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Developmental Biology

प्रारंभिक ड्रोसोफिला भ्रूण के भीतर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और आरएनए इन-सीटू वितरण के लिए एक प्रोटोकॉल

Published: May 6, 2022 doi: 10.3791/61776
Automatic Translation
*1, *1, *2,3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,4, 1, 5, 6, 7, 3, 1
1National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China/CGDB, Shaanxi Normal University College of Life Sciences, 2Shaanxi Key Laboratory of Ischemic Cardiovascular Disease, Shaanxi Key Laboratory of Brain disorders, Institute of Basic & Translational Medicine, Xi'an Medical University, 3Ohio State University College of Medicine, 4Hematology-Oncology Division, Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 5University of Pennsylvania ULAR, 6University of Maryland School of Medicine, 7Columbia University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम ड्रोसोफिला भ्रूण प्रोटीन और आरएनए का पता लगाने और स्थानीयकरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, संग्रह से पूर्व-एम्बेडिंग और एम्बेडिंग, इम्यूनोस्टेनिंग और सीटू संकरण में एमआरएनए तक।

Abstract

कैल्शियम प्रेरित कैल्शियम रिलीज सिग्नलिंग (सीआईसीआर) कई जैविक प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सेल प्रसार और एपोप्टोसिस, विकास और उम्र बढ़ने से लेकर न्यूरोनल सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी और पुनर्जनन तक हर सेलुलर गतिविधि को रयानोडीन रिसेप्टर्स (RYRs) के साथ जोड़ा गया है। कैल्शियम सिग्नलिंग के महत्व के बावजूद, प्रारंभिक विकास में इसके कार्य का सटीक तंत्र स्पष्ट नहीं है। एक छोटी गर्भावधि अवधि के साथ एक जीव के रूप में, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के भ्रूण विकास के दौरान सीआईसीआर से जुड़े प्रोटीन और उनके नियामकों के वितरण और स्थानीयकरण की जांच के लिए प्रमुख अध्ययन विषय हैं। हालांकि, उनके लिपिड-समृद्ध भ्रूण और चिटिन-समृद्ध कोरियन के कारण, उनकी उपयोगिता कांच की सतहों पर बढ़ते भ्रूण की कठिनाई से सीमित है। इस काम में, हम एक व्यावहारिक प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो ड्रोसोफिला भ्रूण के लगाव को स्लाइड और सफल हिस्टोकेमिस्ट्री, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इन-सीटू संकरण के लिए विस्तार विधियों पर काफी बढ़ाता है। क्रोम फिटकरी जिलेटिन स्लाइड-कोटिंग विधि और भ्रूण पूर्व-एम्बेडिंग विधि नाटकीय रूप से ड्रोसोफिला भ्रूण प्रोटीन और आरएनए अभिव्यक्ति का अध्ययन करने में उपज को बढ़ाती है। इस दृष्टिकोण को प्रदर्शित करने के लिए, हमने ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के प्रारंभिक भ्रूण विकास के दौरान RyR के एक प्रसिद्ध नियामक, DmFKBP12 / Calstabin का अध्ययन किया। हमने DmFKBP12 की पहचान की, जैसे ही सिंक्टाइल ब्लास्टोडर्म चरण के रूप में और विकास के दौरान DmFKBP12 के गतिशील अभिव्यक्ति पैटर्न की रिपोर्ट करें: शुरू में सिंक्टाइल ब्लास्टोडर्म में एक समान रूप से वितरित प्रोटीन के रूप में, फिर प्रारंभिक ब्लास्टोडर्म के दौरान कॉर्टेक्स की तहखाने की परत को स्थानीयकृत किया जाता है, प्रारंभिक गैस्ट्रुलेशन में तीन-मणि परत चरण के दौरान आदिम न्यूरोनल और पाचन वास्तुकला में वितरित करने से पहले। यह वितरण महत्वपूर्ण अंग प्रणालियों में RyR की महत्वपूर्ण भूमिका की व्याख्या कर सकता है जो इन परतों से उत्पन्न होता है: suboesophageal और supraesophageal गैंग्लियन, वेंट्रल तंत्रिका तंत्र, और मस्कुलोस्केलेटल सिस्टम।

Introduction

कैल्शियम प्रेरित कैल्शियम रिलीज सिग्नलिंग (सीआईसीआर) कई जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जैसे कि कंकाल / चिकनी मांसपेशियों और हृदय संवहनी समारोह, सेल प्रसार और एपोप्टोसिस, विकास, उम्र बढ़ने, न्यूरोनल सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी, और पुनर्जनन 1,2,3,4,5,6 . Ryanodine रिसेप्टर्स (RyRs) और inositol 1,4,5-trisphosphate रिसेप्टर्स (IP3Rs) कैल्शियम सिग्नलिंग मार्ग में प्रमुख खिलाड़ी हैं जो उनके नियामकों प्रोटीन किनेज ए (पीकेए), Ca2 + / कैलमोडुलिन-निर्भर प्रोटीन किनेज II (CaMKII), FK506 बाध्यकारी प्रोटीन (FKBPs), कैल्सेक्वेस्ट्रिन (CSQ), ट्रायडिन, और जूनक्टिन 1,2,3,4,5,6 द्वारा नियंत्रित हैं . इन प्रोटीनों में असामान्य मानव अभिव्यक्ति और उत्परिवर्तन रोग संबंधी शरीर विज्ञान जैसे अतालता 7 और ऑन्कोजेनिक प्रसार 8,9 का कारण बन सकते हैं।

FKBPs RyRs द्वारा एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलर (ER) से कैल्शियम रिलीज को विनियमित करते हैं। यह प्रक्रिया संकुचन के तंत्र के लिए आवश्यक है, और इस प्रकार भ्रूण RyRs1,2 के साथ कैल्शियम-प्रेरित कैल्शियम रिलीज के माध्यम से मायोसिन-एक्टिन संकुचन द्वारा उत्पन्न सभी यांत्रिक आंदोलन के लिए जिम्मेदार है। माउस मॉडल में, RyR2 और इसके नियामक FKBP12 / Calstabin की कमी हमेशा घातक होती है, या तो भ्रूण के विकास के दौरान या प्रारंभिक प्रसवोत्तर अवधि में 10,11,12। FKBP12 / Calstabin नॉकआउट चूहों भ्रूण विकास के दौरान अनियमित उत्तेजना-संकुचन युग्मन (ईसी) और सेरेब्रल एडिमा के साथ महत्वपूर्ण कार्डियक दोष प्रदर्शित करते हैं। यह इंगित करता है कि FKBP12 / Calstabin RyR2 चैनल अभिव्यक्ति को विनियमित करने में एक आवश्यक भूमिका निभाता है, जो कार्डियक और सेरेब्रल डेवलपमेंट दोनों के लिए महत्वपूर्ण है।

