Summary
Qui, descriviamo un protocollo per il rilevamento e la localizzazione della proteina embrionale di Drosophila e dell'RNA dalla raccolta al pre-incorporamento e incorporamento, all'immunocolorazione e all'ibridazione in situ dell'mRNA.
Abstract
La segnalazione del rilascio di calcio indotta dal calcio (CICR) svolge un ruolo fondamentale in molti processi biologici. Ogni attività cellulare dalla proliferazione cellulare e apoptosi, allo sviluppo e all'invecchiamento, alla plasticità sinaptica neuronale e alla rigenerazione è stata associata ai recettori della rianodina (RyRs). Nonostante l'importanza della segnalazione del calcio, l'esatto meccanismo della sua funzione nello sviluppo iniziale non è chiaro. Come organismo con un breve periodo gestazionale, gli embrioni di Drosophila melanogaster sono soggetti di studio primari per studiare la distribuzione e la localizzazione delle proteine associate al CICR e dei loro regolatori durante lo sviluppo. Tuttavia, a causa dei loro embrioni ricchi di lipidi e del coro ricco di chitina, la loro utilità è limitata dalla difficoltà di montare embrioni su superfici di vetro. In questo lavoro, introduciamo un protocollo pratico che migliora significativamente l'attaccamento dell'embrione di Drosophila su vetrini e metodi di dettaglio per il successo dell'istochimica, dell'immunoistochimica e dell'ibridazione in situ . Il metodo di rivestimento del vetrino della gelatina di allume di cromo e il metodo di pre-incorporamento dell'embrione aumentano notevolmente la resa nello studio della proteina embrionale di Drosophila e dell'espressione dell'RNA. Per dimostrare questo approccio, abbiamo studiato DmFKBP12 / Calstabin, un noto regolatore di RyR durante lo sviluppo embrionale precoce di Drosophila melanogaster. Abbiamo identificato DmFKBP12 già nello stadio sinciziale del blastoderma e riportato il modello di espressione dinamica di DmFKBP12 durante lo sviluppo: inizialmente come proteina uniformemente distribuita nel blastoderma sinciziale, quindi localizzando preliminarmente nello strato basale della corteccia durante il blastoderma cellulare, prima di distribuirsi nell'architettura neuronale e digestiva primitiva durante la fase dello strato di tre gemme nella gastrulazione precoce. Questa distribuzione può spiegare il ruolo critico che RyR svolge nei sistemi di organi vitali che hanno origine da questi strati: il ganglio subesofageo e sopraesofageo, il sistema nervoso ventrale e il sistema muscolo-scheletrico.
Introduction
La segnalazione del rilascio di calcio indotta dal calcio (CICR) svolge un ruolo fondamentale in molti processi biologici, come la funzione scheletrica/muscolare liscia e la funzione vascolare cardiaca, la proliferazione cellulare e l'apoptosi, lo sviluppo, l'invecchiamento, la plasticità sinaptica neuronale e la rigenerazione1,2,3,4,5,6 . I recettori della rianodina (RyRs) e i recettori dell'inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP3R) sono i principali attori nella via di segnalazione del calcio controllata dai loro regolatori proteina chinasi A (PKA), Ca2+ / calmodulina-dipendente proteina chinasi II (CaMKII), FK506 proteine leganti (FKBPs), calsequestrina (CSQ), triadina e junctin1,2,3,4,5,6 . L'espressione umana anomala e le mutazioni in queste proteine possono portare a fisiologia patologica come aritmie7 e proliferazione oncogenica8,9.
Le FKBP regolano il rilascio di calcio dal reticolo endoplasmatico (ER) da parte dei RyR. Questo processo è essenziale per il meccanismo di contrazione, e quindi responsabile di tutti i movimenti meccanici generati dalla contrazione della miosina-actina attraverso il rilascio di calcio indotto dal calcio insieme ai RyR embrionali1,2. Nei modelli murini, la mancanza di RyR2 e del suo regolatore FKBP12/Calstabin è invariabilmente letale, sia durante lo sviluppo embrionale che nel primo periodo postnatale10,11,12. I topi knockout FKBP12/Calstabin presentano difetti cardiaci critici con accoppiamento irregolare eccitazione-contrazione (EC) ed edema cerebrale durante lo sviluppo embrionale. Ciò indica che FKBP12/Calstabin svolge un ruolo essenziale nella regolazione dell'espressione del canale RyR2, che è importante sia per lo sviluppo cardiaco che cerebrale10.
Le scintille di calcio condotte da RyR sono state inizialmente scoperte nella fase di formazione dello zigote delle uova medaka fecondate13,14. Tuttavia, poche indagini sono state eseguite sulla funzione della segnalazione del calcio nello sviluppo embrionale precoce. In Drosophila melanogaster, i risultati ottenuti dai mutanti DmFKBP12 S107 forniscono una forte evidenza a sostegno dell'importanza di questo gene per lo sviluppo larvale e una durata di vita sana, che è attribuita alla sua funzione contro lo stress ossidativo15,16. Recentemente, abbiamo identificato la localizzazione dinamica della proteina FKBP12/Calstabin e dell'RNA messaggero durante lo sviluppo precoce di Drosophila melanogaster17. Utilizzando gli approcci descritti in questa metodologia, siamo stati in grado di tracciare l'espressione di FKBP12 / Calstabin in D. melanogaster durante il blastoderma sinciziale (0-2 h), il blastoderma cellulare (2-3 h), la gastrula precoce (3-12 h) e la gastrula tardiva (12-24 h). In questo articolo, presentiamo i protocolli dettagliati di ogni approccio nello studio precedente, tra cui l'incorporamento pre-embrionale per il sezionamento classico di paraffina, il trattamento con vetrini pre-rivestimento per sezioni embrionali, la colorazione istochimica e l'immunocolorazione e l'ibridazione in situ dell'mRNA per l'identificazione dell'espressione genica.
