Summary
Här beskriver vi ett protokoll för detektion och lokalisering av Drosophila embryoprotein och RNA från insamling till förinbäddning och inbäddning, immunfärgning och mRNA in situ-hybridisering .
Abstract
Kalciuminducerad kalciumfrisättningssignalering (CICR) spelar en avgörande roll i många biologiska processer. Varje cellulär aktivitet från cellproliferation och apoptos, utveckling och åldrande, till neuronal synaptisk plasticitet och regenerering har associerats med ryanodinreceptorer (RyRs). Trots vikten av kalciumsignalering är den exakta mekanismen för dess funktion i tidig utveckling oklar. Som en organism med en kort graviditetsperiod är embryon från Drosophila melanogaster primära studieämnen för att undersöka distributionen och lokaliseringen av CICR-associerade proteiner och deras regulatorer under utvecklingen. Men på grund av deras lipidrika embryon och kitinrika korion begränsas deras användbarhet av svårigheten att montera embryon på glasytor. I detta arbete introducerar vi ett praktiskt protokoll som avsevärt förbättrar fastsättningen av Drosophila-embryo på bilder och detaljmetoder för framgångsrik histokemi, immunohistokemi och in-situ-hybridisering . Glidbeläggningsmetoden för kromalungelgelatin och embryoförbäddningsmetoden ökar dramatiskt utbytet vid studier av Drosophila embryoprotein och RNA-uttryck. För att demonstrera detta tillvägagångssätt studerade vi DmFKBP12 / Calstabin, en välkänd regulator av RyR under tidig embryonal utveckling av Drosophila melanogaster. Vi identifierade DmFKBP12 i så tidigt som det syncytiella blastodermstadiet och rapporterar det dynamiska uttrycksmönstret för DmFKBP12 under utvecklingen: initialt som ett jämnt fördelat protein i syncytial blastoderm, sedan preliminärt lokaliserat till källarskiktet i cortex under cellulär blastoderm, innan det distribueras i den primitiva neuronala och matsmältningsarkitekturen under tre-gem-lagerfasen i tidig gastrulation. Denna fördelning kan förklara den kritiska roll RyR spelar i de vitala organsystemen som härrör från dessa lager: suboesofageal och supraesofageal ganglion, ventralt nervsystem och muskuloskeletala systemet.
Introduction
Kalciuminducerad kalciumfrisättningssignalering (CICR) spelar en avgörande roll i många biologiska processer, såsom skelett/glattmuskel och hjärtkärlfunktion, cellproliferation och apoptos, utveckling, åldrande, neuronal synaptisk plasticitet och regenerering1,2,3,4,5,6 . Ryanodinreceptorer (RyRs) och inositol 1,4,5-trisfosfatreceptorer (IP3R) är viktiga aktörer i kalciumsignalvägen som styrs av deras regulatorer proteinkinas A (PKA), Ca2+/calmodulinberoende proteinkinas II (CaMKII), FK506-bindande proteiner (KBP), kalsequestrin (CSQ), triadin och junctin1,2,3,4,5,6 . Onormalt mänskligt uttryck och mutationer i dessa proteiner kan leda till patologisk fysiologi såsom arytmier7 och onkogen proliferation8,9.
FKBP reglerar kalciumfrisättningen från endoplasmatisk retikulär (ER) av RyRs. Denna process är väsentlig för sammandragningsmekanismen och därmed ansvarig för all mekanisk rörelse som genereras av myosin-aktinkontraktion genom kalciuminducerad kalciumfrisättning tillsammans med embryonala RyRs1,2. I musmodeller är bristen på RyR2 och dess regulator FKBP12 / Calstabin alltid dödlig, antingen under embryonal utveckling eller i den tidiga postnatala perioden10,11,12. FKBP12/Calstabin knockout möss uppvisar kritiska hjärtfel med oregelbunden excitation- sammandragningskoppling (EC) och hjärnödem under embryonal utveckling. Detta indikerar att FKBP12/Calstabin spelar en viktig roll för att reglera RyR2-kanaluttryck, vilket är viktigt både för hjärt- och cerebral utveckling10.
RyR-ledda kalciumgnistrar upptäcktes ursprungligen i zygotbildningsfasen av befruktade Medaka-ägg13,14. Emellertid, få undersökningar har utförts på funktionen av kalcium signalering i tidig embryonal utveckling. I Drosophila melanogaster ger resultat erhållna från DmFKBP12 S107-mutanter starka bevis som stöder betydelsen av denna gen för larvutveckling och en hälsosam livslängd, vilket tillskrivs dess funktion mot oxidativ stress15,16. Nyligen identifierade vi den dynamiska lokaliseringen av FKBP12/Calstabinprotein och budbärar-RNA under tidig Drosophila melanogaster-utveckling17. Med hjälp av de metoder som beskrivs i denna metod kunde vi spåra uttrycket av FKBP12 / Calstabin i D. melanogaster under syncytial blastoderm (0-2 h), cellulär blastoderm (2-3 h), tidig gastrula (3-12 h) och sen gastrula (12-24 h). I detta dokument presenterar vi de detaljerade protokollen för varje tillvägagångssätt i den tidigare studien, inklusive inbäddning före embryo för klassisk paraffinsektion, förbeläggningsbehandling för embryonala sektioner, histokemifärgning och immunfärgning och mRNA in-situ hybridisering för identifiering av genuttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av druvsaftagarplattor
- Tillsätt 5 g agar och 5 g sackaros till 150 ml destillerat vatten. Koka det med en mikrovågsugn tills agar och sackaros är helt upplösta. Blanda 50 ml 100% druvsaft och lösningen tillsammans.
- Tillsätt 1 ml 100% propionsyra för att göra den slutliga koncentrationen till 0,5% propionsyra. Häll 25 ml av den beredda lösningen i varje platta. När agaren har stelnat, förvara mediet i 4 °C.
2. Beläggningsglas
- Förbehandla glider med tvättmedel. Tvätta rutschkanorna 3 gånger med kranvatten och en gång med destillerat vatten. Torka sedan rutschkanorna i en ugn på 45 °C i 2 timmar.
- Sänk ner bilderna i ca 450 ml kaliumdikromat svavelsyralösning (20 g kaliumdikromat, 40 ml destillerat vatten och 400 ml koncentrerad svavelsyra) i 24 timmar. Tvätta rutschkanorna 3 gånger med kranvatten och en gång med destillerat vatten.
- Torka rutschkanorna i en ugn på 45 °C i två timmar. Sänk ner i 95% etanol i mer än 2 timmar.
- Tillsätt 0,5 g kromkaliumsulfat och 5 g gelatin till 1 liter destillerat vatten. Lös upp i ett 60 °C vattenbad före användning. Kromalungelatinet kan förvaras vid 4 °C under långa perioder.
- Släpp 10 μL av kromalungelatinet på bilden och täck hela ytan av bilden helt och jämnt med lösningen. Placera bilden med gelatinsidan uppåt i en ugn vid 42 °C i 48 timmar. De förberedda bilderna kan förvaras vid 4 °C för senare användning.
OBS: Detta är ett kritiskt steg. Den kompletta beläggningen är nödvändig. För fruktfluga och dess embryo verkar denna glidbeläggningsmetod effektivare än polylysinbeläggning.
3. Inbäddning av Drosophila-embryo
-
Drosophila embryo samling
OBS: Vi samlade Drosophila embryon i fyra perioder på 0-2 timmar (syncytial blastoderm), 2-3 timmar (cellulär blastoderm), 3-12 timmar (tidig gastrula) och 12-24 timmar (sen gastrula)18. Andelen av de viktigaste embryotyperna under varje period visas i tabell 1.- Placera 400-500 flugor i en plastuppsamlingsflaska och täck flaskan med druvsaftagarplattan som innehåller jästextrakt. Drosophila embryon läggs på druvsaftagaren vid rumstemperatur.
- Samla fyra perioder av embryon, tillsätt försiktigt 2 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) till varje platta för att flyta embryon. Överför cirka 200 embryon till ett 50 ml centrifugrör och håll det på is i 2 minuter för att slå ner embryon.
- Förinbäddning
- Överför 200 Drosophila-embryon till ett 1,5 ml centrifugrör. Håll röret på is i 2 minuter för att sätta ner embryon och kasta sedan supernatanten försiktigt med pipett. Tillsätt 1 ml 50% blekmedel i röret och skaka det försiktigt i 2 minuter.
OBS: Blekmedlet bör förberedas färskt, och mängden blekmedel kan variera beroende på mängden embryon som samlas in. - Samla försiktigt embryon genom att hälla på filterpapper och tvätta dem 3 gånger med 1 ml PBS vid varje tidpunkt.
- Överför embryona med filterpapper till ca 5 ml n-heptan.
- Överför blandningen till ett nytt centrifugrör på 1,5 ml. Tillsätt 1 ml metanol och skaka den försiktigt. Samla embryon efter sedimentering.
- Ta bort supernatant och tvätta embryon i 1 ml PBS 3-5 gånger.
- Fixera embryona med 400 μL Bouins lösning (71% mättad pikrinsyra, 24% formalin, 5% ättiksyra) i 30 min. Tvätta de fasta embryona 3 gånger i 1 ml PBS i 5 min varje gång.
- För att aggregera embryon, överför proverna till ett gummipropp och ta bort PBS.
- Förbered 1,2 % agaros-PBS-lösning och håll lösningen vid 60 °C. Tillsätt 200 μL 1,2% agaros-PBS-lösning på embryon för att fixera dem i ett agarblock.
- Ta ut blocket från proppen och förvara blocket i PBS.
OBS: Under förinbäddningsmetoden är pro-uppvärmning avgörande för att lyckas. Vi rekommenderar starkt att centrifugrören och mikropipettspetsarna, som kommer att användas i detta steg, ska vara helt förvärmda före drift.
- Överför 200 Drosophila-embryon till ett 1,5 ml centrifugrör. Håll röret på is i 2 minuter för att sätta ner embryon och kasta sedan supernatanten försiktigt med pipett. Tillsätt 1 ml 50% blekmedel i röret och skaka det försiktigt i 2 minuter.
- Paraffin inbäddning
- Sänk ner det förinbäddade agarblocket i 35% etanol, 50% etanol, 75% etanol och 85% etanol i 15 minuter vardera. Doppa sedan 2 gånger i 95% etanol och 100% etanol.
ANMÄRKNINGAR: Cirka 5-10x blockvolym av varje följt av ett graderat fixeringsmedel i 15-30 minuter är nödvändigt beroende på antalet embryon i blocket. - Sänk ner embryoblocket i 100% etanol och xylen (1: 1 förhållande) lösning i 15 min.
- Överför blocket till xylen i 1 min för att göra embryovävnaden transparent.
- Sänk ner blocket i xylen och paraffin (förhållandet 1:1) i 30 min.
- Sänk ner blocket i paraffin I, paraffin II och paraffin III i 2 timmar varje gång.
- Fyll inbäddningslådan med paraffin i förväg och överför sedan försiktigt och horisontellt blocket till botten av inbäddningslådan. Efter att paraffinet stelnat naturligt kan det stelnade paraffinblocket förvaras vid 4 °C.
ANMÄRKNINGAR: Det förinbäddade provet kan användas i kryosektion genom att följa följande steg. Efter att embryona är förinbäddade med agaros som beskrivits ovan, är proverna helt enkelt inbäddade i OCT-föreningen. Därefter kan kryosektion utföras enligt rutinmässigt kryosektionsprotokoll. Därefter kan regelbundna färgningsmetoder användas på sektionerna.
- Sänk ner det förinbäddade agarblocket i 35% etanol, 50% etanol, 75% etanol och 85% etanol i 15 minuter vardera. Doppa sedan 2 gånger i 95% etanol och 100% etanol.
4. Hematoxylin-eosinfärgning
- Förbered Drosophila embryo sektioner. Placera förberedda sektioner i en ugn vid 60 ° C i 15 minuter och sänk sedan ner sektionerna i xylen 2 gånger i 10 minuter vardera. Sänk ner sektionerna en gång i 100% etanol och xylen (1: 1 förhållande) i 2 min.
- Hydrera sektionerna i 100% etanol I, 100% etanol II, 95% etanol, 85% etanol, 75% etanol, 50% etanol och i destillerat vatten i 3 min.
- Fläck sektionerna med hematoxylinlösning i 2 min. Doppa bilderna i 1% sur alkohollösning (1 ml saltsyra, 100 ml 70% etanol) snabbt och tvätta bilderna i destillerat vatten.
- Doppa bilderna i 50% etanol, 75% etanol, 85% etanol och 95% etanol sekventiellt.
- Fläck sektionerna med eosinlösning i 1 min.
- Dehydrera bilderna i 95% etanol I, 95% etanol II, 95% etanol III, 100% etanol I, 100% etanol II och 100% etanol III i 1 min varje gång.
- Rensa bilderna i 100% xylen I, 100% xylen II och 100% xylen III i 5 min varje gång.
- Montera bilderna med neutral balsam enligt tillverkarens instruktioner.
5. Periodisk syra-silvermetenaminfärgning
- Deparaffinisera och hydrera paraffinsektioner av Drosophila-embryot till destillerat vatten.
- Oxidera sektionerna i 1% periodisk syra i 15 min vid rumstemperatur.
- Skölj rutschkanorna i destillerat vatten 3 gånger i 1 min vardera.
- Inkubera diabilderna i ca 40 ml nyfiltrerad silvermetenaminarbetslösning (3 % metenamin, 5 % silvernitrat, 5 % natriumboratlösning) i 1 timme och 20 minuter vid 60 °C. Skölj sedan rutschkanorna i destillerat vatten i 1 min.
- Tona rutschkanorna i 0,2% guldklorid i 2 min och skölj sedan rutschkanorna i destillerat vatten i 1 min.
- Placera bilderna i 3% natriumtiosulfat i 3 min och skölj sedan bilderna i destillerat vatten i 1 min.
- Motståa bilderna i hematoxylin i 30 s. Tvätta rutschkanorna i rinnande kranvatten i 3-5 min.
- Dehydrera bilderna i 70% etanol, 80% etanol, 95% etanol I, 95% etanol II, 95% etanol III, 100% etanol I och 100% etanol II i 5 min vardera.
- Rensa bilderna i 100% xylen I, 100% xylen II och 100% xylen III i 5 min vardera.
- Montera bilderna i neutral balsam enligt tillverkarens instruktioner.
6. Immunohistokemi
- Deparaffinisera och rehydrera paraffinsektioner av Drosophila-embryot till PBS enligt standardprotokollet19.
- Behandla diabilder med 0,3% H2O2 i metanol i 10 min vid rumstemperatur och undvik ljus.
- Förvärm lämplig buffert för antigenhämtning till cirka 100 °C i en behållare med glidbanorna i grönsaksångaren. Behållaren ska också ha ett lock. Lägg bilderna i behållaren. Stäng locket på ångbåten.
- Förvara behållaren i ångbåten i 20 minuter från denna punkt. Observera att locket på glidbehållaren inte ska dras åt helt så att vattenånga kan komma in under ångprocessen.
- Låt bilderna återgå till rumstemperatur innan du sköljer dem försiktigt i PBS-T (PBS med Tween-20, pH 7,2) 3 gånger i 5 minuter vardera och skölj sedan bilderna i PBS 3 gånger i 1 min vardera.
- Blockera diabilderna med 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 60 min vid rumstemperatur.
- Inkubera diabilderna med primär antikropp (anti-FKBP12 vid 1:1000) över natten vid 4 °C eller vid rumstemperatur i 4 timmar.
- Tvätta diabilderna i PBS-T 4 gånger i 5 minuter vardera.
- Applicera diabilderna med HRP-märkt polymer konjugerad med sekundära antikroppar (antikanin, 1:5 000) i 90 minuter vid rumstemperatur. Gör detta i mörkret för att undvika fotoblekning.
- Tvätta rutschkanorna i PBS-T 3 gånger i 5 minuter vardera.
- Inkubera diabilderna med 5% 3,3'-diaminobenzidin-tetrahydroklorid (DAB) i 2-10 min tills färgen på reaktionsprodukterna är lämplig under mikroskop.
- Motståda rutschkanorna i hematoxylin i 30 s och tvätta rutschkanorna i destillerat vatten 2 gånger i 5 minuter vardera.
- Dehydrera bilderna i 50% etanol, 70% etanol, 90% etanol, 95% etanol och 100% etanol i 1 min vardera.
- Rensa bilderna i 100% xylen I, 100% xylen II och 100% xylen III i 5 min vardera.
- Montera bilderna i neutral balsam enligt tillverkarens instruktioner.
7. Hybridisering på plats
OBS: Drosophila embryo sektioner framställdes med 0,01% dietyl pyrokarbonat (DEPC) behandlat vatten. Alla tillbehör som används för in situ-hybridisering tillämpar DEPC över natten behandling i förväg.
- Riboprobe beredning
- Linjärisera mall-DNA genom att skära på ett restriktionsenzymställe nedströms från den klonade insatsen med hjälp av ett restriktionsenzym som skapar 5 'överhäng. Efter linjärisering, rena mallen DNA via fenol / kloroform extraktion och efterföljande etanolutfällning. Använd standardprotokoll.
- Tillsätt 1 μg renat mall-DNA till ett RNasfritt centrifugrör. Placera centrifugröret på is. Tillsätt tillräckligt med DEPC-behandlat vatten till den totala volymen 13 μL.
- Tillsätt sedan följande reagenser i ordning: 2 μL 10x NTP-märkningsblandning, 2 μL 10x transkriptionsbuffert, 1 μL av protektor-RNashämmare, 2 μL RNA-polymeras SP6 eller RNA-polymeras T7.
- Blanda reaktionen genom pipettering och centrifug inom kort. Inkubera i 2 timmar vid 37 °C.
OBS: Längre inkubationer ökar inte utbytet av märkt RNA. En kort rotation (~ 800 rpm) applicerad på reaktionsröret är avgörande nödvändig innan du fortsätter till nästa steg. Denna snurrning gör att allt innehåll, som kan genereras från inkubationen, kan komma till botten av röret. - Tillsätt 2 μL RNasfri DNase I för att ta bort mall-DNA och inkubera i 15 minuter vid 37 °C.
- Tillsätt 2 μL 200 mM EDTA (pH 8,0) för att stoppa reaktionen.
OBS: DIG-märkta RNA-sonder kan lagras vid -15 till -25 ° C i etanol i ett år.
- Pre-hybridisering av Drosophila embryo sektion
- Placera delar av Drosophila embryo i en 42 ° C ugn i 48 timmar.
- Deparaffinisera bilderna i 100% xylen i 10 min två gånger.
- Hydrera bilderna genom att sekventiellt nedsänka i 100% etanol, 95% etanol, 90% etanol, 70% etanol och 50% etanol i 5 min.
- Inkubera diabilderna i PBS i 5 min 3 gånger för att ta bort fixeringslösningen/Bouins lösning från vävnaden.
- Tvätta diabilderna med 100 mmol/L glycin/PBS-lösning 2 gånger i 5 min vardera.
- Tvätta bilderna med PBS 2 gånger i 5 minuter vardera.
- Inkubera bilderna med 0,3% Triton X-100 i PBS i 15 min för att permeabilisera membranen.
- Tvätta bilderna med PBS 3 gånger i 5 minuter vardera.
- Inkubera diabilderna i 15 μg/ml RNasfritt proteinas K i 30 minuter vid 37 °C.
- Inkubera bilderna med 4% paraformaldehyd i PBS i 3 minuter för att stoppa matsmältningen.
- Tvätta bilderna med PBS 2 gånger i 5 minuter vardera.
- Inkubera bilderna i 100 mM trietanolaminbuffert (pH 8,0) med 0,25% (v / v) ättiksyraanhydrid 2 gånger i 5 minuter vardera.
- Tillsätt DEPC-vatten i glidfuktkammaren. Tillsätt 20 μL prehybridiseringslösning (innehållande 100 μg / ml laxsperma-DNA) på bilderna. Sätt in bilderna i glidfuktkammaren. Inkubera rutschkanorna vid 42 °C i 4 timmar.
OBS: Det är nödvändigt att säkerställa tätheten hos locket på den våta lådan och att våtboxen alltid hålls i en horisontell förångning för att förhindra förångning och avvikelse från vävnaden i förhybridiseringslösningen och den följande hybridiseringslösningen.
- Hybridisering av Drosophila embryosektion
- Ta bort förhybridiseringslösningen och tvätta bilderna med 0,2x SSC (150 mM natriumklorid, 15 mM natriumcitrat, pH 7,0) 3 gånger i 5 minuter vardera. Torka av överskott 0,2x SSC runt vävnadsproverna.
- Applicera 30 μL sondhybridiseringslösning (innehållande 2-6 ng digoxinmärkt RNA-sond genom utspädning i förhybridiseringslösning) med en pipett. Inkubera rutschkanorna i glidfuktkammaren vid 42 °C i cirka 20 timmar.
OBS: Var säker på locktätheten som förslag på den sista anteckningen. Annars kommer uttorkningen orsakad av läckage av antingen pre-hybridisering eller pre-hybridisering att generera smutsig bakgrund inklusive pseudo-positiv i bilder.
- Hybridisering
- Ta bort hybridiseringslösningen och tvätta bilderna med 4x SSC-lösning 4 gånger i 15 minuter vardera vid 37 °C.
- Tvätta diabilderna i 2x SSC-lösning med 20 μg/ml RNas A i 30 min vid 37 °C.
- Tvätta rutschkanorna i 1x SSC-lösning i 15 min vid 37 °C.
- Tvätta rutschkanorna i 0,5x SSC-lösning i 15 min vid 37 °C.
- Tvätta rutschkanorna i 0,1x SSC-lösning i 15 min vid 37 °C.
- Tvätta bilderna med PBS 3 gånger i 5 minuter vardera.
- Tvätta rutschkanorna i tvättbuffert (100 mM maleinsyra, 150 mM NaCl, 0,3% (v/v) Tween 20, pH 7,5) i 1 min.
- Inkubera bilderna i 100 ml nyberedd blockerande lösning (2% fårserum i maleinsyrabuffert utan Tween 20) i 30 minuter.
- Inkubera bilderna i 20 ml antikroppslösning i 45 minuter.
- Centrifugera antikroppen i 5 minuter vid 10 000 rpm i originalflaskan före varje användning och pipettera den nödvändiga mängden försiktigt från ytan. Späd anti-digoxigenin-AP 1:5000 (150 mU/ml) i blockerande lösning.
- Tvätta rutschkanorna i 100 ml tvättbuffert 2 gånger i 15 minuter vardera för att avlägsna obundet antikroppskonjugat.
- Balansera rutschkanorna i 20 ml detektionsbuffert (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5) i 2-5 min.
- Inkubera bilderna med 10 ml nyberedd färgsubstratlösning i glidfuktkammaren. Reaktionen börjar inom några minuter och är klar efter 16 timmar. Skaka eller blanda inte medan färgen utvecklas.
- Tvätta rutschkanorna med 50 ml destillerat vatten i 5 minuter för att stoppa reaktionen.
- Torka provet över natten i mörkret.
- Dehydrera bilderna i 70% etanol, 80% etanol, 90% etanol, 95% etanol, 100% etanol I och 100% etanol II i 3 min vardera.
- Rensa bilderna i 100% xylen I, 100% xylen II och 100% xylen III i 20 min vardera.
- Montera bilderna med neutral balsam.
- Dokumentera bilder och analysera med den inverterade mikroskopi- och tillverkarprogramvaran. Utför distributionsanalys med ImageJ enligt densitet av positiv signal antingen längs längsgående axel eller inom differentiell zon av embryon.
OBS: Under inkubationen med den nyberedda färgsubstratlösningen i steg 7.4.12 kan reaktionsfärgen ses även med blotta ögat. Denna observation om hur färgutveckling kan inspekteras under stereoskop. När reaktionsfärgen är rimlig och steg 7.4.13 kan utföras för att stoppa reaktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figurerna beskriver protokoll som används för att övervinna utmaningen att fästa höga lipid- och kitininnehållande korion Drosophila-embryon (tabell 1) på glasskivans yta för undersökning och experiment. Med hjälp av glidbeläggningsmetoden för kromalungelgelatin som visas i figur 1 förbättrade vi fastsättningen av Drosophila-embryon på ytan av diabilder medan embryots förinbäddningsmetod som visas i figur 2 möjliggör effektiv inspektion av den dynamiska fördelningen av protein och RNA DmFKBP12 / Calstabin i alla fyra tidiga utvecklingsstadier (dvs. syncytial blastoderm, cellulär blastoderm, tidig och sen gastrula av Drosophila-embryon). Figur 3 visar proteinfördelningen av antikroppar detekterade FKBP12 / Calstabin vid syncytial och cellulär blastodermstadier. Från dessa histokemiska resultat kan man se att FKBP12-uttrycket är mindre polariserat i syncytial blastoderm (paneler A till H) och börjar sedan lokaliseras i basalmembranet under trophectoderm-epitelet för att bilda en gradient med mer uttryck som finns i den främre än de bakre polerna (paneler I till S). Så småningom blir DmFKBP12 / Calstabin-proteinet begränsat till vissa arkitektoniska komponenter i de primitiva embryonala vävnaderna med mindre extracellulär fördelning än den som observerats i tidiga och sena gastrula embryonala stadier (Figur 4). Intressant nog åtföljs inte den ovan beskrivna dynamiska proteinfördelningen av motsvarande mRNA-nivåer av DmFKBP12 (figur 5), vilket indikerar att proteinuttryck är resultatet av en fortfarande okänd molekylär mekanism efter transkription. Den beskrivna metoden för CAG-glidbeläggning och förinbäddning gör det möjligt för oss att ytterligare undersöka vikten av DmFKBP12 vid kalciumsignalering och gräva fram denna fortfarande okända molekylära mekanism samtidigt som vi kombinerar andra tekniker såsom mikroinjektion RNA-interferens19.
I denna studie utvecklar vi en krom alungelatin glidbeläggning och förinbäddningsmetod för histologi, histokemisk och immun-histologisk analys av Drosophila-embryon i olika utvecklingsstadier. Med hjälp av denna förinbäddningsmetod samlas embryon effektivt in för både kryo- och paraffinsektion som möjliggör analys av längsgående tvärsnitt. Detta gjorde det möjligt för oss att beskriva de utvecklande uttrycksmönstren för detta protein under avgörande utvecklingsstadier, som kopplade uttrycket av proteinet till utvecklingen av viktiga fysiologiska system som tarmen, hjärnan och det anslutande nervsystemet. Genom att använda dessa metoder kunde vi undersöka de dynamiska fördelningarna av RyR-reglerande protein och mRNA FKBP12 / Calstabin under utvecklingen av Drosophila-embryon i definitiva stadier, inklusive syncytial och cellulär blastoderm, och tidiga och sena gastrulationsstadier. Våra data visade att FKBP12/Calstabin-proteinet och dess RNA kan detekteras mycket tidigt i syncytialblastodermen. När embryot utvecklas blir FKBP12 tätare fördelat i basalcellskiktet under blastodermens epitel. FKBP12/Calstabin-proteinet stärker sedan dynamiskt sitt uttryck och differentierar dess fördelning till embryonala muskelinnehållande vävnader, inklusive stomodaeum, stomodaeum och bakre midgut rudiment. Dessa distributionsförändringar från början av blastoderm till sena gastrulationsstadier beskrivs också i det utvecklande neuronala systemet inklusive neuroblaster, ventral nerv, supraesofageal ganglion och hjärna. Medan dessa dynamiska förändringar i FKBP12 / Calstabin antyder dess betydelse i utvecklingen, återspeglas de inte i mRNA-nivåer av proteinet, vilket tyder på en ännu okänd regulator för proteinuttryck som återstår att identifiera.
Figur 1: Skiss av kromangelgelatin (CAG) beläggningsmetod för paraffinsektioner som används i immunologi och RNA in-situ hybridisering för att visualisera fördelningen av DmFKBP12-protein och mRNA i Drosophila-embryon. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Skiss av förinbäddningsmetod för uttrycksprofil för FKBP12 och DmFKBP12 vid utveckling av Drosophila-embryon . Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Uttrycksprofil för DmFKBP12-protein i syncytiella och cellulära blastodermer av Drosophila-embryot . (A-D) H&E-färgning av syncytial blastodermen. Kvantifiering av DmFKBP12-distribution i tidig syncytial blastoderm presenteras i D. (E-G) Paneler presenterar tidig syncytial blastoderm där kärnor är under delning. Kvantifiering av DmFKBP12-distribution i sen syncytial blastoderm presenteras i H. (I-L) H&E-färgning av den cellulära blastodermen. Kvalificeringen av DmFKBP12-distribution i sencellulär blastoderm presenteras i L. (M-S) Paneler uppvisar fördelningen av DmFKBP12-protein i den cellulära blastodermen. O visar de större vyerna av M-N. (P-R) Paneler presenterar tidigare cellulär blastoderm som visas i M-O. Kvantifieringar av DmFKBP12-distribution i tidig cellulär blastoderm presenteras i S. Skalstången för A, E, I, M och P är 60 μm, för B, C, F, J, K, N, Q och R är 40 μm och för G är O 20 μm. AP, äggets främre pol; YK, äggula; CN, klyvningskärna; PP, bakre pol av ägg; BLD, blastoderm, kärnor och celler; BM, Källarmembran. Data uttrycks som medelvärde± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Datakvantifieringen utfördes med ImageJ. För det första var de bruna produkterna kvar i bilden tillsammans med att ta bort alla andra färger. För det andra ändrades den bruna bilden svartvitt och beräknade dess densitet för kvantifiering följaktligen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Uttrycksprofil för DmFKBP12-protein i tidiga och sena gastrulationsstadier av Drosophila-embryot . A, D och G visar H &E-färgning av Drosophila-embryot vid gastrulationsstadiet. B, C, E och F visar fördelningen av DmFKBP12 i det tidiga gastrulationsstadiet. H, I och J-L visar fördelningen av DmFKBP12 vid det sena gastrulationssteget. Kvantifieringar av DmFKBP12-fördelningen i tidiga gastrulae presenteras i M. Skalstången för A, D, E och G är 80 μm, för B, C, F, H, I och J-L är 40 μm. PP, bakre pol av ägg; NBL, neuroblaster; ST, stomodaeum; YK, äggula; PMG, bakre midgut rudiment; BR, hjärna, supraesofageal ganglion; VNS, ventralt nervsystem; PV, proventriculus; MUS, muskler; MGC, midgut caecum; AMG, främre midgut rudipighian; MMG, mellersta midgut; TR, luftstrupe. Uppgifterna uttrycks som medelvärde± SEM. ns, ingen signifikant; ** p < 0,01, *** p < 0,001. Datakvantifieringen utfördes med ImageJ 1.50d genom att förbli produktbrun och byta till svartvit bild och följa genom densitetsberäkning av svartvitt som beskrivits i föregående figurförklaring. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: In-situ-lokalisering av DmFKBP12 mRNA under embryonal utveckling av Drosophila-embryot . A visar in-situ-lokalisering av DmFKBP12 mRNA vid syncytial blastoderm-stadiet när FKBP12 mRNA uttrycktes i embryonets cytoplasma. B och C visar in situ-lokalisering av DmFKBP12 mRNA vid det cellulära blastodermstadiet när FKBP12 mRNA uttrycktes i de inre gränserna för blastodermceller. D och E uppvisar in situ-lokalisering av FKBP12 mRNA vid det tidiga gastrulationsstadiet. Under detta skede är det huvudsakligen lokaliserat i den utvecklande tarmen. F, G och H visar in-situ-lokalisering av FKBP12 mRNA vid det sena gastrulationsstadiet, när mRNA uttrycks i muskeln och tarmen. Jag är positiv kontroll av DmFKBP12 mRNA. J är negativ kontroll av DmFKBP12 mRNA. Skalstången för A, C, E, G och I är 5 μm, för B, D, F, I och J är 10 μm. YK, äggula; CN, klyvningskärna; BLD, blastoderm, kärnor och celler; CF, främre sned klyfta, cephalic fur. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Embryonala stadier | 0-2 timmar (%) | 2-3 timmar (%) | 3-12 timmar (%) | 12-24 timmar (%) |
| Syncytial blastoderm | 90.8 | 0 | 0 | 0 |
| Cellulär blastoderm | 6.9 | 91.54 | 0 | 0 |
| Tidig gastrula | 2.3 | 4.23 | 91.1 | 0 |
| Sen gastrula | 0 | 4.23 | 8.93 | 93.3 |
Tabell 1: Embryosamling av olika utvecklingsstadier av Drosophila melanogaster
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RyRs och IP3Rs medierade kalciumsignalering är en grundläggande väg i många fysiologiska och patologiska processer hos både ryggradsdjur och ryggradslösa djur1,2,3,4. Hos människor leder punktmutationer, såsom CPVT-associerad R4496C-mutation, i RyR2-genen till kalciumläckage från sarkoplasmatisk retikulum av kardiomyocyter, vilket resulterar i hjärtdysfunktion. Dessa mutationer förekommer som arytmi med hög risk för plötslig hjärtdöd under fysisk aktivitet och är reproducerbara i musmodeller konstruerade för att bära denna mutation. Under träningsförhållanden upplevde mössen som bar denna kalciumläckagemutation hjärtdöd som inte demonstrerades av dess vilda motdelar18,20,21,22. Överuttryck av FKBP12, en RyRs-regulator, i hjärtat motsvarade höga kaliumkanaler associerade hjärtdöd i musmodeller22,23, ett fynd som motsvarade fenotypen av FKBP12 knockout-möss10,11. Eftersom däggdjur RyRs inklusive RyR1, RyR 2 och RyR3 och deras regulator FKBP har studerats väl i över tre decennier, är de flesta förfaranden som är involverade i kardiopatologi, skelettmuskulär dysfunktion och hjärnfunktionsprestation efter tidig utveckling plus onkogenes fokus för forskning24,25.
Till skillnad från hos ryggradsdjur, som har tre isoformer av RyR, har Drosophila flugor bara en RyR1,2,3,5. Nyligen demonstrerade vi den kritiska funktionen av Drosophila RyR (DmRyR) i de tidiga stadierna av Drosophila embryonal utveckling. Vi unraveled DmRyR uttryck på både translationell och transkriptionell nivå i Drosophila embryon under tidig utveckling: syncytial blastoderm stadium, blastoderm stadium, och de tidiga gastrula stadier. I alla fyra stegen fördelades DmFKBP12 mRNA jämnt över embryot och förblev på samma nivå, medan genens proteinuttryck var mycket dynamiskt med uttrycksprofiler polariserade främre och sedan fördelade i vissa cellskikt19. De metodologiska protokoll som vi använde i denna publikation var avgörande för förmågan att få en hög volym representativa resultat.
Paraffinsektionering är en grundläggande och praktisk teknik för histologisk detektion av proteinuttryck för kvantitativ analys. Paraffinsektioner är ett grundläggande verktyg för att studera proteinuttryck hos den vuxna insekten. Dessa tekniker har dock varit svåra att replikera vid utveckling av insekter på grund av deras lipidrika embryo och kitinrika korion, vilket gör inbäddning, konservering och glidmontering svår. Lipiderna som finns i embryon stör de krafter som möjliggör fastsättning av embryonala sektioner på ytan av bilden. Medan kitin som finns i korionen presenterar fysiska barriärer som skyddar embryot från kemisk och mekanisk störning, begränsar det också fästningar av embryonala prover till glasrutschbanor. Medan dessa egenskaper säkerställer en högre överlevnad av insektslarver, hindrar det i hög grad förmågan att studera deras in-situ-protein och mRNA-uttryck . Detta problem har varit problemsökt på många sätt. Användningen av yttvättmedel som Tween-20 lossnar ofta Drosophila-embryon och minskar antalet embryon som är tillgängliga för studier. Denna teknik kräver inkubation i 20 timmar för att avslöja mRNA för in-situ-hybridisering , men lossnar också proverna från bilderna nästan helt. Tekniken här för att belägga glasglas med kromalungelatin (CAG) innan immunhistokemi och anti-sense specifikt erkännande för mRNA löser dessa tekniska hinder genom att förbättra fästningen mellan embryot och glasskivan.
Förutom cag-förbättrad fastsättning möjliggör de beskrivna Drosophila-embryo-förinbäddningsteknikerna skörden av ett stort antal exakt daterade Drosophila-embryon. Detta gjorde det möjligt för oss att rapportera det dynamiska uttrycket av DmFKBP12 / Calstabin i olika stadier av tidig embryonal utveckling. Det tidigaste steget vi kunde studera med hjälp av denna teknik är det syncytiella blastodermstadiet, som visade mindre differentierad fördelning och en generellt lägre uttrycksnivå. Genom att studera embryon vid de cellulära blastoderm- och gastrulastadierna fann vi att den allmänna nivån av DmFKBP12 / Calstabin ökade när embryon utvecklas och börjar lokaliseras, först till den främre undersökningen, sedan till vissa lager i treskiktsstadiet. Resultaten tyder på att FKBP12 som är involverad i kalciumsignalering spelar en avgörande roll i tidig utveckling och vars differentiering spelar en viktig roll i Drosophila melanogaster-utvecklingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (# 31771377 / 31571273 / 31371256), Foreign Distinguished Scientist Program från National Department of Education (#MS2014SXSF038), National Department of Education Central Universities Research Fund (#GK201301001 / 201701005 / GERP-17-45) och XZ stöds av Outstanding Doctoral Theal Thesis Fund (#2019TS082 / 2019TS079), Key Program of Shaanxi Provincial Education Department (#20JS138), natural science basic research program Youth Project of Shaanxi Provincial Science and Technology Department (#2020JQ-885).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -20°C Refrigerator | Meiling Biology &Medical | DW-YL270 | Used for regent storage |
| -80°C Ultra low temperature refrigerator | Thermo | Forma 90 Series | Used for regent storage |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparation of grape juice agar plates |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | For the detection of digoxigenin-labeled compound |
| Biochemical incubator | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
| Bouin's solution | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
| Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
| Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
| Chrome Alum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10001018 | Coating Slides |
| Constant temperature water bath | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Dako REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | In-situ Hybridization |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11093274910 | RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | The stocks of Drosophila melanogaster mutant |
| Electric blast drying oven | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | For coating slides and paraffin embedding |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 100092680 | Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Gelatin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10010328 | Coating Slides |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| High Pure PCR Product Purification Kit | Roche | 11732668001 | For purification of PCR products |
| Intelligent constant temperature and humidity box | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | For fly maintenance |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pre-embedding |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10014108 | Drosophila Embryo Collection |
| Microscope | ZEISS | Observer.A1 | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Microscope Slides | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Coating Slides |
| Neutral Gum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10004160 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| N-heptane | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 40026768 | Drosophila Embryo Collection |
| Paraffin slicer | Huahai science instrument | HH-2508III | In-situ Hybridization |
| Paraffin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69019461 | Paraffin Embedding |
| pH/mV Meter | Sartorius | PB-10 | For determing the pH value of a solution |
| Silver nitrate | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10018461 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Ultrapure water meter | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Hybridization |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10023418 | Paraffin Embedding |
References
- Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
- Cheng, H., Lederer, W. J.
- Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
- Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
- Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
- George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
- Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
- Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
- Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
- Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
- Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
- Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
- Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
- Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
- Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer. 633-645 (1958).
- Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
- Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
- Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
- Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
- Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the 'resolution revolution'. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).