RYR आयोजित कैल्शियम स्पार्क्स शुरू में निषेचित Medaka अंडे 13,14 के युग्मनज गठन चरण में खोजा गया था। हालांकि, प्रारंभिक भ्रूण विकास में कैल्शियम सिग्नलिंग के कार्य पर कुछ जांच की गई है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में, DmFKBP12 S107 उत्परिवर्ती से प्राप्त परिणाम लार्वा विकास और एक स्वस्थ जीवन काल के लिए इस जीन के महत्व का समर्थन करने वाले मजबूत सबूत प्रदान करते हैं, जिसे ऑक्सीडेटिव तनाव 15,16 के खिलाफ इसके कार्य के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। हाल ही में, हमने प्रारंभिक ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर विकास 17 के दौरान FKBP12 / Calstabin प्रोटीन और मैसेंजर आरएनए के गतिशील स्थानीयकरण की पहचान की। इस पद्धति में वर्णित दृष्टिकोणों का उपयोग करते हुए, हम सिंकिटियल ब्लास्टोडर्म (0-2 एच), सेलुलर ब्लास्टोडर्म (2-3 एच), शुरुआती गैस्ट्रुला (3-12 एच), और देर से गैस्ट्रुला (12-24 एच) के दौरान डी मेलानोगास्टर में एफकेबीपी 12 / कैलस्टेबिन की अभिव्यक्ति को ट्रैक करने में सक्षम थे। इस पेपर में, हम पिछले अध्ययन में हर दृष्टिकोण के विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जिसमें क्लासिक पैराफिन सेक्शनिंग के लिए पूर्व-भ्रूण एम्बेडिंग, भ्रूण वर्गों के लिए पूर्व-कोटिंग स्लाइड उपचार, हिस्टो-केमिस्ट्री स्टेनिंग और इम्यूनोस्टेनिंग, और जीन अभिव्यक्ति की पहचान के लिए एमआरएनए इन-सीटू संकरण शामिल हैं।

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Protocol

1. अंगूर का रस अगर प्लेटों की तैयारी

  1. आसुत पानी के 150 मिलीलीटर में 5 ग्राम आगर और 5 ग्राम सुक्रोज जोड़ें। इसे माइक्रोवेव का उपयोग करके तब तक उबालें जब तक कि आगर और सुक्रोज पूरी तरह से भंग न हो जाएं। 100% अंगूर के रस के 50 मिलीलीटर और समाधान को एक साथ मिलाएं।
  2. 0.5% प्रोपियोनिक एसिड के लिए अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए 100% प्रोपियोनिक एसिड का 1 मिलीलीटर जोड़ें। प्रत्येक प्लेट में तैयार समाधान के 25 मिलीलीटर डालें। आगर के जमने के बाद, मीडिया को 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर करें।

2. कोटिंग स्लाइड

  1. डिटर्जेंट के साथ प्रीट्रीट स्लाइड्स. स्लाइड को नल के पानी से 3 बार और आसुत पानी से एक बार धोएं। फिर स्लाइड को 2 घंटे के लिए 45 डिग्री सेल्सियस ओवन में सुखाएं।
  2. पोटेशियम डाइक्रोमेट सल्फ्यूरिक एसिड समाधान (पोटेशियम डाइक्रोमेट के 20 ग्राम, आसुत पानी के 40 मिलीलीटर, और केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड के 400 मिलीलीटर) के बारे में 450 मिलीलीटर में स्लाइड को 24 घंटे के लिए विसर्जित करें। स्लाइड को नल के पानी से 3 बार और आसुत पानी से एक बार धोएं।
    1. स्लाइड को दो घंटे के लिए 45 डिग्री सेल्सियस ओवन में सुखाएं। 2 घंटे से अधिक के लिए 95% इथेनॉल में विसर्जित करें।
  3. आसुत पानी के 1 लीटर में क्रोमियम पोटेशियम सल्फेट के 0.5 ग्राम और जिलेटिन के 5 ग्राम जोड़ें। उपयोग करने से पहले 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में भंग करें। क्रोम फिटकरी जिलेटिन को लंबे समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. स्लाइड पर क्रोम फिटकरी जिलेटिन के 10 μL ड्रॉप और पूरी तरह से और समान रूप से समाधान के साथ स्लाइड की पूरी सतह को कवर। जिलेटिन पक्ष के साथ स्लाइड को 48 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में रखें। तैयार स्लाइड्स को बाद में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट:: यह एक महत्वपूर्ण कदम है। पूर्ण कोटिंग आवश्यक है। फल मक्खी और इसके भ्रूण के लिए, यह स्लाइड कोटिंग दृष्टिकोण पॉली-लाइसिन कोटिंग की तुलना में अधिक कुशल दिखाई देता है।

3. ड्रोसोफिला भ्रूण एम्बेडिंग

  1. ड्रोसोफिला भ्रूण संग्रह
    नोट: हमने ड्रोसोफिला भ्रूण को 0-2 घंटे (syncytial blastoderm), 2-3 घंटे (सेलुलर ब्लास्टोडर्म), 3-12 घंटे (शुरुआती गैस्ट्रुला) और 12-24 घंटे (देर से gastrula) 18 की चार अवधियों में एकत्र किया। प्रत्येक अवधि में मुख्य भ्रूण प्रकारों का अनुपात तालिका 1 में दिखाया गया है।
    1. एक प्लास्टिक संग्रह बोतल में 400-500 मक्खियों जगह और अंगूर का रस अगर प्लेट खमीर निकालने युक्त के साथ बोतल को कवर. ड्रोसोफिला भ्रूण कमरे के तापमान पर अंगूर के रस अगर पर रखे जाते हैं।
    2. भ्रूण की चार अवधियों को इकट्ठा करें, धीरे से पीबीएस के 2 एमएल (137 mM NaCl, 2.7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) को जोड़कर भ्रूण को फ्लोट करने के लिए प्रत्येक प्लेट में जोड़ें। लगभग 200 भ्रूणों को 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और भ्रूण को व्यवस्थित करने के लिए इसे 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  2. पूर्व-एम्बेडिंग
    1. 200 ड्रोसोफिला भ्रूण को 1.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। भ्रूण को व्यवस्थित करने के लिए ट्यूब को 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें, और फिर पिपेट के साथ supernatant को ध्यान से छोड़ दें। ट्यूब में 50% ब्लीच का 1 मिलीलीटर जोड़ें और इसे 2 मिनट के लिए धीरे से हिलाएं।
      नोट: ब्लीच को ताजा तैयार करना चाहिए, और एकत्र किए गए भ्रूण की मात्रा के आधार पर ब्लीच की मात्रा भिन्न हो सकती है।
    2. धीरे फिल्टर पेपर पर डालकर भ्रूण इकट्ठा करें और उन्हें हर समय पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ 3 बार धोएं।
    3. फिल्टर पेपर के साथ भ्रूण को एन-हेप्टेन के लगभग 5 मिलीलीटर में स्थानांतरित करें।
    4. मिश्रण को एक ताजा 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। मेथनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें और इसे धीरे से हिलाएं। अवसादन के बाद भ्रूण एकत्र करें।
    5. supernatant निकालें और पीबीएस के 1 मिलीलीटर में भ्रूण को 3-5 बार धोएं।
    6. 30 मिनट के लिए बोइन के समाधान (71% संतृप्त पिक्रिक एसिड, 24% फॉर्मेलिन, 5% एसिटिक एसिड) के 400 μL के साथ भ्रूण को ठीक करें। हर बार 5 मिनट के लिए पीबीएस के 1 मिलीलीटर में निश्चित भ्रूण को 3 बार धोएं।
    7. भ्रूण को एकत्रित करने के लिए, नमूनों को रबर स्टॉपर में स्थानांतरित करें और पीबीएस को हटा दें।
    8. 1.2% agarose-PBS समाधान तैयार करें और 60 डिग्री सेल्सियस पर समाधान रखें। उन्हें एक आगर ब्लॉक में ठीक करने के लिए भ्रूण पर 1.2% agarose-PBS समाधान के 200 μL जोड़ें।
    9. ब्लॉक को स्टॉपर से बाहर निकालें और ब्लॉक को पीबीएस में स्टोर करें।
      नोट: पूर्व एम्बेडिंग दृष्टिकोण के दौरान, प्रो-वार्मिंग सफल होने के लिए महत्वपूर्ण है। हम दृढ़ता से सुझाव देते हैं कि सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और माइक्रोपिपेट युक्तियां, जिनका उपयोग इस चरण में किया जाएगा, को ऑपरेटिंग से पहले पूरी तरह से पूर्व-गर्म होना चाहिए।
  3. पैराफिन एम्बेडिंग
    1. 35% इथेनॉल, 50% इथेनॉल, 75% इथेनॉल और 85% इथेनॉल में पूर्व-एम्बेडेड आगर ब्लॉक को 15 मिनट के लिए विसर्जित करें। फिर 95% इथेनॉल और 100% इथेनॉल में 2 बार डुबकी लगाएं।
      नोट्स: ब्लॉक में भ्रूण की संख्या के आधार पर 15-30 मिनट के लिए एक वर्गीकृत फिक्सेटिव के बाद प्रत्येक के ब्लॉक वॉल्यूम के बारे में 5-10x आवश्यक है।
    2. 15 मिनट के लिए 100% इथेनॉल और जाइलीन (1: 1 अनुपात) समाधान में भ्रूण ब्लॉक को विसर्जित करें।
    3. भ्रूण ऊतक को पारदर्शी बनाने के लिए 1 मिनट के लिए जाइलीन में ब्लॉक स्थानांतरित करें।
    4. 30 मिनट के लिए xylene और पैराफिन (1: 1 अनुपात) में ब्लॉक को डुबोएं।
    5. पैराफिन I, पैराफिन II, और पैराफिन III में ब्लॉक को हर बार 2 घंटे के लिए डुबोएं।
    6. पहले से पैराफिन के साथ एम्बेडिंग बॉक्स भरें, और फिर धीरे से और क्षैतिज रूप से एम्बेडिंग बॉक्स के नीचे ब्लॉक को स्थानांतरित करें। पैराफिन स्वाभाविक रूप से ठोस होने के बाद, ठोस पैराफिन ब्लॉक को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      नोट्स: पूर्व-एम्बेडेड नमूना cryosection में निम्न चरणों का पालन करके उपयोग किया जा सकता है। भ्रूण के बाद पूर्व एम्बेडेड agarose के साथ के रूप में ऊपर वर्णित कर रहे हैं, नमूने बस OCT यौगिक में एम्बेडेड कर रहे हैं. बाद में, क्रायोसेक्शन को नियमित क्रायोसेक्शन प्रोटोकॉल के अनुसार किया जा सकता है। इसके बाद, वर्गों पर नियमित रूप से धुंधला दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है।

