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Developmental Biology

早期果蝇胚胎内免疫组织化学和RNA原位分布的方案

Published: May 6, 2022 doi: 10.3791/61776
Automatic Translation
*1, *1, *2,3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,4, 1, 5, 6, 7, 3, 1
1National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China/CGDB, Shaanxi Normal University College of Life Sciences, 2Shaanxi Key Laboratory of Ischemic Cardiovascular Disease, Shaanxi Key Laboratory of Brain disorders, Institute of Basic & Translational Medicine, Xi'an Medical University, 3Ohio State University College of Medicine, 4Hematology-Oncology Division, Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 5University of Pennsylvania ULAR, 6University of Maryland School of Medicine, 7Columbia University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

在这里，我们描述了果 蝇 胚胎蛋白和RNA的检测和定位方案，从收集到预包埋和包埋，免疫染色和mRNA 原位 杂交。

Abstract

钙诱导钙释放信号传导（CICR）在许多生物过程中起着关键作用。从细胞增殖和凋亡，发育和衰老到神经元突触可塑性和再生的每一个细胞活动都与Ryanodine受体（RyRs）有关。尽管钙信号传导的重要性，但其功能在早期发育中的确切机制尚不清楚。作为一种妊娠期较短的生物体，黑 腹果蝇 的胚胎是研究CICR相关蛋白及其调节剂在发育过程中的分布和定位的主要研究对象。然而，由于它们的富含脂质的胚胎和富含几丁质的绒毛膜，它们的实用性受到将胚胎安装在玻璃表面上的难度的限制。在这项工作中，我们引入了一种实用的方案，可显着增强 果蝇 胚胎在载玻片上的附着力，并详细介绍了成功组织化学，免疫组织化学和 原位 杂交的方法。铬明矾明胶造布法和胚胎预包埋法大大提高了 果蝇 胚胎蛋白和RNA表达研究的产量。为了证明这种方法，我们研究了DmFKBP12 / Calstabin，这是黑 腹果蝇早期胚胎发育期间RyR的着名调节因子。我们早在合胞胚芽孢子阶段就鉴定了 DmFKBP12 ，并报告了 DmFKBP12 在发育过程中的动态表达模式：最初作为合胞体胚层中均匀分布的蛋白质，然后在细胞胚泡期间初步定位到皮层的基底层，然后在早期原肠胚形成的三宝石层阶段分布在原始神经元和消化结构中。这种分布可以解释RyR在起源于这些层的重要器官系统中的关键作用：食管下和食管上神经节，腹侧神经系统和肌肉骨骼系统。

Introduction

钙诱导钙释放信号传导（CICR）在许多生物过程中起着至关重要的作用，例如骨骼肌/平滑肌和心脏血管功能，细胞增殖和凋亡，发育，衰老，神经元突触可塑性和再生1，2，3，4，5，6.Ryanodine受体（RyRs）和肌醇1，4，5-三磷酸受体（IP3Rs）是由其调节蛋白激酶A（PKA），Ca2 +/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII），FK506结合蛋白（FKBPs），钙马蛋白（CSQ），三星素和junctin1，2，3，4，5，6控制的钙信号通路中的主要参与者.这些蛋白质的异常人类表达和突变可导致病理生理学，如心律失常7和致癌增殖8，9。

FKBPs通过RyR调节内质网状（ER）的钙释放。该过程对于收缩机制至关重要，因此负责肌球蛋白收缩通过钙诱导的钙释放以及胚胎RyRs1，2产生的所有机械运动。在小鼠模型中，缺乏RyR2及其调节因子FKBP12 / Calstabin总是致命的，无论是在胚胎发育期间还是在产后早期10，11，12。FKBP12 / Calstabin敲除小鼠在胚胎发育过程中表现出严重的心脏缺陷，具有不规则的兴奋 - 收缩耦合（EC）和脑水肿。这表明FKBP12 / Calstabin在调节RyR2通道表达中起着至关重要的作用，这对心脏和大脑发育都很重要10。

