Summary
Aqui, descrevemos um protocolo de detecção e localização da proteína de embrião Drosophila e RNA da coleta à pré-incorporação e incorporação, imunostaining e mRNA in situ hibridização.
Abstract
A sinalização de liberação de cálcio induzida por cálcio (CICR) desempenha um papel crítico em muitos processos biológicos. Toda atividade celular desde a proliferação celular e apoptose, desenvolvimento e envelhecimento, até a plasticidade sináptica neuronal e a regeneração têm sido associadas aos receptores ryanodo (RyRs). Apesar da importância da sinalização de cálcio, o mecanismo exato de sua função no desenvolvimento precoce não é claro. Como um organismo com um curto período gestacional, os embriões de Drosophila melanogaster são temas de estudo primordial para investigar a distribuição e localização de proteínas associadas ao CICR e seus reguladores durante o desenvolvimento. No entanto, devido aos seus embriões ricos em lipídios e corão rica em quitina, sua utilidade é limitada pela dificuldade de montar embriões em superfícies de vidro. Neste trabalho, introduzimos um protocolo prático que aumenta significativamente a fixação do embrião Drosophila em slides e métodos de detalhes para histoquímica bem sucedida, imunohistoquímica e hibridização in situ . O método de revestimento de slides de gelatina cromada e o método de pré-incorporação de embriões aumentam drasticamente o rendimento no estudo da proteína embrião Drosophila e da expressão de RNA. Para demonstrar essa abordagem, estudamos o DmFKBP12/Calstabin, um conhecido regulador do RyR durante o desenvolvimento embrionário precoce do Drosophila melanogaster. Identificamos o DmFKBP12 no estágio de blastoderme sinintítico e relatamos o padrão de expressão dinâmica do DmFKBP12 durante o desenvolvimento: inicialmente como uma proteína distribuída uniformemente na blastodermia sincicial, localizando preliminarmente a camada de porão do córtex durante o blastoderm celular, antes de distribuir na arquitetura neuronal e digestão primitiva durante a fase de três gemas no início da gasolação. Essa distribuição pode explicar o papel crítico que o RyR desempenha nos sistemas vitais de órgãos que se originam a partir dessas camadas: o gânglio suboesofágico e supraesofágico, o sistema nervoso ventral e o sistema musculoesquelético.
Introduction
A sinalização de liberação de cálcio (CICR) tem papel crítico em muitos processos biológicos, como músculo esquelético/liso e função vascular cardíaca, proliferação celular e apoptose, desenvolvimento, envelhecimento, plasticidade sináptica neuronal e regeneração1,2,3,4,5,6 . Os receptores ryanodine (RyRs) e os receptores de linfosfato inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3Rs) são os principais players na via de sinalização de cálcio controlada por seus reguladores protein quinase A (PKA), Ca2+/calmodulin-dependent protein quinase II (CaMKII), FK506 proteínas vinculantes (FKBPs), calsequestrin (CSQ), tqdinria, tqdinria, tq e junctina1,2,3,4,5,6 . A expressão humana anormal e as mutações nessas proteínas podem levar à fisiologia patológica, como arritmias7 e proliferação oncogênica8,9.
FKBPs regulam a liberação de cálcio do reticular endoplasmico (ER) por RyRs. Este processo é essencial para o mecanismo de contração e, portanto, responsável por todo o movimento mecânico gerado pela contração miosina-actina através da liberação de cálcio induzida pelo cálcio, juntamente com ryRs1,2 embrionário. Nos modelos de mouse, a falta de RyR2 e seu regulador FKBP12/Calstabin é invariavelmente letal, seja durante o desenvolvimento embrionário ou no período pós-natal inicial10,11,12. Os camundongos eliminados FKBP12/Calstabin apresentam defeitos cardíacos críticos com acoplamento irregular de excitação- contração (CE) e edema cerebral durante o desenvolvimento embrionário. Isso indica que o FKBP12/Calstabin desempenha um papel essencial na regulação da expressão do canal RyR2, o que é importante tanto para o desenvolvimento cardíaco quanto cerebral10.
As faíscas de cálcio conduzidas pelo RyR foram inicialmente descobertas na fase de formação de zigotos de ovos Medaka fertilizados13,14. No entanto, poucas investigações foram realizadas sobre a função da sinalização de cálcio no desenvolvimento embrionário precoce. Em Drosophila melanogaster, os resultados obtidos dos mutantes DmFKBP12 S107 fornecem fortes evidências que sustentam a importância desse gene para o desenvolvimento larval e uma vida útil saudável, que é atribuída à sua função contra o estresse oxidativo15,16. Recentemente, identificamos a localização dinâmica da proteína FKBP12/Calstabin e do RNA mensageiro durante o desenvolvimento inicial de Drosophila melanogaster17. Utilizando as abordagens descritas nesta metodologia, pudemos rastrear a expressão de FKBP12/Calstabin em D. melanogaster durante o blastoderm sincicial (0-2 h), blastoderm celular (2-3 h), gastrula precoce (3-12 h) e gastrula tardia (12-24 h). Neste artigo, apresentamos os protocolos detalhados de todas as abordagens do estudo anterior, incluindo incorporação pré-embrionária para secção clássica de parafina, tratamento de slides pré-revestimento para seções embrionárias, coloração de histoquímica e imunostaining, e hibridização mRNA in-situ para identificação da expressão genética.