4. Hematoxylin-eosin धुंधला

  1. ड्रोसोफिला भ्रूण वर्गों को तैयार करें। 15 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में तैयार अनुभागों को रखें और फिर 10 मिनट के लिए 2 बार जाइलीन में वर्गों को डुबोएं। 2 मिनट के लिए 100% इथेनॉल और जाइलीन (1: 1 अनुपात) में एक बार वर्गों को डुबोएं।
  2. 100% इथेनॉल I, 100% इथेनॉल II, 95% इथेनॉल, 85% इथेनॉल, 75% इथेनॉल, 50% इथेनॉल, और 3 मिनट के लिए आसुत पानी में वर्गों को हाइड्रेट करें।
  3. 2 मिनट के लिए hematoxylin समाधान के साथ वर्गों दाग. स्लाइड को 1% एसिड अल्कोहल समाधान (हाइड्रोक्लोरिक एसिड के 1 एमएल, 70% इथेनॉल के 100 एमएल) में जल्दी से डुबोएं और स्लाइड को आसुत पानी में धोलें।
  4. स्लाइड को 50% इथेनॉल, 75% इथेनॉल, 85% इथेनॉल और 95% इथेनॉल में क्रमिक रूप से डुबोएं।
  5. 1 मिनट के लिए eosin समाधान के साथ वर्गों दाग.
  6. स्लाइड को 95% इथेनॉल I, 95% इथेनॉल II, 95% इथेनॉल III, 100% इथेनॉल I, 100% इथेनॉल II और 100% इथेनॉल III में हर बार 1 मिनट के लिए निर्जलित करें।
  7. स्लाइड को 100% xylene I, 100% xylene II, और 100% xylene III में हर बार 5 मिनट के लिए साफ़ करें।
  8. निर्माता के निर्देशों के अनुसार तटस्थ balsam के साथ स्लाइड माउंट.

5. आवधिक एसिड चांदी methenamine धुंधला

  1. डिपैराफिनाइज़ और ड्रोसोफिला भ्रूण के पैराफिन वर्गों को आसुत पानी में हाइड्रेट करें।
  2. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 1% आवधिक एसिड में वर्गों को ऑक्सीकरण करें।
  3. प्रत्येक 1 मिनट के लिए आसुत पानी में स्लाइड को 3 बार कुल्ला।
  4. ताजा फ़िल्टर किए गए चांदी मेथेनामाइन काम करने वाले समाधान (3% मेथेनामाइन, 5% सिल्वर नाइट्रेट, 5% सोडियम बोरेट समाधान) के बारे में 40 मिलीलीटर में स्लाइड्स को 1 घंटे और 20 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर स्लाइड्स को 1 मिनट के लिए आसुत पानी में कुल्ला करें।
  5. 2 मिनट के लिए 0.2% सोने के क्लोराइड में स्लाइड टोन और फिर 1 मिनट के लिए आसुत पानी में स्लाइड कुल्ला।
  6. स्लाइड को 3 मिनट के लिए 3% सोडियम थायोसल्फेट में रखें और फिर स्लाइड को 1 मिनट के लिए आसुत पानी में कुल्ला करें।
  7. 30 s के लिए hematoxylin में स्लाइड counterstain. 3-5 मिनट के लिए बहते नल के पानी में स्लाइड धोएं।
  8. स्लाइड को 70% इथेनॉल, 80% इथेनॉल, 95% इथेनॉल I, 95% इथेनॉल II, 95% इथेनॉल III, 100% इथेनॉल I, और 100% इथेनॉल II में 5 मिनट के लिए निर्जलित करें।
  9. स्लाइड को 100% xylene I, 100% xylene II और 100% xylene III में 5 मिनट के लिए साफ़ करें।
  10. निर्माता के निर्देशों के अनुसार तटस्थ balsam में स्लाइड माउंट.

6. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. मानक प्रोटोकॉल 19 का पालन करते हुए पीबीएस के लिए ड्रोसोफिला भ्रूण के पैराफिन वर्गों को डीपैराफिनाइज़ और रीहाइड्रेट करें।
  2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मेथनॉल में 0.3% H2O2 के साथ स्लाइड का इलाज करें और प्रकाश से बचें।
  3. सब्जी स्टीमर में स्लाइड के साथ एक कंटेनर में लगभग 100 डिग्री सेल्सियस के लिए उपयुक्त एंटीजन पुनर्प्राप्ति बफर को पूर्व-गर्म करें। कंटेनर में ढक्कन भी होना चाहिए। स्लाइड्स को कंटेनर में रखें। स्टीमर का ढक्कन बंद कर दें।
    1. कंटेनर को इस बिंदु से 20 मिनट के लिए स्टीमर में रखें। ध्यान दें कि स्लाइड कंटेनर के ढक्कन को पूरी तरह से कड़ा नहीं किया जाना चाहिए ताकि भाप लेने की प्रक्रिया के दौरान जल वाष्प प्रवेश कर सके।
  4. स्लाइड को धीरे-धीरे पीबीएस-टी (ट्वीन-20, पीएच 7.2 के साथ पीबीएस) में 5 मिनट के लिए 3 बार धोने से पहले कमरे के तापमान पर लौटने की अनुमति दें, और फिर पीबीएस में स्लाइड्स को 1 मिनट के लिए 3 बार कुल्ला करें।
  5. पीबीएस में 1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के साथ स्लाइड को कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए ब्लॉक करें।
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी (एंटी-FKBP12 पर 1:1000 पर) के साथ स्लाइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर या 4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  7. पीबीएस-टी में स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए 4 बार धोएं।
  8. HRP लेबल बहुलक द्वितीयक एंटीबॉडी (विरोधी खरगोश, 1: 5,000) के साथ संयुग्मित के साथ स्लाइड कमरे के तापमान पर 90 मिनट के लिए लागू होते हैं। फोटो ब्लीचिंग से बचने के लिए अंधेरे में ऐसा करें।
  9. पीबीएस-टी में स्लाइड को 5 मिनट के लिए 3 बार धोएं।
  10. 5% 3,3'-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) के साथ स्लाइड को 2-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि प्रतिक्रिया उत्पादों का रंग माइक्रोस्कोप के तहत उपयुक्त न हो।
  11. 30 s के लिए hematoxylin में स्लाइड counterstain और आसुत पानी में स्लाइड को 5 मिनट प्रत्येक के लिए 2 बार धोलें।
  12. स्लाइड को 50% इथेनॉल, 70% इथेनॉल, 90% इथेनॉल, 95% इथेनॉल और 1 मिनट प्रत्येक के लिए 100% इथेनॉल में निर्जलित करें।
  13. स्लाइड को 100% xylene I, 100% xylene II और 100% xylene III में 5 मिनट के लिए साफ़ करें।
  14. निर्माता के निर्देशों के अनुसार तटस्थ balsam में स्लाइड माउंट.

7. इन-सीटू संकरण

नोट: ड्रोसोफिला भ्रूण वर्गों को 0.01% डायथाइल पायरोकार्बोनेट (डीईपीसी) उपचारित पानी के साथ तैयार किया गया था। सीटू संकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी सामान पहले से ही डीईपीसी रात भर उपचार लागू करते हैं।