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Protocol
1. Preparazione di piatti di agar di succo d'uva
- Aggiungere 5 g di agar e 5 g di saccarosio a 150 ml di acqua distillata. Farlo bollire usando un forno a microonde fino a quando l'agar e il saccarosio sono completamente sciolti. Mescolare 50 ml di succo d'uva al 100% e la soluzione insieme.
- Aggiungere 1 mL di acido propionico al 100% per rendere la concentrazione finale allo 0,5% di acido propionico. Versare 25 ml della soluzione preparata in ogni piastra. Dopo che l'agar si è solidificato, conservare il supporto a 4 °C.
2. Vetrini di rivestimento
- Pretrattare i vetrini con detergente. Lavare gli scivoli 3 volte con acqua di rubinetto e una volta con acqua distillata. Quindi asciugare i vetrini in un forno a 45 °C per 2 ore.
- Immergere i vetrini in circa 450 ml di soluzione di acido solforico dicromato di potassio (20 g di dicromato di potassio, 40 ml di acqua distillata e 400 ml di acido solforico concentrato) per 24 ore. Lavare gli scivoli 3 volte con acqua di rubinetto e una volta con acqua distillata.
- Asciugare i vetrini in forno a 45 °C per due ore. Immergere in etanolo al 95% per più di 2 ore.
- Aggiungere 0,5 g di solfato di cromopotassico e 5 g di gelatina a 1 L di acqua distillata. Sciogliere a bagnomaria a 60 °C prima dell'uso. La gelatina di cromo allume può essere conservata a 4 °C per lunghi periodi.
- Far cadere 10 μL di gelatina di cromo allume sul vetrino e coprire completamente e uniformemente l'intera superficie del vetrino con la soluzione. Mettere il vetrino con il lato gelatina in forno a 42 °C per 48 ore. I vetrini preparati possono essere conservati a 4 °C per un uso successivo.
NOTA: questo è un passaggio critico. Il rivestimento completo è necessario. Per il moscerino della frutta e il suo embrione, questo approccio di rivestimento a vetrino sembra più efficiente del rivestimento in polilisina.
3. Incorporamento dell'embrione di Drosophila
-
Raccolta di embrioni di Drosophila
NOTA: Abbiamo raccolto embrioni di Drosophila in quattro periodi di 0-2 ore (blastoderma sinciziale), 2-3 ore (blastoderma cellulare), 3-12 ore (gastrula precoce) e 12-24 ore (gastrula tardiva)18. La proporzione dei principali tipi di embrioni in ciascun periodo è riportata nella Tabella 1.- Metti 400-500 mosche in una bottiglia di raccolta di plastica e copri la bottiglia con il piatto di agar di succo d'uva contenente estratto di lievito. Gli embrioni di Drosophila vengono deposti sul succo d'uva agar a temperatura ambiente.
- Raccogliere quattro periodi di embrioni, aggiungendo delicatamente 2 ml di PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) a ciascuna piastra per far galleggiare gli embrioni. Trasferire circa 200 embrioni in un tubo di centrifuga da 50 ml e tenerlo sul ghiaccio per 2 minuti per sistemare gli embrioni.
- Pre-incorporamento
- Trasferire 200 embrioni di Drosophila in un tubo centrifugo da 1,5 ml. Tenere il tubo sul ghiaccio per 2 minuti per sistemare gli embrioni, quindi scartare con cura il surnatante con la pipetta. Aggiungere 1 mL di candeggina al 50% nel tubo e agitare delicatamente per 2 minuti.
NOTA: La candeggina deve essere preparata fresca e la quantità di candeggina potrebbe variare a seconda della quantità di embrioni raccolti. - Raccogliere delicatamente gli embrioni versandoli su carta da filtro e lavarli 3 volte con 1 ml di PBS alla volta.
- Trasferire gli embrioni con carta da filtro a circa 5 ml di n-eptano.
- Trasferire la miscela in un tubo centrifugo fresco da 1,5 ml. Aggiungere 1 ml di metanolo e agitare delicatamente. Raccogliere gli embrioni dopo la sedimentazione.
- Rimuovere il surnatante e lavare gli embrioni in 1 ml di PBS 3-5 volte.
- Fissare gli embrioni con 400 μL di soluzione di Bouin (71% di acido picrico saturo, 24% formalina, 5% acido acetico) per 30 minuti. Lavare gli embrioni fissi 3 volte in 1 ml di PBS per 5 minuti ogni volta.
- Per aggregare gli embrioni, trasferire i campioni in un tappo di gomma e rimuovere il PBS.
- Preparare la soluzione di agarosio-PBS all'1,2% e mantenere la soluzione a 60 °C. Aggiungere 200 μL di soluzione di agarosio-PBS all'1,2% sugli embrioni per fissarli in un blocco di agar.
- Togliere il blocco dal tappo e memorizzare il blocco in PBS.
NOTA: durante l'approccio di pre-incorporamento, pro-riscaldamento è fondamentale per il successo. Consigliamo vivamente che i tubi della centrifuga e le punte delle micropipette, che verranno utilizzati in questa fase, siano completamente preriscaldati prima del funzionamento.
