 g/L Tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g gærekstrakt, 15 g/L agar, 50 μg/ml kanamycin) plade.
  2. Vokse for en dag i en 30 °C stående inkubator. Isoler en enkelt koloni til verifikation ved standardkoloniskærm PCR-protokol.
  3. Brug verificeret koloni til hver konstruktion. Konisk rør fyld med 10 ml LB-medier (10 g/l trypton, 10 g/L NaCl, 5 g gærekstrakt, 50 μg/ml). Dernæst tilsættes 10 μL af 100 μg/ml kanamycin. Der tilsættes 10 μL 2,5 μg/ml rifampicin for at forhindre E. coli-kontaminering. Inkubere ved 30 °C og 120-150 omdr./min. natten over.
  4. Den næste dag, hvis Agrobacterium kultur er vokset til OD600 = 0,6-0,9, kan det bruges til infiltration. Hvis den er tilgroet (OD600 > 1), skal 1-2 ml overføres til frisk LB med antibiotika og dyrkes til den krævede OD600. Afhængigt af den oprindelige kulturs koncentration kan det potentielt tage to dage at vokse til OD600 = 0,6-0,9.
  5. Når på passende OD600, placere kulturer i en centrifuge, og pellet bakterierne ved centrifugering på 4.500 x g i 20 min, stuetemperatur (RT).
  6. Dekantering supernatant fra begge prøver, og derefter resuspendere hver pellet i 1x infiltration buffer (10 mM 2-(N-morpholino) ethansulfonsyre, 10 mM magnesiumsulfat, justeret til pH 5,5 med KOH) for at få endelige OD600 = 0,4. Dette bør tage ca. 15-45 ml infiltrationsbuffer, afhængigt af den oprindelige kulturtæthed. Kombiner lige store mængder af hver IgG fusion konstruktion med lyskæde konstruktion for at få endelig OD600 = 0,2 pr konstruere i hvert rør.

3. Nålefri sprøjteagroinfiltrering

  1. Tag en glatpapirclips og 5-6-uger gamle N. benthamiana planter fra trin 1. Brug papirclipsens skarpe kant til at lave en lille punktering i det første epidermale lag af bladet på adaxialoverfladen. Undgå at punktere det hele vejen igennem.
    BEMÆRK: De nederste blade er lettere for infiltration, mens bladene på toppen af planten er sværere. Generelt er udtrykket af rekombinant proteiner højest i bladene placeret midt i en plante, og disse blade bliver også mindre nekrotisk.
  2. Fyld en 1 ml sprøjte uden en nål fastgjort med den forberedte Agrobacterium-opløsning fra trin 2. Dæk hullet i det foregående trin med slutningen af sprøjten og tryk langsomt for at injicere bakterierne i bladet, mens du anvender et forsigtigt modtryk bag bladet. Se bladet blive mørkere, da opløsningen injiceres uden at lægge for meget pres på sprøjten.
  3. Prøv at infiltrere det meste af bladområdet ved højst 3-4 gange – overdreven bladskader kan hindre proteinudbytte. Det infiltrerede planteblad vises for det meste mørkt fra bundvisning.
    BEMÆRK: Denne bakterielle opløsning bør være nok til mindst 3-4 planter pr konstruktion. Autoklave eventuelle resterende bakterielle opløsning før kasséring.

4. Vokse og observere infiltreret N. benthamiana

  1. Placer infiltrerede planter tilbage i vækstkammeret og fortsætte med at vande dagligt.
  2. Overhold bladene til chlorose og nekrose i infiltrerede områder. Overhold planter for GFP fluorescens (hvis GFP er til stede) under en lang og kortbølgende UV-lampe.
  3. Dag 4-5 viser den højeste fluorescens af begge GFP konstruktioner i bladene. Høst alle bladene på 4-5 dpi (dage efter infiltration) og afveje det samlede bladmateriale.
  4. Brug den straks til downstream-behandling eller opbevares ved -80 °C, indtil den er klar til brug.

5. Proteinekstraktion

  1. Hold puffere og blenderkopper på is eller ved 4 °C før brug.
  2. Der klargøres 2-3 ml iskold udsugningsbuffer (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 med HCl) pr. 1 g plantemateriale. Der tilsættes 2 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) fra lager (100 mM) og 50 mM natriumascorbat til ekstraktionsbufferen lige før ekstraktion.
  3. Placer plantevæv fra trin 4 i prechilled blender kop. Der tilsættes en målt mængde kølet ekstraktionsbuffer til blenderkoppen (som angivet i trin 5.2). Placer blenderkoppen på blenderen. Tag en forskåret ark parafilm og strække det over toppen af blender kop. Blend til homogenitet med 20-sek intervaller, omrøring godt mellem blanding cykler efter behov.
  4. Overfør blandet materiale til et bægerglas. Der tilsættes en rørebjælke ved 4 °C i 30 minutter for at forbedre proteinopløseligheden og tillade udfældning af faste stoffer.
  5. Placer 2 lag Miracloth over et rent bægerglas på is og hæld ekstraktet gennem det for at fjerne store bladrester. Efter alt ekstraktet hældes, fold Miracloth at presse den resterende blad ekstrakt. Ekstraktet skal fremstå mørkegrønt uden synlige partikler.
  6. 50 μL af denne prøve overføres til et nyt 1,5 ml rør og etiketten "totalekstrakt" til senere analyse. Ekstraktet overføres til centrifugerør. Den resterende del af planteekstraktet centrifugeres ved 16.000 x g i 20 min, 4 °C, og supernatanten overføres til et konisk rør.
  7. Det opløselige ekstrakt filtreres med en 50 ml sprøjte og sprøjteglasfiberfilter (0,75 μm).
  8. Der udtages 50 μL af en prøve efter centrifugering, mærket "opløseligt ekstrakt" til senere analyse.