  1. राइबोप्रोब तैयारी
    1. Linearize टेम्पलेट डीएनए एक प्रतिबंध एंजाइम साइट पर एक प्रतिबंध एंजाइम से नीचे की ओर क्लोन डालने से नीचे की ओर काटने के द्वारा एक प्रतिबंध एंजाइम है कि 5 'overhangs बनाता है का उपयोग कर. Linearization के बाद, फिनोल / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण, और बाद में इथेनॉल वर्षा के माध्यम से टेम्पलेट डीएनए को शुद्ध करें। मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करें।
    2. एक RNase मुक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए शुद्ध टेम्पलेट डीएनए के 1 μg जोड़ें. सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को बर्फ पर रखें। कुल मात्रा 13 μL के लिए पर्याप्त DEPC-उपचारित पानी जोड़ें।
      1. फिर क्रम में निम्नलिखित अभिकर्मकों को जोड़ें: 10x NTP लेबलिंग मिश्रण के 2 μL, 10x प्रतिलेखन बफर के 2 μL, संरक्षक RNase अवरोधक के 1 μL, RNA पोलीमरेज़ SP6 या RNA पोलीमरेज़ T7 के 2 μL।
    3. शीघ्र ही पिपेटिंग और सेंट्रीफ्यूज द्वारा प्रतिक्रिया को मिलाएं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: लंबे समय तक ऊष्मायन लेबल आरएनए की उपज में वृद्धि नहीं करते हैं। प्रतिक्रिया ट्यूब पर लागू एक छोटा स्पिन (~ 800 आरपीएम) अगले चरण को जारी रखने से पहले महत्वपूर्ण है। यह स्पिन सभी सामग्री, जो इनक्यूबेशन से उत्पन्न हो सकता है, ट्यूब के तल पर आने की अनुमति देगा।
    4. टेम्पलेट डीएनए को हटाने और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के लिए RNase-मुक्त DNase I के 2 μL जोड़ें।
    5. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 200 mM EDTA (pH 8.0) के 2 μL जोड़ें।
      नोट: डीआईजी-लेबल वाले आरएनए जांच को एक वर्ष के लिए इथेनॉल में -15 से -25 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. ड्रोसोफिला भ्रूण अनुभाग का पूर्व-संकरण
    1. ड्रोसोफिला भ्रूण के वर्गों को 48 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।
    2. 10 मिनट के लिए 100% xylene में स्लाइड्स को दो बार deparaffinize करें।
    3. 100% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 90% इथेनॉल, 70% इथेनॉल, और 5 मिनट के लिए 50% इथेनॉल में क्रमिक रूप से डूबकर स्लाइड को हाइड्रेट करें।
    4. ऊतक से फिक्सेटिव समाधान / बोइन के समाधान को हटाने के लिए 5 मिनट 3 बार पीबीएस में स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें।
    5. स्लाइड को 100 mmol/L ग्लाइसिन/PBS समाधान से 5 मिनट के लिए 2 बार धोएं।
    6. पीबीएस के साथ स्लाइड को 5 मिनट के लिए 2 बार धोएं।
    7. झिल्ली permeabilize करने के लिए 15 मिनट के लिए पीबीएस में 0.3% Triton X-100 के साथ स्लाइड इनक्यूबेट.
    8. पीबीएस के साथ स्लाइड को 5 मिनट के लिए 3 बार धोएं।
    9. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 15 μg / mL RNase-मुक्त proteinase K में स्लाइड इनक्यूबेट करें।
    10. पाचन को रोकने के लिए 3 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ स्लाइड को इनक्यूबेट करें।
    11. पीबीएस के साथ स्लाइड को 5 मिनट के लिए 2 बार धोएं।
    12. 100 mM triethanolamine बफर (पीएच 8.0) में स्लाइड्स को 0.25% (v / v) एसिटिक एनहाइड्राइड के साथ 5 मिनट प्रत्येक के लिए 2 बार इनक्यूबेट करें।
    13. स्लाइड नमी कक्ष में DEPC पानी जोड़ें। स्लाइड पर पूर्व-संकरण समाधान के 20 μL जोड़ें (जिसमें सैल्मन शुक्राणु डीएनए के 100 μg / mL शामिल हैं)। स्लाइड नमी कक्ष में स्लाइड रखो. स्लाइड्स को 42 °C पर 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: गीले बॉक्स के ढक्कन की जकड़न सुनिश्चित करना आवश्यक है और यह कि गीले बॉक्स को हमेशा पूर्व-संकरण समाधान और निम्नलिखित संकरण समाधान के ऊतक से वाष्पीकरण और विचलन को रोकने के लिए क्षैतिज में रखा जाता है।
  3. ड्रोसोफिला भ्रूण अनुभाग का संकरण
    1. पूर्व संकरण समाधान निकालें और 0.2x एसएससी (150 mM सोडियम क्लोराइड, 15 mM सोडियम साइट्रेट, pH 7.0) के साथ स्लाइड को 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार धोएं। ऊतक के नमूनों के चारों ओर अतिरिक्त 0.2x एसएससी को पोंछें।
    2. एक पिपेट के साथ प्रोब संकरण समाधान के 30 μL लागू करें (जिसमें पूर्व-संकरण समाधान में पतला करके डिगॉक्सिन-लेबल वाले आरएनए प्रोब के 2-6 एनजी होते हैं)। स्लाइड नमी कक्ष में स्लाइड्स को लगभग 20 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: पिछले नोट के सुझाव के रूप में कैप-जकड़न पर सुनिश्चित करें। अन्यथा, या तो पूर्व-संकरण या पूर्व-संकरण के रिसाव के कारण होने वाला सूखा-अप स्लाइड्स में छद्म-सकारात्मक सहित गंदी पृष्ठभूमि उत्पन्न करेगा।
  4. संकरण
    1. संकरण समाधान निकालें और 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक 15 मिनट के लिए 4 बार 4x एसएससी समाधान के साथ स्लाइड धोएं।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए RNase A के 20 μg / mL के साथ 2x SSC समाधान में स्लाइड को धोएं।
    3. स्लाइड को 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 1x एसएससी समाधान में धोएं।
    4. स्लाइड को 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 0.5x एसएससी समाधान में धोएं।
    5. स्लाइड को 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 0.1x एसएससी समाधान में धोएं।
    6. पीबीएस के साथ स्लाइड को 5 मिनट के लिए 3 बार धोएं।
    7. 1 मिनट के लिए वॉशिंग बफर (100 mM maleic acid, 150 mM NaCl, 0.3% (v/ v) Tween 20, pH 7.5) में स्लाइड धोएं।
    8. ताजा तैयार ब्लॉकिंग समाधान के 100 मिलीलीटर में स्लाइड को इनक्यूबेट करें (ट्वीन 20 के बिना मैलिक एसिड बफर में 2% भेड़ सीरम) 30 मिनट के लिए।
    9. 45 मिनट के लिए एंटीबॉडी समाधान के 20 मिलीलीटर में स्लाइड इनक्यूबेट करें।
      1. प्रत्येक उपयोग से पहले मूल शीशी में 10,000 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए एंटीबॉडी को सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह से आवश्यक मात्रा को सावधानीपूर्वक पाइप करें। समाधान को अवरुद्ध करने में एंटी-डिगॉक्सिजेनिन-एपी 1: 5000 (150 mU / mL) पतला करें।
    10. अनबाउंड एंटीबॉडी संयुग्म को हटाने के लिए प्रत्येक को 15 मिनट के लिए 2 बार धोने के बफर के 100 मिलीलीटर में स्लाइड को धोएं।
    11. 2-5 मिनट के लिए पता लगाने बफर (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9.5) के 20 mL में स्लाइड को संतुलित करें।
    12. स्लाइड नमी कक्ष में ताजा तैयार रंग सब्सट्रेट समाधान के 10 मिलीलीटर के साथ स्लाइड इनक्यूबेट करें। प्रतिक्रिया कुछ ही मिनटों में शुरू होती है और 16 घंटे के बाद पूरी हो जाती है। रंग विकसित होने के दौरान हिलाएं या मिश्रण न करें।
    13. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 5 मिनट के लिए 50 मिलीलीटर आसुत पानी के साथ स्लाइड को धोएं।
    14. नमूने को अंधेरे में रात भर सुखाएं।
    15. 70% इथेनॉल, 80% इथेनॉल, 90% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 100% इथेनॉल I और 100% इथेनॉल II में स्लाइड को 3 मिनट के लिए निर्जलित करें।
    16. स्लाइड को 100% xylene I, 100% xylene II और 100% xylene III में 20 मिनट के लिए प्रत्येक के लिए साफ़ करें।
    17. तटस्थ balsam के साथ स्लाइड माउंट.
    18. दस्तावेज़ छवियों और उल्टे माइक्रोस्कोपी और निर्माता सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण. या तो अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ या भ्रूण के विभेदक क्षेत्र के भीतर सकारात्मक संकेत के घनत्व के अनुसार ImageJ का उपयोग करके वितरण विश्लेषण करें।
      नोट: चरण 7.4.12 में ताजा तैयार रंग सब्सट्रेट समाधान के साथ इनक्यूबेशन के दौरान, प्रतिक्रिया रंग को एक नंगे आंख से भी देखा जा सकता है। स्टीरियोस्कोप के तहत रंग के विकास का निरीक्षण कैसे किया जा सकता है, इस पर यह अवलोकन। एक बार प्रतिक्रिया रंग उचित है और प्रतिक्रिया को रोकने के लिए चरण 7.4.13 किया जा सकता है।

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Representative Results

आंकड़े परीक्षण और प्रयोग के लिए ग्लास स्लाइड सतह पर उच्च लिपिड और चिटिन युक्त कोरियन ड्रोसोफिला भ्रूण (तालिका 1) को संलग्न करने की चुनौती को दूर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। चित्रा 1 में दिखाए गए क्रोम एलम जिलेटिन स्लाइड-कोटिंग विधि का उपयोग करते हुए, हमने स्लाइड की सतह पर ड्रोसोफिला भ्रूण के लगाव को बढ़ाया, जबकि चित्र 2 में दिखाए गए भ्रूण पूर्व-एम्बेडिंग विधि प्रोटीन के गतिशील वितरण के कुशल निरीक्षण के लिए अनुमति देती है और आरएनए DmFKBP12 / Calstabin सभी चार शुरुआती विकास चरणों में (यानी, syncytial blastoderm, सेलुलर ब्लास्टोडर्म, सेलुलर ब्लास्टोडर्म, ड्रोसोफिला भ्रूण के शुरुआती और देर से गैस्ट्रुला)। चित्रा 3 एंटीबॉडी के प्रोटीन वितरण को दर्शाता है जो syncytial और सेलुलर ब्लास्टोडर्म चरणों में FKBP12 / Calstabin का पता चला है। इन हिस्टोकेमिकल परिणामों से, यह देखा जा सकता है कि FKBP12 अभिव्यक्ति syncytial blastoderm (पैनल A से H) में कम ध्रुवीकृत है, और फिर trophectoderm उपकला के नीचे तहखाने झिल्ली के भीतर स्थानीयकरण शुरू करने के लिए पीछे के ध्रुवों (पैनल I से S) की तुलना में पूर्वकाल में पाए जाने वाले अधिक अभिव्यक्ति के साथ एक ढाल बनाने के लिए। आखिरकार, DmFKBP12 / Calstabin प्रोटीन प्रारंभिक और देर से gastrula भ्रूण चरणों (चित्रा 4) में मनाया की तुलना में कम extracellular वितरण के साथ आदिम भ्रूण ऊतकों के कुछ वास्तुशिल्प घटकों के लिए प्रतिबंधित हो जाता है। दिलचस्प बात यह है कि उपर्युक्त वर्णित गतिशील प्रोटीन वितरण DmFKBP12 (चित्रा 5) के इसी mRNA स्तरों के साथ नहीं है, जो प्रोटीन अभिव्यक्ति को अभी भी अज्ञात पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शन आणविक तंत्र का परिणाम होने का संकेत देता है। सीएजी स्लाइड-कोटिंग और पूर्व-एम्बेडिंग की वर्णित विधि हमें कैल्शियम सिग्नलिंग में डीएमएफकेबीपी 12 के महत्व की आगे जांच करने और माइक्रो-इंजेक्शन आरएनए हस्तक्षेप 19 जैसी अन्य तकनीकों के संयोजन के दौरान इस अभी भी अज्ञात आणविक तंत्र का पता लगाने की अनुमति देगी।