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Protocol
1. Preparação de pratos de ágar de suco de uva
- Adicione 5 g de ágar e 5 g de sacarose a 150 mL de água destilada. Ferva-o usando um micro-ondas até que o ágar e a sacarose estejam totalmente dissolvidos. Misture 50 mL de suco de uva 100% e a solução em conjunto.
- Adicione 1 mL de ácido 100% propiônico para fazer a concentração final a 0,5% de ácido propínico. Despeje 25 mL da solução preparada em cada placa. Depois que o ágar se solidificar, armazene a mídia em 4 °C.
2. Slides de revestimento
- Deslizes pré-tratados com detergente. Lave os slides 3 vezes com água da torneira e uma vez com água destilada. Em seguida, seque as lâminas em um forno de 45 °C por 2 h.
- Mergulhe os slides em cerca de 450 mL de solução de ácido sulfúrico de potássio (20 g de dicromato de potássio, 40 mL de água destilada e 400 mL de ácido sulfúrico concentrado) por 24 horas. Lave os slides 3 vezes com água da torneira e uma vez com água destilada.
- Seque as lâminas em um forno de 45 °C por duas horas. Mergulhe em 95% de etanol por mais de 2h.
- Adicione 0,5 g de sulfato de potássio de cromo e 5 g de gelatina a 1 L de água destilada. Dissolva-se em um banho de água de 60 °C antes de usar. A gelatina cromada pode ser armazenada a 4 °C por longos períodos.
- Solte 10 μL da gelatina cromada no slide e cubra de forma completa e uniforme toda a superfície do slide com a solução. Coloque o slide com o lado da gelatina para cima em um forno a 42 °C por 48 h. Os slides preparados podem ser armazenados a 4 °C para uso posterior.
NOTA: Este é um passo crítico. O revestimento completo é necessário. Para mosca de fruta e seu embrião, esta abordagem de revestimento deslizante parece mais eficiente do que o revestimento de poli-liseina.
3. Embrião de Drosophila
-
Coleção de embriões de Drosophila
NOTA: Coletamos embriões de Drosophila em quatro períodos de 0-2 horas (blastoderm sincicial), 2-3 horas (blastoderm celular), 3-12 horas (gastrula precoce) e 12-24 horas (gastrula tardia)18. A proporção dos principais tipos de embriões em cada período é mostrada na Tabela 1.- Coloque 400-500 moscas em uma garrafa de coleta de plástico e cubra a garrafa com a placa de ágar de suco de uva contendo extrato de levedura. Embriões de drosophila são colocados no ágar de suco de uva à temperatura ambiente.
- Colete quatro períodos de embriões, adicionando suavemente 2 mL de PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) a cada placa para flutuar os embriões. Transfira cerca de 200 embriões para um tubo centrífuga de 50 mL e mantenha-o no gelo por 2 minutos para acalmar os embriões.
- Pré-incorporação
- Transfira 200 embriões de Drosophila para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Mantenha o tubo no gelo por 2 minutos para acalmar os embriões e, em seguida, descarte o sobrenatante com pipeta cuidadosamente. Adicione 1 mL de alvejante de 50% no tubo e agite-o suavemente por 2 minutos.
NOTA: O alvejante deve preparar fresco, e a quantidade do alvejante pode variar dependendo da quantidade de embriões coletados. - Colete suavemente embriões por despeje em papel filtro e lave-os 3 vezes com 1 mL de PBS a cada vez.
- Transfira os embriões com papel filtro para cerca de 5 mL de n-heptane.
- Transfira a mistura para um tubo de centrífuga fresco de 1,5 mL. Adicione 1 mL de metanol e agite delicadamente. Coletar embriões após a sedimentação.
- Remova o supernaspe e lave os embriões em 1 mL de PBS 3-5 vezes.
- Fixar os embriões com 400 μL da solução de Bouin (ácido picrico saturado 71%, 24% de formalina, 5% ácido acético) por 30 min. Lave os embriões fixos 3 vezes em 1 mL de PBS por 5 minutos cada vez.
- Para agregar embriões, transfira as amostras para uma rolha de borracha e remova o PBS.
- Prepare 1,2% de solução agarose-PBS e mantenha a solução a 60 °C. Adicione 200 μL de solução agarose-PBS de 1,2% aos embriões para corrigi-los em um bloco de ágar.
- Tire o bloco da rolha e armazene o bloco na PBS.
NOTA: Durante a abordagem pré-incorporação, o pró-aquecimento é fundamental para o sucesso. Sugerimos fortemente que os tubos centrífugas e as pontas de micropipette, que serão usados nesta etapa, devem ser completamente pré-aquecidos antes de operar.