6. Proceduren for protein G-kolonnekromatografi

BEMÆRK: Den protokol, der er beskrevet her, er for tyngdekraft-flow kromatografi ved hjælp af Pierce Protein G agarose harpiks. Hvis du bruger en anden harpiks, skal du se i producentens vejledning til justeringer. Lad aldrig harpiksen løbe tør og undgå, at al væske løber ud. Opsummer stikkontakten efter behov.

  1. Opret en polypropylen kolonne, der indeholder 20 ml prøve.
  2. Anslå mængden af gylle, der er nødvendig, afhængigt af målimmunglobulintypen og dens affinitet til harpiksen. Generelt, 3 ml total gylle med 1,5 ml sengevolumen er tilstrækkelig til rensning af flere milligram Ab.
  3. Hæld forsigtigt den nødvendige mængde resuspenderet gylle i den udjævnede kolonne. Åbn kolonneudtaget fra bunden af kolonnen, og lad den løbe ud, indtil det meste af bufferen er væk.
  4. Hæld straks 10 ml vaskebuffer 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 med HCl) på toppen. Lad det dræne og gentag denne vask trin 2x.
  5. Påfør den filtrerede prøve fra trin 5 på kolonnen, og opsaml gennemstrømningen – aliquot 50 μL flowthrough til senere analyse. Gem resten af flowthrough i tilfælde af Ab ikke binde sig til harpiksen.
    BEMÆRK: Gentiltøjning af flowthrough til en ny kolonne resulterer normalt ikke i et godt udbytte. derfor tilrådes det at starte med nyt bladmateriale.
  6. Harpiksen vaskes to gange med 10 ml 1x PBS for at reducere ikke-specifik binding. Hvis det ønskes, skal der vaskes 50 μL, når bufferen løber gennem kolonnen for at kontrollere, at målet Ab ikke er eluteret med en vaskebuffer.
  7. Opsæt og mærk fem rør med 125 μL steril 1 M Tris-HCl ved pH 8. Dette er for at neutralisere Abs i den sure elution buffer for at undgå potentielle strukturelle ændringer. Alternativt tilsættes 30 μL 2 M Tris base for at få en mindre fortyndet prøve.
    FORSIGTIG: Under elution kan UV-lys anvendes til visualisering. Dette behøver ikke at ske under hele elueringen. Hvis UV anvendes, skal du sørge for at bære passende PV for at undgå skader på øjne og hud. Det er ikke nødvendigt at bruge et UV-lys under elueringstrinnet.
  8. Eluter abs ved at anvende 5 ml elution buffer (100 mM glycin, pH 2,5 med HCl) til kolonnen og indsamle 1 ml fraktioner til hvert udpeget rør fra det foregående trin.
  9. Kolonnen regenereres straks ved at anvende 20 ml vaskebuffer efterfulgt af 10 ml vaskebuffer. Sørg for, at harpiksen ikke efterlades i et surt miljø i længere tid. Elutions skal vises fluorescerende, ofte den højeste fluorescens ses i den anden eluering, men kan variere fra udvinding til udvinding.
  10. Til opbevaring vaskes harpiksen med 10 ml 20% ethanol i PBS og lad den løbe halvvejs. Resumé toppen, derefter bunden af kolonnen, og holde oprejst ved 4 °C.
    BEMÆRK: Generelt kan protein G harpiks genbruges op til 10 gange uden betydeligt tab af effektivitet. Se producentens retningslinjer for specifikke oplysninger.
  11. Ab-koncentrationen bestemmes ved hjælp af et spektrofotometer ved måling af absorbans ved 280 nm ved hjælp af elution-bufferen som blind. Eluaterne opbevares i -80 °C og aliquot 50 μL af hver fraktion til et separat rør til yderligere analyse.

7. SDS-PAGE til GFP-Ig fusionsdetektion

  1. Forbered alle eksempler, før du konfigurerer SDS-PAGE.
    1. Der tilsættes 4 μL prøvebuffer (6x reducerende prøvebuffer: 3,0 ml glycerol, 0,93 g DTT, 1 g SDS, 7 ml 4x tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg bromophenolblåt); (6x ikke-reducerende prøvebuffer: 3,0 ml glycerol, 1 g SDS, 7 ml 4x Tris (pH 6.8) 0,5 M, 1,2 mg bromophenolblå) til 20 μL af hver prøve (totalekstrakt, opløseligt ekstrakt, flowthrough, vask, alle elution fraktioner) til analyse. Sørg for, at rørhætterne er forsvarligt fastgjort.
    2. Behandl kun reducere prøver i 5 minutter i et kogende vandbad, og derefter sætte prøver i 5 min på is. Spin prøver i en mikrocentrifuge til ~ 5 s og belastning 20 μL af hver prøve i rækkefølgen af indsamling i gel brønde. Belastning 3 μL dobbelt-farve protein stigen i en separat brønd.
  2. Kør SDS-PAGE gelen ved en konstant 100 V til ønsket proteinbåndsadskillelse; det tager omkring 1,5 timer. Overvåg stigen som en indikator for proteinadskillelse.
  3. Visualiser gelen under UV for at observere GFP fluorescens.
  4. Hvis det ønskes, plette gel med Coomassie pletten at vurdere det samlede protein i hver prøve. Alternativt, udføre vestlige blot at evaluere mål protein ved hjælp af specifikke Abs.
    BEMÆRK: Både Coomassie farvning og western blot kan udføres ved at følgestandardprotokollerne 47,48.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne undersøgelse viser en nem og hurtig metode til at producere rekombinant proteiner og visualisere dem i hele downstream processer. Ved hjælp af N. benthamiana og efter den medfølgende protokol kan rekombinant proteinproduktion, der er beskrevet her, opnås på mindre end en uge. Den overordnede arbejdsgang for planteudtryk, udvinding og rensning er vist i figur 1. Stadierne af plantevækst fra 2 uger gamle planter, 4 uger gamle planter og 6 uger gamle planter vises i figur 1A (1-3), mens figur 1B viser bladmorfologiske ændringer som følge af nekrose ( figur1B-1) eller chlorosis (Figur 1B-2). Nekrose kan forekomme på injektionsstedet mellem dag 3-5 efter infiltration. Disse ændringer afhænger ofte af proteinets egenskaber, der udtrykkes, og de infiltrerede planters sundhed (yderligere undersøgt i diskussionen). Samtidig kan chlorose også stole på sundheden for planter, der anvendes (yderligere undersøgt i diskussionen). Processen med agrobakteriervækst og forberedelse til infiltration er vist i figur 1C. Figur 1C-1 viser isolerede kolonier af Agrobacterium. Figur 1C (2-5) viser mediernes forventede udseende, efter at det er podet med en enkelt isoleret koloni. Se figur 3 for at få flere oplysninger om disse trin. Plantinfiltrationsprocessen vises i figur 1D og begynder med et ikke-infiltreret anlæg og efterfølges af infiltrationsprocessen. Udtrykket, ekstraktionen og tydeligeringen af planteproteiner vises i figur 1E. Bladmaterialet anbringes i en blender og homogeniseres, vist i figur 1E (1-3). Der udtages derefter en prøve, der repræsenterer total homogenat. Det er derefter filtreret gennem en Miracloth (gaze eller endda en kaffe filter kan erstatte reducerede udgifter), og den afklarede suspension er centrifugeret. Centrifugering giver mulighed for adskillelse af supernatanten fra de resterende materialer, som vist i figur 1E (4-6). Den afklarede supernatant belastes derefter på en protein G-affinitetskromatografistamme, figur 1F (1-3). Når det meste af proteinet er bundet, figur 1F-4, eluteres proteinerne fra harpiksen Figur 1F(5,6).