RyR传导的钙火花最初是在受精的Medaka卵的受精卵形成阶段发现的13，14。然而，对钙信号传导在早期胚胎发育中的作用的研究很少。在 黑色果蝇中，从 DmFKBP12 S107突变体获得的结果提供了强有力的证据，支持该基因对幼虫发育和健康寿命的重要性，这归因于其对抗氧化应激的功能15，16。最近，我们确定了 FKBP12 / Calstabin 蛋白和信使RNA在早期 果蝇黑色素胃发育 过程中的动态定位17。使用该方法中描述的方法，我们能够在合胞体胚芽孢子虫（0-2小时），细胞胚芽肿（2-3小时），早期胃肠（3-12小时）和晚期胃肠炎（12-24小时）期间跟踪D . melanogaster 中FKBP12 / Calstabin的表达。在本文中，我们介绍了先前研究中每种方法的详细方案，包括用于经典石蜡切片的胚胎前包埋，用于胚胎切片的预包衣载玻片处理，组织化学染色和免疫染色以及用于鉴定基因表达的mRNA 原位 杂交。

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Protocol

1. 葡萄汁琼脂平板的制备

  1. 将5克琼脂和5克蔗糖加入150毫升蒸馏水中。用微波炉煮沸，直到琼脂和蔗糖完全溶解。将 50 mL 100% 葡萄汁和溶液混合在一起。
  2. 加入1 mL 100%丙酸，使最终浓度为0.5%丙酸。将25mL准备好的溶液倒入每个板中。琼脂凝固后，将培养基储存在4°C。

2. 涂布载玻片

  1. 用洗涤剂预处理载玻片。用自来水清洗载玻片3次，用蒸馏水清洗一次。然后将载玻片在45°C的烤箱中干燥2小时。
  2. 将载玻片浸入约450mL重铬酸钾硫酸溶液（20g重铬酸钾，40mL蒸馏水和400mL浓硫酸）24小时。用自来水清洗载玻片3次，用蒸馏水清洗一次。
    1. 将载玻片在45°C的烤箱中干燥两小时。浸入95%乙醇中超过2小时。
  3. 将0.5克硫酸铬钾和5克明胶加入1升蒸馏水中。使用前溶解在60°C水浴中。铬明矾明胶可以在4°C下长时间储存。
  4. 将10μL铬明矾明胶滴在载玻片上，并用溶液完全均匀地覆盖载玻片的整个表面。将带有明胶面的载玻片放在42°C的烘箱中48小时。准备好的载玻片可以储存在4°C供以后使用。
    注意：这是一个关键步骤。完整的涂层是必要的。对于果蝇及其胚胎，这种载玻片包衣方法似乎比聚赖氨酸包衣更有效。

3. 果蝇 胚胎嵌入

  1. 果蝇 胚胎采集
    注意：我们在四个周期内收集了 果蝇 胚胎，分别为0-2小时（合胞胚芽），2-3小时（细胞胚芽），3-12小时（早期胃痉挛）和12-24小时（晚期胃肠）18。每个时期主要胚胎类型的比例如 表1所示。
    1. 将400-500只苍蝇放入塑料收集瓶中，并用含有酵母提取物的葡萄汁琼脂平板盖住瓶子。 果蝇 胚胎在室温下产在葡萄汁琼脂上。
    2. 收集四个周期的胚胎，轻轻地向每个板中加入2mL PBS（137mM NaCl，2.7mM KCL，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH 7.4）以漂浮胚胎。将约200个胚胎转移到50mL离心管中，并将其保持在冰上2分钟以稳定胚胎。
  2. 预嵌入
    1. 将200个 果蝇 胚胎转移到1.5mL离心管中。将管子放在冰上2分钟以沉降胚胎，然后用移液管小心地丢弃上清液。在管中加入1毫升50%漂白剂，轻轻摇晃2分钟。
      注意：漂白剂应该新鲜制备，漂白剂的量可能会根据收集的胚胎量而变化。
    2. 通过倒在滤纸上轻轻收集胚胎，每次用1毫升PBS洗涤3次。
    3. 用滤纸将胚胎转移到约5 mL正庚烷中。
    4. 将混合物转移到新鲜的1.5mL离心管中。加入1毫升甲醇，轻轻摇匀。沉淀后收集胚胎。
    5. 取出上清液，在1毫升PBS中洗涤胚胎3-5次。
    6. 用400μL布恩溶液（71%饱和苦味酸，24%福尔马林，5%乙酸）固定胚胎30分钟。将固定的胚胎在1毫升PBS中洗涤3次，每次5分钟。
    7. 要聚集胚胎，将样品转移到橡胶塞中并取出PBS。
    8. 准备1.2%琼脂糖-PBS溶液，并将溶液保持在60°C。 将200μL1.2%琼脂糖-PBS溶液加入胚胎中，以将其固定到琼脂块中。
    9. 从塞子中取出块，并将块存储在PBS中。
      注意：在预嵌入方法中，亲变暖是成功的关键。我们强烈建议，本步骤中将要使用的离心管和微量移液器吸头在操作前应完全预热。
  3. 石蜡包埋
    1. 将预包埋的琼脂块浸入35%乙醇，50%乙醇，75%乙醇和85%乙醇中各15分钟。然后在95%乙醇和100%乙醇中浸入2次。
      注意：根据块中的胚胎数量，每个块的块体积约为5-10倍，然后使用分级固定剂15-30分钟是必要的。
    2. 将胚胎块浸入100%乙醇和二甲苯（1：1比例）溶液中15分钟。
    3. 将块转移到二甲苯1分钟以使胚胎组织透明。
    4. 将块浸没在二甲苯和石蜡（1：1比例）中30分钟。
    5. 每次将块浸没在石蜡I，石蜡II和石蜡III中2小时。
    6. 事先用石蜡填充嵌入盒，然后轻轻地水平将块转移到嵌入框的底部。石蜡自然固化后，固化后的石蜡块可以储存在4°C。
      注：预包埋样品可按照以下步骤用于冷冻切片。如上所述，将胚胎预先包埋琼脂糖后，将样品简单地包埋在OCT化合物中。之后，可以根据常规冷冻切除方案进行冷冻切除。随后，可以在切片上使用常规染色方法。

4. 血氧菌素-曙红染色

  1. 准备 果蝇 胚胎切片。将准备好的部分置于60°C的烘箱中15分钟，然后将切片浸没在二甲苯中2次，每次10分钟。将切片浸没在100%乙醇和二甲苯（1：1比例）中一次2分钟。
  2. 在100%乙醇I，100%乙醇II，95%乙醇，85%乙醇，75%乙醇，50%乙醇和蒸馏水中水合切片3分钟。
  3. 用苏木精溶液染色切片2分钟。将载玻片快速浸入1%酸醇溶液（1mL盐酸，100mL 70%乙醇）中，并在蒸馏水中洗涤载玻片。
  4. 将载玻片依次浸入 50% 乙醇、75% 乙醇、85% 乙醇和 95% 乙醇中。
  5. 用曙红溶液染色切片1分钟。
  6. 载玻片在95%乙醇I，95%乙醇II，95%乙醇III，100%乙醇I，100%乙醇II和100%乙醇III中每次脱水1分钟。
  7. 每次在100%二甲苯I，100%二甲苯II和100%二甲苯III中清除载玻片5分钟。
  8. 根据制造商的说明，用中性香脂安装载玻片。

5. 甲基嶦胺酸银染色

  1. 将 果蝇 胚胎的石蜡部分脱蜡并水合到蒸馏水中。
  2. 在室温下用1%的元素酸氧化切片15分钟。
  3. 用蒸馏水冲洗载玻片3次，每次1分钟。
  4. 将载玻片在约40mL新鲜过滤的甲基安非他明银工作溶液（3%甲基苯胺，5%硝酸银，5%硼酸钠溶液）中孵育1小时，并在60°C下孵育20分钟。 然后在蒸馏水中冲洗载玻片1分钟。
  5. 用0.2%氯化金调理载玻片2分钟，然后在蒸馏水中冲洗载玻片1分钟。
  6. 将载玻片置于3%硫代硫酸钠中3分钟，然后在蒸馏水中冲洗载玻片1分钟。
  7. 在苏木精中复刻玻片30秒。在流动的自来水中洗涤载玻片3-5分钟。
  8. 载玻片在70%乙醇，80%乙醇，95%乙醇I，95%乙醇II，95%乙醇III，100%乙醇I和100%乙醇II中分别脱水5分钟。
  9. 在100%二甲苯I，100%二甲苯II和100%二甲苯III中分别清除载玻片5分钟。
  10. 根据制造商的说明将载玻片安装在中性香脂中。

6. 免疫组化

  1. 按照标准方案将果蝇胚胎的石蜡部分脱蜡并重新水合到PBS19。
  2. 在室温下用0.3%H 2O 2 在甲醇中处理载玻片10分钟，避免光照。
  3. 在蔬菜蒸笼中带有载玻片的容器中预热适当的抗原检索缓冲液至约100°C。容器还应有盖子。将幻灯片放入容器中。合上蒸笼盖。
    1. 从这一点开始，将容器放在蒸笼中20分钟。请注意，滑动容器的盖子不应完全拧紧，以免水蒸气在蒸煮过程中进入。
  4. 让载玻片恢复到室温，然后在PBS-T（PBS与吐温-20，pH 7.2）中轻轻冲洗3次，每次5分钟，然后用PBS冲洗载玻片3次，每次1分钟。
  5. 在室温下用PBS中的1%牛血清白蛋白（BSA）阻断载玻片60分钟。
  6. 用一抗（1：1000的抗FKBP12）在4°C或室温下孵育载玻片过夜4小时。
  7. 用PBS-T洗涤载玻片4次，每次5分钟。
  8. 在室温下用HRP标记的聚合物与二抗（抗兔，1：5，000）偶联的载玻片应用载玻片90分钟。在黑暗中这样做，以避免照片漂白。
  9. 用PBS-T洗涤载玻片3次，每次5分钟。
  10. 用5%的3，3'-二氨基联苯胺-四盐酸盐（DAB）孵育载玻片2-10分钟，直到反应产物的颜色在显微镜下合适。
  11. 将载玻片在苏木精中复染30秒，并在蒸馏水中洗涤载玻片2次，每次5分钟。
  12. 载玻片在50%乙醇，70%乙醇，90%乙醇，95%乙醇和100%乙醇中脱水1分钟。
  13. 在100%二甲苯I，100%二甲苯II和100%二甲苯III中分别清除载玻片5分钟。
  14. 根据制造商的说明将载玻片安装在中性香脂中。

7. 原位 杂交

注意： 果蝇 胚胎切片是用0.01%焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水制备的。所有用于 原位 杂交的配件均需提前进行DEPC过夜处理。

  1. 核糖探针制剂
    1. 通过使用产生5'悬垂的限制性内切酶，在克隆插入片段下游的限制性内切酶位点，线性化模板DNA。线性化后，通过苯酚/氯仿提取纯化模板DNA，然后进行乙醇沉淀。使用标准协议。
    2. 将1μg纯化的模板DNA加入无RNase离心管中。将离心管放在冰上。向总体积13μL中加入足够的DEPC处理水。
      1. 然后按顺序加入以下试剂：2 μL 10x NTP标记混合物，2 μL 10x转录缓冲液，1 μL保护剂RNase抑制剂，2 μL RNA聚合酶SP6或RNA聚合酶T7。
    3. 通过移液和离心机混合反应。在37°C下孵育2小时。
      注意：较长的孵育不会增加标记RNA的产量。在继续下一步之前，在反应管上施加短旋转（约800 rpm）是至关重要的。这种旋转将允许所有可能从孵育中产生的内容物到达管的底部。
    4. 加入2μL不含RNase的DNase I以除去模板DNA并在37°C下孵育15分钟。
    5. 加入2μL200mM EDTA（pH 8.0）以停止反应。
      注意：DIG标记的RNA探针可以在-15至-25°C的乙醇中储存一年。
  2. 果蝇胚胎切片的预杂交
    1. 将 果蝇 胚胎切片置于42°C的烘箱中48小时。
    2. 将载玻片在100%二甲苯中脱蜡两次10分钟。
    3. 通过依次浸没在100%乙醇，95%乙醇，90%乙醇，70%乙醇和50%乙醇中5分钟来水合载玻片。
    4. 将载玻片在PBS中孵育5分钟3次，以从组织中除去固定溶液/ Bouin溶液。
    5. 用100 mmol / L甘氨酸/ PBS溶液洗涤载玻片2次，每次5分钟。
    6. 用PBS清洗载玻片2次，每次5分钟。
    7. 将载玻片与0.3%Triton X-100在PBS中孵育15分钟以透化膜。
    8. 用PBS清洗载玻片3次，每次5分钟。
    9. 将载玻片在15μg/ mL不含RNase的蛋白酶K中孵育30分钟，在37°C下。
    10. 将载玻片与4%多聚甲醛在PBS中孵育3分钟以停止消化。
    11. 用PBS清洗载玻片2次，每次5分钟。
    12. 将载玻片孵育在100 mM三乙醇胺缓冲液（pH 8.0）中，其中0.25%（v / v）乙酸酐2次，每次5分钟。
    13. 将DEPC水加入玻片水分室。在载玻片上加入20μL预杂交溶液（含有100μg/ mL鲑鱼精子DNA）。将载玻片放入载玻片水分室。将载玻片在42°C孵育4小时。
      注意：有必要确保湿盒盖的密封性，并且湿盒始终保持水平，以防止挥发和偏离预杂交溶液和随后杂交溶液的组织。
  3. 果蝇胚胎切片的杂交
    1. 除去预杂交溶液，并用0.2x SSC（150mM氯化钠，15mM柠檬酸钠，pH 7.0）洗涤载玻片3次，每次5分钟。擦去组织样本周围多余的0.2倍SSC。
    2. 用移液管将30μL探针杂交溶液（通过在预杂交溶液中稀释，含有2-6ng地高辛标记的RNA探针）。将载玻片在载玻片水分室中孵育42°C约20小时。
      注意：确保将盖子紧固作为最后一个音符的建议。否则，由预杂交或预杂交泄漏引起的干涸将产生肮脏的背景，包括幻灯片中的伪阳性。
  4. 杂交
    1. 除去杂交溶液并用4x SSC溶液洗涤载玻片4次，每次15分钟，每次37°C。
    2. 在2x SSC溶液中用20μg/ mL的RNase A在37°C下洗涤载玻片30分钟。
    3. 在37°C下将载玻片在1x SSC溶液中洗涤15分钟。
    4. 在37°C下将载玻片在0.5x SSC溶液中洗涤15分钟。
    5. 在37°C下将载玻片在0.1x SSC溶液中洗涤15分钟。
    6. 用PBS清洗载玻片3次，每次5分钟。
    7. 在洗涤缓冲液（100 mM马来酸，150mM NaCl，0.3%（v / v）吐温20，pH 7.5）中洗涤载玻片1分钟。
    8. 将载玻片在100mL新鲜制备的封闭溶液（2%绵羊血清在不含吐温20的马来酸缓冲液中）孵育30分钟。
    9. 将载玻片在20mL抗体溶液中孵育45分钟。
      1. 每次使用前，在原始小瓶中以10，000rpm离心抗体5分钟，并从表面小心地移液必要的量。在封闭溶液中稀释抗地高辛-AP 1：5000（150 mU / mL）。
    10. 将载玻片放入100mL洗涤缓冲液中洗涤2次，每次15分钟，以除去未结合的抗体偶联物。
    11. 将载玻片在20 mL检测缓冲液（100 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，pH 9.5）中平衡2-5分钟。
    12. 在载玻片水分室中用10 mL新鲜制备的彩色底物溶液孵育载玻片。反应在几分钟内开始，并在16小时后完成。在显色时不要摇晃或混合。
    13. 用50mL蒸馏水洗涤载玻片5分钟以停止反应。
    14. 将样品在黑暗中干燥过夜。
    15. 载玻片在70%乙醇，80%乙醇，90%乙醇，95%乙醇，100%乙醇I和100%乙醇II中分别脱水3分钟。
    16. 在100%二甲苯I，100%二甲苯II和100%二甲苯III中分别清除载玻片20分钟。
    17. 用中性香脂安装载玻片。
    18. 使用倒置显微镜和制造商软件记录图像并进行分析。使用ImageJ根据沿纵轴或胚胎差异区内的阳性信号密度进行分布分析。
      注意：在步骤7.4.12中用新鲜制备的彩色底物溶液孵育期间，即使用裸眼也可以看到反应颜色。关于如何在立体镜下检查显色的观察结果。一旦反应颜色合理，步骤7.4.13即可停止反应。

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Representative Results

这些数字描述了用于克服将高脂质和含甲壳素的绒毛膜 果蝇 胚胎（表1）附着到载玻片表面进行检查和实验的挑战的方案。利用 图1所示的铬明矾明胶载玻片包衣方法，我们增强了 果蝇 胚胎在载玻片表面的附着力，而 图2 所示的胚胎预包埋方法可以有效地检查蛋白质和RNA DmFKBP12 / Calstabin在所有四个早期发育阶段（即合胞胚芽，细胞胚芽肿， 果 蝇胚胎的早期和晚期胃痉挛）。 图3 显示了在合胞体和细胞胚芽阶段检测到的抗体FKBP12 / Calstabin的蛋白质分布。从这些组织化学结果中可以看出，FKBP12表达在合胞体胚泡（图A至H）中的极化较少，然后开始在滋养外胚层上皮下方的基底膜内定位于梯度内，形成梯度，在前极比后极（图I至S）中发现更多的表达。最终，DmFKBP12 / Calstabin蛋白被限制在原始胚胎组织的某些结构成分中，其细胞外分布小于在早期和晚期胃胚期观察到的成分（图4）。有趣的是，上述动态蛋白质分布没有伴随 DmFKBP12 的相应mRNA水平（图5），表明蛋白质表达是转录后分子机制尚不清楚的结果。所描述的CAG载玻片包衣和预包埋方法将使我们能够进一步探索 DmFKBP12 在钙信号传导中的重要性，并挖掘出这种仍然未知的分子机制，同时结合其他技术，如微注射RNA干扰19。

在本研究中，我们开发了一种铬明矾明胶载玻片包衣和预包埋方法，用于不同发育阶段 果蝇 胚胎的组织学，组织化学和免疫组织学分析。使用这种预包埋方法，可以有效地收集胚胎以进行冷冻和石蜡切片，从而可以分析纵向横截面。这使我们能够描述这种蛋白质在决定性发育阶段的进化表达模式，将蛋白质的表达与关键生理系统（如肠道，大脑和连接神经系统）的发育联系起来。通过采用这些方法，我们能够在 果蝇 胚胎发育期间研究RyR调节蛋白和mRNA FKBP12 / Calstabin在确定阶段的动态分布，包括合胞体和细胞胚芽，以及早期和晚期原肠胚形成阶段。我们的数据显示，FKBP12 / Calstabin蛋白及其RNA可以在合胞胚芽孢子虫中非常早期地检测到。随着胚胎的发育，FKBP12在胚芽孢子上皮下方的基底细胞层中变得更加密集。然后，FKBP12 / Calstabin蛋白动态增强其表达并将其分布区分为胚胎含肌肉的组织，包括造口，造口和后中肠初级。从胚芽孢子开始到晚期原肠胚形成阶段的这些分布变化也在发育中的神经元系统中描述，包括神经母细胞，腹侧神经，食管上神经节和脑。虽然FKBP12 / Calstabin中的这些动态变化暗示了其在发育中的重要性，但它们并没有反映在蛋白质的mRNA水平中，暗示了尚未确定的蛋白质表达调节因子。

Figure 1
图1：用于免疫学和RNA原位杂交的石蜡切片的铬明胶（CAG）包衣方法的草图，以可视化果蝇胚胎中DmFKBP12蛋白和mRNA的分布。请单击此处查看该图的放大版本。

Figure 2
图2： FKBP12和DmFKBP12 在果 蝇 胚胎发育中的表达谱的预包埋方法草图。 请单击此处查看此图的放大版本。

Figure 3
图3：DmFKBP12蛋白在果蝇胚胎的合胞体和细胞胚芽中的表达谱。 （A-D）合胞体胚芽肿的H&E染色。早期合胞体胚芽肿中DmFKBP12分布的定量在D.（E-G）面板中呈现，其中细胞核处于分裂状态。在H中给出了晚期合胞胚芽肿中DmFKBP12分布的定量。（I-L）细胞胚泡的H&E染色。晚期细胞胚芽中DmFKBP12分布的鉴定在L.（M-S）面板中表现出DmFKBP12蛋白在细胞胚芽中的分布。O 显示 M-N 的较大视图。（P-R）显示早期细胞胚泡的面板显示在M-O中。早期细胞胚芽中DmFKBP12分布的定量在S中呈现.A，E，I，M和P的比例尺为60μm，B，C，F，J，K，N，Q和R为40μm，G，O为20μm。YK，蛋黄;CN，裂解核;PP，蛋的后极;BLD，胚芽细胞，细胞核和细胞;BM，基底膜。± * p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001 表示 。数据量化是用ImageJ进行的。首先，棕色产品保留在图像中，并删除了所有其他颜色。其次，将棕色图像改为黑白，并计算其密度以进行定量。请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 4
图4：DmFKBP12蛋白在 果蝇 胚胎 早期和晚期原肠胚期的表达谱。A， D 和 G 显示了果蝇胚胎在原肠胚形成阶段的H&E染色。 B、 C、 E 和 F 显示了DmFKBP12在早期原肠胚形成阶段的分布。 H、 I和 J-L 显示了DmFKBP12在原肠胚增生晚期的分布。早期胃瓜中DmFKBP12分布的定量在M中呈现. A， D， E 和 G 的比例尺为80μm， B， C， F， H， I 和 J-L 为40μm。NBL，神经母细胞;ST， stomodaeum;YK，蛋黄;PMG，后中肠初级;BR，脑，食管上神经节;VNS，腹侧神经系统;PV， Proventriculus;肌肉，肌肉;MGC，中肠盲肠;AMG，前中肠鲁迪皮吉安;MMG，中肠;TR，气管。数据表示为平均值±SEM.ns，无显著性;** p < 0.01， *** p < 0.001。使用ImageJ 1.50d进行数据量化，方法是保留产品棕色并更改为黑白图像，然后按照上图例中所述进行黑白密度计算。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 5
图5：果蝇胚胎发育过程中DmFKBP12 mRNA的原位定位。A显示了当FKBP12 mRNA在胚胎细胞质中表达时，DmFKBP12 mRNA在合胞胚芽细胞阶段的原位定位。B和C在细胞胚芽细胞阶段显示DmFKBP12 mRNA的原位定位，当FKBP12 mRNA在胚芽细胞的内限中表达时。D和E在早期原肠胚形成阶段表现出FKBP12 mRNA的原位定位。在这个阶段，它主要局限于发育中的肠道。F，G和H在原肠胚形成晚期显示FKBP12 mRNA的原位定位，当mRNA在肌肉和肠道中表达时。I是DmFKBP12 mRNA的阳性对照。J是DmFKBP12 mRNA的阴性对照。A，C，E，G和I的比例尺为5μm，B，D，F，I和J的比例尺为10μm。CN，裂解核;BLD，胚芽细胞，细胞核和细胞;CF，前斜裂，头沟。请点击此处查看此图的放大版本。

胚胎阶段 0-2小时 （%） 2-3小时 （%） 3-12小时 （%） 12-24小时 （%）
合胞体胚芽肿 90.8 0 0 0
细胞胚泡 6.9 91.54 0 0
早期胃肠 2.3 4.23 91.1 0
晚期胃肠 0 4.23 8.93 93.3

表1：黑腹果蝇发育不同阶段的胚胎收集

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Discussion

RyRs和IP3Rs介导的钙信号传导是脊椎动物和无脊椎动物许多生理和病理过程的基本途径1，2，3，4。在人类中，RyR2基因中的点突变（例如CPVT相关的R4496C突变）导致心肌细胞肌质网的钙泄漏，从而导致心脏功能障碍。这些突变表现为心律失常，在体力活动期间具有心脏性猝死的高风险，并且在设计用于携带该突变的小鼠模型中是可重复的。在运动条件下，携带这种钙泄漏突变的小鼠经历了心脏性猝死，而其野生型对应物部分没有证明18，20，21，22。在小鼠模型中，RyRs调节剂FKBP12的过表达与小鼠模型中与钾通道相关的心脏死亡率高，这一发现与FKBP12敲除小鼠的表型相对应10，11。由于哺乳动物RyR（包括RyR1，RyR 2和RyR3及其调节剂FKBPs）已经进行了三十多年的良好研究，因此大多数涉及心脏病理学，骨骼肌功能障碍和早期发育后脑功能成就以及肿瘤发生是研究的重点24，25。

与具有三种RyR亚型的脊椎动物不同， 果 蝇只有一种RyR1，2，3，5。最近，我们证明了 果蝇 RyR（DmRyR）在 果蝇 胚胎发育早期阶段的关键功能。在早期发育期间，我们在 果蝇 胚胎的翻译和转录水平上解开了DmRyR表达：合胞体胚泡期，胚芽期和早期胃肠期。在所有四个阶段中， DmFKBP12 mRNA均匀分布在整个胚胎中并保持在同一水平，而基因的蛋白质表达高度动态，表达谱前极化，然后分布在某些细胞层19。我们在本出版物中使用的方法学方案对于获得大量代表性结果的能力至关重要。

石蜡切片是用于定量分析的蛋白质表达组织学检测的基本和实用技术。石蜡切片是研究成虫中蛋白质表达的基础工具。然而，这些技术在发育中的昆虫中很难复制，因为它们富含脂质的胚胎和富含几丁质的绒毛膜，这使得嵌入，保存和载玻片安装变得困难。在胚胎中发现的脂质会干扰允许胚胎切片附着在载玻片表面上的力。虽然在绒毛膜中发现的几丁质存在物理屏障，保护胚胎免受化学和机械干扰，但它也限制了胚胎样品附着在载玻片上的附着物。虽然这些特性确保了昆虫幼虫的更高存活率，但它极大地阻碍了研究其 原位 蛋白质和mRNA表达的能力。这个问题在很多方面都遇到了麻烦。使用吐温-20等表面洗涤剂通常会分离 果蝇 胚胎并减少可用于研究的胚胎数量。该技术需要孵育20小时才能揭示用于 原位 杂交的mRNA，但也几乎可以将样品从载玻片中完全分离出来。在对mRNA进行免疫组织化学和反义特异性识别之前，用铬明矾明胶（CAG）涂覆载玻片的技术通过增强胚胎和载玻片之间的附着力解决了这些技术障碍。

除了CAG增强附着之外，所描述的 果蝇 胚胎预包埋技术允许收获大量精确确定日期的 果蝇 胚胎。这使我们能够报告 DmFKBP12 / Calstabin 在早期胚胎发育的各个阶段的动态表达。我们能够使用这种技术研究的最早阶段是合胞胚芽肿期，其显示出较少的分化分布和通常较低的表达水平。通过研究细胞胚芽和胃胚层阶段的胚胎，我们发现DmFKBP12 / Calstabin的一般水平随着胚胎发育并开始定位而增加，首先是前轮询，然后是三层阶段的某些层。研究结果表明，参与钙信号传导的 FKBP12 在早期发育中起着关键作用，其分化在 黑腹果蝇 发育中起重要作用。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了国家自然科学基金（#31771377/31571273/31371256），国家教育部外国杰出科学家项目（#MS2014SXSF038），国家教育部中央高校研究基金（#GK201301001/201701005/GERP-17-45）的支持，XZ由优秀博士论文基金（#2019TS082/2019TS079），陕西省教育厅重点项目（#20JS138） 支持。 陕西省科技厅自然科学基础研究计划青年项目（#2020JQ-885）。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-20°C Refrigerator Meiling Biology &Medical DW-YL270 Used for regent storage
-80°C Ultra low temperature refrigerator Thermo Forma 90 Series Used for regent storage
Agar Sigma-Aldrich WXBB6360V Preparation of grape juice agar plates
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Roche 11093274910 For the detection of digoxigenin-labeled compound
Biochemical incubator Shanghai Bluepard Instruments LRH-250 In-situ Hybridization
Bouin's solution Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 69945460 Drosophila Embryo Embedding
Centrifuge Eppendorf 540BH07808 In-situ Hybridization
Centrifuge tube Denville C-2170 Drosophila Embryo Collection
Chrome Alum Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10001018 Coating Slides
Constant temperature water bath Jintan Henfeng Instruments KW-1000DC Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Dako REAL EnVision Detection System Dako K5007 In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining.
DEPC Sigma-Aldrich D5758 In-situ Hybridization
DIG RNA Labeling Kit Roche 11093274910 RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase
Drosophila melanogaster Bloomington Stock Center BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 The stocks of Drosophila melanogaster mutant
Electric blast drying oven Tianjin Taiste Instruments 101-0AB For coating slides and paraffin embedding
Eosin Sigma-Aldrich 230251 Hematoxylin-Eosin Staining
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 100092680 Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Gelatin Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10010328 Coating Slides
Gold chloride Sigma-Aldrich 379948 Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3136 Hematoxylin-Eosin Staining
High Pure PCR Product Purification Kit Roche 11732668001 For purification of PCR products
Intelligent constant temperature and humidity box Ningbo Jiangnan Instruments HWS For fly maintenance
LE Agarose HyAgarose 14190108029 Pre-embedding
Methanol Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10014108 Drosophila Embryo Collection
Microscope ZEISS Observer.A1 Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Microscope Slides MeVid Labware Manufacturing P105-2001 Coating Slides
Neutral Gum Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10004160 Hematoxylin-Eosin Staining
N-heptane Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 40026768 Drosophila Embryo Collection
Paraffin slicer Huahai science instrument HH-2508III In-situ Hybridization
Paraffin Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 69019461 Paraffin Embedding
pH/mV Meter Sartorius PB-10 For determing the pH value of a solution
Silver nitrate Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10018461 Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Ultrapure water meter Thermo AFXI-0501-P In-situ Hybridization
Xylene Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10023418 Paraffin Embedding

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References

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发育生物学，第183期， 果蝇 胚胎，石蜡切片，包衣载玻片，包埋， 原位 杂交，DmFKBP12 /Calstabin
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Zhang, W., Lei, X., Zhou, X., He,… More

Zhang, W., Lei, X., Zhou, X., He, B., Xiao, L., Yue, H., Wang, S., Sun, Y., Wu, Y., Wang, L., Ghartey-Kwansah, G., Jones, O. D., Bryant, J. L., Xu, M., Ma, J., Xu, X. A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo. J. Vis. Exp. (183), e61776, doi:10.3791/61776 (2022).

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