- Transfira 200 embriões de Drosophila para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Mantenha o tubo no gelo por 2 minutos para acalmar os embriões e, em seguida, descarte o sobrenatante com pipeta cuidadosamente. Adicione 1 mL de alvejante de 50% no tubo e agite-o suavemente por 2 minutos.
- Incorporação de parafina
- Mergulhe o bloco de ágar pré-incorporado em 35% de etanol, 50% de etanol, 75% de etanol e 85% de etanol por 15 minutos cada. Em seguida, caia 2 vezes em 95% de etanol e 100% etanol.
NOTAs: Cerca de 5-10x de volume de bloco de cada seguido por um fixador classificado por 15-30 minutos é necessário dependendo do número de embriões no bloco. - Mergulhe o bloco de embriões em solução 100% etanol e xileno (proporção 1:1) por 15 min.
- Transfira o bloco para xileno por 1 min para tornar transparente o tecido embrião.
- Submergir o bloco em xileno e parafina (proporção de 1:1) por 30 min.
- Submergir o bloco em parafina I, parafina II, e parafina III por 2h cada vez.
- Encha a caixa de incorporação com parafina com antecedência e, em seguida, transfira suavemente e horizontalmente o bloco para o fundo da caixa de incorporação. Após a parafina se solidificar naturalmente, o bloco de parafina solidificada pode ser armazenado a 4 °C.
NOTAs: A amostra pré-incorporada pode ser usada na crioseção seguindo as seguintes etapas. Depois que os embriões são pré-incorporados com agarose como descrito acima, as amostras são simplesmente incorporadas no Composto OCT. Posteriormente, a criosecção pode ser realizada de acordo com o protocolo de crioseção de rotina. Posteriormente, abordagens regulares de coloração podem ser usadas nas seções.
- Mergulhe o bloco de ágar pré-incorporado em 35% de etanol, 50% de etanol, 75% de etanol e 85% de etanol por 15 minutos cada. Em seguida, caia 2 vezes em 95% de etanol e 100% etanol.
4. Mancha de hematoxilina-eosina
- Prepare seções de embriões de Drosophila . Coloque seções preparadas em um forno a 60 °C por 15 minutos e, em seguida, submerse as seções em xileno 2 vezes por 10 minutos cada. Submergir as seções uma vez em 100% etanol e xileno (proporção de 1:1) por 2 min.
- Hidrate as seções em 100% etanol I, 100% etanol II, 95% etanol, 85% etanol, 75% etanol, 50% etanol, e em água destilada por 3 min.
- Manche as seções com solução de hematoxilina por 2 minutos. Mergulhe os slides em solução de álcool ácida de 1% (1 mL de ácido clorídrico, 100 mL de 70% de etanol) rapidamente e lave os slides em água destilada.
- Queda nos slides em 50% etanol, 75% etanol, 85% etanol e 95% etanol sequencialmente.
- Manche as seções com solução de eosina por 1 min.
- Desidratar os slides em 95% de etanol I, 95% etanol II, 95% etanol III, 100% etanol I, 100% etanol II e 100% etanol III por 1 min cada vez.
- Limpe os slides em 100% xileno I, 100% xileno II, e 100% xileno III por 5 min cada vez.
- Monte os slides com bálsamo neutro de acordo com as instruções do fabricante.
5. Coloração periódica ácido-prata methenamina
- Desparafinar e hidratar seções de parafina do embrião de Drosophila à água destilada.
- Oxidar as seções em ácido periódico de 1% por 15 minutos em temperatura ambiente.
- Enxágüe os slides em água destilada 3 vezes por 1 min cada.
- Incubar os slides em cerca de 40 mL de solução de trabalho de methenamina prateada recém-filtrada (3% de methenamina, 5% de nitrato de prata, 5% solução de bortrato de sódio) por 1h e 20 minutos a 60 °C. Em seguida, enxágue os slides em água destilada por 1 min.
- Tonque os slides em cloreto de ouro de 0,2% por 2 min e enxágue os slides em água destilada por 1 min.
- Coloque os slides em 3% de tiossulfato de sódio por 3 minutos e depois enxágue os slides em água destilada por 1 min.
- Contratente os slides na hematoxilina por 30 s. Lave os slides em água da torneira por 3-5 min.
- Desidratar os slides em 70% de etanol, 80% etanol, 95% de etanol I, 95% de etanol II, 95% etanol III, 100% etanol I e 100% etanol II por 5 min cada.
- Limpe os slides em 100% xileno I, 100% xileno II e 100% xileno III por 5 min cada.
- Monte os slides em bálsamo neutro de acordo com as instruções do fabricante.
6. Imunohistoquímica
- Desparafinar e reidratar seções de parafina de embrião de Drosophila para PBS seguindo o protocolo padrão19.
- Trate slides com 0,3% de H2O2 em metanol por 10 minutos à temperatura ambiente e evite a luz.