Tabel 1 viser plantens optimerede nukleinsyresekvenser, der anvendes til at producere asGFP45 (øverste række) i pBY! KEAM-GFPasH vektor, der anvendes i denne undersøgelse til at udtrykke asGFP-IgG fusion og GFP33 (nederste række) i PBYEAM-GFPHgp vektor, der anvendes i denne undersøgelse til at udtrykke GFP-IgG fusion. Nukleinsyre sekvenser blev undersøgt ved hjælp af Expasy protein oversætte værktøj (https://web.expasy.org/translate/) til at bestemme aminosyre sekvenser.

En repræsentativ Agrobacterium plade udarbejdet ved hjælp af denne protokol er vist i figur 2. Ønskede kolonier skal vises runde og ensartet i form og farve. Kolonier tættere på midten af pladen har en højere sandsynlighed for at udtrykke kanamycin modstand. De flydende kulturer vil blive forberedt fra en enkelt isoleret koloni.

Det forventede udseende af medier, der indeholder kulturer, vises i figur 3. Ved første inokulering af en isoleret koloni vises LB-medier lysegule og gennemsigtige, som vist i figur 3A. Efter inkubation af en isoleret koloni natten over ved 30 °C, LB medier vil synes uklar. Som vist i figur 3Bkan objekter ikke længere ses gennem mediet, når der er vækst i LB. Efter centrifugering, bør en pellet form i bunden af røret. Røret vil have en klar adskillelse af LB-medier over pellet og vil fremstå lys gul og gennemsigtig, som vist i figur 3C. LB-mediesupernatanten bortskaffes, og pelletsuspendes i infiltrationsbufferen. Ved en OD600 på 0,2 vises mediet uklart, som vist i figur 3D. OD600 måles som beskrevet i metoderne.

Figur 4 repræsenterer processen med bladinfiltration. En lille prod af bladet med en papirclips bør give en pause i bladet epidermis, der ikke passerer helt gennem bladet. Bruddet bør næppe gennembore bladet, så infiltrationsbufferen kan sprøjtes ind i bladet, vist i figur 4A-C. Suspensionen af Agrobacterium og infiltration buffer injiceres direkte ind i pausen i bladet og lidt ændrer infiltreret blad farve; se Figur 4D-F.

Udseendet af blade, der udtrykker IgG-fusioner , er repræsenteret i figur 5. Det viser efterlader, at udtrykke asGFP-IgG fusioner (Figur 5A) og GFP-IgG fusioner (Figur 5C) under hvidt lys. Hvis konstruktioner i denne protokol anvendes, når infiltreret på en 0,2 OD600, blade skal vises sundt på dag 1-5 for både blade udtrykke asGFP-IgG fusioner og blade udtrykke GFP-IgG fusioner. Der kan være en let nekrotisk udseende på injektionssteder på dag 5, hvilket normalt fremgår af afgrænsning af plantevæv i disse områder. Figur 5 viser også blade, der udtrykker asGFP-IgG fusioner (Figur 5B) og GFP-IgG fusioner (figur 5D) henholdsvis under langbølget UV-lys fra bladets topvisning. Fluorescens stiger i intensitet som dagene fremskridt for begge konstruktioner udtrykt. Blade udtrykker asGFP-IgG fusioner tendens til at have lidt mindre intens fluorescens end blade udtrykke GFP-IgG fusioner på alle dage.

Når supernatanten af asGFP-IgG-ekstraktet tilsættes protein G-kolonnen, bliver harpiksen lidt grøn under hvidt lys på grund af plantechlorofylpigmenter (Figur 6A). Tilsætning af supernatant under kortbølget UV-lys resulterer i akkumulering af fluorescens i Protein G harpiks, som vist i figur 6B. Bemærk, at supernatanten også vil være fluorescerende alene under UV-lys. Alligevel forventes fluorescens at være langt mere koncentreret, når asGFP-IgG fusion begynder at binde sig til harpiksen.