- Trasferire 200 embrioni di Drosophila in un tubo centrifugo da 1,5 ml. Tenere il tubo sul ghiaccio per 2 minuti per sistemare gli embrioni, quindi scartare con cura il surnatante con la pipetta. Aggiungere 1 mL di candeggina al 50% nel tubo e agitare delicatamente per 2 minuti.
- Incorporamento di paraffina
- Immergere il blocco di agar pre-incorporato in etanolo al 35%, etanolo al 50%, etanolo al 75% etanolo all'85% per 15 minuti ciascuno. Quindi immergere 2 volte in etanolo al 95% e etanolo al 100%.
NOTE: Circa 5-10x di volume di blocco di ciascuno seguito da un fissativo graduato per 15-30 minuti è necessario a seconda del numero di embrioni nel blocco. - Immergere il blocco embrionale in soluzione di etanolo al 100% e xilene (rapporto 1:1) per 15 minuti.
- Trasferire il blocco in xilene per 1 minuto per rendere trasparente il tessuto embrionale.
- Immergere il blocco in xilene e paraffina (rapporto 1:1) per 30 min.
- Immergere il blocco in paraffina I, paraffina II e paraffina III per 2 ore ogni volta.
- Riempi la casella di incorporamento con paraffina in anticipo, quindi trasferisci delicatamente e orizzontalmente il blocco nella parte inferiore della scatola di incorporamento. Dopo che la paraffina si è solidificata naturalmente, il blocco di paraffina solidificato può essere conservato a 4 °C.
NOTE: Il campione pre-incorporato può essere utilizzato in criosezione seguendo i seguenti passaggi. Dopo che gli embrioni sono pre-incorporati con agarosio come descritto sopra, i campioni sono semplicemente incorporati in OCT Compound. Successivamente, la criosezione può essere eseguita secondo il protocollo di criosezione di routine. Successivamente, è possibile utilizzare approcci di colorazione regolari sulle sezioni.
- Immergere il blocco di agar pre-incorporato in etanolo al 35%, etanolo al 50%, etanolo al 75% etanolo all'85% per 15 minuti ciascuno. Quindi immergere 2 volte in etanolo al 95% e etanolo al 100%.
4. Colorazione dell'ematossilina-eosina
- Preparare sezioni di embrioni di Drosophila . Mettere le sezioni preparate in forno a 60 °C per 15 minuti e poi immergere le sezioni in xilene 2 volte per 10 minuti ciascuna. Immergere le sezioni una volta in etanolo al 100% e xilene (rapporto 1:1) per 2 min.
- Idratare le sezioni in etanolo I al 100%, etanolo II al 100%, etanolo al 95%, etanolo all'85%, etanolo al 75%, etanolo al 50% e in acqua distillata per 3 minuti.
- Macchiare le sezioni con soluzione di ematossilina per 2 minuti. Immergere rapidamente i vetrini in soluzione alcolica acida all'1% (1 mL di acido cloridrico, 100 ml di etanolo al 70%) e lavare i vetrini in acqua distillata.
- Immergere i vetrini in etanolo al 50%, etanolo al 75%, etanolo all'85% etanolo al 95% in sequenza.
- Macchiare le sezioni con soluzione di eosina per 1 min.
- Disidratare i vetrini in etanolo I al 95%, etanolo II al 95%, etanolo III al 95%, etanolo I al 100%, etanolo II al 100% e etanolo III al 100% per 1 minuto ogni volta.
- Pulire le diapositive in 100% xilene I, 100% xilene II e 100% xilene III per 5 minuti ogni volta.
- Montare le diapositive con balsamo neutro secondo le istruzioni del produttore.
5. Colorazione periodica acido-argento metenamina
- Deparaffinizzare e idratare le sezioni di paraffina dell'embrione di Drosophila in acqua distillata.
- Ossidare le sezioni in acido periodico all'1% per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Risciacquare i vetrini in acqua distillata 3 volte per 1 minuto ciascuno.
- Incubare i vetrini in circa 40 ml di soluzione di lavoro di metenamina d'argento appena filtrata (3% metenamina, 5% nitrato d'argento, soluzione di borato di sodio al 5%) per 1 ora e 20 minuti a 60 °C. Quindi risciacquare i vetrini in acqua distillata per 1 minuto.
- Tonificare i vetrini in cloruro d'oro allo 0,2% per 2 minuti e quindi risciacquare i vetrini in acqua distillata per 1 minuto.
- Posizionare i vetrini in tiosolfato di sodio al 3% per 3 minuti e quindi risciacquare i vetrini in acqua distillata per 1 minuto.
- Controbattere le diapositive in ematossilina per 30 s. Lavare gli scivoli in acqua corrente del rubinetto per 3-5 minuti.
- Disidratare i vetrini in etanolo al 70%, etanolo all'80%, etanolo I al 95%, etanolo II al 95%, etanolo III al 95%, etanolo I al 100% etanolo II al 100% per 5 minuti ciascuno.
- Pulire le diapositive in 100% xilene I, 100% xilene II e 100% xilene III per 5 minuti ciascuna.
- Montare le diapositive in balsamo neutro secondo le istruzioni del produttore.
6. Immunoistochimica
- Deparaffinizzare e reidratare le sezioni di paraffina dell'embrione di Drosophila in PBS seguendo il protocollo standard19.
- Trattare i vetrini con 0,3% di H2O2 in metanolo per 10 minuti a temperatura ambiente ed evitare la luce.
- Preriscaldare il tampone di recupero dell'antigene appropriato a circa 100 °C in un contenitore con i vetrini nel piroscafo vegetale. Il contenitore dovrebbe anche avere un coperchio. Metti le diapositive nel contenitore. Chiudere il coperchio del piroscafo.
- Tenere il contenitore nel piroscafo per 20 minuti da questo punto. Si noti che il coperchio del contenitore a scorrimento non deve essere completamente stretto in modo che il vapore acqueo possa entrare durante il processo di cottura a vapore.
- Lasciare che i vetrini tornino a temperatura ambiente prima di risciacquarli delicatamente in PBS-T (PBS con Tween-20, pH 7,2) 3 volte per 5 minuti ciascuno, quindi risciacquare i vetrini in PBS 3 volte per 1 minuto ciascuno.
- Bloccare i vetrini con l'1% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS per 60 minuti a temperatura ambiente.
- Incubare i vetrini con anticorpo primario (anti-FKBP12 a 1:1000) durante la notte a 4 °C o a temperatura ambiente per 4 ore.
- Lavare le diapositive in PBS-T 4 volte per 5 minuti ciascuna.
- Applicare i vetrini con polimero marcato HRP coniugato con anticorpi secondari (anti-Rabbit, 1:5.000) per 90 min a temperatura ambiente. Fallo al buio per evitare lo sbiancamento delle foto.
- Lavare i vetrini in PBS-T 3 volte per 5 minuti ciascuno.
- Incubare i vetrini con il 5% di 3,3'-diaminobenzidina-tetracloridrato (DAB) per 2-10 minuti fino a quando il colore dei prodotti di reazione è appropriato al microscopio.
- Controbattere i vetrini in ematossilina per 30 s e lavare i vetrini in acqua distillata 2 volte per 5 minuti ciascuno.
- Disidratare i vetrini in etanolo al 50%, etanolo al 70%, etanolo al 90%, etanolo al 95% ed etanolo al 100% per 1 minuto ciascuno.
- Pulire le diapositive in 100% xilene I, 100% xilene II e 100% xilene III per 5 minuti ciascuna.
- Montare le diapositive in balsamo neutro secondo le istruzioni del produttore.
7. Ibridazione in situ
NOTA: le sezioni di embrione di Drosophila sono state preparate con acqua trattata con pirocarbonato di dietile (DEPC) allo 0,01%. Tutti gli accessori utilizzati per l'ibridazione in situ applicano in anticipo il trattamento notturno DEPC.
- Preparazione del riboprobo
- Linearizzare il DNA del modello tagliando in un sito enzimatico di restrizione a valle dell'inserto clonato utilizzando un enzima di restrizione che crea sporgenze di 5 '. Dopo la linearizzazione, purificare il DNA del modello tramite estrazione di fenolo / cloroformio e successiva precipitazione di etanolo. Utilizzare protocolli standard.
- Aggiungere 1 μg di DNA modello purificato a un tubo centrifugo privo di RNasi. Posizionare il tubo della centrifuga sul ghiaccio. Aggiungere abbastanza acqua trattata con DEPC al volume totale di 13 μL.
- Quindi aggiungere i seguenti reagenti nell'ordine: 2 μL di 10x miscela di etichettatura NTP, 2 μL di 10x tampone di trascrizione, 1 μL di inibitore della RNasi protettore, 2 μL di RNA polimerasi SP6 o RNA polimerasi T7.
- Mescolare la reazione mediante pipettaggio e centrifuga a breve. Incubare per 2 ore a 37 °C.
NOTA: incubazioni più lunghe non aumentano la resa dell'RNA marcato. Una breve rotazione (~ 800 giri / min) applicata sul tubo di reazione è fondamentale prima di continuare con il passaggio successivo. Questo spin permetterà a tutti i contenuti, che potrebbero generare dall'incubazione, di arrivare sul fondo del tubo. - Aggiungere 2 μL di DNasi I priva di RNasi per rimuovere il DNA modello e incubare per 15 minuti a 37 °C.
- Aggiungere 2 μL di 200 mM EDTA (pH 8,0) per arrestare la reazione.
NOTA: le sonde di RNA marcate DIG possono essere conservate a -15-22 °C in etanolo per un anno.
- Pre-ibridazione della sezione embrionale di Drosophila
- Mettere sezioni di embrione di Drosophila in un forno a 42 °C per 48 ore.
- Deparaffinizzare le diapositive in 100% xilene per 10 minuti due volte.
- Idratare i vetrini immergendo sequenzialmente in etanolo al 100%, etanolo al 95%, etanolo al 90%, etanolo al 70% ed etanolo al 50% per 5 minuti.
- Incubare i vetrini in PBS per 5 minuti e 3 volte per rimuovere la soluzione fissativa / soluzione di Bouin dal tessuto.
- Lavare i vetrini con 100 mmol/L glicina/PBS soluzione 2 volte per 5 minuti ciascuno.
- Lavare le diapositive con PBS 2 volte per 5 minuti ciascuna.
- Incubare i vetrini con 0,3% Triton X-100 in PBS per 15 minuti per permeabilizzare le membrane.
- Lavare le diapositive con PBS 3 volte per 5 minuti ciascuna.
- Incubare i vetrini in 15 μg/mL di proteinasi K priva di RNasi per 30 minuti a 37 °C.
- Incubare i vetrini con il 4% di paraformaldeide in PBS per 3 minuti per fermare la digestione.
- Lavare le diapositive con PBS 2 volte per 5 minuti ciascuna.
- Incubare i vetrini in tampone trietanolammina da 100 mM (pH 8,0) con anidride acetica allo 0,25% (v/v) 2 volte per 5 minuti ciascuno.
- Aggiungere acqua DEPC nella camera di umidità della diapositiva. Aggiungere 20 μL di soluzione di pre-ibridazione (contenente 100 μg/mL di DNA di spermatozoi di salmone) sui vetrini. Mettere le diapositive nella camera di umidità della diapositiva. Incubare i vetrini a 42 °C per 4 ore.
NOTA: È necessario garantire la tenuta del coperchio della scatola bagnata e che la scatola bagnata sia sempre tenuta in orizzontale per evitare volatilizzazione e deviazione dal tessuto della soluzione di pre-ibridazione e della soluzione di ibridazione seguita.
- Ibridazione del comparto embrionale di Drosophila
- Rimuovere la soluzione di pre-ibridazione e lavare i vetrini con 0,2x SSC (150 mM di cloruro di sodio, 15 mM di citrato di sodio, pH 7,0) 3 volte per 5 minuti ciascuno. Pulire l'eccesso di SSC 0,2x intorno ai campioni di tessuto.
- Applicare 30 μL di soluzione di ibridazione della sonda (contenente 2-6 ng di sonda di RNA marcata con digossina diluendo in soluzione di pre-ibridazione) con una pipetta. Incubare i vetrini nella camera di umidità del vetrino a 42 °C per circa 20 ore.
NOTA: Assicurarsi della tenuta del cappuccio come suggerimento dell'ultima nota. Altrimenti, il prosciugamento causato dalla perdita di pre-ibridazione o pre-ibridazione genererà uno sfondo sporco incluso pseudo-positivo nelle diapositive.
- Ibridazione
- Rimuovere la soluzione di ibridazione e lavare i vetrini con 4x soluzione SSC 4 volte per 15 minuti ciascuno a 37 °C.
- Lavare i vetrini in 2x soluzione SSC con 20 μg/mL di RNasi A per 30 min a 37 °C.
- Lavare i vetrini in 1 soluzione SSC per 15 minuti a 37 °C.
- Lavare i vetrini in soluzione SSC 0,5x per 15 minuti a 37 °C.
- Lavare i vetrini in soluzione SSC 0,1x per 15 minuti a 37 °C.
- Lavare le diapositive con PBS 3 volte per 5 minuti ciascuna.
- Lavare i vetrini nel tampone di lavaggio (100 mM di acido maleico, 150 mM NaCl, 0,3% (v/v) Tween 20, pH 7,5) per 1 min.
- Incubare i vetrini in 100 ml di soluzione bloccante appena preparata (siero di pecora al 2% in tampone di acido maleico senza Tween 20) per 30 minuti.
- Incubare i vetrini in 20 ml di soluzione anticorpale per 45 minuti.
- Centrifugare l'anticorpo per 5 minuti a 10.000 giri/min nel flaconcino originale prima di ogni utilizzo e pipettare con attenzione la quantità necessaria dalla superficie. Anti-digoxigenina-AP diluita 1:5000 (150 mU/mL) in soluzione bloccante.
- Lavare i vetrini in 100 ml di tampone di lavaggio 2 volte per 15 minuti ciascuno per rimuovere il coniugato anticorpale non legato.
- Equilibrare le diapositive in 20 mL di tampone di rilevamento (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5) per 2-5 min.
- Incubare i vetrini con 10 ml di soluzione di substrato colorato appena preparata nella camera di umidità del vetrino. La reazione inizia entro pochi minuti ed è completa dopo 16 ore. Non agitare o mescolare mentre il colore si sta sviluppando.
- Lavare i vetrini con 50 ml di acqua distillata per 5 minuti per fermare la reazione.
- Asciugare il campione durante la notte al buio.
- Disidratare i vetrini in 70% etanolo, 80% etanolo, 90% etanolo, 95% etanolo, 100% etanolo I e 100% etanolo II per 3 minuti ciascuno.
- Cancellare le diapositive in 100% xilene I, 100% xilene II e 100% xilene III per 20 minuti ciascuna.
- Montare gli scivoli con balsamo neutro.
- Documenta le immagini e analizzale con la microscopia invertita e il software del produttore. Eseguire l'analisi della distribuzione utilizzando ImageJ in base alla densità del segnale positivo lungo l'asse longitudinale o all'interno della zona differenziale degli embrioni.
NOTA: Durante l'incubazione con la soluzione di substrato colorante appena preparata nel passaggio 7.4.12, il colore della reazione può essere visto anche ad occhio nudo. Questa osservazione su come lo sviluppo del colore può essere ispezionata sotto stereoscopio. Una volta che il colore della reazione è ragionevole e il passaggio 7.4.13 può essere eseguito per fermare la reazione.
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Representative Results
Le figure descrivono i protocolli utilizzati per superare la sfida di attaccare embrioni di Drosophila ad alto contenuto di lipidi e chitina (Tabella 1) alla superficie del vetrino per l'esame e la sperimentazione. Utilizzando il metodo di rivestimento dei vetrini di gelatina di allume cromato mostrato nella Figura 1, abbiamo migliorato l'attaccamento degli embrioni di Drosophila sulla superficie dei vetrini, mentre il metodo di pre-incorporamento dell'embrione mostrato nella Figura 2 consente un'ispezione efficiente della distribuzione dinamica della proteina e dell'RNA DmFKBP12 / Calstabin in tutte e quattro le prime fasi di sviluppo (cioè blastoderma sinciziale, blastoderma cellulare, gastrula precoce e tardiva degli embrioni di Drosophila). La Figura 3 mostra la distribuzione proteica degli anticorpi rilevati FKBP12 / Calstabin negli stadi di blastoderma sinciziale e cellulare. Da questi risultati istochimici, si può vedere che l'espressione di FKBP12 è meno polarizzata nel blastoderma sinciziale (pannelli da A a H), e quindi inizia a localizzarsi all'interno della membrana basale sotto l'epitelio del trofoectoderma per formare un gradiente con più espressione che si trova nei poli anteriori rispetto ai poli posteriori (pannelli da I a S). Alla fine, la proteina DmFKBP12/Calstabin diventa limitata a determinati componenti architettonici dei tessuti embrionali primitivi con una distribuzione extracellulare inferiore a quella osservata nelle fasi embrionali di gastrula precoce e tardiva (Figura 4). È interessante notare che la distribuzione dinamica delle proteine sopra descritta non è accompagnata dai corrispondenti livelli di mRNA di DmFKBP12 (Figura 5), indicando che l'espressione proteica è il risultato di un meccanismo molecolare post-trascrizione ancora sconosciuto. Il metodo descritto di rivestimento e pre-incorporamento del vetrino CAG ci consentirà di sondare ulteriormente l'importanza di DmFKBP12 nella segnalazione del calcio e di portare alla luce questo meccanismo molecolare ancora sconosciuto combinando altre tecniche come l'interferenza dell'RNA di micro-iniezione19.
In questo studio, sviluppiamo un metodo di rivestimento e pre-incorporamento di gelatina di allume cromo per l'istologia, l'analisi istochimica e immuno-istologica degli embrioni di Drosophila in diverse fasi di sviluppo. Utilizzando questo metodo di pre-incorporamento, gli embrioni vengono effettivamente raccolti sia per il sezionamento di crio- che di paraffina che consente l'analisi di sezioni trasversali longitudinali. Questo ci ha permesso di descrivere i modelli di espressione in evoluzione per questa proteina durante le fasi di sviluppo decisive, collegando l'espressione della proteina allo sviluppo di sistemi fisiologici chiave come l'intestino, il cervello e il sistema nervoso di collegamento. Impiegando questi metodi, siamo stati in grado di studiare le distribuzioni dinamiche della proteina regolatrice RyR e dell'mRNA FKBP12 / Calstabin durante lo sviluppo di embrioni di Drosophila in fasi definitive, tra cui il blastoderma sinciziale e cellulare e le fasi di gastrulazione precoce e tardiva. I nostri dati hanno mostrato che la proteina FKBP12 / Calstabin e il suo RNA possono essere rilevati molto presto nel blastoderma sinciziale. Man mano che l'embrione si sviluppa, FKBP12 diventa più densamente distribuito nello strato cellulare basale sotto l'epitelio del blastoderma. La proteina FKBP12/Calstabin rafforza quindi dinamicamente la sua espressione e differenzia la sua distribuzione nei tessuti embrionali contenenti muscoli, tra cui lo stomodeo, lo stomodeo e il rudimento del midgut posteriore. Questi cambiamenti di distribuzione dall'inizio del blastoderma alle fasi tardive della gastrulazione sono descritti anche nel sistema neuronale in via di sviluppo, compresi i neuroblasti, il nervo ventrale, il ganglio sopraesofageo e il cervello. Mentre questi cambiamenti dinamici in FKBP12 / Calstabin suggeriscono la sua importanza nello sviluppo, non si riflettono nei livelli di mRNA della proteina, suggerendo un regolatore ancora sconosciuto dell'espressione proteica che rimane da identificare.
Figura 1: Schizzo del metodo di rivestimento della gelatina di cromo allume (CAG) per sezioni di paraffina utilizzate in immunologia e ibridazione in situ dell'RNA per visualizzare la distribuzione della proteina DmFKBP12 e dell'mRNA negli embrioni di Drosophila. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Figura 2: Schizzo del metodo di pre-incorporamento per il profilo di espressione di FKBP12 e DmFKBP12 nello sviluppo di embrioni di Drosophila . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Profilo di espressione della proteina DmFKBP12 nei blastodermi sinciziali e cellulari dell'embrione di Drosophila . (A-D) Colorazione H&E del blastoderma sinciziale. La quantificazione della distribuzione di DmFKBP12 nel blastoderma sinciziale precoce è presentata in D. (E-G) I pannelli presentano blastoderma sinciziale precoce in cui i nuclei sono sotto divisione. La quantificazione della distribuzione di DmFKBP12 nel blastoderma sinciziale tardivo è presentata in H. (I-L) Colorazione H&E del blastoderma cellulare. La qualifica della distribuzione di DmFKBP12 nel blastoderma cellulare tardivo è presentata in L. (M-S) I pannelli mostrano la distribuzione della proteina DmFKBP12 nel blastoderma cellulare. O mostra le viste più grandi di M-N. (P-R) I pannelli presentano un blastoderma cellulare precedente mostrato in M-O. Le quantificazioni della distribuzione di DmFKBP12 nel blastoderma cellulare precoce sono presentate in S. La barra di scala per A, E, I, M e P è 60 μm, per B, C, F, J, K, N, Q e R è 40 μm, e per G, O è 20 μm. AP, polo anteriore dell'uovo; YK, tuorlo; CN, nucleo di scissione; PP, polo posteriore dell'uovo; BLD, blastoderma, nuclei e cellule; BM, Membrana basale. I dati sono espressi come media± SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. La quantificazione dei dati è stata effettuata con ImageJ. In primo luogo, i prodotti marroni sono rimasti nell'immagine insieme alla rimozione di tutti gli altri colori. In secondo luogo, l'immagine marrone è stata cambiata in bianco e nero e calcolare la sua densità per la quantificazione di conseguenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Profilo di espressione della proteina DmFKBP12 nelle fasi iniziali e tardive della gastrulazione dell'embrione di Drosophila. A, D e G mostrano la colorazione H&E dell'embrione di Drosophila nella fase di gastrulazione. B, C, E e F mostrano la distribuzione di DmFKBP12 nella fase iniziale di gastrulazione. H, I e J-L visualizzano la distribuzione di DmFKBP12 nella fase di gastrulazione tardiva. Le quantificazioni della distribuzione di DmFKBP12 nelle prime gastrule sono presentate in M. La barra di scala per A, D, E e G è 80 μm, per B, C, F, H, I e J-L è 40 μm. PP, polo posteriore dell'uovo; NBL, neuroblasti; ST, stomodaeum; YK, tuorlo; PMG, rudimento dell'intestino medio posteriore; BR, cervello, ganglio sopraesofageo; VNS, sistema nervoso ventrale; PV, proventriculus; MUS, muscolo; MGC, caecum midgut; AMG, rudipighiano dell'intestino medio anteriore; MMG, midgut medio; TR, trachea. I dati sono espressi come media± SEM. ns, non significativi; ** p < 0,01, *** p < 0,001. La quantificazione dei dati è stata effettuata con ImageJ 1.50d rimanendo prodotto-marrone e passando all'immagine in bianco e nero, e seguendo il calcolo della densità del bianco e nero come descritto nella precedente legenda della figura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Localizzazione in situ dell'mRNA DmFKBP12 durante lo sviluppo embrionale dell'embrione di Drosophila. A mostra la localizzazione in situ dell'mRNA DmFKBP12 allo stadio di blastoderma sinciziale quando l'mRNA FKBP12 è stato espresso nel citoplasma dell'embrione. B e C mostrano localizzazione in situ dell'mRNA DmFKBP12 allo stadio di blastoderma cellulare quando l'mRNA FKBP12 è stato espresso nei limiti interni delle cellule blastodermiche. D ed E mostrano la localizzazione in situ dell'mRNA FKBP12 nella fase iniziale della gastrulazione. Durante questa fase, è principalmente localizzato nell'intestino in via di sviluppo. F, G e H mostrano la localizzazione in situ dell'mRNA FKBP12 nella fase di gastrulazione tardiva, quando l'mRNA è espresso nel muscolo e nell'intestino. I è il controllo positivo dell'mRNA DmFKBP12. J è il controllo negativo dell'mRNA DmFKBP12. La barra della scala per A, C, E, G e I è 5 μm, per B, D, F, I e J è 10 μm. YK, tuorlo; CN, nucleo di scissione; BLD, blastoderma, nuclei e cellule; CF, fessura obliqua anteriore, solco cefalico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Fasi embrionali | 0-2 ore (%) | 2-3 ore (%) | 3-12 ore (%) | 12-24 ore (%) |
| Blastoderma sinciziale | 90.8 | 0 | 0 | 0 |
| Blastoderma cellulare | 6.9 | 91.54 | 0 | 0 |
| Gastrula precoce | 2.3 | 4.23 | 91.1 | 0 |
| Gastrula tardiva | 0 | 4.23 | 8.93 | 93.3 |
Tabella 1: Raccolta di embrioni di diversi stadi di sviluppo di Drosophila melanogaster
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Discussion
La segnalazione del calcio mediata da RyR e IP3R è una via fondamentale in molti processi fisiologici e patologici di animali vertebrati e invertebrati1,2,3,4. Nell'uomo, le mutazioni puntiformi, come la mutazione R4496C associata a CPVT, nel gene RyR2 portano alla fuoriuscita di calcio dal reticolo sarcoplasmatico dei cardiomiociti, con conseguente disfunzione cardiaca. Queste mutazioni si presentano come aritmia con un alto rischio di morte cardiaca improvvisa durante l'attività fisica ed è riproducibile in modelli murini progettati per portare questa mutazione. In condizioni di esercizio, i topi portatori di questa mutazione di perdita di calcio hanno sperimentato una morte improvvisa cardiaca non dimostrata dalle sue parti di contatore wildtype18,20,21,22. La sovraespressione di FKBP12, un regolatore di RyRs, nel cuore, corrispondeva ad alti tassi di morte cardiaca associata ai canali del potassio nei modelli murini22,23, una scoperta che corrispondeva al fenotipo dei topi knockout FKBP1210,11. Poiché i RyR dei mammiferi, tra cui RyR1, RyR 2 e RyR3 e i loro FKBP regolatori, sono stati ben studiati per oltre tre decenni, la maggior parte dei procedimenti coinvolti in cardiopatologia, disfunzione muscolare scheletrica e raggiungimento della funzione cerebrale dopo lo sviluppo precoce più oncogenesi sono al centro della ricerca24,25.
A differenza dei vertebrati, che hanno tre isoforme di RyR, le mosche Drosophila hanno un solo RyR1,2,3,5. Recentemente, abbiamo dimostrato la funzione critica di Drosophila RyR (DmRyR) nelle prime fasi dello sviluppo embrionale di Drosophila. Abbiamo svelato l'espressione di DmRyR sia a livello traslazionale che trascrizionale negli embrioni di Drosophila durante lo sviluppo precoce: lo stadio di blastoderma sinciziale, lo stadio di blastoderma e le prime fasi di gastrula. In tutte e quattro le fasi, l'mRNA dmFKBP12 è stato distribuito uniformemente in tutto l'embrione ed è rimasto allo stesso livello, mentre l'espressione proteica del gene era altamente dinamica con profili di espressione polarizzati anteriormente e poi distribuiti in alcuni strati cellulari19. I protocolli metodologici che abbiamo utilizzato in questa pubblicazione sono stati fondamentali per la capacità di ottenere un elevato volume di risultati rappresentativi.
Il sezionamento di paraffina è una tecnica di base e pratica per la rilevazione istologica dell'espressione proteica per l'analisi quantitativa. Le sezioni di paraffina sono uno strumento fondamentale per studiare l'espressione proteica nell'insetto adulto. Tuttavia, queste tecniche sono state difficili da replicare nello sviluppo degli insetti a causa del loro embrione ricco di lipidi e del coro ricco di chitina, che rendono difficile l'incorporamento, la conservazione e il montaggio di diapositive. I lipidi presenti negli embrioni interferiscono con le forze che consentono l'attaccamento di sezioni embrionali sulla superficie del vetrino. Mentre la chitina trovata nel corion presenta barriere fisiche che proteggono l'embrione da interferenze chimiche e meccaniche, limita anche gli attaccamenti di campioni embrionali a vetrini di vetro. Mentre queste caratteristiche assicurano un più alto tasso di sopravvivenza delle larve di insetti, ostacolano notevolmente la capacità di studiare la loro espressione di proteine e mRNA in situ . Questo problema è stato risolto in molti modi. L'uso di detergenti per superfici come Tween-20 spesso stacca gli embrioni di Drosophila e riduce il numero di embrioni disponibili per lo studio. Questa tecnica richiede l'incubazione per 20 ore per svelare l'mRNA per l'ibridazione in situ , ma stacca anche i campioni dai vetrini quasi interamente. La tecnica qui di rivestire vetrini di vetro con gelatina di allume di cromo (CAG) prima di eseguire l'immunoistochimica e il riconoscimento specifico anti-senso per l'mRNA risolve queste barriere tecniche migliorando l'attaccamento tra l'embrione e il vetrino di vetro.
Oltre all'attaccamento potenziato CAG, le tecniche di pre-incorporamento dell'embrione di Drosophila descritte consentono la raccolta di un gran numero di embrioni di Drosophila datati con precisione. Questo ci ha permesso di riportare l'espressione dinamica di DmFKBP12/Calstabin in varie fasi dello sviluppo embrionale precoce. Il primo stadio che siamo stati in grado di studiare usando questa tecnica è lo stadio di blastoderma sinciziale, che ha mostrato una distribuzione meno differenziata e un livello generalmente inferiore di espressione. Studiando gli embrioni negli stadi di blastoderma cellulare e gastrula, abbiamo scoperto che il livello generale di DmFKBP12 / Calstabin aumenta man mano che gli embrioni si sviluppano e inizia a localizzarsi, prima al sondaggio anteriore, poi a determinati strati nello stadio a tre strati. I risultati suggeriscono che l'FKBP12 coinvolto nella segnalazione del calcio svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo precoce e la cui differenziazione svolge un ruolo importante nello sviluppo di Drosophila melanogaster .
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (#31771377/ 31571273/31371256), dal Foreign Distinguished Scientist Program del National Department of Education (#MS2014SXSF038), dal National Department of Education Central Universities Research Fund (#GK201301001/201701005/GERP-17-45) e XZ è supportato da Outstanding Doctoral Thesis Fund (#2019TS082 /2019TS079), Key Program of Shaanxi Provincial Education Department (#20JS138), il Natural Science Basic Research Program Youth Project del Dipartimento Provinciale di Scienza e Tecnologia dello Shaanxi (#2020JQ-885).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -20°C Refrigerator | Meiling Biology &Medical | DW-YL270 | Used for regent storage |
| -80°C Ultra low temperature refrigerator | Thermo | Forma 90 Series | Used for regent storage |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparation of grape juice agar plates |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | For the detection of digoxigenin-labeled compound |
| Biochemical incubator | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
| Bouin's solution | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
| Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
| Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
| Chrome Alum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10001018 | Coating Slides |
| Constant temperature water bath | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Dako REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | In-situ Hybridization |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11093274910 | RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | The stocks of Drosophila melanogaster mutant |
| Electric blast drying oven | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | For coating slides and paraffin embedding |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 100092680 | Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Gelatin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10010328 | Coating Slides |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| High Pure PCR Product Purification Kit | Roche | 11732668001 | For purification of PCR products |
| Intelligent constant temperature and humidity box | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | For fly maintenance |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pre-embedding |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10014108 | Drosophila Embryo Collection |
| Microscope | ZEISS | Observer.A1 | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Microscope Slides | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Coating Slides |
| Neutral Gum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10004160 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| N-heptane | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 40026768 | Drosophila Embryo Collection |
| Paraffin slicer | Huahai science instrument | HH-2508III | In-situ Hybridization |
| Paraffin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69019461 | Paraffin Embedding |
| pH/mV Meter | Sartorius | PB-10 | For determing the pH value of a solution |
| Silver nitrate | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10018461 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Ultrapure water meter | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Hybridization |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10023418 | Paraffin Embedding |
References
- Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
- Cheng, H., Lederer, W. J.
- Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
- Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
- Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
- George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
- Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
- Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
- Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
- Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
- Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
- Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
- Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
- Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
- Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer. 633-645 (1958).
- Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
- Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
- Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
- Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
- Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the 'resolution revolution'. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).