- Pré-aqueça o tampão de recuperação de antígeno apropriado para aproximadamente 100 °C em um recipiente com os slides no vapor vegetal. O recipiente também deve ter uma tampa. Coloque os slides no recipiente. Feche a tampa do vapor.
- Mantenha o recipiente no vapor por 20 minutos a partir deste ponto. Observe que a tampa do recipiente de lâmina não deve ser totalmente apertada para que o vapor de água possa entrar durante o processo de vapor.
- Deixe que os slides retornem à temperatura ambiente antes de enxágüe-os suavemente em PBS-T (PBS com Interpol-20, pH 7.2) 3 vezes por 5 minutos cada e, em seguida, enxágue os slides em PBS 3 vezes por 1 min cada.
- Bloqueie os slides com 1% de albumina de soro bovino (BSA) na PBS por 60 minutos em temperatura ambiente.
- Incubar os slides com anticorpo primário (anti-FKBP12 a 1:1000) durante a noite a 4 °C ou em temperatura ambiente por 4h.
- Lave os slides em PBS-T 4 vezes por 5 minutos cada.
- Aplique os slides com polímero rotulado HRP conjugado com anticorpos secundários (anti-Coelho, 1:5.000) por 90 minutos à temperatura ambiente. Faça isso no escuro para evitar branqueamento de fotos.
- Lave os slides em PBS-T 3 vezes por 5 minutos cada.
- Incubar os slides com 5% 3,3'-diaminobenzidina-tetrahidrocloreto (DAB) por 2-10 min até que a cor dos produtos de reação seja apropriada sob microscópio.
- Contratente os slides na hematoxilina por 30 s e lave os slides em água destilada 2 vezes por 5 minutos cada.
- Desidratar os slides em 50% etanol, 70% etanol, 90% etanol, 95% etanol e 100% etanol por 1 min cada.
- Limpe os slides em 100% xileno I, 100% xileno II e 100% xileno III por 5 min cada.
- Monte os slides em bálsamo neutro de acordo com as instruções do fabricante.
7. Hibridização in-situ
NOTA: Foram preparadas seções de embrião de drosophila com água tratada de pirocarbonato de diotila (DEPC) de 0,01%. Todos os acessórios utilizados para a hibridização in situ aplicam o tratamento noturno DA DEPC com antecedência.
- Preparação de Riboprobe
- Linearize o DNA do modelo cortando um local de enzima de restrição rio abaixo da inserção clonada usando uma enzima de restrição que cria saliências de 5'. Após a linearização, purifique o DNA do modelo através da extração fenol/clorofórmio e da precipitação subsequente do etanol. Use protocolos padrão.
- Adicione 1 μg de DNA de modelo purificado a um tubo de centrífuga livre de RNase. Coloque o tubo de centrífuga no gelo. Adicione água tratada com DEPC suficiente ao volume total de 13 μL.
- Em seguida, adicione os seguintes reagentes em ordem: 2 μL de mistura de rotulagem NTP 10x, 2 μL de tampão de transcrição de 10x, 1 μL do inibidor RNase protetor, 2 μL de RNA Polymerase SP6 ou RNA Polymerase T7.
- Misture a reação por pipetação e centrífuga em breve. Incubar por 2 h a 37 °C.
NOTA: Incubações mais longas não aumentam o rendimento do RNA rotulado. Um giro curto (~800 rpm) aplicado no tubo de reação é necessário para ser necessário antes de continuar para o próximo passo. Este giro permitirá que todo o conteúdo, que poderia gerar a partir da incubação, chegue ao fundo do tubo. - Adicione 2 μL de DNase I sem RNase para remover o DNA do modelo e incubar por 15 min a 37 °C.
- Adicione 2 μL de 200 mM EDTA (pH 8.0) para parar a reação.
NOTA: As sondas de RNA com rótulo DIG podem ser armazenadas a -15 a -25 °C em etanol durante um ano.
- Pré-hibridização da seção de embriões de Drosophila
- Coloque seções de embrião de Drosophila em forno de 42 °C por 48 h.
- Desparafinar os slides em 100% de xileno por 10 minutos duas vezes.
- Hidrate os slides sequencialmente submersos em 100% etanol, 95% etanol, 90% etanol, 70% etanol e 50% etanol por 5 min.
- Incubar os slides em PBS por 5 min 3 vezes para remover a solução fixativa/solução de Bouin do tecido.
- Lave os slides com 100 mmol/L glicina/PBS solução 2 vezes por 5 min cada.
- Lave os slides com PBS 2 vezes por 5 minutos cada.
- Incubar os slides com 0,3% Triton X-100 em PBS por 15 minutos para permeabiliizar as membranas.
- Lave os slides com PBS 3 vezes por 5 minutos cada.
- Incubar os slides em 15 μg/mL RNase-free proteinase K por 30 minutos a 37 °C.
- Incubar os slides com 4% de paraformaldeído em PBS por 3 minutos para parar a digestão.
- Lave os slides com PBS 2 vezes por 5 minutos cada.
- Incubar os slides em tampão de trietanolamina de 100 mM (pH 8.0) com anidrido acético de 0,25% (v/v) 2 vezes por 5 min cada.
- Adicione água DEPC na câmara de umidade do slide. Adicione 20 μL de solução de pré-hibridização (contendo 100 μg/mL de DNA de esperma de salmão) nas lâminas. Coloque os slides na câmara de umidade do slide. Incubar os slides a 42 °C por 4 h.
NOTA: É necessário garantir o aperto da tampa da caixa molhada e que a caixa molhada seja sempre mantida horizontalmente para evitar a volatilização e o desvio do tecido da solução de pré-hibridização e da solução de hibridização seguida.
- Hibridização da seção de embriões de Drosophila
- Remova a solução de pré-hibridização e lave os slides com 0,2x SSC (cloreto de sódio de 150 mM, citrato de sódio de 15 mM, pH 7.0) 3 vezes por 5 min cada. Limpe o excesso de 0,2x SSC ao redor das amostras de tecido.
- Aplique 30 μL de solução de hibridização da sonda (contendo 2-6 ng de sonda RNA com etiqueta de digoxina, diluindo em solução de pré-hibridização) com uma pipeta. Incubar os slides na câmara de umidade de slides a 42 °C por aproximadamente 20 h.
NOTA: Certifique-se do aperto da tampa como sugestão da última nota. Caso contrário, o secamento causado pelo vazamento de pré-hibridização ou pré-hibridização gerará fundo sujo, incluindo pseudo-positivo em slides.
- Hibridização
- Remova a solução de hibridização e lave os slides com solução SSC 4 vezes por 15 minutos cada a 37 °C.
- Lave os slides em solução SSC 2x com 20 μg/mL de RNase A por 30 min a 37 °C.
- Lave os slides em solução SSC de 1x por 15 min a 37 °C.
- Lave os slides em solução SSC de 0,5x por 15 min a 37 °C.
- Lave os slides em solução SSC de 0,1x por 15 min a 37 °C.
- Lave os slides com PBS 3 vezes por 5 minutos cada.
- Lave os slides no tampão de lavagem (100 mM ácido masculino, 150 mM NaCl, 0,3% (v/v) Interpol 20, pH 7.5) por 1 min.
- Incubar os slides em 100 mL de solução de bloqueio recém-preparada (2% soro de ovelha em tampão de ácido maleico sem Interpol 20) por 30 minutos.
- Incubar os slides em 20 mL de solução de anticorpos por 45 minutos.
- Centrifugar o anticorpo por 5 min a 10.000 rpm no frasco original antes de cada uso, e encaixe a quantidade necessária cuidadosamente da superfície. Diluir anti-digoxigenina-AP 1:5000 (150 mU/mL) na solução de bloqueio.
- Lave os slides em 100 mL de tampão de lavagem 2 vezes por 15 minutos cada para remover o conjugado de anticorpos desvinculados.
- Equilibre os slides em 20 mL de tampão de detecção (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9.5) por 2-5 min.
- Incubar os slides com 10 mL de solução de substrato de cores recém-preparada na câmara de umidade de slides. A reação começa em poucos minutos e é completa após 16 h. Não agite ou misture enquanto a cor estiver se desenvolvendo.
- Lave os slides com 50 mL de água destilada por 5 minutos para parar a reação.
- Seque a amostra durante a noite no escuro.
- Desidratar os slides em 70% etanol, 80% etanol, 90% etanol, 95% etanol, 100% etanol I e 100% etanol II por 3 min cada.
- Limpe os slides em 100% xileno I, 100% xileno II e 100% xileno III por 20 min cada.
- Monte os slides com bálsamo neutro.
- Documente imagens e analise com a microscopia invertida e o software do fabricante. Realizar análise de distribuição utilizando ImageJ de acordo com a densidade de sinal positivo ao longo do eixo longitudinal ou dentro da zona diferencial de embriões.
NOTA: Durante a incubação com a solução de substrato de cores recém-preparada na etapa 7.4.12, a cor da reação pode ser vista mesmo com um olho nu. Esta observação sobre como o desenvolvimento de cores pode ser inspecionado sob estereoscópio. Uma vez que a cor da reação é razoável e o passo 7.4.13 pode ser realizado para parar a reação.
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Representative Results
As figuras descrevem protocolos usados para superar o desafio de anexar embriões de chorão de alta lipídica e de chitina (Tabela 1) à superfície do slide de vidro para exame e experimentação. Utilizando o método de revestimento de slides de gelatina cromada mostrado na Figura 1, aumentamos a fixação de embriões de Drosophila na superfície dos slides, enquanto o método de pré-incorporação de embriões mostrado na Figura 2 permite uma inspeção eficiente da distribuição dinâmica da proteína e do RNA DmFKBP12/Calstabin em todos os quatro estágios iniciais de desenvolvimento (i.e., blastoderm sinintário, blastoderm celular, gastrula precoce e tardia dos embriões de Drosophila). A Figura 3 mostra a distribuição proteica de anticorpos detectados FKBP12 / Calstabin nos estágios de blastoderm sincicial e celular. A partir desses resultados histoquímicos, pode-se ver que a expressão FKBP12 é menos polarizada em blastoderme sincicial (Painéis A a H), e então começa a se localizar dentro da membrana do porão sob o epitélio trophectoderm para formar um gradiente com mais expressão encontrada no anterior do que os polos posteriores (Painéis I a S). Eventualmente, a proteína DmFKBP12/Calstabin torna-se restrita a certos componentes arquitetônicos dos tecidos embrionários primitivos com distribuição menos extracelular do que a observada em estágios embrionários gastrula precoces e tardios (Figura 4). Curiosamente, a distribuição de proteína dinâmica acima descrita não é acompanhada por níveis correspondentes de mRNA de DmFKBP12 (Figura 5), indicando que a expressão proteica é o resultado de um mecanismo molecular pós-transcrição ainda desconhecido. O método descrito de revestimento de slides cag e pré-incorporação nos permitirá sondar ainda mais a importância do DmFKBP12 na sinalização de cálcio e desenterrar este mecanismo molecular ainda desconhecido, combinando outras técnicas como a interferência de RNA de microinjeção19.
Neste estudo, desenvolvemos um método de revestimento de slides de gelatina cromada e método de pré-incorporação para histologia, análise histoquímica e imuno-histológica de embriões Drosophila em diferentes estágios de desenvolvimento. Usando este método de pré-incorporação, os embriões são efetivamente coletados para seção de crio e parafina que permite a análise de seções longitudinais transversais. Isso nos permitiu descrever os padrões de expressão em evolução para essa proteína durante estágios decisivos de desenvolvimento, ligando a expressão da proteína ao desenvolvimento de sistemas fisiológicos chave, como o intestino, o cérebro e o sistema nervoso de conexão. Ao utilizar esses métodos, pudemos investigar as distribuições dinâmicas da proteína reguladora RyR e do mRNA FKBP12/Calstabin durante o desenvolvimento de embriões de Drosophila em estágios definitivos, incluindo o blastoderm sincicial e celular, e estágios de gastrulação precoce e tardia. Nossos dados mostraram que a proteína FKBP12/Calstabin e seu RNA podem ser detectados muito cedo no blastoderm sincicial. À medida que o embrião se desenvolve, fKBP12 torna-se mais densamente distribuído na camada de células basais sob o epitélio do blastoderm. A proteína FKBP12/Calstabin então fortalece dinamicamente sua expressão e diferencia sua distribuição em tecidos embrionários contendo músculos, incluindo o estomodaeum, o stomodaeum e o rudimento médio posterior. Essas mudanças de distribuição desde o início do blastoderm até os estágios de gastrulação tardia também são descritas no sistema neuronal em desenvolvimento, incluindo neuroblastos, nervo ventral, gânglio supraesofágico e cérebro. Embora essas mudanças dinâmicas no FKBP12/Calstabin indiquem sua importância no desenvolvimento, elas não se refletem nos níveis de mRNA da proteína, sugerindo um regulador ainda desconhecido da expressão proteica que ainda não foi identificado.
Figura 1: Esboço do método de revestimento de gelatina de alum cromado (CAG)para seções de parafina utilizadas em imunologia e hibridização in-situ RNA para visualizar a distribuição da proteína DmFKBP12 e mRNA em embriões de Drosophila. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esboço do método de pré-incorporação para perfil de expressão de FKBP12 e DmFKBP12 no desenvolvimento de embriões de Drosophila . Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Perfil de expressão da proteína DmFKBP12 em blastoderms siníntiais e celulares do embrião Drosophila . (A-D) H&E coloração do blastoderm sinintítial. Quantificação da distribuição DmFKBP12 no blastodermo siníntial inicial é apresentada em Painéis D. (E-G) apresentam blastodermia sincicial inicial em que os núcleos estão sob divisão. Quantificação da distribuição DmFKBP12 em blastoderm sinintítial tardio são apresentados em H. (I-L) Mancha h&E do blastoderm celular. A qualificação da distribuição DmFKBP12 no blastoderm celular tardio é apresentada em Painéis L. (M-S) exibem a distribuição da proteína DmFKBP12 no blastoderm celular. O mostra as vistas maiores de M-N. (P-R) Painéis apresentam blastoderm celular anterior mostrado em M-O. Quantificações de distribuição DmFKBP12 no blastoderm celular inicial é apresentada em Barra de Escala S. para A, E, I, M e P é de 60 μm, para B, C, F, J, K, N, Q e R é de 40 μm, e para G, O é 20 μm. AP, polo anterior de ovo; YK, gema; CN, núcleo de decote; PP, polo posterior de ovo; BLD, blastoderme, núcleos e células; BM, membrana porão. Os dados são expressos como média± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. A quantificação dos dados foi realizada com o ImageJ. Em primeiro lugar, os produtos marrons permaneceram na imagem, juntamente com a remoção de todas as outras cores. Em segundo lugar, a imagem marrom foi alterada em preto e branco e calculou sua densidade para quantificação consequentemente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Perfil de expressão da proteína DmFKBP12 em estágios de gastrulação precoce e tardia do embrião de Drosophila. A, D e G mostram a coloração de H&E do embrião de Drosophila na fase de gastruação. B, C, E e F exibem a distribuição de DmFKBP12 no estágio inicial de gastrulação. H, I e J-L exibem a distribuição de DmFKBP12 no estágio de gastrulação tardia. Quantificações de distribuição DmFKBP12 no início gastrulae são apresentadas na barra de escala M. para A, D, E e G é de 80 μm, para B, C, F, H, I e J-L é de 40 μm. PP, polo posterior de ovo; NBL, neuroblastos; ST, stomodaeum; YK, gema; PMG, rudimento midgut posterior; BR, cérebro, gânglio supraesofágico; VNS, sistema nervoso ventral; PV, proventriculus; MUS, músculo; MGC, caecum midgut; AMG, midgut rudipighian anterior; MMG, midgut médio; TR, traqueia. Os dados são expressos como média± SEM. ns, sem significantes; ** p < 0,01, *** p < 0,001. A quantificação dos dados foi realizada com ImageJ 1,50d por permanecer marrom-produto e mudar para imagem em preto e branco, e seguindo por cálculo de densidade de preto e branco, como descrito na legenda da figura anterior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Localização in-situ de DmFKBP12 mRNA durante o desenvolvimento embrionário do embrião Drosophila. Uma localização in situ de DmFKBP12 mRNA no estágio de blastodermia sinintítial quando FKBP12 mRNA foi expressa no citoplasma do embrião. B e C mostram localização in-situ de DmFKBP12 mRNA no estágio de blastoderme celular quando FKBP12 mRNA foi expresso nos limites internos das células blastoderm. D e E exibem localização in-situ de FKBP12 mRNA no estágio inicial de gastrulação. Durante esta etapa, é localizado principalmente no intestino em desenvolvimento. F, G e H mostram localização in-situ de FKBP12 mRNA no estágio de gastrulação tardia, quando o mRNA é expresso no músculo e intestino. Eu sou o controle positivo do DmFKBP12 mRNA. J é o controle negativo do DmFKBP12 mRNA. Barra de escala para A, C, E, G e I é de 5 μm, para B, D, F, I e J é 10 μm. YK, gema; CN, núcleo de decote; BLD, blastoderme, núcleos e células; CF, fissura oblíqua anterior, sulco cefálico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Estágios embrionários | 0-2 horas (%) | 2-3 horas (%) | 3-12 horas (%) | 12-24 horas (%) |
| Blastoderm sinintítial | 90.8 | 0 | 0 | 0 |
| Blastoderm celular | 6.9 | 91.54 | 0 | 0 |
| Gastrula precoce | 2.3 | 4.23 | 91.1 | 0 |
| Gastrula tardia | 0 | 4.23 | 8.93 | 93.3 |
Tabela 1: Coleta de embriões de diferentes estágios no desenvolvimento de Drosophila melanogaster
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Discussion
RyRs e IP3Rs mediados sinalização de cálcio é um caminho fundamental em muitos processos fisiológicos e patológicos de animais vertebrados e invertebrados1,2,3,4. Em humanos, mutações pontuais, como a mutação R4496C associada ao CPVT, no gene RyR2 levam ao vazamento de cálcio do ritúlumo sarcoplasmático do cardiomiócito, resultando em disfunção cardíaca. Essas mutações apresentam-se como arritmia com alto risco de morte cardíaca súbita durante a atividade física, e é reproduzível em modelos de camundongos projetados para carregar essa mutação. Em condições de exercício, os camundongos portadores dessa mutação de vazamento de cálcio experimentaram morte súbita cardíaca não demonstrada por suas partes de contador silvestre18,20,21,22. A superexpressão do FKBP12, um regulador ryrs, no coração, correspondeu a altas taxas de canais de potássio associados à morte cardíaca em modelos de camundongos22,23, um achado que correspondia ao fenótipo de FKBP12 knockout mice10,11. Como os RyRs mamíferos, incluindo RyR1, RyR 2e RyR3 e seus FKBPs reguladores têm sido bem estudados por mais de três décadas, a maioria dos procedimentos envolvidos em cardiopatologia, disfunção muscular esquelética e realização da função cerebral após o desenvolvimento precoce mais a oncogênese são o foco da pesquisa24,25.
Ao contrário dos vertebrados, que têm três isoformes de RyR, as moscas de Drosophila têm apenas um RyR1,2,3,5. Recentemente, demonstramos a função crítica do Drosophila RyR (DmRyR) nos estágios iniciais do desenvolvimento embrionário de Drosophila. Nós desvendamos a expressão DmRyR tanto no nível translacional quanto transcricional em embriões de Drosophila durante o desenvolvimento inicial: o estágio de blastoderme sincicial, o estágio de blastoderm e os estágios iniciais gastrula. Em todos os quatro estágios, o DmFKBP12 mRNA foi distribuído uniformemente por todo o embrião e permaneceu no mesmo nível, enquanto a expressão proteica do gene foi altamente dinâmica com perfis de expressão polarizados anteriormente e depois distribuídos em determinadas camadas celulares19. Os protocolos metodológicos utilizados nesta publicação foram fundamentais para a capacidade de obter um alto volume de resultados representativos.
A secção de parafina é uma técnica básica e prática para a detecção histológica da expressão proteica para análise quantitativa. As seções de parafina são uma ferramenta fundamental para estudar a expressão proteica no inseto adulto. No entanto, essas técnicas têm sido difíceis de replicar no desenvolvimento de insetos devido ao seu embrião rico em lipídios e corão rica em quitina, que dificultam a incorporação, preservação e montagem de slides. Os lipídios encontrados em embriões interferem com as forças que permitem a fixação de seções embrionárias na superfície do slide. Embora a quitina encontrada no acorde apresente barreiras físicas que protegem o embrião contra interferências químicas e mecânicas, ela também restringe os acessórios de amostras embrionárias a lâminas de vidro. Embora essas características garantam uma maior taxa de sobrevivência das larvas de insetos, isso dificulta muito a capacidade de estudar sua proteína in-situ e expressão mRNA. Este problema tem sido problemático em muitos aspectos. O uso de detergente superficial como o Tween-20 frequentemente destaca embriões de Drosophila e reduz o número de embriões disponíveis para estudo. Esta técnica requer incubação por 20 horas para desvendar mRNA para hibridização in-situ , mas também destaca as amostras dos slides quase inteiramente. A técnica aqui de revestimento de lâminas de vidro com gelatina cromada de alum (CAG) antes de realizar a imunohistoquímica e o reconhecimento específico anti-sentido para mRNA resolve essas barreiras técnicas, aumentando o acessório entre o embrião e o escorregador de vidro.
Além do anexo aprimorado do CAG, as técnicas descritas de pré-incorporação de embriões de Drosophila permitem a colheita de um grande número de embriões de Drosophila datados com precisão. Isso nos permitiu relatar a expressão dinâmica do DmFKBP12/Calstabin em vários estágios do desenvolvimento embrionário inicial. O estágio mais antigo que pudemos estudar usando essa técnica é o estágio de blastodermia sinintítual, que mostrou distribuição menos diferenciada e um nível de expressão geralmente menor. Ao estudar embriões nos estágios de blastoderm celular e gastrula, descobrimos que o nível geral de DmFKBP12/Calstabin aumentou à medida que os embriões se desenvolvem e começam a se localizar, primeiro para a pesquisa anterior, depois para certas camadas no estágio de três camadas. Os achados sugerem que o FKBP12 envolvido na sinalização de cálcio desempenha um papel crítico no desenvolvimento precoce e na diferenciação do qual desempenha um papel importante no desenvolvimento de melanogaster de Drosophila .
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (#31771377/ 31571273/31371256), o Programa de Cientistas Distintos Estrangeiros do Departamento Nacional de Educação (#MS2014SXSF038), o Fundo Nacional de Pesquisa das Universidades Centrais do Departamento de Educação (#GK201301001 201701005/GERP-17-45) e XZ são apoiados pelo Fundo de Tese de Doutorado Excepcional (#2019TS082/2019TS079), Programa-Chave do Departamento de Educação Provincial de Shaanxi (#20JS138), o Projeto Jovem do Programa de Pesquisa Básica de Ciências Naturais do Departamento provincial de Ciência e Tecnologia de Shaanxi (#2020JQ-885).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -20°C Refrigerator | Meiling Biology &Medical | DW-YL270 | Used for regent storage |
| -80°C Ultra low temperature refrigerator | Thermo | Forma 90 Series | Used for regent storage |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparation of grape juice agar plates |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | For the detection of digoxigenin-labeled compound |
| Biochemical incubator | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
| Bouin's solution | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
| Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
| Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
| Chrome Alum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10001018 | Coating Slides |
| Constant temperature water bath | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Dako REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | In-situ Hybridization |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11093274910 | RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | The stocks of Drosophila melanogaster mutant |
| Electric blast drying oven | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | For coating slides and paraffin embedding |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 100092680 | Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Gelatin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10010328 | Coating Slides |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| High Pure PCR Product Purification Kit | Roche | 11732668001 | For purification of PCR products |
| Intelligent constant temperature and humidity box | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | For fly maintenance |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pre-embedding |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10014108 | Drosophila Embryo Collection |
| Microscope | ZEISS | Observer.A1 | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Microscope Slides | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Coating Slides |
| Neutral Gum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10004160 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| N-heptane | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 40026768 | Drosophila Embryo Collection |
| Paraffin slicer | Huahai science instrument | HH-2508III | In-situ Hybridization |
| Paraffin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69019461 | Paraffin Embedding |
| pH/mV Meter | Sartorius | PB-10 | For determing the pH value of a solution |
| Silver nitrate | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10018461 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Ultrapure water meter | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Hybridization |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10023418 | Paraffin Embedding |
References
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