इस अध्ययन में, हम विभिन्न विकास चरणों में ड्रोसोफिला भ्रूण के हिस्टोलॉजी, हिस्टोकेमिकल और प्रतिरक्षा-हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए क्रोम फिटकरी जिलेटिन स्लाइड-कोटिंग और पूर्व-एम्बेडिंग विधि विकसित करते हैं। इस पूर्व-एम्बेडिंग विधि का उपयोग करते हुए, भ्रूण को क्रायो- और पैराफिन सेक्शनिंग दोनों के लिए प्रभावी ढंग से एकत्र किया जाता है जो अनुदैर्ध्य क्रॉस सेक्शन के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। इसने हमें निर्णायक विकास चरणों के दौरान इस प्रोटीन के लिए विकसित अभिव्यक्ति पैटर्न का वर्णन करने की अनुमति दी, प्रोटीन की अभिव्यक्ति को आंत, मस्तिष्क और कनेक्टिंग तंत्रिका तंत्र जैसे प्रमुख शारीरिक प्रणालियों के विकास से जोड़ा। इन तरीकों को नियोजित करके, हम निश्चित चरणों में ड्रोसोफिला भ्रूण के विकास के दौरान प्रोटीन और एमआरएनए एफकेबीपी 12 / कैलस्टेबिन को विनियमित करने वाले RyR के गतिशील वितरण की जांच करने में सक्षम थे, जिसमें सिंकटाइटियल और सेलुलर ब्लास्टोडर्म, और शुरुआती और देर से गैस्ट्रुलेशन चरण शामिल थे। हमारे डेटा से पता चला है कि FKBP12 / Calstabin प्रोटीन और इसके आरएनए syncytial blastoderm में बहुत जल्दी पता लगाया जा सकता है। जैसे-जैसे भ्रूण विकसित होता है, FKBP12 ब्लास्टोडर्म के उपकला के नीचे बेसल सेल परत में अधिक सघनता से वितरित हो जाता है। FKBP12 / Calstabin प्रोटीन तब गतिशील रूप से अपनी अभिव्यक्ति को मजबूत करता है और भ्रूण की मांसपेशियों से युक्त ऊतकों में इसके वितरण को अलग करता है, जिसमें स्टोमोडेयम, स्टोमोडेयम और पोस्टीरियर मिडगट रूडिमेंट शामिल हैं। ब्लास्टोडर्म की शुरुआत से देर से गैस्ट्रुलेशन चरणों तक इन वितरण परिवर्तनों को विकासशील न्यूरोनल सिस्टम में भी वर्णित किया गया है जिसमें न्यूरोब्लास्ट्स, वेंट्रल तंत्रिका, सुप्रासोफेगल गैंग्लियन और मस्तिष्क शामिल हैं। जबकि FKBP12 / Calstabin में ये गतिशील परिवर्तन विकास में इसके महत्व पर संकेत देते हैं, वे प्रोटीन के एमआरएनए स्तरों में परिलक्षित नहीं होते हैं, प्रोटीन अभिव्यक्ति के अभी तक अज्ञात नियामक पर इशारा करते हैं जिसे पहचाना जाना बाकी है।

Figure 1
चित्र 1: ड्रोसोफिला भ्रूण में DmFKBP12 प्रोटीन और mRNA के वितरण की कल्पना करने के लिए इम्यूनोलॉजी और आरएनए इन-सीटू संकरण में उपयोग किए जाने वाले पैराफिन-वर्गों के लिए क्रोम फिटकरी जिलेटिन (CAG) कोटिंग विधि का स्केच। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: ड्रोसोफिला भ्रूण के विकास में FKBP12 और DmFKBP12 की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के लिए पूर्व-एम्बेडिंग विधि का स्केच। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ड्रोसोफिला भ्रूण के syncytial और सेलुलर ब्लास्टोडर्म्स में DmFKBP12 प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल। (A-D) Syncytial blastoderm के एच एंड ई धुंधला. प्रारंभिक सिंक्टाइल ब्लास्टोडर्म में DmFKBP12 वितरण का परिमाणीकरण D. (E-G) पैनलों में प्रस्तुत किया गया है जो प्रारंभिक सिंक्टाइल ब्लास्टोडर्म को प्रस्तुत करते हैं जिसमें नाभिक विभाजन के अधीन होते हैं। देर से syncytial ब्लास्टोडर्म में DmFKBP12 वितरण का परिमाणीकरण एच में प्रस्तुत कर रहे हैं। (I-L) सेलुलर ब्लास्टोडर्म का एच एंड ई धुंधला। देर से सेलुलर ब्लास्टोडर्म में DmFKBP12 वितरण की योग्यता L. (M-S) पैनलों में प्रस्तुत किया गया है जो सेलुलर ब्लास्टोडर्म में DmFKBP12 प्रोटीन के वितरण को प्रदर्शित करता है। O , M-N के बड़े विचारों को दर्शाता है। (P-R) एम-ओ में दिखाए गए पहले सेलुलर ब्लास्टोडर्म मौजूद पैनल। प्रारंभिक सेलुलर ब्लास्टोडर्म में DmFKBP12 वितरण का परिमाणीकरण S में प्रस्तुत किया गया है। A, E, I, M और P के लिए स्केल बार 60 μm है, B, C, F, J, K, N, Q और R के लिए 40 μm है, और G के लिए, O 20 μm है। AP, अंडे का पूर्वकाल ध्रुव; YK, जर्दी; सीएन, दरार नाभिक; पीपी, अंडे के पीछे ध्रुव; बीएलडी, ब्लास्टोडर्म, नाभिक और कोशिका; बीएम, तहखाने झिल्ली. डेटा को माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है± SEM. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. डेटा परिमाणित करना ImageJ के साथ किया गया था। सबसे पहले, भूरे रंग के उत्पादों को अन्य सभी रंगों को हटाने के साथ छवि में बने रहे। दूसरे, भूरे रंग की छवि को काले और सफेद रंग में बदल दिया गया था और परिणामस्वरूप परिमाणीकरण के लिए इसके घनत्व की गणना की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ड्रोसोफिला भ्रूण के शुरुआती और देर से गैस्ट्रुलेशन चरणों में DmFKBP12 प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल। ए, डी और जी गैस्ट्रुलेशन चरण में ड्रोसोफिला भ्रूण के एच एंड ई धुंधला दिखाते हैं। B, C, E और F प्रारंभिक गैस्ट्रुलेशन चरण में DmFKBP12 के वितरण को प्रदर्शित करते हैं। एच, आई, और जे-एल देर से गैस्ट्रुलेशन चरण में डीएमएफकेबीपी 12 के वितरण को प्रदर्शित करते हैं। प्रारंभिक गैस्ट्रूले में DmFKBP12 वितरण के परिमाणीकरण को M में प्रस्तुत किया गया है। A, D, E और G के लिए स्केल बार 80 μm है, B, C, F, H, I और J-L के लिए 40 μm है। PP, अंडे का पश्च ध्रुव; NBL, neuroblasts; एसटी, stomodaeum; YK, जर्दी; पीएमजी, पीछे midgut रूडिमेंट; बीआर, मस्तिष्क, supraesophageal नाड़ीग्रन्थि; वीएनएस, वेंट्रल तंत्रिका तंत्र; PV, proventriculus; MUS, मांसपेशी; MGC, midgut caecum; एएमजी, पूर्वकाल midgut rudipighian; MMG, मध्य midgut; टीआर, श्वासनली। डेटा को माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है± SEM. ns, कोई महत्वपूर्ण नहीं; ** पी < 0.01, *** पी < 0.001. डेटा परिमाणीकरण ImageJ 1.50d के साथ शेष उत्पाद-भूरे रंग और काले और सफेद छवि में बदलने के द्वारा किया गया था, और पिछले आंकड़े किंवदंती में वर्णित काले और सफेद रंग के घनत्व गणना के बाद। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ड्रोसोफिला भ्रूण के भ्रूण के विकास के दौरान DmFKBP12 mRNA के इन-सीटू स्थानीयकरण। एक Syncytial ब्लास्टोडर्म चरण में DmFKBP12 mRNA के इन-सीटू स्थानीयकरण को दर्शाता है जब FKBP12 mRNA भ्रूण के साइटोप्लाज्म में व्यक्त किया गया था। बी और सी सेलुलर ब्लास्टोडर्म चरण में DmFKBP12 mRNA के इन-सीटू स्थानीयकरण को दिखाते हैं जब FKBP12 mRNA ब्लास्टोडर्म कोशिकाओं की आंतरिक सीमाओं में व्यक्त किया गया था। डी और ई प्रारंभिक गैस्ट्रुलेशन चरण में FKBP12 mRNA के इन-सीटू स्थानीयकरण का प्रदर्शन करते हैं। इस चरण के दौरान, यह मुख्य रूप से विकासशील आंत में स्थानीयकृत है। एफ, जी और एच देर से गैस्ट्रुलेशन चरण में FKBP12 mRNA के इन-सीटू स्थानीयकरण को दिखाते हैं, जब mRNA मांसपेशियों और आंत में व्यक्त किया जाता है। मैं DmFKBP12 mRNA का सकारात्मक नियंत्रण है। J DmFKBP12 mRNA का नकारात्मक नियंत्रण है। A, C, E, G और I के लिए स्केल बार 5 μm है, B, D, F, I और J के लिए 10 μm है। YK, जर्दी; सीएन, दरार नाभिक; बीएलडी, ब्लास्टोडर्म, नाभिक और कोशिकाएं; सीएफ, पूर्वकाल तिरछी फांक, सेफलिक फर्रो। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

भ्रूणीय अवस्थाएँ 0-2 घंटे (%) 2-3 घंटे (%) 3-12 घंटे (%) 12-24 घंटे (%)
समकालिक ब्लास्टोडर्म 90.8 0 0 0
सेलुलर ब्लास्टोडर्म 6.9 91.54 0 0
प्रारंभिक गैस्ट्रुला 2.3 4.23 91.1 0
देर से gastrula 0 4.23 8.93 93.3

तालिका 1: ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के विकास में विभिन्न चरणों का भ्रूण संग्रह

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Discussion

RyRs और IP3Rs मध्यस्थता कैल्शियम सिग्नलिंग कशेरुक और अकशेरुकी जानवरों दोनों की कई शारीरिक और रोग प्रक्रिया में एक मौलिक मार्ग है1,2,3,4. मनुष्यों में, बिंदु उत्परिवर्तन, जैसे CPVT-संबद्ध R4496C उत्परिवर्तन, RyR2 जीन में कार्डियोमायोसाइट्स के सार्कोप्लाज्मिक रेटिकुलम से कैल्शियम रिसाव का कारण बनता है, जिसके परिणामस्वरूप कार्डियक डिसफंक्शन होता है। ये उत्परिवर्तन शारीरिक गतिविधि के दौरान अचानक हृदय की मृत्यु के उच्च जोखिम के साथ अतालता के रूप में मौजूद होते हैं, और इस उत्परिवर्तन को ले जाने के लिए इंजीनियर किए गए माउस मॉडल में पुन: प्रस्तुत करने योग्य होते हैं। व्यायाम की स्थिति के तहत, इस कैल्शियम-रिसाव उत्परिवर्तन को ले जाने वाले चूहों ने कार्डियक अचानक मौत का अनुभव किया, जो इसके वाइल्डटाइप काउंटर पार्ट्स 18,20,21,22 द्वारा प्रदर्शित नहीं किया गया था। FKBP12, एक RyRs नियामक, दिल में, के overexpression, माउस मॉडल 22,23 में कार्डियक मृत्यु से जुड़े पोटेशियम चैनलों की उच्च दरों के साथ मेल खाती है, एक खोज है कि FKBP12 नॉकआउट mice10,11 के फेनोटाइप के साथ मेल खाती है। जैसा कि RyR1, RyR 2 और RyR3 और उनके नियामक FKBPs सहित स्तनधारी RyRs का तीन दशकों से अधिक समय से अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है, कार्डियोपैथोलॉजी, कंकाल की मांसपेशियों की शिथिलता और प्रारंभिक विकास के बाद मस्तिष्क समारोह उपलब्धि में शामिल अधिकांश कार्यवाही के साथ-साथ ऑन्कोजेनेसिस अनुसंधान 24,25 का ध्यान केंद्रित कर रहे हैं।

कशेरुकियों के विपरीत, जिनमें RyR के तीन आइसोफोर्म होते हैं, ड्रोसोफिला मक्खियों में केवल एक RyR1,2,3,5 होता है। हाल ही में, हमने ड्रोसोफिला भ्रूण विकास के शुरुआती चरणों में ड्रोसोफिला आरआईआर (डीएमआरआईआर) के महत्वपूर्ण कार्य का प्रदर्शन किया। हमने प्रारंभिक विकास के दौरान ड्रोसोफिला भ्रूण में ट्रांसलेशनल और ट्रांसक्रिप्शनल दोनों स्तरों पर DmRyR अभिव्यक्ति को उजागर किया: syncytial ब्लास्टोडर्म चरण, ब्लास्टोडर्म चरण, और शुरुआती गैस्ट्रुला चरणों। सभी चार चरणों में, DmFKBP12 mRNA को पूरे भ्रूण में समान रूप से वितरित किया गया था और एक ही स्तर पर बना रहा, जबकि जीन की प्रोटीन अभिव्यक्ति अभिव्यक्ति प्रोफाइल के साथ अत्यधिक गतिशील थी जो पूर्वकाल में ध्रुवीकृत थी और फिर कुछ सेल परतों में वितरित की गई थी। इस प्रकाशन में हमने जिन पद्धतिगत प्रोटोकॉल का उपयोग किया था, वे प्रतिनिधि परिणामों की उच्च मात्रा प्राप्त करने की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण थे।

पैराफिन सेक्शनिंग मात्रात्मक विश्लेषण के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति के हिस्टोलॉजिकल डिटेक्शन के लिए एक बुनियादी और व्यावहारिक तकनीक है। पैराफिन अनुभाग वयस्क कीट में प्रोटीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक मूलभूत उपकरण हैं। हालांकि, इन तकनीकों को उनके लिपिड-समृद्ध भ्रूण और चिटिन-समृद्ध चोरियन के कारण कीड़ों के विकास में दोहराना मुश्किल हो गया है, जो एम्बेडिंग, संरक्षण और स्लाइड को बढ़ते हुए मुश्किल बनाते हैं। भ्रूण में पाए जाने वाले लिपिड स्लाइड की सतह पर भ्रूण वर्गों के लगाव के लिए अनुमति देने वाले बलों के साथ हस्तक्षेप करते हैं। जबकि कोरियोन में पाया जाने वाला चिटिन भौतिक बाधाओं को प्रस्तुत करता है जो भ्रूण को रासायनिक और यांत्रिक हस्तक्षेप से बचाता है, यह भ्रूण के नमूनों के अनुलग्नकों को कांच की स्लाइड तक भी प्रतिबंधित करता है। जबकि ये विशेषताएं कीट लार्वा की उच्च जीवित रहने की दर सुनिश्चित करती हैं, यह उनके इन-सीटू प्रोटीन और एमआरएनए अभिव्यक्ति का अध्ययन करने की क्षमता में बहुत बाधा डालती है। यह समस्या कई मायनों में परेशान करने वाली रही है। ट्वीन -20 जैसे सतह डिटर्जेंट का उपयोग अक्सर ड्रोसोफिला भ्रूण को अलग करता है और अध्ययन के लिए उपलब्ध भ्रूण की संख्या को कम करता है। इस तकनीक को इन-सीटू संकरण के लिए एमआरएनए का अनावरण करने के लिए 20 घंटे के लिए इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है, लेकिन स्लाइड से नमूनों को लगभग पूरी तरह से अलग कर देता है। एमआरएनए के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और एंटी-सेंस विशिष्ट मान्यता करने से पहले क्रोम फिटकरी जिलेटिन (सीएजी) के साथ ग्लास स्लाइड कोटिंग करने की तकनीक भ्रूण और ग्लास स्लाइड के बीच लगाव को बढ़ाकर इन तकनीकी बाधाओं को हल करती है।

सीएजी ने बढ़ाया लगाव के अलावा, वर्णित ड्रोसोफिला भ्रूण पूर्व-एम्बेडिंग तकनीकें बड़ी संख्या में सटीक रूप से दिनांकित ड्रोसोफिला भ्रूण की फसल की अनुमति देती हैं। इसने हमें प्रारंभिक भ्रूण विकास के विभिन्न चरणों में DmFKBP12 / Calstabin की गतिशील अभिव्यक्ति की रिपोर्ट करने की अनुमति दी। इस तकनीक का उपयोग करके हम जिस शुरुआती चरण का अध्ययन करने में सक्षम थे, वह सिंकिटियल ब्लास्टोडर्म चरण है, जिसने कम विभेदित वितरण और अभिव्यक्ति के आम तौर पर निचले स्तर को दिखाया। सेलुलर ब्लास्टोडर्म और गैस्ट्रुला चरणों में भ्रूण का अध्ययन करके, हमने पाया कि DmFKBP12 / Calstabin का सामान्य स्तर बढ़ गया क्योंकि भ्रूण विकसित होते हैं और स्थानीयकरण करना शुरू करते हैं, पहले पूर्वकाल के सर्वेक्षण के लिए, फिर तीन-परत चरण में कुछ परतों के लिए। निष्कर्ष बताते हैं कि कैल्शियम सिग्नलिंग में शामिल FKBP12 प्रारंभिक विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और जिसका भेदभाव ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (#31771377/ 31571273/31371256), राष्ट्रीय शिक्षा विभाग (#MS2014SXSF038), राष्ट्रीय शिक्षा विभाग केंद्रीय विश्वविद्यालय अनुसंधान कोष (#GK201301001/ 201701005 / जीईआरपी -17-45) से विदेशी प्रतिष्ठित वैज्ञानिक कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था, और XZ को उत्कृष्ट डॉक्टरेट थीसिस फंड (#2019TS082 / 2019TS079), शांक्सी प्रांतीय शिक्षा विभाग (#20JS138) के प्रमुख कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था। प्राकृतिक विज्ञान बुनियादी अनुसंधान कार्यक्रम Shaanxi प्रांतीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग के युवा परियोजना (#2020JQ-885).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-20°C Refrigerator Meiling Biology &Medical DW-YL270 Used for regent storage
-80°C Ultra low temperature refrigerator Thermo Forma 90 Series Used for regent storage
Agar Sigma-Aldrich WXBB6360V Preparation of grape juice agar plates
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Roche 11093274910 For the detection of digoxigenin-labeled compound
Biochemical incubator Shanghai Bluepard Instruments LRH-250 In-situ Hybridization
Bouin's solution Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 69945460 Drosophila Embryo Embedding
Centrifuge Eppendorf 540BH07808 In-situ Hybridization
Centrifuge tube Denville C-2170 Drosophila Embryo Collection
Chrome Alum Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10001018 Coating Slides
Constant temperature water bath Jintan Henfeng Instruments KW-1000DC Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Dako REAL EnVision Detection System Dako K5007 In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining.
DEPC Sigma-Aldrich D5758 In-situ Hybridization
DIG RNA Labeling Kit Roche 11093274910 RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase
Drosophila melanogaster Bloomington Stock Center BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 The stocks of Drosophila melanogaster mutant
Electric blast drying oven Tianjin Taiste Instruments 101-0AB For coating slides and paraffin embedding
Eosin Sigma-Aldrich 230251 Hematoxylin-Eosin Staining
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 100092680 Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Gelatin Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10010328 Coating Slides
Gold chloride Sigma-Aldrich 379948 Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3136 Hematoxylin-Eosin Staining
High Pure PCR Product Purification Kit Roche 11732668001 For purification of PCR products
Intelligent constant temperature and humidity box Ningbo Jiangnan Instruments HWS For fly maintenance
LE Agarose HyAgarose 14190108029 Pre-embedding
Methanol Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10014108 Drosophila Embryo Collection
Microscope ZEISS Observer.A1 Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Microscope Slides MeVid Labware Manufacturing P105-2001 Coating Slides
Neutral Gum Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10004160 Hematoxylin-Eosin Staining
N-heptane Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 40026768 Drosophila Embryo Collection
Paraffin slicer Huahai science instrument HH-2508III In-situ Hybridization
Paraffin Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 69019461 Paraffin Embedding
pH/mV Meter Sartorius PB-10 For determing the pH value of a solution
Silver nitrate Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10018461 Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Ultrapure water meter Thermo AFXI-0501-P In-situ Hybridization
Xylene Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10023418 Paraffin Embedding

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 183 ड्रोसोफिला भ्रूण पैराफिन अनुभाग कोटिंग स्लाइड एम्बेडिंग इन-सीटू संकरण DmFKBP12 /
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Zhang, W., Lei, X., Zhou, X., He,… More

Zhang, W., Lei, X., Zhou, X., He, B., Xiao, L., Yue, H., Wang, S., Sun, Y., Wu, Y., Wang, L., Ghartey-Kwansah, G., Jones, O. D., Bryant, J. L., Xu, M., Ma, J., Xu, X. A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo. J. Vis. Exp. (183), e61776, doi:10.3791/61776 (2022).

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