Efter passage af supernatant af asGFP-IgG gennem proteinet G harpiks, skal harpiksen lyser under kortbølget UV-lys, som vist i figur 7A. På dette tidspunkt vil det meste af IgG være bundet til harpiksen. Ved tilsætning af elution buffer, fluorescens indeholdt i proteinet G harpiks vil stadig være synlig under kortbølget UV-lys og vil begynde at miste intensitet som mere elution buffer af lav pH passerer gennem harpiksen. Fluorescens vil begynde at akkumulere i eluaterne (Figur 7B). Eluate fraktioner vil variere i fluorescens. Som det fremgår af figur 8, er fluorescens den laveste intensitet i den første edser og højeste intensitet i den anden og tredje eluates. Resultaterne kan variere, da fluorescens vil afhænge af proteinets udtryk, høstet bladmateriale og andre forhold, der anvendes i forsøget.

Efter endt rensningsproces analyseres prøverne på 10% SDS-PAGE gel under reducerende forhold (prøvebuffer indeholder DTT og prøver blev kogt i 5 min) og ikke-reducerende betingelser (prøvebufferen indeholder ikke DTT, og prøverne blev ikke kogt). Som vist i figur 9Avil kun ikke-reducerende prøver, såsom i Elution 2 NR lane, fluorescere, når de udsættes for kortbølge-UV-lys. Denne vognbanes første bånd fluorescerende på det fulde produkts forventede størrelse ~ 200 kDa, hvilket indikerer, at asGFP stadig er kropsligt korrekt. Fluorescerende bånd nær bunden af gelen er farvestof fra reduktionsbufferen. Bemærk, at asGFP mister fluorescens, når det udsættes for temperaturer ved eller over 95 °C i 5 minutter. dette er forskelligt fra eGFP (forbedret GFP), hvilket ville opretholde en vis fluorescens under de sammebetingelser 49,50. To bånd af stigen, 75 kDa og 25 kDa, også fluorescere. Figur 9B repræsenterer en Coomassie plet af samme gel i figur 9A. Elutions i vognbane 6-9 er blevet forberedt under reducerende forhold. Når der køres på en gel og Coomassie-farvede, skal disse prøver vise asGFP-IgG fusionskomponenter separat. Disse komponenter omfatter den tunge kæde smeltet til GFP (~ 75 kDa), den tunge kæde alene (50 kDa), lyskæden (25 kDa) og asGFP selv (27 kDa). Den ikke-reducerende prøve blev inkluderet i gelens sidste bane til sammenligningsformål og skulle vise et enkelt stort bånd (~200 kDa), som skulle være af to tunge kæder, der smeltes til asGFP og de respektive lyskæder. Derudover er mindre bånd sandsynligvis forårsaget af indfødte proteaser. Denne kavalergang kan forebygges ved tilsætning af proteasehæmmere og ved at holde proteinekstraktet koldt på alle tidspunkter, herunder ved udførelse af kolonnerensning. IgG-fusionsproteinets individuelle komponenter vil ikke kunne skelnes fra deres bestanddel af de ikke-reducerende prøver på Coomassie-gelen.

Figure 1
Figur 1: Arbejdsgang for planteudtryk, udtrækning og rensningsprocesser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Nukleotidsekvens brugt Aminosyresekvens
Sekvenser
anvendes til
asGFP i
pBY! KEAM
-GFPasH
Vektor
anvendes i
den
Udtryk
af de
asGFP-IgG
Fusion		 ATGGTGTCCAAGGGAGAGGAAGCTTCTGGAAGAGCCTTGTTC
CAGTACCCTATGACTTCTAAAATCGAGTTGAATGGCGAGATCA
ACGGAAAGAAGTTTAAGGTTGCTGGAGAGGGTTTCACCCCTTC
ATCTGGAAGATTCAATATGCACGCTTACTGTACTACCGGAGAC
TTGCCTATGTCCTGGGTTGTTATAGCTTCCGCTTCAGTACGG
GTTTCACATGTTTTGCCCACTACCCTGAGGATATCACTCACTTCTT
CCAAGAATGTTTTCCTGGGTCTTATACTCTCGACAGAACTTTGA
GGATGGAGGGAGACGGTACTCTTACTACTCACCACGAGTACTC
CCTTGAGGACGGTGCGTTACTTCCAAGACTTTGAACGCTT
CTGGATTCGACCCCAAGCCCCACTATGACTAAGTCTTCGT
CAAACAGCTCCCAAACGAGGTCAAAATCACCCACGGGCCA
AATGGTATTAGACTTACTTCCACTGTTCTACCTTAAGGAGGA
CGGAACTATCCAGATCGGAACTCAAGACTGCATCGTTACCCCA
GTTGGCGGCAGAAAAGTTACTCAGCCTAAGGCTCACTTTCTTC
ATACTCAGATCATTCAGAAGGACCCAAACGACACCAGAG
ATCACATCGTTCAGACTGAGCTGCCGTTGCTGGAAATCTTTG
GCACGGCATGGATGAGCTTTACAAGA		 MVSKGEEASGRALF
QYPMTSKIELNGEI
NGKKFKVAGEGFTP
SSGRFNMHAYCTT
GDLPMSWVVIASPL
QYGFHMFAHYPEDI
THFFQECFPGSYTL
DRTLRMEGDGTLTT
HHEYSLEDGCVTSK
TTLNASGFDPKGAT
MTKSFVKQLPNEVK
ITPHGPNGIRLTSTV
LYLKEDGTIQIGTQD
CIVTPVGGRKVTQP
KAHFLHTQIIQKK
NDTRDHIVQTELAV
AGNLWHGMDELY
K
Sekvenser
anvendes til
GFP i
pBYEAMGFPHgp
Vektor
anvendes i
den
Udtryk
af GFP-IgG
Fusion		 ATGGCTAACAAGCACCTCTCATTGTCTCTTGTGCTCCTTCCTTT
GGTCTTTCTGCTTCTTGCTTCTGGTATGGTGAGCAAGGGCG
AGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGG
ACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGG
GCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCA
TCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGT
GACCACCTTCAGCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCC
GACCACATGAAGCACCGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCG
AAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTTCAAGGACGACGG
CAACTACAAGACCCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACAC
CCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGA
GGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAA
CAGCCACAACGTCTATATCATGGGACAAGCAGAGAA
CATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACAGAGGACGGC
AGCGTGCAGCCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCG
GCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCAC
CCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAAGCGCGATCA
CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCAC
GGCATGGACGAGCTGTACAAGA		 MANKHLSLFLVLL
GLSASLASGMVSKG
EELFTGVVPILVELD
GDVNGHKFSVSGE
GEGDATYGKLTLKFI
CTTGKLPVPWPTLV
TTFSYGVQCFSRYP
DHMKQHDFFKSA
MPEGYVQERTIFFK
DDGNYKTRAEVKFE
GDTLVNRIELKGIDF
KEDGNILGHKLEYN
YNSHNVYIMADKQ
KNGIKVNFKIRHNIE
DGSVQLADHYQQN
TPIGDGPVLLPDNH
YLSTQSALSKDPNEK
RDHMVLLEFVTAA
GITH

Tabel 1: Sekvenser, der bruges til at oprette asGFP og GFP

Figure 2
Figur 2: Agrobacteriumkolonier dyrket på LB-plade, der indeholder kanamycin. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Fremkomsten af medier i hele vækst og forarbejdning af Agrobacterium. (A) Fremkomsten af LB medier umiddelbart efter inokulering af isolerede Agrobacterium koloni. (B) Tilstedeværelsen af medier efter natten inkubation af en isoleret koloni ved 30 °C. (C) Fremkomsten af medier efter kulturer er spundet ned i 20 min ved 4.500 x g. (D) Pellet resuspenderet i infiltration buffer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Proces med infiltration af N. benthamiana planter. (A-B) Lidt stikke bladet resulterer i en subtil hul i toppen af bladet. (C-D) Injektion af Agrobacterium suspension i blade. (E) Infiltreret planteblad fra den øverste visning. (F) Plant med flere blade infiltreret fra den øverste visning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Visualisering af blade, der indeholder asGFP-IgG fusion og GFP-IgG fusion begynder på dag 1 post infiltration (dpi) i første række, der fører op til dag 5 dpi i den sidste række for alle betingelser. A) asGFP-IgG fusion under hvidt lys. B) asGFP-IgG fusion under langbølge-UV. C) GFP-IgG fusion under hvidt lys. D) GFP-IgG fusion under langbølge-UV. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Supernatant af asGFP-IgG-ekstraktet, der tilsættes protein G-kolonnen. A) Tilføjelse under hvidt lys. B) Tilføjelse under kort bølge UV-lys. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Protein G harpiks under kortbølget UV-lys efter supernatant af asGFP-IgG ekstrakt blev kørt gennem kolonnen. A) Protein G harpiks under kortbølget UV-lys. B) Protein G harpiks ved eluering af proteiner under lave PH-forhold. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Rensede elueringer af asGFP-IgG opnået efter udsættelse for lave pH-betingelser ved rensning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: SDS-SIDE med kolonneeksempler. Prøver mærket med "R" er i at reducere forholdene, og prøver mærket med "NR" er i ikke-reducerende forhold. A) Under UV-lys, kun ikke-reducerende prøver fluorescere i 10% polyacryamid gel, som det ses i Elution 2 NR lane. De 75 kDa og 25 kDa stigen bands også fluorescere. B) Coomassie farvning af samme gel afslører tilstedeværelsen af alle proteiner i prøven. I de reducerede elueringer er IgG-fusion uden lyskæde, den tunge kæde, lyskæden og muligvis forringet GFP til stede ved ~ 75 kDa, ~ 50 kDa, ~ 25 kDa og ~ 10 kDa. I modsætning hertil er der i de ikke-reducerede elueringer et fremtrædende bånd til stede, hvilket er i overensstemmelse med størrelsen af hele asGFP-IgG-fusion (~200 kDa). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol kan anvendes til visuel verifikation af ethvert rekombinant Ab- eller rekombinant protein, der produceres i N. benthamiana-planter, herunder dem, der kræver midlertidig eksponering for sure miljøer tilkolonnerensning 42,43,44. Desuden kan fusion af asGFP til andre proteiner i forskellige udtrykssystemer være et nyttigt redskab til eksperimentel visualisering og uddannelse. Protokollen heri kan yderligere skaleres til større og mindre mængder af bladmateriale til at producere den ønskede mængde rekombinant protein. De beskrevne metoder udnytter tidligere undersøgelser, der har identificeret og gjort versioner af GFP, der forbliver stabile under sure forhold46. Omfattende tidligere undersøgelser har skabt immunglobulin domæner smeltet til et protein af interesse, ofte kaldet IgG-fusioner, som denne protokol også kan rumme28. Ved at skabe og udtrykke en IgG-fusion bestående af en humaniseret IgG1 smeltet til en GFP og asGFP, vi var i stand til at visualisere tilstedeværelsen af det ønskede protein under udtrykket, ekstraktion, og rensning processer.

Hvis en dygtig forsker følger denne protokol, blade vil begynde at vise nekrose tegn på infiltration steder mellem dag 4-5. Men når du bruger de beskrevne vektorer, infiltrerede områder af blade bør synes sundt indtil dag 5 med ordentlig pleje. Det er vigtigt at bemærke, at Agrobacterium infektion i sig selv i sidste ende vil resultere i nekrose af plantebladene på grund af ophobning af reaktive ilt arter (ROS) som en del af planten celle immunrespons51,52. Dette immunrespons og det deraf følgende niveau af nekrose kan variere baseret på flere faktorer51, herunder cellulær målretning, proteinets placering, den type protein, der produceres, ekspressionsvektoren og agrobakteriets stamme brugte 53,54. Variationer i den optiske massen (OD600) i det agrobakteriium, der anvendes til infiltration, kan også påvirke niveauet af nekrose55. Mange ekspressionsvektorer anvenderproteiner,der binder retinoblastomaprotein, til at holde plantecellerne i syntese (S)-fasen og øge celledelings- og transformationsfrekvensen56,57. Stigninger i proteinproduktion, såsom dem, der forårsages af binding til retinoblastoma protein, kan føre til nekrose56,57. Fremskridt inden for vektordesign, såsom dem, der anvendes i modificerede versioner af geminivirus BeYDV replicons anvendes i denne protokol, har minimeret nekrose og samtidig opretholde høje proteinudtryk niveauer58. Også, BeYDV replicons er ikke-konkurrerende, giver udtryk for flere proteiner på en enkelt kassette uden kendte størrelsesbegrænsninger53,59.

Flere faktorer påvirker plantevækst før og efter infiltration, hvilket i sidste ende kan føre til lavt proteinudbytte. Når såning planter, alt for mange frø pr plante pellet kan resultere i mange små plantespirer fører til mere beskedne plantevækst. Derfor vil en reduktion af frøtallet pr. tørvepellet og fjernelse af de ekstra spirer efter en uge resultere i bedre plantevækst. Opretholdelse af ordentlig jordfugtighed er en anden faktor, der påvirker den generelle plantesundhed. Overvanding, under vandet, tilsætning af for meget eller for lidt gødning kan bidrage til klorose og påvirkeplantesundheden 60,61,62. Nekrose og chlorose kan desuden være forårsaget af produktionen af et protein, der forårsager cellestress. Dette fænomen er blevet set mange gange med udtryk for rekombinant immun komplekser (RIC)56. Vi har observeret, at ændringer i proteinstruktur og fusion af proteiner kan hjælpe med at minimere nekrose; dog, nogle proteiner kan forblive giftige for planter, selv efter forskellige ændringer. Hvis der anvendes de udtryksvektorer, der er beskrevet heri, kan ekstraktion af protein udføres tidligt og før starten på betydelig nekrose, hvilket resulterer i højt proteinudbytte56.

Forskellige vækstbetingelser kan bremse eller endda hæmme Agrobacterium vækst. Agrobacterium vokser optimalt ved 28 °C-30 °C og oplever et varmechok, når det inkuberes over 30 °C, hvilket giver celledelingsfejl62. Vækst kan også hæmmes ved tilsætning af for meget rifampicin, som forskellige Agrobacterium stammer er mere eller mindre naturligt resistente over for dette antibiotikum62. Den bakteriekultur forberedt til infiltration med betydeligt højere OD600 end anbefalet vil sandsynligvis forårsage nekrose55. En lidt højere OD600 af kulturen påvirker normalt ikke udbyttet, men hvis det er lavere end 0,1, kan proteinudbyttet reduceres betydeligt. Ophobning af døde celler kan forekomme under to omstændigheder; 1) kulturen var tilgroet, hvilket førte til en betydelig brøkdel af OD er døde celler, og 2) skadelige / dræbe Agrobacterium efter vækst, såsom med kemiske rester eller høje centrifuge hastigheder. Infiltrationer ved hjælp af et øget antal døde celler i kulturen kan reducere proteinudtryk. Desuden kan punktering bladene ved at anvende for meget pres skade bladene og dermed kan føre til for tidlig nekrose. I betragtning af disse mulige faktorer, når de udtrykker rekombinant proteiner i Nicotiana benthamiana, kan føre til øget proteinproduktion.

Opnåelse lavt proteinudbytte kan skyldes nogle problemer i ekstraktion og rensning trin. For det første kan ekstraktionsbufferen have brug for optimering afhængigt af det protein af interesse. Under blanding skal plantemateriale være homogent uden synlige bladstykker. Dernæst kræver nogle proteiner rengøringsmidler til opløselighed i ekstraktionsbufferen, såsom Tween-20 eller Triton. Andre proteiner kan have brug for urinstof ved høje koncentrationer ~ 7,5 M for opløselighed, mens nogle kan udvindes med PBS kun. Nedbrydning af protein kan forekomme, hvis buffere, plantevæv, centrifuger osv. Mangel på proteasehæmmere og natriumascorbat eller lignende kemikalier i ekstraktionsbufferen kan også forårsage nedbrydning eller aggregering. Nogle proteasehæmmere som PMSF nedbrydes hurtigt, og natrium ascorbat tager lidt tid at blive vandig. Samlet set bør forskerne bestemme optimale betingelser for deres protein af interesse.

Rensningen af IgG-fusioner omfatter få trin, der kan have brug for ændringer, hvis lavt proteinudbytte opnås. Analyse af prøven aliquots indsamlet under hele processen ved SDS-PAGE og Western vil bidrage til at identificere fejlen af metoderne. For eksempel, hvis flowthrough indeholder en betydelig mængde protein, så bindingen af proteinet kan lettes ved at ændre pH-zonen af bufferen. Brug af høje koncentrationer af vaske- og rengøringsmidler under ekstraktionsprocessen kan påvirke harpiksens bindingsgenskab, især hvis harpiksen genbruges flere gange. Korrekt opbevaring af harpiksen, som beskrevet i metoderne, er afgørende for harpiksens levetid. Desuden, hvis vask trin fjerner protein af interesse fra harpiksen, buffere kan være nødvendigt at genskabe for at løse dette problem. Andre problemer med proteinrensning kan skyldes fejlfoldede eller nedbrudte proteiner, hvilket kan kræve yderligere analyse af det overordnede proteindesign. Hvis du refererer til den beskrevne fejlfinding, kan det øge effektiviteten af rensningen ved hjælp af denne protokol.

Den beskrevne GFP-IgG fusion rensning er nyttig i et undervisningsmiljø. Visualisering er grundlæggende for naturvidenskabelig uddannelse, fordi det giver eleverne mulighed for at forstå begreber lettere39. Eleverne rapporterer ofte misforståelser ud over svært ved at forstå begreber på molekylært niveau39. Især de eksperimenter, der kræver en forståelse af det specifikke protein placering på hvert trin kan ændres ved mærkning protein af interesse med fluorescerende molekyler. Derfor kan GFP eller asGFP, afhængigt af det anvendte pH-miljø, anvendes til at udnytte deres fluorescens til at lette belysningen af proteinrensningsteknikken for studerende.

Sammenfattende beskriver vi en simpel metode til udtryk og rensning af en rekombinant Ab smeltet til en GFP i N. benthamiana planter. Denne protokol kan bruges til rensning af en Ab smeltet til enhver ønsket mål protein. Processen kan redigeres for at imødekomme forskellige mængder af bladmateriale og giver mulighed for visuel bestemmelse af protein tilstedeværelse før, under og efter afslutningen af proteinekstraktion og rensning proces. Disse metoder kan være nyttige som kontrol og kan være formålstet med undervisningsteknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Maria Pia DiPalma for at redigere videoen. Vi takker også Office of Educational Outreach og Student Services på Arizona State University for deres generøse offentliggørelse gebyr bistand. Forskning for denne protokol blev støttet af School of Life Sciences, Arizona State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL syringe any N/A
50 mL syringe any N/A
Agar SIGMA-ALDRICH A5306
Blender with cups any N/A
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404
DTT (DL-Dithiothreitol) MP BIOMEDICALS 219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid SIGMA-ALDRICH E-6760
Ethanol any N/A
Glycerol G-Biosciences BTNM-0037
Glycine SIGMA-ALDRICH G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid) EMD MILLIPORE CORPORATION HX0603-4
Heating block any reputable supplier N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets Hummert International 14237000
Kanamycin Gold Biotechnology Inc K-120-100
KCl (Potassium Chloride) SIGMA-ALDRICH P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate) J.t.baker 3248-05
KOH (Potassium Hydroxide) VWR BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate SIGMA-ALDRICH M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) SIGMA-ALDRICH M8250
Miracloth Millipore 4 75855-1R
Moisture control potting mix Miracle-Gro 755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate) J.t.baker 3827-01
NaCl (Sodium Chloride) Santa Cruz Biotechnology sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds any reputable supplier N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) G-Biosciences 786-787
Polypropylene Column any N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 1610394
Protein G resin Thermo Fisher Scientific 20399
Rifampicin Gold Biotechnology Inc R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) G-Biosciences DG093
Sodium Ascorbate SIGMA-ALDRICH A7631-500G
Spectrophotometer any reputable supplier N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter ThermoScientific 40725-GM
Tray for peat pellets with dome any N/A
TRIS Base J.t.baker 4109-02
Tris-HCl Amresco M108-1KG
Tryptone SIGMA-ALDRICH 17221
UV lamp any N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2000992
Yeast extract SIGMA-ALDRICH 9182

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
  2. Kaplon, H., Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2019. mAbs. 11 (2), 219-238 (2019).
  3. The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePharma. , Available from: https://www.fiercepharma.com/special-report/top-20-drugs-by-2018-u-s-sales (2018).
  4. Grilo, A. L., Mantalaris, A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends in Biotechnology. 37 (1), 9-16 (2019).
  5. Kim, M. -Y., et al. Novel vaccination approach for dengue infection based on recombinant immune complex universal platform. Vaccine. 33 (15), 1830-1838 (2015).
  6. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Transgenic plants in the biopharmaceutical market. Expert Opinion on Emerging Drugs. 10 (1), 185-218 (2005).
  7. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. -C. Plant Molecular Pharming for the Treatment of Chronic and Infectious Diseases. Annual Review of Plant Biology. 65 (1), 743-768 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and Bioengineering. 109 (10), 2575-2588 (2012).
  9. Yao, J., Weng, Y., Dickey, A., Wang, K. Y. Plants as factories for human pharmaceuticals: Applications and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28549-28565 (2015).
  10. Mor, T. S., Moon, Y. -S., Palmer, K. E., Mason, H. S. Geminivirus vectors for high-level expression of foreign proteins in plant cells. Biotechnology and Bioengineering. 81 (4), 430-437 (2003).
  11. Hefferon, K. L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology. 433 (1), 1-6 (2012).
  12. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Scientific Reports. 8 (1), 4755 (2018).
  13. Zhong, G. Y., et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Molecular Breeding. 5 (4), 345-356 (1999).
  14. Giddings, G., Allison, G., Brooks, D., Carter, A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 18 (11), 1151-1155 (2000).
  15. Fulton, A., Lai, H., Chen, Q., Zhang, C. Purification of monoclonal antibody against Ebola GP1 protein expressed in Nicotiana benthamiana. Journal of Chromatography A. 1389, 128-132 (2015).
  16. Diamos, A., et al. A highly expressing, soluble, and stable plant-made IgG fusion carrying Zika virus envelope domain III elicits potent immunogenic responses in mice without adjuvant. Frontiers in immunology. 3140 (11), (2020).
  17. Hunter, J. G. L., et al. Evaluation of a toxoid fusion protein vaccine produced in plants to protect poultry against necrotic enteritis. PeerJ. 2019 (3), 6600 (2019).
  18. Dent, M., et al. Plant-produced anti-dengue virus monoclonal antibodies exhibit reduced antibody-dependent enhancement of infection activity. Journal of General Virology. 97 (12), 3280-3290 (2016).
  19. Diamos, A. G., et al. High Level Production of Monoclonal Antibodies Using an Optimized Plant Expression System. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 472 (2020).
  20. Olinger, G. G., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 18030-18035 (2012).
  21. Mastrangeli, R., Palinsky, W., Bierau, H. Glycoengineered antibodies: towards the next-generation of immunotherapeutics. Glycobiology. 29 (3), 199-210 (2019).
  22. Montero-Morales, L., Steinkellner, H. Advanced Plant-Based Glycan Engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 81 (2018).
  23. Joosten, V., Lokman, C., vanden Hondel, C. A. M. J. J., Punt, P. J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 2 (1), 1-15 (2003).
  24. Müller, D. Antibody fusions with immunomodulatory proteins for cancer therapy. Pharmacology and Therapeutics. 154, 57-66 (2015).
  25. Bootz, F., Neri, D. Immunocytokines: A novel class of products for the treatment of chronic inflammation and autoimmune conditions. Drug Discovery Today. 21 (1), 180-189 (2016).
  26. Jafari, R., Zolbanin, N. M., Rafatpanah, H., Majidi, J., Kazemi, T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 24 (12), (2017).
  27. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. mAbs. 9 (2), 182-212 (2017).
  28. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  29. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  30. Diamos, A. G., et al. Vaccine synergy with virus-like particle and immune complex platforms for delivery of human papillomavirus L2 antigen. Vaccine. 37 (1), 137-144 (2019).
  31. Diamos, A. G., et al. Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity. Vaccine. 38 (18), 3455-3463 (2020).
  32. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  33. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  34. Palm, M., Baumstark-Khan, C., Horneck, G. Green Fluorescent Protein (GFP) Expression in Mammalian Cells After UV-Irradiation. Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation. , 311-316 (1999).
  35. Paemeleire, K., et al. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26. Molecular Biology of the Cell. 11 (5), 1815-1827 (2000).
  36. Harper, B. K., Stewart, C. N. Patterns of Green Fluorescent Protein Expression in Transgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 18 (2), 141 (2000).
  37. Kaishima, M., Ishii, J., Matsuno, T., Fukuda, N., Kondo, A. Expression of varied GFPs in Saccharomyces cerevisiae: Codon optimization yields stronger than expected expression and fluorescence intensity. Scientific Reports. 6, (2016).
  38. Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21772029/ (2020).
  39. Mnguni, L. E. The theoretical cognitive process of visualization for science education. SpringerPlus. 3 (1), 1-9 (2014).
  40. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  41. Bjorck, L., Kronvall, G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-Binding reagent. The Journal of Immunology. 133 (2), (1984).
  42. Andrew, S. M., Titus, J. A. Purification of Immunoglobulin G. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 1-12 (2001).
  43. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 848 (1), 40-47 (2007).
  44. Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Björck, L., Mariani, M. Recombinant proteins L and LG: efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 668 (2), 209-218 (1995).
  45. Shinoda, H., Ma, Y., Nakashima, R., Sakurai, K., Matsuda, T., Nagai, T. Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa. Cell Chemical Biology. 25 (3), 330-338 (2018).
  46. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  47. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  48. Mahmood, T., Western Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  49. Vessoni Penna, T. C., Ishii, M., Cholewa, O., de Souza, L. C. Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted from Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 38 (2), 135-139 (2004).
  50. Kang, S. J., Park, E. A., Lee, D. H., Hong, K. W. Comparison of the stability of eGFP displayed on the Bacillus subtilis spore surface using CotB and C-terminally truncated CotB proteins as an anchoring motif under extreme conditions. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 41 (2019).
  51. Kuta, D. D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4 (8), 752-757 (2005).
  52. Qiusheng, Z., Bao, J., Likun, L., Xianhua, X. Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea) explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (1), 83-90 (2005).
  53. Diamos, A. G., Rosenthal, S. H., Mason, H. S. H.S. 5' and 3' Untranslated Regions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 7, 200 (2016).
  54. Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 706-714 (2009).
  55. Diamos, A. G., Mason, H. S. Modifying the Replication of Geminiviral Vectors Reduces Cell Death and Enhances Expression of Biopharmaceutical Proteins in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 9, 1974 (2019).
  56. Gordon-Kamm, W., et al. Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11975-11980 (2002).
  57. Villemont, E., Dubois, F., Sangwan, R. S., Vasseur, G., Bourgeois, Y., Sangwan-Norreel, B. S. Role of the host cell cycle in the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Petunia: Evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta. 201 (2), 160-172 (1997).
  58. Regnard, G. L., Halley-Stott, R. P., Tanzer, F. L., Hitzeroth, I. I., Rybicki, E. P. High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector. Plant Biotechnology Journal. 8 (1), 38-46 (2010).
  59. Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Human Vaccines. 7 (3), 331-338 (2011).
  60. Morton, T. G., Gold, A. J., Sullivan, W. M. Influence of Overwatering and Fertilization on Nitrogen Losses from Home Lawns. Journal of Environmental Quality. 17 (1), 124-130 (1988).
  61. Brown, J. C. Iron Chlorosis in Plants. Advances in Agronomy. 13, 329-369 (1961).
  62. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory Maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , CHAPTER, Unit3D.1 (2012).

Tags

Biologi antistof monoklonalt antistof molekylær pharming agroinfiltration forbigående udtryk Nicotiana benthamiana grøn fluorescerende protein syre-stabil grøn fluorescerende protein antistof fusion IgG-fusion protein G rensning
Produktion af IgG Fusion Proteiner Transiently Udtrykt i <em>Nicotiana benthamiana</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kamzina, A. S., DiPalma, M. P.,… More

Kamzina, A. S., DiPalma, M. P., Hunter, J. G. L., Diamos, A. G., Armer, B., Mor, T. S., Mason, H. S. Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana. J. Vis. Exp. (167), e61774, doi:10.3791/61774 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter