Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

니코티아나 벤타미안나에서 과도하게 표현된 IgG 융합 단백질의 생산

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61774
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School
* These authors contributed equally

Summary

우리는 니코티아나 벤타미안에서GFP에 융합된 재조합 인간 IgG의 발현, 추출 및 정제를 위한 간단한 방법을 여기에서 설명한다. 이 프로토콜은 열 크로마토그래피를 활용하는 수많은 단백질의 정제 및 시각화로 확장될 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 직접 및 가상 대학 교육 실험실에 적용되어 프로젝트 기반 탐사를 제공합니다.

Abstract

다양한 전염성, 대사, 자가면역, 신플라스틱 및 기타 질병에 대한 치료 개입으로서 항체에 대한 수요가 높아지면서 재조합 항체 생산을 위한 효율적인 방법을 개발할 필요성이 증가하고 있다. 2019년 현재, FDA승인 단일클론 항체가 70개 이상 있었으며 기하급수적인 성장 잠재력이 있습니다. 그들의 약속에도 불구하고, 광범위한 사용에 대한 제한 요인은 제조 비용과 복잡성입니다. 잠재적으로 식물은 저비용, 안전하며 쉽게 확장 가능한 단백질 제조 전략을 제공합니다. 니코티아나 벤타미안과 같은 식물은 복잡한 포유류 단백질을 올바르게 접고 조립할 수 없을 뿐만 아니라 포유류 세포 배양에서 제공하는 것과 유사한 중요한 번역 후 수정을 추가할 수 있습니다. 본 작품에서는, 인간 단일클론 항체에 융합된 녹색 형광 단백질(GFP)의 원종 GFP 및 산안정변체를 사용하여, 우리는 N. 벤타미안 식물로부터 의 전체 과도 항체 발현 및 정화 과정을 시각화할 수 있었다. 실험의 목적에 따라 네이티브 GFP 융합은 식물의 발현 단계에서 쉽게 시각화할 수 있으며, 산안정성 GFP 융합은 다운스트림 처리 중에 시각화를 가능하게 합니다. 이 확장 가능하고 간단한 절차는 몇 가지 작은 식물을 사용하여 며칠 만에 고도로 순수한 항체 또는 항체 융합 단백질의 밀리그램 양을 생산하는 단일 연구원에 의해 수행 될 수있다. 이러한 기술은 식물 및 기타 발현 시스템에서 모든 유형의 항체 정제 공정 및 잠재적으로 많은 다른 단백질의 시각화로 확장될 수 있다. 또한, 이러한 기술은 가상 지침에 도움이 될 수 있으며 분자 생물학 기술에 대한 최소한의 사전 경험을 가진 학부 생에 의해 교육 실험실에서 실행될 수 있으며, 실제 응용 프로그램과 프로젝트 기반 탐사를위한 토대를 제공합니다.

Introduction

업계 보고서에 따르면 미국에서 가장 많이 매출을 기록한 20개 중 13개 약물은 생물학적 제제(단백질 기반 의약품)였으며, 그 중 9개가 항체였습니다. 2019년 현재, 다양한 임상 개발상에서570개 이상의 항체(Ab) 치료제가1,2,3하였다. 현재 글로벌 Ab 매출은 1,000억 달러를 초과하며, 단일클론 Ab(mAb) 치료제 시장은 2025년1,4년까지최대 3,000억 달러를 창출할 것으로 예상됩니다. 이러한 높은 수요와 예상 된 수익 증가로, 연구원은 더 높은 품질과 낮은 비용으로, 그 어느 때보 다 큰 규모로 Ab 치료제를 생산하는 방법을 개발하기 위해 노력하고있다. 식물계 발현 시스템은 Ab 치료제5,6의저렴하고 대규모 제조를 위해 전통적인 포유류 세포주보다 몇 가지 장점이 있다. 식물에서 단백질 치료제의 생산("분자 파밍")은 전통적인 포유류 세포 배양기술7,8과같이 고가의 생물반응기 또는 세포 배양 시설을 필요로 하지 않는다. 식물은 인간의 병원균을 계약할 수 없으므로 잠재적 오염 을 최소화할 수 없습니다 9. 과도 및 형질 전환 식물 기반 단백질 발현 은 포유류 또는 세균 성 생산 시스템(10)에대한 저비용 대안으로 활용 될 수있다. 형질 전환 식물은 작물 생산을 위해 선호되지만,이 방법을 사용하여 재조합 단백질 생산은 몇 주에서 몇 달이 필요할 수 있습니다. 주사기 또는 진공 농약침을 통해 바이러스 벡터를 이용한 과도발현의 어드밴스는11일,12,13,14일에원하는 단백질의 각각 소규모 및 대규모 생산을허용한다. 에볼라, 뎅기열 및 지카 및 수많은 다른 재조합 단백질에 대한 mAbs의 생산은 N. 벤타미안 식물15,16,17,18,19에서일시적인 발현을 사용하여 신속하고 효율적으로 생산및 정제되었다. 이러한 상황은 과도 식물 기반 발현을 다중 Ab 치료제 및 이프로토콜(20)에서입증된 방법을 개발하기 위한 매력적인 옵션으로 만든다.

1세대 mAbs는 뮤린 유도체였으며, 인체실험(21)에서사용될 때 비특이적 면역원성으로 귀결되었다. 시간이 지남에 따라, 키메라, 인간화, 그리고 결국, 완전히 인간 복근은 Ab 치료에 의해 유도된 면역원성을 감소시키기 위하여 생성되었다. 불행히도, 이러한 복근 중 일부는 여전히글리코실화(21)의차이로 인해 숙주 면역원성을 유발한다. 식물 공학의 개발은 Ab glycans의 수정을 허용했으며, 이는 Ab의 안정성과 기능이 글리코실화상태(22)의영향을 크게 받을 수 있기 때문에 필수적입니다. 어드밴스는 인간 글리칸을 함유하고 그 결과 대량 생산된 인간 약제19,21의원하는 생물학적 특성을 포함하는 인간화된 mAbs의 높은 수준의 발현의 식물 시스템에서 생산을 허용하고 있다.

재조합 복근 이외에, Ab 융합 분자 (Ab 퓨전) 최근 수십 년 동안 다양한 목적을 위해 탐구되었습니다. Ab 퓨전은 종종 분자 또는 단백질에 융합된 Ab 또는 Ab 단편으로 구성되며 면역 이펙터세포(23)로부터반응을 유도하도록 설계되었습니다. 이들 분자는암 및 자가면역질환(24,25,26,27)과같은 다양한 병리를 치료하는 잠재적 치료 내정간섭으로 만들어졌다. 재조합 면역 복합체(RIC)는 백신지원자(28)로채용된 또 다른 종류의 Ab 퓨전이다. RI는 Ab fusions의 Fc 영역을 인식하는 면역 계통의 능력을 이용하고 다른 백신플랫폼(29,30,31)과결합될 때 면역원성을 향상시키는 것으로 밝혀졌다.

녹색 형광 단백질 (GFP)은 자외선32,33에의해 흥분 될 때 녹색 빛을 방출 해파리 Aequorea 빅토리아에서 파생 된 생물 발광 단백질이다. 수년에 걸쳐, 유전자 발현의 시각적 마커로서의 GFP의 사용은 에샤리치아 대장균의 발현에서 N. 벤타미안 식물34,35,36,37,38을포함한 수많은 단백질 발현 시스템으로 확장되었다. GFP와 같은 눈에 보이는 마커는 과학적 개념의 가르침과 학습에 풍부한 영향을 미칩니다. 수많은 엔트리 레벨 학생들은 가르쳐지는 아이디어가 분자 생물학 및 관련 분야39의개념과 같은 육안으로 보이지 않을 때 과학적 개념을 파악하는 데 어려움을 설명합니다. GFP와 같은 시각적 마커는 과학적 과정과 관련된 정보 처리에 기여할 수 있으며 학생들이 수많은 과학적 개념을 배우는 데 보고하는 어려움을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.

GFP는 생체 내에서유전자와 발현을 나타내는 마커로 자주 사용되지만 산성 조건을 사용하는 경우 다운스트림 공정에서 시각화하기가 어렵습니다. 이러한 상황은 주로 GFP가 낮은 pH40에서구조및 그 결과 형광을 유지하지 않기 때문이다. 일시적인 산성 환경은 단백질 G, 단백질 A 및 단백질 L 크로마토그래피와 같은 다양한 정제 공정에서 종종 요구되며, 종종 Ab 정제41,42,43,44에활용된다. GFP 돌연변이체는 산성 조건 하에서 형광을 유지하기 위해 사용되어 왔다45,46.

본 원에서 우리는 N. 벤타미안 식물에서 재조합 IgG 융합 단백질의 발현, 추출 및 정제를 위한 간단한 방법을 설명합니다. 우리는 인간화된 IgG 헤비 체인의 N 종단에 융합된 전통적인 GFP를 생산하여 GFP-IgG 융합을 만들었습니다. 동시에, 우리는 인간화 된 IgG 무거운 체인의 N 종기에 산 안정 GFP (asGFP)에 대한 식물 코돈 최적화 서열의 융합을 개발하여 asGFP-IgG 융합을 만들었습니다. GFP-IgG를 생산하는 장점은 발현 중에 표적 단백질의 존재를 시각화하는 기능을 포함하고, asGFP-IgG는 발현 및 추출 단계뿐만 아니라 단백질의 정제 단계에서 재조합 단백질의 존재를 볼 수 있게 한다. 이 프로토콜은 N. benthamiana에서 생산된 다양한 GFP 융합 단백질의 생산, 정제 및 시각화에 적응하고 낮은 pH를 요구하는 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 이 과정은 또한 잎 재료의 다양한 양에 맞게 조정할 수 있습니다. GFP 또는 asGFP로 태그된 Abs 및 융합 단백질은 치료에 사용되지 않지만, 이러한 방법은 실험 중 대조군으로 유용할 수 있으며, 직접 및 사실상 분자 및 세포 생물학 및 생명 공학을 위한 교육 도구로 더 활용될 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. N. 벤타미안 식물 을 재배

  1. 토양 토탄 펠릿을 트레이에 놓고 이전에 삶은, 여전히 뜨거운 (~ 40-45 °C), 전체 확장을위한 토탄 펠릿 위에 물을 부어. 펠릿이 완전히 확장된 후 핀셋을 사용하여 각 토탄 펠릿에 2-3 N. 벤타미안 씨앗을 놓습니다.
  2. 트레이의 바닥을 덮기 위해 물 에서 약 0.5를 붓습니다. 트레이에 시드 날짜로 레이블을 지정합니다. 매일 모종에 적절한 양의 비료로 물을 계속 합니다. 비료(수용성 다목적 식물 식품) 농도는 일반적으로 2.5-2.8g/L이다.
  3. 성장 챔버에 놓을 때 휴미돔 상의로 트레이를 덮습니다. 16h 포토기간과 60% 상대 습도를 가진 23-25°C의 성장 챔버에 시드 토탄 펠릿을 보관하십시오.
  4. 1 주일 후, 한 모종으로 각 펠릿을 떠나 여분의 식물을 제거합니다.
  5. 식물이 2-3 주 오래되면 각 토탄 펠릿을 수분 제어 토양을 포함하는 개별 냄비로 옮기십시오. 이 데모는 기적-그로 수분 제어 포팅 토양을 사용했습니다.
  6. 매일 1 g/L 비료로 물을 섭취하십시오. 토양을 완전히 건조하게 두지 마십시오. 식물은 5-6 주 된 때 침투 할 준비가되어 있습니다.

2. 침투를 위한 아그로박테리움 tumefaciens의 준비

참고: GFP-IgG 융합 구문은 본제31에기재된 바와 같이 얻을 수 있다. asGFP 유전자는 이 연구 결과로부터 수득및 식물에최적화되었다(45). 다음 단계는 Bunsen 버너 옆에 수행해야하며 오염을 방지하기 위해 기본 무균 기술을 적용해야합니다.

  1. 줄무늬 A. tumefaciens EHA105 항두 노란 왜성 바이러스 (BeYDV)19 각 구조에 대한 식물 발현 벡터 (asGFP-IgG, GFP-IgG, 라이트 체인) LB 한천에 글리세롤 주식에서 (10 g/L 트립톤, 10 g/L NaCl, 5 g 효모 추출물, 15 g/L/L/l/ lgar) 5g/ lgar.
  2. 30°C 서 인큐베이터에서 하루 동안 성장하십시오. 표준 콜로니 스크린 PCR 프로토콜에 의해 검증을 위해 단일 콜로니를 분리합니다.
  3. 각 구문에 대해 검증된 콜로니를 사용합니다. 10mL의 LB 미디어(10g/L 트립톤, 10g/L NaCl, 효모 추출물 5g, 50 μg/mL)로 원뿔튜브를 채웁니다. 다음으로 100 μg/mL 카나마이신의 10 μL을 추가합니다. 대장균 오염을 방지하기 위해 2.5 μg/mL 리팜피신의 10 μL을 추가합니다. 하룻밤 사이에 30°C및 120-150 rpm에서 배양하십시오.
  4. 다음 날, 아그로박테리움 배양이 OD600 = 0.6-0.9로 성장하면 침투에 사용될 수 있다. 자란 경우(OD600 > 1), 1-2mL은 항생제로 신선한 LB로 이전되어야 하며 필요한 OD600으로성장해야 한다. 초기 배시의 농도에 따라 OD600 = 0.6-0.9로 성장하는 데 2 일이 걸릴 수 있습니다.
  5. 적절한 OD600에한 번, 원심분리기에 배양을 배치하고, 20분 동안 4,500 x g, 실온(RT)으로 원심분리로 박테리아를 펠렛한다.
  6. 두 샘플모두에서 극치상, 1x 침투 완충제(10mMM 2-(N-morpholino) 에탄설포닉산, 10mM 마그네슘 황산, KOH로 pH 5.5로 조정된 각 펠릿을 최종 OD600 = 0.4로 재연한다. 이것은 초기 배양 밀도에 따라 침투 버퍼의 대략 15-45 mL를 취해야 합니다. 각 IgG 퓨전 구조와 라이트 체인 구조의 동일한 볼륨을 결합하여 각 튜브의 구조당 최종 OD600 = 0.2를 얻습니다.

3. 바늘없는 주사기 농나무 침전

  1. 1단계에서 는 곧게 펴진 종이 클립과 5-6주 된 N. 벤타미안 식물을 가져 가라. 종이 클립의 날카로운 가장자리를 사용하여 adaxial 표면에 있는 잎의 첫 번째 표피 층에 작은 구멍을 만듭니다. 끝까지 구멍을 뚫지 마십시오.
    참고: 하부 잎은 침투가 더 쉬운 반면 식물 의 상단의 잎은 더 어렵습니다. 일반적으로, 재조합 단백질의 발현은 식물의 중간에 있는 잎에서 가장 높으며, 이러한 잎은 또한 덜 괴사합니다.
  2. 2단계에서 준비된 아그로박테리움 용액을 바늘없이 1mL 주사기를 채우세요. 주사기의 끝으로 이전 단계에서 만든 구멍을 덮고 천천히 잎 뒤에서 부드러운 반압을 적용하면서 잎에 박테리아를 주입밀어. 주사기에 너무 많은 압력을 가하지 않고 용액이 주입됨에 따라 잎이 어두워지는 것을 지켜보십시오.
  3. 잎 부위의 대부분을 최대 3-4배까지 침투하여 과도한 잎 손상으로 인해 단백질 수율을 저해할 수 있습니다. 침투된 식물 잎은 아래쪽 보기에서 대부분 어둡게 나타납니다.
    참고: 이 세균용 용액은 구조당 적어도 3-4 식물에 충분해야 합니다. 폐기하기 전에 남은 세균용 용액을 자동 복제합니다.

4. 침투한 N. 벤타미안나 에서 성장하고 관찰

  1. 침수된 식물을 다시 성장 챔버에 놓고 매일 물을 계속합니다.
  2. 침투 된 지역에서 클로로시스와 괴사잎을 관찰하십시오. 길고 단파 UV 램프 아래에서 GFP 형광(GFP가 존재하는 경우)에 대한 식물을 관찰한다.
  3. 일 4-5 잎에서 두 GFP 구조의 가장 높은 형광을 보여줍니다. 모든 잎을 4-5 dpi(침전 후 일)로 수확하고 총 잎 재료의 무게를 측정합니다.
  4. 다운스트림 처리또는 -80°C에서 사용할 준비가 될 때까지 즉시 사용하십시오.

5. 단백질 추출

  1. 사용 전에 버퍼와 블렌더 컵을 얼음이나 4°C로 유지하십시오.
  2. 식물 재료 1 g 당 2-3 mL의 얼음 냉기 추출 버퍼 (100 m Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 HCl)를 준비하십시오. 추출 직전에 추출 버퍼에 재고(100mMMM)와 50mM 나트륨 아스코르베이트에서 2m mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)를 추가합니다.
  3. 4단계에서 식물 조직을 미리 냉각된 블렌더 컵에 넣습니다. 블렌더 컵에 측정된 양의 냉장 추출 버퍼를 추가합니다(5.2단계에서 나타낸 대로). 블렌더 컵을 블렌더에 놓습니다. 파라필름의 사전 컷 시트를 가지고 블렌더 컵의 상단에 스트레칭. 20초 간격으로 균일성에 블렌딩하여 필요에 따라 블렌드 사이클 간에 잘 저어줍니다.
  4. 혼합 된 재료를 비커로 옮기. 교반 바를 넣고 단백질 용해도를 높이고 고체의 강수량을 허용하기 위해 30 분 동안 4 °C에서 저어줍니다.
  5. 얼음 위에 깨끗한 비커 위에 미라클로스 2층을 놓고 추출물을 부어 큰 잎 파편을 제거합니다. 모든 추출물을 붓은 후 미라클로스를 접어 잔류 잎 추출물을 짜냅니다. 추출은 눈에 보이는 미립자 없이 어두운 녹색 으로 표시 되어야 합니다.
  6. 이 샘플의 50 μL을 새로운 1.5mL 튜브로 옮기고 나중에 분석을 위해 "총 추출물"을 라벨로 지정합니다. 추출물을 원심분리기 튜브로 옮기습니다. 원심 분리기 는 20 분, 4 °C에 대한 16,000 x g에서 식물 추출물의 나머지를 원심 분리하고 원적 튜브로 상류체를 전송합니다.
  7. 50mL 주사기 및 주사기 유리 섬유 필터(0.75 μm)를 사용하여 수용성 추출물을 필터링합니다.
  8. 원심분리 후 시료의 50μL을 수집하고, 나중에 분석을 위해 "용해 추출물"이라고 라벨을 붙입니다.

6. 단백질 G 컬럼 크로마토그래피 시술

참고: 여기서 설명된 프로토콜은 피어스 단백질 G 아가로즈 수지의 중력 흐름 크로마토그래피를 위한 것입니다. 다른 수지를 사용하는 경우 제조업체의 조정 지침을 참조하십시오. 수지가 건조하게 달리지 말고 모든 액체가 배수되는 것을 방지하십시오. 필요에 따라 콘센트를 다시 캡합니다.

  1. 20mL의 시료를 포함하는 폴리프로필렌 컬럼을 설정합니다.
  2. 대상 면역글로불린 유형및 수지에 대한 선호도에 따라 필요한 슬러리의 양을 추정한다. 일반적으로, 총 슬러리 3mL1.5 mL 침대 부피를 가진 Ab의 여러 밀리그램의 정화에 충분하다.
  3. 필요한 양의 재일시 슬러리를 덮은 기둥에 조심스럽게 붓습니다. 열 아래쪽에서 열 콘센트를 열고 대부분의 버퍼가 사라질 때까지 드레인할 수 있습니다.
  4. 즉시 10mL의 워시 버퍼 1x PBS(137m NaCl, 2.7m KCl, 10mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4,pH 7.4)를 위에 붓습니다. 이 세척 단계를 2x로 배출하고 반복하십시오.
  5. 5단계에서 컬럼에 여과된 샘플을 적용하고 흐름통과(이후 분석을 위해 50μl의 흐름)를 수집합니다. Ab가 수지에 바인딩되지 않은 경우 흐름의 나머지 부분을 저장합니다.
    참고: 새 열에 흐름을 다시 적용해도 일반적으로 좋은 수율을 초래하지는 않습니다. 따라서 새로운 잎 재료로 시작하는 것이 좋습니다.
  6. 수지 10mL1x PBS로 두 번 세척하여 비특이적 결합을 줄입니다. 원하는 경우, 버퍼가 컬럼을 통해 배수됨에 따라 알리쿼트 50 μL의 세척을 알리쿼트하여 대상 Ab가 세척 버퍼로 용출되지 않았는지 확인합니다.
  7. pH 8에서 멸균 1M Tris-HCl의 125 μL로 5개의 튜브를 설정하고 라벨을 부착합니다. 이는 잠재적인 구조적 변화를 피하기 위해 산성 용출 버퍼에서 Abs를 중화시키는 것입니다. 또는 2M Tris 베이스의 30 μL을 추가하여 희석된 시료를 적게 얻습니다.
    주의: 용출 시 UV 광이 시각화에 사용될 수 있습니다. 용출 기간 동안 이 작업을 수행할 필요가 없습니다. 자외선을 사용하는 경우 눈과 피부의 손상을 피하기 위해 적절한 PPE를 착용하십시오. 용출 단계에서 는 UV 광을 사용할 필요가 없습니다.
  8. 열에 5mL의 용출 버퍼(100m 글리신, HCl로 pH 2.5)를 적용하여 복근을 엘테우트와 이전 단계로부터 지정된 각 튜브에 1mL 분획을 수집한다.
  9. 20mL의 워시 버퍼를 적용하고 10mL의 워시 버퍼를 적용하여 컬럼을 즉시 재생합니다. 수지는 장시간 산성 환경에 남아 있지 않은지 확인합니다. 용출은 형광으로 나타나야하며, 종종 가장 높은 형광은 두 번째 용출에서 보이지만 추출에서 추출에 이르기까지 다를 수 있습니다.
  10. 수지용으로 는 PBS에서 20% 에탄올의 10mL로 수지세척하여 중간배수하게 합니다. 상단을 다시 한 다음 열의 아래쪽을 다시 한 번 4°C에서 똑바로 세워보세요.
    참고: 일반적으로 단백질 G 수지는 효율성의 상당한 손실 없이 최대 10회 재사용할 수 있습니다. 특정 세부 사항에 대 한 제조업체의 지침을 참조 하십시오.
  11. 용출 버퍼를 공백으로 사용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하여 분광계를 사용하여 Ab 농도를 결정합니다. 추가 분석을 위해 각 분획의 -80°C 및 알리쿼트 50 μL에 용출을 저장합니다.

7. GFP-Ig 융합 검출을 위한 SDS-PAGE

  1. SDS-PAGE를 설정하기 전에 모든 샘플을 준비합니다.
    1. 샘플 버퍼 4 μL 추가 (6 x 감소 샘플 버퍼: 글리세롤 3.0 mL, DTT의 0.93 g, SDS 1 g, 4 x Tris의 7 mL (pH 6.8) 0.5 M, 브로모페놀 블루의 1.2 mg); (6x 비감소 시료 버퍼: 글리세롤 3.0mL, SDS 1g, 4x Tris(pH 6.8) 0.5M, 브로모페놀 블루 1.2 mg) ~ 20 μL(총 추출물, 용해 추출물, 유동, 세척, 모든 용출 분수) 분석. 튜브 캡을 안전하게 고정해야 합니다.
    2. 끓는 수조에서 5분 동안 만 샘플을 줄이는 데 만 치료한 다음 얼음에 5분 동안 샘플을 넣습니다. 마이크로센심분리기에서 샘플을 ~5s로 스핀하고 각 샘플의 20 μL을 젤 우물에 수집하는 순서로 로드합니다. 이중 색 단백질 사다리의 3 μL을 별도의 우물에 적재합니다.
  2. 원하는 단백질 밴드 분리에 일정한 100 V에서 SDS-PAGE 젤을 실행; 약 1.5시간이 걸립니다. 단백질 분리의 지표로 사다리를 모니터링합니다.
  3. GFP 형광을 관찰하기 위해 UV 아래의 젤을 시각화합니다.
  4. 원하는 경우, 각 샘플에서 총 단백질을 평가하기 위해 Coomassie 얼룩으로 젤을 얼룩지게합니다. 대안적으로, 특정 Abs를 사용하여 표적 단백질을 평가하기 위하여 서쪽 얼룩을 능력을 발휘합니다.
    참고: 쿠마시 염색 및 서부 얼룩 모두 표준 프로토콜47,48에따라 수행될 수 있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

이 연구는 재조합 단백질을 생성하고 다운스트림 프로세스 전반에 걸쳐 시각화하는 쉽고 빠른 방법을 보여줍니다. N. 벤타미안을 사용하고 제공된 프로토콜을 따르고, 여기에 설명된 재조합 단백질 생산은 1주일 이내에 달성될 수 있다. 식물 발현, 추출 및 정제의 전체 워크플로우가 도 1에표시됩니다. 2주 된 묘목, 4주 된 식물, 6주 된 식물의 식물 성장 단계는 각각 도 1A(1-3)에 표시되며, 도 1B는 괴사(그림 1B-1)또는 클로로시스(그림 1B-2)로인한 잎 형태학적 변화를 묘사한다. 괴사는 침윤 후 3-5 일 사이에 주사 부위에서 발생할 수 있습니다. 이러한 변화는 종종 표현되는 단백질의 특성과 침투 식물의 건강에 달려 있습니다 (토론에서 추가 로 검사됨). 동시에 클로로시스는 사용되는 식물의 건강에 의존 할 수 있습니다 (토론에서 추가 검사). Agrobacterium 성장 및 침투 준비의 과정은 도 1C에도시된다. 그림 1C-1은 아그로박테리움의고립된 식민지를 표시한다. 그림 1C(2-5)는 하나의 고립된 식민지로 접종된 후 미디어의 예상 된 모습을 표시합니다. 그림 3을 참조하여 다음 단계에 대한 자세한 내용을 확인하십시오. 식물 침윤 공정은 도 1D에 표시되고 침투되지 않은 식물로 시작하여 침투 공정이 뒤따릅니다. 식물 성 단백질의 발현, 추출 및 설명은 도 1E에표시됩니다. 잎 재료는 블렌더에 배치되고 그림 1E (1-3)에 도시된 균질화된다. 그런 다음 총 균동호를 나타내는 샘플을 채취합니다. 그런 다음 미라클로스(거즈 또는 커피 필터를 통해 여과되어 비용을 절감할 수 있음)를 통해 필터링되며, 명확한 서스펜션은 원심분리됩니다. 원심분리는 그림 1E(4-6)에도시된 바와 같이 나머지 재료로부터 상류체를 분리할 수 있게 한다. 정제된 상체는 단백질 G 친화도 크로마토그래피 컬럼, 도 1F(1-3)에 적재된다. 단백질의 대부분이 결합된 후, 도 1F-4,단백질은 수지 1F(5,6)로부터용출된다.

표 1은 pBY에서 asGFP45(상부 행)를 생산하는 데 사용되는 식물 최적화된 핵산 서열을 표시합니다! 이 연구에서 사용되는 KEAM-GFPasH 벡터는 GFP-IgG 융합을 발현하기 위해 본 연구에서 사용되는 PBYEAM-GFPHgp 벡터에서 gFP-IgG 융합 및 GFP33(하부 행)을 발현하는 데 사용된다. 핵산 서열은 엑스파시 단백질 번역 도구(https://web.expasy.org/translate/)를 사용하여 아미노산 서열을 결정하도록 검사하였다.

이 프로토콜을 사용하여 제조된 대표적인 아그로박테리움 플레이트는 도 2에도시된다. 원하는 식민지는 모양과 색상으로 둥글고 균일하게 나타나야 합니다. 플레이트의 중심에 가까운 식민지는 카나마이신 저항을 표현할 가능성이 높습니다. 액체 배양은 하나의 고립 된 식민지에서 준비됩니다.

문화권이 포함된 미디어의 예상 모습은 그림 3에표시됩니다. 격리된 식민지를 처음 접종하면 LB 미디어는 그림 3A에표시된 것처럼 밝은 노란색및 반투명으로 나타납니다. 30°C에서 하룻밤 사이에 고립된 식민지의 배양 후, LB 미디어는 탁탁하게 된다. 도 3B에도시된 바와 같이, LB에 성장이 있을 때 미디어를 통해 객체를 더 이상 볼 수 없습니다. 원심 분리 에 따라, 펠릿은 튜브의 바닥에 형성되어야한다. 튜브는 펠릿 위에 LB 매체를 명확하게 분리하고 그림 3C에표시된 것처럼 밝은 노란색과 반투명으로 나타납니다. LB 미디어 상체는 폐기되고 펠릿이 침투 버퍼에서 다시 중단됩니다. 0.2의 OD600에서 용지 3D와같이 미디어가 탁한 것처럼 보입니다. OD(600)는 방법에 기재된 대로 측정해야 한다.

도 4는 잎 침투 과정을 나타냅니다. 종이 클립잎이 있는 잎의 약간의 prod는 잎을 완전히 통과하지 못하는 잎 표피에서 휴식을 취해야 합니다. 침입 버퍼가 리프에주입 될 수 있도록 나누기는 간신히 잎을 관통해야하며 그림 4A-C에도시된. Agrobacterium 및 침투 버퍼의 현탁액은 잎의 휴식에 직접 주입되고 잠입 된 잎의 색상을 약간 변경합니다. 그림 4D-F를참조하십시오.

IgG 융합을 표현하는 나뭇잎의 모양은 도 5로표현된다. 백색광 아래에서 는 gFP-IgG융합(그림 5A)과GFP-IgG 융합(그림5C)을표현하는 잎을 표시합니다. 이 프로토콜의 구문이 사용되는 경우 0.2 OD600에침투할 때 잎은 GFP-IgG 융합을 표현하는 두 잎 모두에 대해 1-5일에 건강하게 나타나야 하며 GFP-IgG 융합을 표현하는 나뭇잎이 나타납니다. 5일째에 주사 부위에 약간의 괴사 모양이있을 수 있습니다, 이는 일반적으로 그 지역에서 식물 조직의 번개에 의해 명백하다. 도 5는 또한 잎의 상단 보기에서 긴 파도 UV 빛 아래, 각각 GFP-IgG 융합(도 5B)및 GFP-IgG 융합(도 5D)로표현 잎을 표시합니다. 형광은 두 구조에 대한 날이 진행됨에 따라 강도가 증가합니다. GFP-IgG 융합을 표현하는 잎은 온일 GFP-IgG 융합을 표현하는 잎보다 약간 덜 강렬한 형광을 갖는 경향이 있습니다.

asGFP-IgG 추출물의 상부제가 단백질 G 컬럼에 첨가되면, 수지는 식물 엽록소 안료(도6A)로인해 백색광 하에서 약간 녹색이 된다. 단파 UV 광 하에서 상체체를 첨가하면 도 6B에 도시된 바와 같이 단백질 G 수지에서 형광이 축적되는 결과를 낳는다. 상체는 또한 UV 빛 아래에서 혼자 형광될 것입니다. 여전히, 형광은 asGFP-IgG 융합이 수지에 결합하기 시작할 때 훨씬 더 집중될 것으로 예상됩니다.

단백질 G 수지를 통해 asGFP-IgG의 상체가 전달된 후, 수지는 도 7A에도시된 바와 같이 단파 UV 빛 아래에서 조명되어야 한다. 이 시점에서, IgG의 대부분은 수지에 바인딩됩니다. 용출 버퍼를 추가하면, 단백질 G 수지에 포함된 형광은 여전히 단파 UV 빛 하에서 볼 수 있으며 낮은 pH의 더 많은 용출 버퍼가 수지를 통과함에 따라 강도를 잃기 시작합니다. 형광은 용액(도 7B)에축적되기 시작합니다. 용액 분수는 형광에 따라 다릅니다. 도 8에서볼 수 있듯이, 형광은 제1용출에서 가장 낮은 강도이며 두 번째 및 세 번째 용출에서 가장 높은 강도이다. 형광은 단백질의 발현, 수확된 잎 물질 및 실험에 사용된 다른 조건에 따라 달라지므로 결과가 달라질 수 있다.

정화 과정을 마친 후, 샘플은 10% SDS-PAGE 겔을 감소 조건하에서 분석(샘플 버퍼는 DTT를 포함하고 샘플을 5분 동안 삶아올렸음) 및 비감소 조건(샘플 버퍼는 DTT를 포함하지 않으며 시료는 끓이지 않았다). 도 9A에도시된 바와 같이, 용출 2 NR 레인과 같은 비감소 시료만이 단파 UV 광에 노출되면 형광을 합니다. 이 레인의 첫 번째 밴드는 전체 제품의 예상 크기 ~200 kDa에서 형광을 하고 있어 asGFP가 여전히 형태적으로 정확하다는 것을 나타냅니다. 젤 바닥 근처의 형광 대역은 감소 버퍼에서 염료입니다. AsGFP는 5 분 동안 95 °C 이상의 온도에 노출되면 형광을 잃는다; 이는 eGFP(향상된 GFP)와 다르며, 이는 동일한 조건하에서 일부 형광을 유지할 것이다49,50. 사다리의 두 밴드, 75 kDa와 25 kDa, 또한 형광. 도 9B는 도 9A에서동일한 젤의 쿠마시 얼룩을 나타낸다. 차선 6-9의 용출은 감소 조건하에서 준비되었습니다. 젤과 쿠마시 염색에서 실행될 때, 이 견본은 별도로 asGFP-IgG 융합 분대를 표시해야 합니다. 이러한 구성 요소에는 GFP(~75kDa), 중형 체인(50kDa), 라이트 체인(25kDa), asGFP 자체(27kDa)에 융합된 중형 체인이 포함됩니다. 비감소 시료는 비교목적으로 겔의 마지막 차선에 포함되었으며, asGFP 및 각 광 사슬에 융합된 두 개의 중형 체인으로 구성되어야 하는 단일 대형 대역(~200 kDa)을 표시해야 한다. 또한, 작은 밴드는 네이티브 프로테아제에 의해 발생할 가능성이 높습니다. 이러한 분열은 프로테아제 억제제의 첨가와 컬럼 정화를 수행할 때를 포함하여 단백질 추출물을 항상 차갑게 유지함으로써 방지될 수 있다. IgG 융합 단백질의 개별 성분은 쿠마시 젤의 비감소 시료에서 구별할 수 없습니다.

Figure 1
그림 1: 식물 발현, 추출 및 정화 공정의 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

사용되는 뉴클레오티드 서열 아미노산 서열
시퀀스
에 사용
asGFP에서
pBY! 켐 (주)
-GFPasH
벡터
에 사용
Tthe
식

asGFP-IgG
퓨전		 ATGGTGTCCAAG가와그CTCTGGGAAAGGTGTTC
카그타크타트가액트CTAAATCGAGTTGAATGGAGGGAGATCA
ACGGAAAGAAGTTTAAGGTTGCGGAGAGGGTCCCTTC
ATCTGGAATCAATGCACTTACTACTACTACCGGAGAC
TTGCCTATGTCCTGTGTTGTTGT타타GCTTCCCCGCTTCAGTACGGGG
GTTTCACATTTGCCCACTACCCTGAGGATCACTCTCTCTT
CCAAGAATGTTTTCCTGTCTTCTCTCTCTCTCGACAGAACTTTGA
GGATGGAGG가그랙트액트카가그택트랙트액트
CCTTGAGGACGGTGTTACTTCCAAGACTACTTTGAACGCTT
CTGGATTCGACCCCAAGGGAGCCACTAAGTTTCGT
카아카카
AATGGT타그액트CC액트CTCTCTCTCTACCTTAAGGA
CGGAACTATCCAGATCGGAACTCAAGACTAGACTGCATCGTTACCCCA
GTTGGCGGCAAAAAGTTACTCAGCCTAAGCTCTCTCTCTCTCTCTCtCtCCTCtCCCTCtCCCCTCtCCCCCTCCCCTCtCCCCCTCtCCCCCCCTCtCCCCCTCtCCCCC
ATACTCAGATCAGAAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA
ATCACATCGTTCAGACTGAGCTTGCTTGCTGGAATCTG
GCACGGGGGGGGATGAGCTTACAAAAAGA		 MVSKGEEASGRALF
QYPMTSKIELNGEI
NGKKFKVAGEFTP
SSGRFNMHAYCTT
GDLPMSWVVIASPL
QYGFHMFAHYPEDI
THFFQECFPGSYTL
DRTLRMEGDGTLTT
헤이슬레드그CVTSK
TTLNASGFDPKGAT
MTKSFVKQLPNEVK
ITPHGPNGIRLTSTV
LYLKEDGTIQIGTQD
시브트PVGGRKVQP
카플랑치이크KDP
NDTRDHIVQTELAV
아그NLWHGMDELY
K
시퀀스
에 사용
GFP에서
pBYEAMGFPHgp
벡터
에 사용
Tthe
식
GFP-IgG의
퓨전		 ATGGCTAACAAGCACCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTCCTTGTGCTCCTT
GGTCTCTGCTTCTCTCTTGCTTTGCTTGGGGATGGATGGATGGGGGCG
AGAGCTGTTCACCGGGGTGGGTCCATCCTGGTGGAGCTGGGGGGGG
ACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTGTGGGGGAG
GCGAGGGGGGAGACCACCTACAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTTCA
TCTGCACCAGAGAGAGCTGCCCGTCCCCTGGCCCCCCTCGT
가ACCACCTTCAGCTACGGGGCGGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCC
가카아가가GCAGCACGACTTCTTCAAGTCCCCCATCCCCCCCG
AAGCTACGTCCAGAGCGCACCATCTCTTCAAGACGACGGGG
카액타카가크CGCG가그GTGAAGAGCGAGGCGACAC
CCTGGGACCGCATCGAGCTGAAGGGAAGGGCATCGACTTCAAGGA
GGAGGGGGCAAAGGGGGCACAAGGGAGTACAACTAA
CAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGAAGCAAGGAAGAACGGGG
카타가액트카아가트CCGCCACAACATCGAGAGCGGC
AGCGCAGCTCGCCGACCACTAGCAGAACCCCATCCCATCG
GCGACGGCCCCGTGTTGCTGCTGCCCGAACCACCACCACTACCTGAGCAC
CCAGTCCCCTGAGCAAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGCGCGATCA
CATGGTCCTGCTGGAGTTCGGACCGCCGCCGGATCACTCAC
GGCATGGACGAGCTGTGTACAAGA		 만벨스벨
GLSASLASGMVSKG
엘프트브브볼벨드
GDVNGHKFSVSGE
게그다티클LKFI
CTTGKLPVPWPTLV
TTFSYGVQCFSRYP
DHMKQHDFFKSA
MPEGYVQertIFFK
DDGNYKTRAEVKFE
GDTLVNRIELKGIDF
케지닐클리엔
YNSHNVY이마크Q
KNGIKVNFKIRHNIE
DGSVQLADHYQQN
TPIGDGPVLLPDNH
일스트스크살스크DPNEK
RDHMVLLEFVTAA
GITH

표 1: asGFP 및 GFP를 만드는 데 사용되는 시퀀스

Figure 2
그림 2: 카나마이신을 함유한 LB 플레이트에서 자란 아그로박테리움 콜로니. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 아그로바테리움의성장과 가공을 통해 미디어의 출현. (A) 고립된 아그로박테리움 식민지의 접종 직후 LB 미디어의 출현. (B) 30°C에서 고립된 식민지를 하룻밤 사이에 배양한 후 미디어의 존재는 배양 후 의 외형이 4,500 x g.(D) 펠릿이 침투 버퍼에서 재장매된 4,500 x g.(D)에서 20분 동안 회전한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: N. 벤타미안 식물의 침투 과정. (A-B) 잎을 약간 찌르면 잎 꼭대기에 미묘한 구멍이 발생합니다. (C-D) 잎에 아그로 박테리움 현탁액의 주입. (E) 상단 보기에서 식물 잎에 침투합니다. (F) 상단 보기에서 여러 잎이 침투한 식물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 모든 조건에 대한 마지막 행에서 1일째에 첫 번째 행에 침투(dpi)를 게시하여 로GFP-IgG 융합 및 GFP-IgG 융합을 포함하는 잎의 시각화가 시작됩니다. A) 백색광 아래에서 GFP-IgG 융합. B) 연동 UV에서 asGFP-IgG 융합. C) 백색광 아래 GFP-IgG 융합. D) GFP-IgG 융합 에서 긴 파 UV. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
도 6: 단백질 G 컬럼에 첨가되는 asGFP-IgG 추출물의 상수. A) 백색광 아래에 추가. B) 단파 UV 빛 아래에서 추가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
도 7: 단백질 G 수지 는 asGFP-IgG 추출물의 상부 후 단파 UV 빛 아래컬을 통해 컬럼을 통해 실행되었다. A) 단파 UV 빛 아래 단백질 G 수지. B) 낮은 PH 조건 하에서 단백질의 용출 시 단백질 G 수지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
도 8: 정제를 통해 낮은 pH 조건에 노출 후 얻은 asGFP-IgG의 정제 된 용출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 9
그림 9: 열 샘플의 SDS 페이지입니다. "R"로 표시된 샘플은 조건을 줄이고 "NR"으로 표시된 샘플은 감소되지 않는 조건에 있습니다. A) UV 빛 아래에서, 용출 2 NR 레인에서 볼 수 있듯이 10% 폴리 아크릴아미드 젤에서 비감소 시료만 형광을 합니다. 75 kDa와 25 kDa 사다리 밴드도 형광. B) 동일한 젤의 쿠마시 염색은 샘플에 있는 모든 단백질의 존재를 보여줍니다. 감소된 용출에서, 라이트 체인이 없는 IgG 융합, 헤비 체인, 라이트 체인 및 가능성이 저하된 GFP는 ~75 kDa, ~50 kDa, ~25kDa 및 ~10kDa에 각각 존재한다. 대조적으로, 감소되지 않은 에출리에서, 하나의 눈에 띄는 밴드가 존재하며, 전체 asGFP-IgG 융합(~200 kDa)의 크기와 일치한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

이러한 프로토콜은 N. 벤타미안 식물에서 생산되는 임의의 재조합 Ab 또는 재조합 단백질의 시각적 검증을 위해 활용될 수 있으며, 여기에는 열 정화목적42,43,44에대한 산성 환경에 일시적으로 노출이 필요한 단백질이 포함된다. 더욱이, 다른 발현 시스템에서 다른 단백질에 asGFP의 융합은 실험적인 시각화 및 교육을 위한 유용한 도구가 될 수 있다. 본 원에서 프로토콜은 재조합 단백질의 원하는 양을 생성하기 위해 더 크고 적은 양의 잎 물질로 확장될 수 있다. 설명된 방법은 산성 조건 하에서 안정적으로 유지되는 GFP의 버전을 확인하고 만든 이전 연구를활용(46). 포괄적인 사전 연구는 관심있는 단백질에 융합된 면역글로불린 도메인을 만들었습니다, 수시로 이 프로토콜은또한 28를수용할 수 있는 IgG-fusions에게 불린. GFP 및 asGFP에 융합된 인간화된 IgG1로 구성된 IgG-fusion을 생성하고 표현함으로써, 발현, 추출 및 정제 과정에서 원하는 단백질의 존재를 시각화할 수 있었습니다.

숙련 된 연구원이이 프로토콜을 따르는 경우 잎은 4-5 일 사이에 침투 부위에 괴사 징후를 표시하기 시작합니다. 그러나, 설명된 벡터를 사용하는 경우, 잎의 침투 부위는 적절한 주의를 기울여 5일까지 건강하게 나타나야 한다. 그 자체로 아그로박테리움 감염은 식물 세포 면역 반응의 일환으로 반응성 산소 종(ROS)의 축적으로 인해 식물 잎의 괴사를 초래할 것이라는 점에 유의하는 것이 중요하다51,52. 이러한 면역 반응 및 괴사의 결과 수준은 세포 표적화, 단백질의 위치, 생산되는 단백질의 종류, 발현 벡터 및 아그로박테리움의 균주를 포함하는 여러요인(51)에따라 달라질 수있으며, 53,54를사용했다. 또한, 침투에 사용되는 아그로박테리움의 광학 밀도(OD600)의변화는 괴사(55)의 수준에 영향을 미칠 수 있다. 많은 발현 벡터는 망막 모세포종 단백질을 결합하여 식물 세포를 합성 (S)-phase에 유지하고 세포 분열 및 변환 주파수56,57을증가시키는단백질을이용한다. 망막 모세포종 단백질에 결합에 의해 유발되는 단백질 생산의 증가는괴사(56,57)로이어질 수 있다. 이 프로토콜에 사용되는 쌍둥이 바이러스 BeYDV 레플리턴의 변형 된 버전에 사용되는 것과 같은 벡터 설계의 발전은 고단백 발현 수준을 유지하면서 괴사를최소화했습니다(58). 또한, BeYDV 레플리션은 비경쟁적이며, 알려진 크기 제한 없이 단일 카세트에 다중 단백질의 발현을제공한다53,59.

여러 가지 요인은 결국 낮은 단백질 수율로 이어질 수 있습니다 침투 전후 식물 성장에 영향을 미칩니다. 식물을 파종할 때, 식물 펠릿 당 너무 많은 씨앗은 더 겸손한 식물 성장으로 이어지는 많은 작은 식물 콩나물을 초래할 수 있습니다. 따라서, 토탄 펠릿 당 종자 수를 감소 하 고 일주일 후 여분의 새싹을 제거 더 나은 식물 성장 귀 착될 것 이다. 적절한 토양 수분을 유지하는 것은 전반적인 식물 건강에 영향을 미치는 또 다른 요소입니다. 과수, 수중, 너무 많거나 너무 적은 비료를 첨가하면 클로로시스에 기여하고 식물 건강60,61,62에영향을 줄 수 있습니다. 괴사와 클로로시스는 세포 스트레스를 유발하는 단백질의 생산에 의해 추가적으로 발생할 수 있습니다. 이러한 현상은 재조합 면역 복합체(RIC)56의발현과 함께 여러 번 볼 수 있다. 우리는 단백질 구조의 변화와 단백질의 융합이 괴사를 최소화하는 데 도움이 될 수 있음을 관찰했습니다. 그러나, 일부 단백질은 다양 한 수정 후에도 식물에 독성 남아 있습니다. 본 원에 설명된 발현 벡터를 사용하는 경우, 단백질의 추출은 중요한 괴사의 발병 전에 조기에 수행될 수 있으며, 그 결과 고단백수율(56).

다른 성장 조건 둔화 또는 심지어 Agrobacterium 성장을 억제 할 수 있습니다. 아그로박테리움은 28°C-30°C에서 최적으로 성장하고 30°C 이상으로 배양할 때 열 충격을 경험하여 세포 분열오차(62)를생성한다. 성장은 또한 다른 Agrobacterium 균주가 이 항생제62에다소 자연적으로 저항하기 때문에 너무 많은 리팜피신의 첨가에 의해 방해될 수 있다. 권장보다 OD600이 상당히 높은 침투를 위해 준비된 세균 배양은괴사(55)를유발할 가능성이 높다. 배양의 약간 더 높은 OD600은 일반적으로 수율에 영향을 미치지 않지만 0.1보다 낮으면 단백질 수율이 상당히 감소될 수 있습니다. 죽은 세포의 축적은 두 가지 상황에서 발생할 수 있습니다; 1) 배양은 자란, 죽은 세포인 OD의 상당한 부분으로 이어지는, 2) 화학 잔류물 또는 높은 원심 분리기 속도와 같은 성장 후 Agrobacterium을 손상 / 죽이는. 배양에서 죽은 세포의 증가를 사용하여 침투는 단백질 발현을 감소시킬 수 있습니다. 또한, 너무 많은 압력을 가하여 잎을 뚫는 것은 잎을 손상시킬 수 있으므로 조기 괴사로 이어질 수 있습니다. 니코티아나 벤타미안나에서재조합 단백질을 표현할 때 이러한 가능한 요인을 고려하면 단백질 생산이 향상될 수 있습니다.

낮은 단백질 수율을 얻는 것은 추출 및 정화 단계에 있는 몇몇 문제점 때문일 수 있었습니다. 첫째, 추출 버퍼는 관심있는 단백질에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다. 블렌딩 하는 동안, 식물 재료는 눈에 보이는 잎 조각 없이 균일 해야 합니다. 다음으로, 일부 단백질은 Tween-20 또는 트리톤과 같은 추출 완충제에서 용용화를 위한 세제를 필요로 한다. 다른 단백질은 용해화를 위해 고농도 ~7.5 M에서 우레아를 필요로 할 수 있으며, 일부는 PBS로만 추출할 수 있습니다. 단백질의 분해는 완충제, 식물 조직, 원심분리기 등이 추출 과정에서 시원하게 유지되지 않으면 발생할 수 있다. 추출 버퍼에서 프로테아제 억제제 및 나트륨 아스코르바테 또는 이와 유사한 화학 물질이 부족하면 분해 또는 응집을 일으킬 수도 있습니다. PMSF 와 같은 일부 프로테아제 억제제는 빠르게 저하되고, 나트륨 아스코르베테는 수성되기 위해 시간이 걸립니다. 전반적으로, 연구원은 관심있는 그들의 단백질을 위한 최적 조건을 결정해야 합니다.

IgG 융합의 정제에는 저단백질 수율을 얻을 경우 수정이 필요할 수 있는 몇 가지 단계가 포함됩니다. SDS-PAGE 및 Western에서 전체 프로세스 중에 수집된 샘플 알리쿼트를 분석하면 메서드의 결함을 식별하는 데 도움이 됩니다. 예를 들어, 흐름이 상당한 양의 단백질을 함유하는 경우, 단백질의 결합은 완충제의 pH를 변경하여 촉진될 수 있다. 추출 과정에서 고농도의 세제를 사용하면 수지의 결합 특성에 영향을 줄 수 있으며, 특히 수지가 여러 번 재사용되는 경우. 방법에 설명된 바와 같이 수지의 적절한 보관은 수지의 수명에 매우 중요합니다. 더욱이, 세척 단계가 수지로부터 관심있는 단백질을 제거하는 경우, 버퍼는이 문제를 해결하기 위해 다시 만들어야 할 수도 있습니다. 단백질 정제를 가진 그밖 문제점은 전반적인 단백질 디자인의 추가 분석이 필요할 지도 모르다 잘못 접히거나 저하된 단백질 때문일 지도 모릅니다. 설명된 트러블슈팅을 참조하면 이 프로토콜을 사용하여 정화의 효율이 높아질 수 있다.

설명된 GFP-IgG 융합 정화는 교육 환경에서 도움이 된다. 시각화는 학습자가 개념을 보다 쉽게 이해할 수 있기 때문에 과학 교육의기본입니다 39. 학생들은 종종 분자 수준39에서개념을 이해하는 어려움 뿐만 아니라 오해를 보고합니다. 특히, 각 단계에서 특정 단백질 위치를 이해해야 하는 실험은 형광 분자에 관심 있는 단백질을 태그하여 수정될 수 있다. 따라서, GFP 또는 asGFP는 사용되는 pH 환경에 따라, 학생들을 위한 단백질 정화 기술의 용해성을 용이하게 하기 위해 형광을 활용하는 데 활용될 수 있다.

요약하자면, 우리는 N. benthamiana 식물의 GFP에 융합된 재조합 Ab의 발현 및 정제를 위한 간단한 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 원하는 표적 단백질에 융합된 Ab의 정제를 위해 사용될 수 있다. 이 과정은 다양한 양의 잎 물질을 수용하도록 편집할 수 있으며 단백질 추출 및 정제 과정의 결론 전, 도중 및 정제 과정의 결론 이후에 단백질 존재의 시각적 판단을 허용합니다. 이러한 방법은 컨트롤로 유용할 수 있으며 기술을 가르치는 데 사용될 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

우리는 비디오를 편집 마리아 피아 디팔마 감사합니다. 우리는 또한 그들의 관대 한 출판 수수료 지원에 대한 애리조나 주립 대학의 교육 봉사 및 학생 서비스 사무실에 감사드립니다. 이 프로토콜에 대한 연구는 생명 과학 의 학교에 의해 지원되었다, 애리조나 주립 대학.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL syringe any N/A
50 mL syringe any N/A
Agar SIGMA-ALDRICH A5306
Blender with cups any N/A
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404
DTT (DL-Dithiothreitol) MP BIOMEDICALS 219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid SIGMA-ALDRICH E-6760
Ethanol any N/A
Glycerol G-Biosciences BTNM-0037
Glycine SIGMA-ALDRICH G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid) EMD MILLIPORE CORPORATION HX0603-4
Heating block any reputable supplier N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets Hummert International 14237000
Kanamycin Gold Biotechnology Inc K-120-100
KCl (Potassium Chloride) SIGMA-ALDRICH P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate) J.t.baker 3248-05
KOH (Potassium Hydroxide) VWR BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate SIGMA-ALDRICH M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) SIGMA-ALDRICH M8250
Miracloth Millipore 4 75855-1R
Moisture control potting mix Miracle-Gro 755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate) J.t.baker 3827-01
NaCl (Sodium Chloride) Santa Cruz Biotechnology sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds any reputable supplier N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) G-Biosciences 786-787
Polypropylene Column any N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 1610394
Protein G resin Thermo Fisher Scientific 20399
Rifampicin Gold Biotechnology Inc R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) G-Biosciences DG093
Sodium Ascorbate SIGMA-ALDRICH A7631-500G
Spectrophotometer any reputable supplier N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter ThermoScientific 40725-GM
Tray for peat pellets with dome any N/A
TRIS Base J.t.baker 4109-02
Tris-HCl Amresco M108-1KG
Tryptone SIGMA-ALDRICH 17221
UV lamp any N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2000992
Yeast extract SIGMA-ALDRICH 9182

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
  2. Kaplon, H., Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2019. mAbs. 11 (2), 219-238 (2019).
  3. The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePharma. , Available from: https://www.fiercepharma.com/special-report/top-20-drugs-by-2018-u-s-sales (2018).
  4. Grilo, A. L., Mantalaris, A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends in Biotechnology. 37 (1), 9-16 (2019).
  5. Kim, M. -Y., et al. Novel vaccination approach for dengue infection based on recombinant immune complex universal platform. Vaccine. 33 (15), 1830-1838 (2015).
  6. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Transgenic plants in the biopharmaceutical market. Expert Opinion on Emerging Drugs. 10 (1), 185-218 (2005).
  7. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. -C. Plant Molecular Pharming for the Treatment of Chronic and Infectious Diseases. Annual Review of Plant Biology. 65 (1), 743-768 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and Bioengineering. 109 (10), 2575-2588 (2012).
  9. Yao, J., Weng, Y., Dickey, A., Wang, K. Y. Plants as factories for human pharmaceuticals: Applications and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28549-28565 (2015).
  10. Mor, T. S., Moon, Y. -S., Palmer, K. E., Mason, H. S. Geminivirus vectors for high-level expression of foreign proteins in plant cells. Biotechnology and Bioengineering. 81 (4), 430-437 (2003).
  11. Hefferon, K. L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology. 433 (1), 1-6 (2012).
  12. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Scientific Reports. 8 (1), 4755 (2018).
  13. Zhong, G. Y., et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Molecular Breeding. 5 (4), 345-356 (1999).
  14. Giddings, G., Allison, G., Brooks, D., Carter, A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 18 (11), 1151-1155 (2000).
  15. Fulton, A., Lai, H., Chen, Q., Zhang, C. Purification of monoclonal antibody against Ebola GP1 protein expressed in Nicotiana benthamiana. Journal of Chromatography A. 1389, 128-132 (2015).
  16. Diamos, A., et al. A highly expressing, soluble, and stable plant-made IgG fusion carrying Zika virus envelope domain III elicits potent immunogenic responses in mice without adjuvant. Frontiers in immunology. 3140 (11), (2020).
  17. Hunter, J. G. L., et al. Evaluation of a toxoid fusion protein vaccine produced in plants to protect poultry against necrotic enteritis. PeerJ. 2019 (3), 6600 (2019).
  18. Dent, M., et al. Plant-produced anti-dengue virus monoclonal antibodies exhibit reduced antibody-dependent enhancement of infection activity. Journal of General Virology. 97 (12), 3280-3290 (2016).
  19. Diamos, A. G., et al. High Level Production of Monoclonal Antibodies Using an Optimized Plant Expression System. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 472 (2020).
  20. Olinger, G. G., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 18030-18035 (2012).
  21. Mastrangeli, R., Palinsky, W., Bierau, H. Glycoengineered antibodies: towards the next-generation of immunotherapeutics. Glycobiology. 29 (3), 199-210 (2019).
  22. Montero-Morales, L., Steinkellner, H. Advanced Plant-Based Glycan Engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 81 (2018).
  23. Joosten, V., Lokman, C., vanden Hondel, C. A. M. J. J., Punt, P. J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 2 (1), 1-15 (2003).
  24. Müller, D. Antibody fusions with immunomodulatory proteins for cancer therapy. Pharmacology and Therapeutics. 154, 57-66 (2015).
  25. Bootz, F., Neri, D. Immunocytokines: A novel class of products for the treatment of chronic inflammation and autoimmune conditions. Drug Discovery Today. 21 (1), 180-189 (2016).
  26. Jafari, R., Zolbanin, N. M., Rafatpanah, H., Majidi, J., Kazemi, T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 24 (12), (2017).
  27. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. mAbs. 9 (2), 182-212 (2017).
  28. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  29. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  30. Diamos, A. G., et al. Vaccine synergy with virus-like particle and immune complex platforms for delivery of human papillomavirus L2 antigen. Vaccine. 37 (1), 137-144 (2019).
  31. Diamos, A. G., et al. Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity. Vaccine. 38 (18), 3455-3463 (2020).
  32. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  33. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  34. Palm, M., Baumstark-Khan, C., Horneck, G. Green Fluorescent Protein (GFP) Expression in Mammalian Cells After UV-Irradiation. Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation. , 311-316 (1999).
  35. Paemeleire, K., et al. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26. Molecular Biology of the Cell. 11 (5), 1815-1827 (2000).
  36. Harper, B. K., Stewart, C. N. Patterns of Green Fluorescent Protein Expression in Transgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 18 (2), 141 (2000).
  37. Kaishima, M., Ishii, J., Matsuno, T., Fukuda, N., Kondo, A. Expression of varied GFPs in Saccharomyces cerevisiae: Codon optimization yields stronger than expected expression and fluorescence intensity. Scientific Reports. 6, (2016).
  38. Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21772029/ (2020).
  39. Mnguni, L. E. The theoretical cognitive process of visualization for science education. SpringerPlus. 3 (1), 1-9 (2014).
  40. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  41. Bjorck, L., Kronvall, G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-Binding reagent. The Journal of Immunology. 133 (2), (1984).
  42. Andrew, S. M., Titus, J. A. Purification of Immunoglobulin G. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 1-12 (2001).
  43. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 848 (1), 40-47 (2007).
  44. Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Björck, L., Mariani, M. Recombinant proteins L and LG: efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 668 (2), 209-218 (1995).
  45. Shinoda, H., Ma, Y., Nakashima, R., Sakurai, K., Matsuda, T., Nagai, T. Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa. Cell Chemical Biology. 25 (3), 330-338 (2018).
  46. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  47. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  48. Mahmood, T., Western Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  49. Vessoni Penna, T. C., Ishii, M., Cholewa, O., de Souza, L. C. Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted from Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 38 (2), 135-139 (2004).
  50. Kang, S. J., Park, E. A., Lee, D. H., Hong, K. W. Comparison of the stability of eGFP displayed on the Bacillus subtilis spore surface using CotB and C-terminally truncated CotB proteins as an anchoring motif under extreme conditions. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 41 (2019).
  51. Kuta, D. D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4 (8), 752-757 (2005).
  52. Qiusheng, Z., Bao, J., Likun, L., Xianhua, X. Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea) explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (1), 83-90 (2005).
  53. Diamos, A. G., Rosenthal, S. H., Mason, H. S. H.S. 5' and 3' Untranslated Regions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 7, 200 (2016).
  54. Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 706-714 (2009).
  55. Diamos, A. G., Mason, H. S. Modifying the Replication of Geminiviral Vectors Reduces Cell Death and Enhances Expression of Biopharmaceutical Proteins in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 9, 1974 (2019).
  56. Gordon-Kamm, W., et al. Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11975-11980 (2002).
  57. Villemont, E., Dubois, F., Sangwan, R. S., Vasseur, G., Bourgeois, Y., Sangwan-Norreel, B. S. Role of the host cell cycle in the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Petunia: Evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta. 201 (2), 160-172 (1997).
  58. Regnard, G. L., Halley-Stott, R. P., Tanzer, F. L., Hitzeroth, I. I., Rybicki, E. P. High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector. Plant Biotechnology Journal. 8 (1), 38-46 (2010).
  59. Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Human Vaccines. 7 (3), 331-338 (2011).
  60. Morton, T. G., Gold, A. J., Sullivan, W. M. Influence of Overwatering and Fertilization on Nitrogen Losses from Home Lawns. Journal of Environmental Quality. 17 (1), 124-130 (1988).
  61. Brown, J. C. Iron Chlorosis in Plants. Advances in Agronomy. 13, 329-369 (1961).
  62. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory Maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , CHAPTER, Unit3D.1 (2012).

Tags

생물학 제167 항체 단일클론 항체 분자 파밍 농약침투 일시적인 발현 니코티아나 벤타미안,녹색 형광 단백질 산안정녹색 형광단백질 항체 융합 IgG 융합 단백질 G 정제
<em>니코티아나 벤타미안나에서</em> 과도하게 표현된 IgG 융합 단백질의 생산
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kamzina, A. S., DiPalma, M. P.,… More

Kamzina, A. S., DiPalma, M. P., Hunter, J. G. L., Diamos, A. G., Armer, B., Mor, T. S., Mason, H. S. Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana. J. Vis. Exp. (167), e61774, doi:10.3791/61774 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter