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Neuroscience

मॉडलिंग न्यूरॉन-ओलिगोडेंड्रोसाइट इंटरैक्शन के लिए प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से मानव न्यूरॉन्स और ओलिगोडेंड्रोसाइट्स की पीढ़ी

Published: November 9, 2020 doi: 10.3791/61778
Automatic Translation
*1, *1,2, *3, 1, 1, 3, 3,4, 1,5,6
1Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University, 2Department of Neurology, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine, 4Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 5Department of Neurology, Warren Alpert Medical School of Brown University, 6Center for Translational Neuroscience, Robert J. and Nancy D. Carney Institute for Brain Science and Brown Institute for Translational Science, Brown University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

अपर्याप्त उपकरणों और विधियों के कारण न्यूरोडीजेनेरेशन में न्यूरॉन-ग्लियल इंटरैक्शन को अच्छी तरह से समझा नहीं गया है। यहां, हम मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्रेरित न्यूरॉन्स, ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं और ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स प्राप्त करने के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और अल्जाइमर रोग में सेल-प्रकार-विशिष्ट योगदान को समझने में इन तरीकों के मूल्यों के उदाहरण प्रदान करते हैं।

Abstract

अल्जाइमर रोग (एडी) और अन्य न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में, ऑलिगोडेंड्रोग्लियल विफलता एक आम प्रारंभिक रोग संबंधी विशेषता है, लेकिन यह रोग के विकास और प्रगति में कैसे योगदान देता है, विशेष रूप से मस्तिष्क के ग्रे पदार्थ में, काफी हद तक अज्ञात है। ऑलिगोडेंड्रोसाइट वंश कोशिकाओं की शिथिलता को माइलिनेशन में कमी और ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं (ओपीसी) के बिगड़ा हुआ आत्म-नवीकरण द्वारा चिह्नित किया जाता है। ये दो दोष कम से कम पैथोलॉजी के निर्माण के साथ न्यूरॉन और ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के बीच बातचीत के व्यवधान के कारण होते हैं। ओपीसी सीएनएस विकास के दौरान माइलिनेटेड ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स को जन्म देते हैं। परिपक्व मस्तिष्क प्रांतस्था में, ओपीसी प्रमुख प्रोलिफेरेटिव कोशिकाएं हैं (जिसमें कुल मस्तिष्क कोशिकाओं का ~ 5% शामिल है) और तंत्रिका गतिविधि-निर्भर तरीके से नए माइलिन गठन को नियंत्रित करते हैं। इस तरह के न्यूरॉन-टू-ऑलिगोडेंड्रोसाइट संचार का काफी कम अध्ययन किया जाता है, विशेष रूप से एडी जैसी न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियों के संदर्भ में, उचित उपकरणों की कमी के कारण। हाल के वर्षों में, हमारे समूह और अन्य लोगों ने मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से व्यक्तिगत रूप से कार्यात्मक न्यूरॉन्स और ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध प्रोटोकॉल में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण प्रगति की है। इस पांडुलिपि में, हम अपनी अनुकूलित प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं, जिसमें न्यूरॉन-ऑलिगोडेंड्रोसाइट कनेक्शन को मॉडल करने के लिए एक सह-संस्कृति प्रणाली की स्थापना शामिल है। ओलिगोडेंड्रोसाइट्स से मस्तिष्क एमाइलॉयडोसिस और सिनैप्स अखंडता में एक अप्रत्याशित योगदान का सुझाव देते हैं और एडी अनुसंधान के लिए इस पद्धति की उपयोगिता को उजागर करते हैं। यह न्यूनीकरणवादी दृष्टिकोण मस्तिष्क के अंदर अंतर्निहित जटिलता से विशिष्ट हेटरो-सेलुलर इंटरैक्शन को विच्छेदित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यहां हम जिन प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, वे न्यूरोडीजेनेरेशन के रोगजनन में ऑलिगोडेंड्रोग्लियाल दोषों पर भविष्य के अध्ययन की सुविधा प्रदान करने की उम्मीद करते हैं।

Introduction

ओलिगोडेंड्रोसाइट वंश कोशिकाएं - जिसमें ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाएं (ओपीसी), माइलिनेटेड ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स और बीच में संक्रमणकालीन प्रकार शामिल हैं - मानव मस्तिष्क कोशिकाओं के एक प्रमुख समूह का गठन करते हैं1 जो तंत्रिका विकास और उम्र बढ़ने के दौरान हमारे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के उचित संचालन और रखरखाव के लिए कई महत्वपूर्ण कार्यों में सक्रिय रूप से भाग लेते हैं। . जबकि ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स न्यूरोनल गतिविधि संचरण की सुविधा और सफेद पदार्थ में अक्षीय स्वास्थ्य का समर्थन करने के लिए माइलिन के उत्पादन के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है, ओपीसी ग्रे पदार्थ में प्रचुर मात्रा में (~ 5%) होते हैं जहां माइलिनेशन दुर्लभ होता है और सीखने के व्यवहार और स्मृति गठन को नियंत्रित करने के लिए गतिविधि-निर्भर सिग्नलिंग कार्य करता है 5,6,7,8 . अल्जाइमर रोग (एडी) और अन्य उम्र से जुड़े न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियों के रोगजनन में ऑलिगोडेंड्रोग्लियल कोशिकाएं कैसे कार्य करती हैं और शिथिलता काअध्ययन किया गया है। एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली की अपर्याप्तता और एक प्रयोगात्मक पथ को आगे बढ़ाने के लिए सामान्य ज्ञान में कमियां इस अंतर के प्रमुख कारण हैं।

भ्रूण स्टेम (ईएस) और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं सहित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से मानव मस्तिष्क कोशिकाओं को प्राप्त करने में नवीनतम सफलताओं के प्रकाश में, आधुनिक जीन संपादन उपकरणों के साथ संयोजन में ऐसे सेलुलर मॉडल मस्तिष्क में सेलुलर इंटरैक्शन के जटिल गठजोड़ को संभालने के लिए मजबूत उपकरण के रूप में उभरे हैं, और मानव-विशिष्ट रोग अभिव्यक्तियों का प्रदर्शन करने में सक्षम हैं। 11. यह देखते हुए कि व्यक्तिगत मस्तिष्क सेल प्रकार एक ही एडी-बढ़ावा देने वाली स्थितियों12,13 के सामने अलग-अलग और यहां तक कि परस्पर विरोधी प्रभाव प्रदर्शित कर सकते हैं, यह स्टेम सेल पद्धति विशिष्ट रूप से सेल प्रकार-विशिष्ट जानकारी प्रदान करती है जो पहले विवो या इन विट्रो मॉडल में स्थापित का उपयोग करके याद की गई है जो केवल मस्तिष्क सेल प्रकारों के संग्रह से कुल रीडआउट प्रदान करते हैं। पिछले दशक में, ईएस / आईपीएस कोशिकाओं के ट्रांस-भेदभाव से मानव न्यूरॉन्स उत्पन्न करने या अन्य टर्मिनल रूप से विभेदित सेल प्रकारों (जैसे, फाइब्रोब्लास्ट) 14,15 से प्रत्यक्ष रूपांतरण से मानव न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए अच्छी संख्या में विश्वसनीय प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। विशेष रूप से, मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के लिए प्रमुख न्यूरोजेनिक प्रतिलेखन कारकों (जैसे, न्यूरोजेनिन 2, एनजीएन 2) 16 का अनुप्रयोग ग्लियाल कोशिकाओं12,17,18 के साथ सह-संवर्धन की आवश्यकता के बिना शुद्ध संस्कृतियों के लिए अच्छी तरह से विशेषता वाले न्यूरोनल सेल प्रकारों की एक सजातीय आबादी उत्पन्न कर सकता है। प्रेरित मानव ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के लिए, कुछ प्रकाशित प्रोटोकॉल हैं जो अपने प्राथमिक समकक्षों के समान कार्यात्मक कोशिकाओं को उत्पन्न कर सकते हैं, समय और संसाधनों में दक्षता और मांग की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . आज तक, इनमें से कोई भी प्रोटोकॉल यह जांचने के लिए लागू नहीं किया गया है कि ऑलिगोडेंड्रोग्लियाल कोशिकाएं एडी रोगजनन का जवाब कैसे देती हैं और प्रभावित करती हैं।

यहां, हम मानव प्रेरित न्यूरॉन्स (आईएन) और ओपीसी / ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स (आईओपीसी / आईओएल) की एकल और मिश्रित संस्कृतियों के लिए हमारे बेहतर प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यहां वर्णित आईएन प्रोटोकॉल व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले एनजीएन 2 दृष्टिकोण16 पर आधारित है, और इसमें ग्लिया-मुक्त होने की अतिरिक्त विशेषता है। परिणामी आईएन समरूप होते हैं और कॉर्टिकल परत 2/3 उत्तेजक न्यूरॉन्स से मिलते-जुलते हैं, जिसमें विशिष्ट पिरामिड आकृति विज्ञान, जीन अभिव्यक्ति पैटर्न और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताएं17,18 (चित्रा 1) हैं। प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के निर्देशित विभेदन में कुछ मूलभूत बाधाओं को दूर करने के लिए, हमने कम खुराक वाले डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) पूर्व-उपचार29,30 की एक सरल और प्रभावी विधि विकसित की है, और मानव ईएस / आईपीएस कोशिकाओं की आईओपीसी और आईओएल 31 में अंतर करने की बढ़ी हुई प्रवृत्ति की सूचना दी है, जो डौवारस और फोसाती32 द्वारा व्यापक रूप से अनुकूलित प्रोटोकॉल पर आधारित है। . हमने प्रोटोकॉल को और सरल बनाया है और ऑलिगोडेंड्रोग्लियाल परिपक्वता की प्रक्रिया को तेज करने के लिए एक मजबूत भेदभाव को बढ़ावा देने वाले यौगिक, क्लेमास्टीन 7,33,34 को शामिल किया है। नतीजतन (चित्रा 2), आईओपीसी 2 सप्ताह में उत्पन्न हो सकते हैं (मार्कर ओ 4 के लिए ~ 95% सकारात्मक) और चार सप्ताह में आईओएल (परिपक्व मार्कर एमबीपी और पीएलपी 1 व्यक्त करते हुए)। दिलचस्प बात यह है कि हमने पाया कि अकेले आईओपीसी एमिलॉयड-β (एओ) की एक उल्लेखनीय मात्रा का स्राव करते हैं, जो स्वतंत्र ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा के अनुरूप है, जो एमिलॉयड अग्रदूत प्रोटीन (एपीपी) की प्रचुर मात्रा में अभिव्यक्ति और ऑलिगोडेंड्रोसाइट वंशावली कोशिकाओं में प्रोसेसिंग प्रोटीज β-सेक्रेटेज (बीएसीई 1)को दर्शाता है। इसके अलावा, हमारी iN-iOPC सह-संस्कृति प्रणाली MBP-पॉजिटिव आईओएल प्रक्रियाओं द्वारा अक्षतंतु के आवरण को बढ़ावा देती है और सिनैप्स गठन के लिए महत्वपूर्ण समर्थन प्रदान करती है (चित्रा 3)। इस प्रकार, जिन प्रोटोकॉल को हमने नीचे विस्तृत किया है, उनमें पहले सूचीबद्ध न्यूरॉन-ऑलिगोडेंड्रोग्लिया सह-संवर्धन विधियों पर तकनीकी और जैविक फायदे हैं, और एडी में न्यूरोडीजेनेरेशन को बेहतर मॉडलिंग में एक वादा करते हैं।

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Protocol

1. मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से मानव न्यूरॉन प्रेरण

  1. लेंटीवायरस तैयारी (~ 5 दिन, विस्तृत प्रोटोकॉल जैसा कि पहले वर्णितहै 16)
    1. प्लेट ~ 1 मिलियन एचईके 293 टी कोशिकाएं प्रत्येक टी 75 फ्लास्क, अभिकर्मक करते समय उन्हें ~ 40% कंफ्लुएंट करने के लिए। उन्हें टेट्रासाइक्लिन-इंड्यूसेबल एनजीएन 2 और प्यूरोमाइसिन-प्रतिरोधी जीन (प्यूरोआर; एक ही टेटो प्रमोटर नियंत्रण के तहत), आरटीटीए और तीन हेल्पर प्लास्मिड पीआरएसवी-आरईवी, पीएमडीएलजी / पीआरआरई, और वीएसवी-जी (लेंटिवायरल वेक्टर डीएनए के 12 μg और प्रत्येक हेल्पर प्लास्मिड डीएनए के 6 μg) को व्यक्त करने वाले प्लास्मिड के साथ स्थानांतरित करें। लेंटीवायरस तैयार करने के लिए कम से कम तीन फ्लास्क तैयार करें। निर्माता के निर्देश का पालन करते हुए अभिकर्मक के लिए पीईआई का उपयोग करें। 16 घंटे के बाद मीडिया बदलें और छोड़ दें।
    2. हार्वेस्ट ने हर दिन संस्कृति मीडिया एकत्र करके वायरल कणों को जारी किया और 3 दिनों के लिए ताजा मीडिया के साथ बदल दिया। शुद्धिकरण के लिए वायरल कणों वाले एकत्रित मीडिया को पूल करें। वायरस को 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें और 90 मिनट के लिए 49,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। पीबीएस-ग्लूकोज (~ 150 μL) की उचित मात्रा में गोली को पुन: निलंबित करें।
  2. न्यूरॉन प्रेरण (~ 5 दिन)
    नोट: यह प्रेरण प्रोटोकॉल (चित्रा 1 ए; प्रवाह आरेख) मान्य प्लुरिपोटेंसी के आईपीएस और ईएस कोशिकाओं दोनों के लिए अत्यधिक प्रभावी है (जिसे अच्छी तरह से विशेषता वाले प्लुरिपोटेंसी मार्करों के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री स्टेनिंग द्वारा परख लिया जा सकता है; चित्र 1 बी)।
    1. 52 के पारित होने पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एच 1 मानव ईएस कोशिकाओं का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)। बाह्य मैट्रिक्स समाधान पर कोशिकाओं को ईएस सेल रखरखाव माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके 6-वेल प्लेटों (~ 0.5 मिलीग्राम मैट्रिक्स समाधान प्रति 6-वेल प्लेट; सामग्री की तालिका देखें) को लेपित करें और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस परप्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    2. दिन -2 पर, ईएस कोशिकाओं (80% कंफ्लुएंट) को 1 एमएल सेल डिटेचमेंट समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ अलग करें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को एक ट्यूब में स्थानांतरित करें; कुएं को 2 एमएल मीडिया से धोएं और उसी ट्यूब में मिलाएं। 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज, मीडिया में गोली को फिर से निलंबित करें, और कोशिकाओं को मैट्रिक्स लेपित 6-वेल प्लेटों पर 1 x 105 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से सीडिंग घनत्व पर प्लेट करें।
    3. दिन -1 पर, ताजा ईएस सेल रखरखाव माध्यम में ईएस कोशिकाओं में पॉलीब्रीन (8 μg / ml) के साथ Ngn2 प्लस PuroR और RTTA को व्यक्त करने वाले लेंटीवायरस जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। वायरस की सटीक मात्रा वास्तविक टिटर्स या अनुमापन द्वारा निर्धारित की जानी चाहिए। हम आम तौर पर 6-वेल प्लेट में प्रति अच्छी तरह से प्रत्येक वायरस को 5 μL जोड़ते हैं।
    4. दिन 0 पर, डीएमईएम-एफ 12 माध्यम में डॉक्सीसाइक्लिन (2 μg / mL, Ngn2 अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए) को मॉर्फोजेन के बिना N2 पूरक के साथ जोड़ें।
    5. पहले दिन, डीएमईएम-एफ 12 प्लस एन 2 और डॉक्सीसाइक्लिन के ताजा माध्यम में प्यूरोमाइसिन जोड़ें, 1 μg / mL माध्यम की अंतिम एकाग्रता के लिए। कम से कम 24 घंटे के लिए प्यूरोमाइसिन में ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं का चयन करें। वायरस टिटर कम होने पर अंडर-ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से हटाने के लिए उच्च प्यूरोमाइसिन एकाग्रता (5 μg / mL तक) और लंबी चयन अवधि (48 घंटे तक) की आवश्यकता हो सकती है।
    6. दूसरे दिन, सेल डिटेचमेंट समाधान के साथ विभेदित न्यूरॉन्स को अलग करें ( सामग्री की तालिका देखें), और उन्हें मैट्रिक्स समाधान के साथ लेपित 24-वेल प्लेटों (80,000-200,000 कोशिकाओं / कुएं के बीच) पर फिर से प्लेट करें ( सामग्री की तालिका देखें), और उन्हें डॉक्सीसाइक्लिन के बिना एनबीए / बी 27 माध्यम में बनाए रखें। बीजारोपण घनत्व महत्वपूर्ण है।
    7. इस स्तर पर, अलग न्यूरॉन्स को विशेष वाणिज्यिक ठंड माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) में जमे हुए किया जा सकता है और 3 महीने तक तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया जा सकता है। शुद्ध न्यूरॉन्स को पिघलने के बाद विशिष्ट ~ 15% -20% कोशिका मृत्यु के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, अकेले सुसंस्कृत किया जा सकता है या अन्य मस्तिष्क कोशिका प्रकारों के साथ सह-संवर्धित किया जा सकता है (ओपीसी के साथ सह-संवर्धन के लिए चरण 3.2.3 देखें)।
    8. निर्माता द्वारा निर्देशित बाह्य मैट्रिक्स-आधारित समाधानों के साथ लेपित प्लेटों पर शुद्ध आयनों को कल्चर करें ( सामग्री की तालिका देखें)। विशिष्ट पिरामिड आकृति विज्ञान दिन 4 (और दिन 6) तक स्पष्ट होना चाहिए; चित्र 1 सी)। सिनैप्स गठन का पता 14 से 16 दिन की शुरुआत में लगाया जा सकता है और मानक प्री-और पोस्ट-सिनैप्टिक मार्करों के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग द्वारा 24 वें दिन प्रमुख है। (चित्रा 1 डी; प्री-सिनैप्टिक मार्कर सिनैप्सिन 1 और डेंड्राइटिक मार्कर मैप 2 के साथ लेबल किया गया)।

2. प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं और ऑलिगोडेंड्रोसाइट परिपक्वता से मानव ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत सेल (ओपीसी) प्रेरण

  1. न्यूरल प्रोजेनिटर सेल (एनपीसी) पीढ़ी: मोनोलेयर प्रोटोकॉल (~ 7 दिन)। प्रवाह आरेख के लिए चित्र 2A देखें।
    1. संस्कृति एच 1 मानव ईएस कोशिकाएं जैसा कि पहले वर्णित है (चरण 1.2.1 देखें) और उन्हें दोहरी एसएमएडीआई नामक एक स्थापित दृष्टिकोण द्वारा तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं (एनपीसी) में ट्रांस-अंतर करें, जिसमें कई सिग्नलिंग मार्गों के लिए छोटे अणु अवरोधक हैं। यहां हम एक व्यापक रूप से स्वीकृत वाणिज्यिक किट का उपयोग करते हैं और निर्माता द्वारा प्रदान किए गए मोनोलेयर प्रोटोकॉल का पालन करते हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. दिन -1 पर, ईएस सेल रखरखाव माध्यम के साथ एक विकास कारक कम मैट्रिक्स समाधान द्वारा लेपित6-वेल प्लेट में प्लेट 0.5-1 x 10 6 कोशिकाएं प्रति कुएं ( सामग्री की तालिका देखें; ~ 0.5 मिलीग्राम मैट्रिक्स समाधान प्रति 6-वेल प्लेट) के साथ ( सामग्री की तालिका देखें)। इस विकास कारक कम मैट्रिक्स समाधान का उपयोग उन सभी प्लेटों को कोट करने के लिए किया जाता है जिनका उपयोग निम्नलिखित चरणों में किया जाएगा।
    3. दिन 0 पर, ईएस सेल रखरखाव माध्यम के साथ 24 घंटे के लिए कोशिकाओं का इलाज करें ( सामग्री की तालिका देखें) 2% डीएमएसओ द्वारा पूरक।
    4. दिन 1-6 पर, वाणिज्यिक किट से एसएमएडी अवरोधकों वाले गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) तंत्रिका प्रेरण माध्यम के साथ पूर्ण मीडिया को बदलें ( सामग्री की तालिका देखें)। यदि कोशिकाएं विभाजित होती हैं और 7 दिन से पहले संगम तक पहुंचती हैं, तो उन्हें 0.5-1 x 10 6 के सीडिंग घनत्व तक लेजाएं, जैसा कि चरण 2.1.2 में पहले वर्णित है।
    5. 7 वें दिन, सेल डिटेचमेंट समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) और 24-वेल प्लेट के 1-2 x 105 कोशिकाओं / कुएं के सीडिंग घनत्व पर प्लेट का उपयोग करके एनपीसी पारित करें।
    6. उदाहरण के लिए, प्लूरिपोटेंसी मार्कर, ओसीटी 4 की अनुपस्थिति के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) धुंधला द्वारा विभेदन दक्षता और पैक्स 6, नेस्टीन और सॉक्स 1 जैसे एनपीसी मार्करों की उपस्थिति की परख करें।
    7. इस स्तर पर, अलग किए गए एनपीसी को विशेष वाणिज्यिक एनपीसी फ्रीजिंग मीडिया ( सामग्री की तालिका देखें) में फ्रीज किया जा सकता है और 3 महीने तक तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया जा सकता है। एक बार के लिए फ्रीज-और-पिघलने के बाद, एनपीसी अभी भी विश्वसनीय प्रोटोकॉल के साथ न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स और ओपीसी को जन्म देने के लिए मल्टीपोटेंसी बनाए रखते हैं।
  2. ओलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत सेल (ओपीसी) पीढ़ी (~ 7 दिन)। कृपया प्रवाह आरेख के लिए चित्र 2A देखें।
    1. 7 वें दिन, सेल डिटेचमेंट समाधान का उपयोग करके एनपीसी को पारित करें ( सामग्री की तालिका देखें) और उन्हें वाणिज्यिक किट से गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) तंत्रिका प्रेरण माध्यम और एसएमएडी अवरोधकों में 24-वेल प्लेट में 1-2 x 105 कोशिकाओं प्रति कुएं के सीडिंग घनत्व पर प्लेट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. 8 वें दिन, ओपीसी भेदभाव माध्यम में 1% डीएमएसओ का समाधान तैयार करें और 24 घंटे के लिए प्लेटेड एनपीसी का इलाज करें। ओपीसी विभेदन माध्यम से बना है: डीएमईएम / एफ 12 माध्यम, 1% एन 2 पूरक, 1% बी 27 पूरक, 20 एनजी / एमएल पर बीएफजीएफ, 1 μM पर एसएजी, 1 एनजी / एमएल पर पीडीजीएफ-एए ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. 9 वें दिन, डीएमएसओ के बिना नए ओपीसी भेदभाव माध्यम के साथ मीडिया को बदलें। 15 वें दिन तक हर दूसरे दिन कोशिकाओं को खिलाएं। यदि कोशिकाएं 15 वें दिन से पहले संगम तक पहुंच जाती हैं, तो उन्हें चरण 2.2.1 में वर्णित 1-2 x 105 कोशिकाओं के सीडिंग घनत्व तक ले जाएं।
    4. 14 वें दिन, ओपीसी विभेदन माध्यम में प्लेट ओपीसी 1-2 x 105 कोशिकाओं / कुएं के घनत्व पर 24-वेल प्लेट में।
    5. इस स्तर (दिन 15) पर, आईएचसी स्टेनिंग या क्यूपीसीआर (जैसे, ओ 4, ओलिग 1/2, सीएसपीजी 4 / एनजी 2, एनकेएक्स 2.2, पीडीजीएफआरए) द्वारा ओपीसी-विशिष्ट मार्करों की उपस्थिति के लिए परीक्षण कोशिकाएं; चित्र 2B) और एनपीसी मार्करों (पैक्स 6 या नेस्टीन) की अनुपस्थिति के लिए; चित्र 2 डी)। हम आम तौर पर 15 वें दिन 95% से अधिक कोशिकाओं में ओ 4 विकृति का पता लगाते हैं। अल्जाइमर रोग के लिए विशेष प्रासंगिकता, एपीपी (एमिलॉयड अग्रदूत प्रोटीन), बीएसीई 1 (प्रसंस्करण प्रोटीज β-सेक्रिएटेज 1), और पेप्टाइड एमिलॉयड-β (ए) की अभिव्यक्ति ओपीसी (चित्रा 2 एफ) में प्रचुर मात्रा में है।
  3. ऑलिगोडेंड्रोसाइट (ओएल) परिपक्वता (~ 7-20 दिन)
    1. 15 वें दिन, मीडिया को ओएल परिपक्वता माध्यम के साथ बदलें: न्यूरोबेसल-ए माध्यम, 2% बी 27 पूरक, 1 μM cAMP, 200 ng / mL T3 triiodothyronine, और 1 μM के क्लेमास्टीन ( सामग्री की तालिका देखें)। यदि आवश्यक हो तो हर दूसरे दिन या हर दिन माध्यम बदलें।
    2. जब कोशिकाएं 90% संगम तक पहुंच जाती हैं, तो 1: 3 के अनुपात में 2 मार्ग तक विभाजित होती हैं या जब तक कोशिका विभाजन काफी हद तक धीमा नहीं हो जाता। यदि ओपीसी बहुत तेजी से विभाजित होते हैं और 3 दिनों से कम समय में संयोजन तक पहुंचते हैं, तो 1-3 दिनों के लिए 2-5 μM की एकाग्रता पर Ara-C ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। सक्रिय प्रसार कम परिपक्वता दक्षता को इंगित करता है।
    3. ओएल मार्करों की अभिव्यक्ति का आकलन करके ऑलिगोडेंड्रोग्लियल परिपक्वता की दक्षता की जांच करें, उदाहरण के लिए, सीएलडीएन 11, पीएलपी 1, क्यूपीसीआर द्वारा एमबीपी, आईएचसी धुंधला या इम्यूनोब्लोटिंग। अत्यधिक जटिल संरचनाओं की विशिष्ट आकृति विज्ञान (चित्रा 2 सी) और ओएल मार्करों की अभिव्यक्ति (चित्रा 2 ई) को दिन 28 तक आसानी से पता लगाया जाना चाहिए।

3. मानव प्रेरित न्यूरॉन्स (आईएन) और ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं (आईओपीसी) का सह-संवर्धन

  1. आईओपीसी चढ़ाना (~ 3 दिन)
    1. ओपीसी विभेदन माध्यम में (जैसा कि चरण 2.2.2 में वर्णित है) में 24-वेल प्लेट (जैसा कि ऊपर चरण 2.2.4 में वर्णित है) में 1 x 105 कोशिकाओं के घनत्व पर 14 वें दिन प्लेट आईओपीसी।
  2. iN-iOPC सह-संस्कृति स्थापित
    1. 15 वें दिन, पुरोमाइसिन चयन के बाद दिन 2 के चरण में प्रेरित मानव न्यूरॉन्स को अलग करें (जैसा कि चरण 1.2.6 में वर्णित है) सेल डिटेचमेंट समाधान ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. सुसंस्कृत ओपीसी पर न्यूरॉन्स जोड़ें, बढ़ते ओपीसी (चरण 3.1.1 से) के साथ 24-वेल प्लेट में प्रति अच्छी तरह से 2 x 105 कोशिकाओं के सीडिंग घनत्व पर चढ़ाना। न्यूरोबेसल-ए माध्यम, 2% बी 27 पूरक, और 100 एनजी / एमएल टी 3 ट्रायोडोथायरोनिन युक्त सह-संस्कृति माध्यम का उपयोग करें। अगले दिन और फिर उसके बाद हर दूसरे दिन माध्यम बदलें। यदि ओपीसी बहुत तेजी से बढ़ते हैं और 3 दिनों से कम समय में कंफ्लुएंसी तक पहुंचते हैं, तो 2-5 μM की एकाग्रता पर Ara-C जोड़ें। 7 दिनों के न्यूरॉन्स के बाद सह-संस्कृति में उगाए गए आईएन और आईओपीसी की एक प्रतिनिधि छवि चित्रा 3 ए में दिखाई गई है।
    3. ओपीसी के साथ सह-संवर्धन के लिए चरण 1.2.7 में ऊपर वर्णित अनुसार तैयार जमे हुए न्यूरॉन्स का उपयोग करें। प्लेट फ्रीज-एंड-पिघलना न्यूरॉन्स प्रति कुएं 3 x 105 कोशिकाओं के उच्च घनत्व पर।
    4. सह-संस्कृतियों में 14-16 दिन के बाद, आईएन में सिनैप्स गठन को पूर्व और पोस्ट-सिनैप्टिक मार्करों के आईएचसी धुंधला होने से देखा जा सकता है, और दिन 21 तक सिनैप्टिक पंक्टा प्रचुर मात्रा में होना चाहिए (चित्रा 3 सी) और न्यूरोनल गतिविधियों को मज़बूती से दर्ज किया जा सकता है।
    5. दिन 21 से शुरू होकर, ओएल विशिष्ट मार्करों (उदाहरण के लिए, एमबीपी और पीएलपी 1) के लिए परीक्षण कोशिकाएं। 28 वें दिन तक, हम आम तौर पर आईओएल प्रक्रियाओं द्वारा आईएन अक्षतंतु की घटना का निरीक्षण करते हैं, जिसे विशिष्ट मार्करों के लिए आईएचसी धुंधलापन द्वारा लेबल किया जाता है (चित्रा 3 बी; आईएन अक्षतंतु के लिए न्यूरोफिलामेंट एनएफ और आईओपीसी प्रक्रियाओं के लिए एमबीपी)।

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Representative Results

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से मानव प्रेरित न्यूरॉन्स की प्रत्यक्ष पीढ़ी
यह बहुत महत्वपूर्ण है कि प्रारंभिक मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल आईएन या आईओपीसी / आईओएल की सफल पीढ़ी के लिए उच्च स्तर की प्लूरिपोटेंसी प्रदर्शित करते हैं। इसलिए, वर्तमान पांडुलिपि (चित्रा 1 ए) में वर्णित प्रेरण प्रोटोकॉल में से किसी को भी शुरू करने से पहले कोशिकाओं को विशिष्ट मार्करों, जैसे अक्टूबर 4 और एसओएक्स 2 के लिए दाग दिया जाना चाहिए। झांग एट अल द्वारा पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल के बाद प्रेरित उत्तेजक फोरब्रेन न्यूरॉन्स प्राप्त करने के लिए मानव एच 1 कोशिकाओं का उपयोग किया गया था (चित्रा 1 सी) 12,16,17,18। यहां, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें दिन 2 पर आईएन को मैट्रिक्स समाधान (सामग्री की तालिका देखें) पर शुद्ध संस्कृति में फिर से चढ़ाया जाता है, किसी भी फीडर परत की अनुपस्थिति में: ग्लिया या फाइब्रोब्लास्ट। पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल के अलावा, हम देखते हैं कि दिन 2 पर आईएन फ्रीज करना सेल व्यवहार्यता (पिघलने के बाद ~ 15% -20% सेल मृत्यु) को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करता है। संस्कृति में शुद्ध न्यूरॉन्स दिन 14-16 (चित्रा 1 डी) में सिनैप्सिन 1 व्यक्त करना शुरू कर देंगे। एक शुद्ध न्यूरोनल संस्कृति स्थापित करना बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि कुछ कारक, उदाहरण के लिए, अग्रणी एडी जोखिम कारक एपीओई, फीडर परत में कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किया जा सकता है और यह परिणामों को काफी भ्रमित कर सकता है।

डीएमएसओ उपचार द्वारा आईओपीसी उत्पादन और आईओएल परिपक्वता में सुधार हुआ है
यहां, हम एक तेज़ और कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो 2 सप्ताह में आईओपीसी की पीढ़ी और 4-5 सप्ताह में परिपक्व आईओएल को सक्षम बनाता है (चित्रा 2 ए)। हमने ईएस और आईपीएस कोशिकाओं 29,30,31 के लिए भेदभाव दक्षता को बढ़ाने के लिए पहले विकसित क्षणिक डीएमएसओ उपचारकी विधि का लाभ उठाया। डीएमएसओ उपचार बेहतर सिग्नलिंग एकीकरण के लिए प्रारंभिक जी 1 चरण में कोशिकाओं की संख्या को समृद्ध करता है, भेदभाव का पक्ष लेता है। हमने एनपीसी उत्पन्न करने के लिए मानव ईएस कोशिकाओं को प्रेरित करने से पहले पहला उपचार किया, और एनपीसी को आईओपीसी में अलग करने से पहले दूसरा उपचार किया। हम ईएस एच 1 कोशिकाओं (चित्रा 2 बी, ई) की प्लेटिंग के 2 सप्ताह बाद विशिष्ट ओपीसी मार्करों (ओलिग 2, सीएसपीजी 4, एनकेएक्स 2.2, और पीडीजीएफआरए) का पता लगा सकते हैं। इस स्तर पर आईओपीसी आबादी काफी समरूप है, जिसमें >95% कोशिकाएं ओ 4 धुंधला होने के लिए सकारात्मक हैं और अन्य मार्करों के लिए उच्च स्तर की विकृति है (चित्रा 2 बी)। दिन 15 में ओएल परिपक्वता की शुरुआत के बाद, हम आम तौर पर दिन 28 (चित्रा 2 सी, ई) से शुरू होने वाले विशिष्ट ओएल मार्करों (एमबीपी, ओ 1, सीएलडीएन 11, और पीएलपी 1) का पता लगा सकते हैं। इन चरण-विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति ऑलिगोडेंड्रोग्लियाल कोशिकाओं के विकास पाठ्यक्रम से संबंधित है और एक त्वरित गति का सुझाव देती है, जिसमें एनपीसी मार्कर उत्तरोत्तर नीचे जा रहे हैं, ओपीसी मार्कर दूसरे सप्ताह के आसपास चरम पर हैं, और ओएल मार्कर तीसरे सप्ताह तक बढ़ रहे हैं (चित्रा 2डी, ई)37)। कृपया ध्यान दें कि यह परिपक्वता प्रक्रिया सेल आबादी में विविधता लाती है। निरंतरता में उप-आबादी, जिसमें ओपीसी और परिपक्व माइलिनिंग ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के बीच कई मध्यवर्ती चरण शामिल हैं, मौजूद हो सकते हैं और कुल कोशिकाओं के अलग-अलग प्रतिशत के लिए जिम्मेदार हो सकते हैं, जिसमें बाद के समय में अधिक परिपक्व कोशिकाएं हावी होती हैं।

तुलना के रूप में, हमने अत्यधिक संदर्भित आईओपीसी खरीदे, और निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करते हुए उन्हें आईओएल में परिपक्व किया। हमने अपने आईओपीसी और आईओएल तैयारी दोनों में और हमारे द्वारा खरीदी गई कोशिकाओं में ऊपर उल्लिखित मार्करों की अभिव्यक्ति का परीक्षण किया। हमने निर्धारित किया कि हमारे प्रोटोकॉल के बाद उत्पन्न कोशिकाओं में परीक्षण किए गए सभी जीनों की उच्च अभिव्यक्ति थी (चित्रा 2 ई)। दिलचस्प बात यह है कि जब हमने आईएन बनाम आईओपीसी में एमिलॉयड-β (ए40 और ए42) के दो प्रमुख आइसोफॉर्म के स्रावित स्तरों का परीक्षण किया, तो हमने देखा कि आईओपीसी ने दोनों टुकड़ों को अधिक स्रावित किया, लेकिन अनुपात समान रहा (चित्रा 2 एफ)।

iNs और iOPCs का सह-संवर्धन
यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से आईएन और आईओपी के सह-संवर्धन के लिए अनुकूलित किया गया है और तंत्रिका विकास के दौरान इन दो सेल प्रकारों के बीच अंतर-सेलुलर संचार की हमारी वास्तविक समय निगरानी की अनुमति देता है। उचित भेदभाव प्राप्त करने के लिए दोनों सेल प्रकारों के लिए आदर्श चढ़ाना घनत्व सेल नंबर अनुमापन की एक श्रृंखला के साथ तय करने की आवश्यकता है (चित्रा 3 ए)। सह-संस्कृतियों में 4 सप्ताह के बाद, आईओपीसी को ओएल में पर्याप्त रूप से विभेदित किए जाने की उम्मीद है जो एमबीपी जैसे विशिष्ट मार्करों के लिए सकारात्मक हैं और एनशीथ अक्षतंतु (चित्रा 3 बी) तक प्रक्रियाओं का विस्तार करते हैं। सह-संस्कृति प्रणाली सिनैप्स की संख्या को मजबूती से बढ़ा सकती है, यह दर्शाता है कि आईओपीसी भौतिक संपर्कों या ट्रॉफिक कारकों की रिहाई के माध्यम से एक न्यूरोनल समर्थन प्रदान करते हैं (चित्रा 3 सी)। हम सह-संस्कृतियों को 6 सप्ताह तक स्वीकार्य स्वास्थ्य स्थिति में बनाए रख सकते हैं और देख सकते हैं कि सिनैप्स संख्या और अन्य न्यूरोनल विशेषताएं पांचवें सप्ताह के आसपास स्थिर होती हैं। ध्यान दें, एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया हमारी तैयारी में मौजूद नहीं हैं और उनकी अनुपस्थिति को विशिष्ट मार्करों (चित्रा 3 डी) की अभिव्यक्ति की जांच करके प्रलेखित किया जा सकता है। आईओपीसी अच्छी तरह से विशेषता वाले जीनों की एक अच्छी संख्या व्यक्त करते हैं जो संभावित रूप से एक पैराक्रिन (जैसे न्यूरोट्रोफिन और मेटाबोलाइट्स) और / या सिनैप्टिक तरीके से पड़ोसी न्यूरॉन्स से गतिविधि-निर्भर संकेतों का जवाब दे सकते हैं और मध्यस्थता कर सकते हैं (चित्रा 3 ई और 3 एफ)।

Figure 1
चित्रा 1: एचपीएससी से मानव प्रेरित न्यूरॉन्स (आईएन) की प्रत्यक्ष पीढ़ी। (ए) आईएन पीढ़ी का प्रवाह आरेख। (बी) प्लुरिपोटेंसी की पुष्टि करने के लिए मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एच 1) की शुरुआती संस्कृति के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र और इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। अक्टूबर 4 को लाल रंग में और Sox2 को हरे रंग में दिखाया गया है। (सी) दिन 4 और दिन 6 में आईएन की प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियां। (डी) 24 दिनों के लिए शुद्ध संस्कृति में उगाए गए और डेंड्राइटिक मार्कर मैप 2 और प्री-सिनैप्टिक मार्कर सिनैप्सिन 1 (सिन 1) के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा दाग दिए गए आईएन में डेंड्राइटिक आर्बराइजेशन और सिनेप्स पंक्टा के लिए विशिष्ट आकृति विज्ञान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: आईओपीसी पीढ़ी और आईओएल परिपक्वता। (ए) आईओपीसी और आईओएल उत्पादन का प्रवाह आरेख। (बी) 15 वें दिन आईओपीसी के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र और इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। ओलिग 2 (पैन-ऑलिगोडेंड्रोग्लिया मार्कर) हरे रंग में, ओ 4 (ओपीसी मार्कर) लाल रंग में और डीएपीआई नीले रंग में दिखाया गया है। इमेजिंग से पता चला कि >95% आईओपी ओ 4 के लिए सकारात्मक हैं और ओलिग 2 के लिए 25% हैं। (सी) 28 वें दिन आईओएल के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र और इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। एमबीपी को हरे रंग में, ओ 1 को लाल रंग में और DAPI को नीले रंग में दिखाया गया है। (घ) एनपीसी मार्कर पैक्स6 की अभिव्यक्ति 14वें दिन आईओपीसी में नाटकीय रूप से कम हो जाती है और 28वें दिन ओएल में पृष्ठभूमि में और कम हो जाती है, जो एक मजबूत एनपीसी ट्रांस-भेदभाव और आईओपीसी आबादी में उच्च स्तर की एकरूपता को दर्शाता है। (ई) वर्णित प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न संस्कृतियों में सामान्य ओपीसी और ओएल मार्कर जीन की समय-पाठ्यक्रम अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल, (-डीएमएसओ) या (+डीएमएसओ) डीएमएसओ इनक्यूबेशन के चरण (चरण 2.1.3 और 2.2.2) के साथ, अलग-अलग समय बिंदुओं पर परख की गई। तुलना के रूप में, वाणिज्यिक आईओपीसी ( सामग्री की तालिका देखें) को निर्माता के निर्देशों के अनुसार परिपक्व किया गया था, और दोनों आईओपीसी (आईओपीसी-टेम्पो) या आईओएल (आईओएल-टेम्पो) को समान मार्करों के लिए परीक्षण किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, एमबीपी (एक परिपक्व ऑलिगोडेंड्रोसाइट मार्कर) का परीक्षण किए गए सभी आईओपीसी में भेदभाव के शुरुआती चरणों में पता नहीं लगाया गया था (एनडी)। डीएमएसओ ने ओपीसी भेदभाव और ओएल परिपक्वता की दक्षता में काफी वृद्धि की। (च) शुद्ध iNs और iOPCs संस्कृतियों में A40 और A42 का उत्पादन और स्राव, वाणिज्यिक एलिसा किट ( सामग्री की तालिका देखें) द्वारा मापा जाता है, जो 15 वें दिन शुद्ध iNs और iOPCs संस्कृतियों से प्राप्त सुपरनैटेंट पर मापा जाता है और सेल संख्याओं (दोनों 24-वेल प्लेट में प्रति कुएं 200,000 कोशिकाओं के घनत्व पर) द्वारा सामान्यीकृत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बार ग्राफ़ में डेटा को एसईएम (एन ≥ 3) ± माध्य के रूप में प्लॉट किया गया है। सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन छात्र के टी-टेस्ट (*, पी < 0.05; ***, पी < 0.001) द्वारा किया गया था; एनपीसी की तुलना में (डी) में; नियंत्रण आईओपीसी-टेम्पो की तुलना में (ई); (एफ) में, iN की तुलना में।

Figure 3
चित्रा 3: आईएन और आईओपीसी की सह-संस्कृति। (ए) दिन 7 पर सह-सुसंस्कृत आईएन और आईओपीसी की प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवि, आगे परिपक्वता के लिए उचित घनत्व दिखाती है। (बी) आईएन और आईओपीसी की प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि 28 दिनों के लिए सह-सुसंस्कृत। अक्षीय मार्कर न्यूरोफिलामेंट एनएफ को हरे रंग में और ओलिगोडेंड्रोसाइटिक मार्कर एमबीपी को लाल रंग में दिखाया गया है। दाएं, आईओएल प्रक्रिया (एमबीपी +) द्वारा संलग्न आईएन अक्षतंतु का एक खंड। (सी) 4 सप्ताह पुरानी सह-संस्कृतियों में सिनैप्स गठन की परख की गई। कोशिकाओं को सिनेप्सिन 1 (सिन 1, हरा) और एमएपी 2 (लाल) के लिए दाग दिया गया था, और सिनैप्टिक पंक्टा कोडेंड्राइटिक खंडों के साथ घनत्व के कॉन्फोकल विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था जैसा कि 17,18 वर्णित है। (घ) आईएन और आईओपीसी (सह-संवर्धन के 7 दिन) की हमारी सह-संस्कृतियों में, एस्ट्रोसाइट मार्करों, एएलडीएचएल 1 और जीएफएपी की अभिव्यक्ति न्यूनतम (शीर्ष) है, और क्यूपीसीआर द्वारा माइक्रोग्लिया मार्करों, टीएमईएम 119, टीआरईएम 2 और सीडी 33 की अभिव्यक्ति का पता नहीं लगाया गया है। इस प्रकार इन दो ग्लियल सेल प्रकारों से संदूषण को बाहर रखा गया है। (ई) आईओपीसी को आईएन के साथ जोड़ने से न्यूरॉन-ओपीसी सिनैप्स का निर्माण होता है। फ्लोरेसेंस-टैग किए गए पोस्ट-सिनैप्टिक मार्कर पीएसडी 95-एमचेरी केवल ओपीसी में व्यक्त किया जाता है, और एकल संस्कृतियों (बाएं) में एक फैलाव पैटर्न प्रदर्शित करता है, लेकिन कोकल्चर में पंक्टा बनाने के लिए एकत्रित होता है (दाएं, तीर द्वारा इंगित; Tuj1, न्यूरोनल मार्कर)। (एफ) अच्छी तरह से विशेषता वाले ऑलिगोडेंड्रोग्लियाल जीन की अभिव्यक्ति जो 14 वें दिन आईओपी की शुद्ध संस्कृतियों में न्यूरोनल गतिविधियों को समझ और प्रतिक्रिया दे सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बार ग्राफ़ में डेटा को एसईएम (एन ≥ 3) ± माध्य के रूप में प्लॉट किया गया है। सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन छात्र के टी-टेस्ट (*, पी < 0.005; ***, पी < 0.001) द्वारा किया गया था; (सी) में, कोई ओपीसी स्थिति की तुलना में; शीर्ष पैनल में प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स की तुलना में (डी) में।

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Discussion

सिनैप्स संरचनाओं को स्थिर करने और माइलिनेशन द्वारा नमकीन संकेत चालन की सुविधा के लिए शारीरिक और चयापचय समर्थन के अलावा, ऑलिगोडेंड्रोसाइट वंशावली कोशिकाएं न्यूरॉन्स 5,6,7 के साथ तेजी से और गतिशील क्रॉस-टॉकके माध्यम से न्यूरोनल गतिविधि पैटर्न को आकार दे सकती हैं। जबकि एडी पैथोलॉजी में ऑलिगोडेंड्रोग्लियल प्रतिक्रियाओं को शुरू में सूजन और ऑक्सीडेटिव तनाव के लिए केवल द्वितीयक माना जाता था, अब यह तर्क देते हुए आशाजनक सबूत हैं कि माइलिन अखंडता से समझौता एकत्रीकरण और ताऊ हाइपरफॉस्फोराइलेशन9 की उपस्थिति से पहले एक प्रारंभिक रोगजनक घटना है। इसके अलावा, ओपीसी के आत्म-नवीकरण के माध्यम से माइलिनेशन की मरम्मत एडी38 में विशेष रूप से कमजोर है, एक प्रक्रिया जो न्यूरोनल गतिविधियों पर बहुत अधिक निर्भर करती है। स्वस्थ न्यूरॉन-ऑलिगोडेंड्रोसाइट सिग्नलिंग का समर्थन करने के लिए तंत्र को समझना इस प्रकार नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए एक उत्कृष्ट अवसर का प्रतिनिधित्व करता है।

एकल प्रतिलेखन कारक एनजीएन 2 प्रोटोकॉल स्टेम सेल-व्युत्पन्न मानव न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए सबसे अधिक नियोजित तकनीकों में से एक है, और यहां उल्लिखित प्रक्रियाएं शुद्ध न्यूरोनल संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए और शोधन हैं। हमारे iOPC / iOL प्रोटोकॉल में पहले प्रकाशित अध्ययनों (4 से 24 सप्ताह) की तुलना में प्रेरण अवधि कम है, जिसमें अन्य सामान्य रूप से उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल19,20,22,23,24,25,26,27,28 के बराबर मजबूत उपज और शुद्धता है। . हमारा प्रोटोकॉल विशिष्ट पैटर्निंग संकेतों द्वारा एनपीसी, ओपीसी और अंत में ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के लिए ईएस कोशिकाओं के चरणबद्ध भेदभाव का परिचय देता है, और कार्यात्मक कोशिकाओं को उत्पन्न करता है जिनका उपयोग माइलिनेशन होमियोस्टैसिस के विनियमन का अध्ययन करने और विट्रो या विवो में मरम्मत के लिए किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, कंपकंपी माउस मॉडल में संलग्न करके) जैसा कि पिछले काम में वर्णित है। हमारे प्रोटोकॉल में सुधार को डीएमएसओ इनक्यूबेशन द्वारा बहुत बढ़ावा दिया जाता है, जो रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन को सक्रिय करता है और निर्देशित भेदभाव की उत्तेजनाओं को बेहतर ढंग से एकीकृत करने के लिए सेल चक्र के जी 1 चरण को बढ़ाता है, और कार्यात्मक डेरिवेटिव29,30 में टर्मिनल भेदभाव को भी बढ़ाता है। अंत में, क्लेमास्टीन का उपयोग, एक मस्केरिनिक और एंटीहिस्टामिनिक यौगिक है, जिसे रिमाइलिनेशन थेरेप्यूटिक्स33 के लिए ड्रग स्क्रीन के माध्यम से पहचाना जाता है, अतिरिक्त रूप से ऑलिगोडेंड्रोसाइट परिपक्वता को कम करता है, जैसा कि आईपीएस सेल तैयारी और जीवित जानवरों में देखा गयाहै।

तकनीक की सीमाएं मुख्य रूप से सरलीकृत इन विट्रो सेटिंग्स और मस्तिष्क में विवो परिवेश के बीच आंतरिक विसंगति में निहित हैं; यह विसंगति व्यक्तिगत मस्तिष्क कोशिका प्रकारों के लिए उन्नत चरणों में पूर्ण विकास क्षमता में छूट की ओर ले जाती है। आईएन के लिए, हाल के अध्ययन काफी लंबे समय तक अच्छे सिनैप्टिक स्वास्थ्य में संस्कृतियों को बनाए रखने में सक्षम थे, लेकिन फिर भी कुछ सापेक्ष अपरिपक्वता का पता चला जो "पुरानी" आईएन संस्कृतियों (यहां तक कि 25 महीने पुराने लोगों) में रीढ़ जैसी संरचनाओं और बिगड़ा हुआ सहज सिनैप्टिक ट्रांसमिशन के रूप में प्रकट हुआ। जबकि ट्रांसजेनिक माउस दिमाग में प्रत्यारोपित होने के बाद आईओपी को विवो में माइलिनेट अक्षतंतु के रूप में दिखाया गया है, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक मूल्यांकन के साथ इन विट्रो माइलिनेशन परख अभी भी लगभग सभी प्रकाशित प्रोटोकॉल19,28 के लिए असंतोषजनक दक्षता के साथ एक तकनीकी चुनौती का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें यह भी शामिल है। इसलिए, हमारे न्यूरॉन-ओपीसी सह-संस्कृति प्रणाली को मस्तिष्क-उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के साथ-साथ एडी पैथोलॉजी के अंतिम चरण की ईमानदारी से नकल करने का अनुमान नहीं है। इसके बजाय, यह विशिष्ट रूप से न्यूरॉन्स और ओपीसी या प्रारंभिक चरण ऑलिगोडेंड्रोसाइट के बीच विस्तृत अंतर-सेलुलर इंटरैक्शन को अलग करने के लिए तैयार है, जो माइलिनेशन से स्वतंत्र हैं और अभी तक उचित तंत्रिका विकास और रोग रोगजनन के लिए मौलिक हैं।

यहां वर्णित तीन प्रक्रियाओं में से प्रत्येक में प्रोटोकॉल के भीतर अपने महत्वपूर्ण चरण हैं और संशोधनों और समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है। आईएन प्रोटोकॉल के लिए, दो महत्वपूर्ण चरण हैं: प्यूरोमाइसिन चयन (चरण 1.2.5) और चढ़ाना घनत्व (चरण 1.2.6)। अंडर-ट्रांसड्यूस्ड सेल के अपूर्ण निष्कासन के परिणामस्वरूप खराब विभेदित कोशिकाओं का संदूषण होता है और न्यूरोनल अस्तित्व और कार्यों से समझौता होता है। चरण 1.2.5 में वर्णित उच्च एकाग्रता और लंबे इनक्यूबेशन के साथ मजबूत प्यूरोमाइसिन चयन के लिए संशोधनों पर विचार किया जाना चाहिए। उपयुक्त चढ़ाना घनत्व प्रत्येक प्लुरिपोटेंट सेल लाइन के लिए अनुमापन द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए, क्योंकि कम घनत्व संस्कृतियों के पतन की ओर जाता है और उच्च घनत्व सेल एकत्रीकरण को प्रोत्साहित करता है और न्यूरोनल विकास में बाधा डालता है। आईओएल प्रोटोकॉल के लिए, दो महत्वपूर्ण कदम ओपीसी भेदभाव (चरण 2.2.3) में सेल प्रसार का नियंत्रण और ओएल परिपक्वता के लिए चढ़ाना घनत्व (चरण 2.2.4 और 2.3.2) हैं। एनपीसी को अलग करने की अतिवृद्धि ओपीसी भेदभाव उत्तेजनाओं के लिए खराब प्रतिक्रिया का संकेत देती है और इसे आरा-सी उपचार (संकेतित सीमा के भीतर) की उचित खुराक द्वारा कम करने की आवश्यकता होती है। परिपक्वता के लिए ओपीसी चढ़ाते समय, सेल घनत्व की एक कम सीमा को यहां पसंद किया जाता है क्योंकि विरल वितरण जटिल संरचनाओं के शारीरिक आकृति विज्ञान के प्रेरण की सुविधा प्रदान कर सकता है (जैसा कि चित्रा 2 सी में दिखाया गया है)। iN-iOPC सह-संवर्धन प्रोटोकॉल के लिए, हम दोनों सेल प्रकारों (चरण 3.1.1 और 3.2.2) के लिए उपयुक्त घनत्व के साथ प्लेटिंग के महत्वपूर्ण चरण पर ध्यान आकर्षित करना चाहते हैं। विशेष रूप से, बढ़ते ओपीसी के बीच में आईएनएस सतह से अच्छी तरह से संलग्न नहीं हो सकते हैं और जब संस्कृति सामंजस्य तक पहुंचती है तो पहले अलग हो जाती है। इष्टतम अनुपात सेल संख्याओं को टाइट करके तय किया जाना चाहिए।

कुल मिलाकर, हमारे प्रोटोकॉल में रहने वाला यह न्यूनीकरणवादी दृष्टिकोण मानव मस्तिष्क की अंतर्निहित जटिलता से विशिष्ट हेटरो-सेलुलर इंटरैक्शन को विच्छेदित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, और स्वास्थ्य और एडी में ऑलिगोडेंड्रोग्लियल जीव विज्ञान को उजागर करने के लिए काम करता है। मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व इस प्रकार हमारी राय में काफी स्पष्ट है। भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए यहां विकसित तरीकों की एक अतिरिक्त उपयोगिता डिमाइलेटिंग स्थितियों के लिए सेल-आधारित चिकित्सा है, जैसे कि पोस्ट-रेडियोथेरेपी40 और रीढ़ की हड्डी की चोट41,42। इसके अलावा, इस स्टेम सेल-आधारित प्रणाली की उच्च-थ्रूपुट क्षमता का उपयोग यौगिकों के लिए छोटे अणुओं के पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए बड़े पैमाने पर भी किया जा सकता है जो न्यूरॉन्स, ओपीसी, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स और उनकी बातचीत की शारीरिक स्थिति की रक्षा या पुनर्स्थापना कर सकते हैं। इस प्रकार, हमारा मानना है कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल एडी और अन्य न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के लिए बेहतर मॉडलिंग टूल और प्रभावी उपचार विकसित करने में भविष्य के काम की सुविधा प्रदान करेंगे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (आर00 एजी054616 से वाईएएएच और टी 32 जीएम 1365666 केसी), स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन और सिबेल फैलोशिप (एससी को सम्मानित) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। वाई.ए.एच. ब्राउन इंस्टीट्यूट फॉर ट्रांसलेशनल साइंसेज में सेंटर फॉर ट्रांसलेशनल न्यूरोसाइंस से एक जीएफएल ट्रांसलेशनल प्रोफेसर हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase STEMCELL Technologies 7920
B27 supplement ThermoFisher 17504044
bFGF ThermoFisher PHG 0266
cAMP MilliporeSigma A9501
Clemastine MilliporeSigma SML0445
DMEM/F12 medium STEMCELL Technologies 36254
DMSO ThermoFisher D12345
Doxycycline MilliporeSigma D3072
Fetal Bovine Serum ScienCell 10
H1 human ES cells WiCell WA01
Matrigel Corning 354234
mTeSR plus STEMCELL Technologies 5825
N2 supplement ThermoFisher 17502001
Neurobasal A medium ThermoFisher 10888-022
Non Essential Amino Acids ThermoFisher 11140-050
PDGF-AA R&D Systems 221-AA-010
PEI VWR 71002-812
pMDLg/pRRE Addgene 12251
Polybrene MilliporeSigma TR-1003-G
pRSV-REV Addgene 12253
Puromycin ThermoFisher A1113803
ROCK Inhibitor Y-27632 STEMCELL Technologies 72302
SAG Tocris 4366
STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media STEMCELL Technologies 5838
STEMdiff SMADi Neural Induction Kit STEMCELL Technologies 8581
T3 triiodothyronine MilliporeSigma T6397
Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs Tempo BioScience SKU102
TetO-Ng2-Puro Addgene 52047
VSV-G Addgene 12259

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References

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न्यूरोसाइंस अंक 165 प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल आईपीएस कोशिकाएं मानव भ्रूण स्टेम सेल ईएस कोशिकाएं न्यूरॉन्स ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स ऑलिगोडेंड्रोसाइट पूर्वज कोशिकाएं ओपीसी अल्जाइमर रोग एमिलॉयड-बीटा पेप्टाइड्स सिनैप्स

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions
Posted by JoVE Editors on 12/29/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions. The Representative Results section has been updated.

Figure 3 was updated from:

Figure 3
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. (E) Coculturing iOPC with iN leads to the formation of neuron-OPC synapses. The fluorescence-tagged post-synaptic marker PSD95-mCherry is expressed only in OPCs, and display a diffuse pattern in single cultures (left) but aggregate to form puncta in cocultures (right, indicated by arrows; Tuj1, neuronal marker). (F) The expression of well-characterized oligodendroglial genes that can sense and respond to neuronal activities in the pure cultures of iOPCs at Day 14. Please click here to view a larger version of this figure.

The fourth paragraph was updated from:

Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D).

to:

Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D). The iOPCs express a good number of well-characterized genes that can potentially respond to and mediate the activity-dependent signals from neighboring neurons, in a paracrine (e.g. neurotrophins and metabolites) and/or a synaptic manner (Figure 3E and 3F). 

मॉडलिंग न्यूरॉन-ओलिगोडेंड्रोसाइट इंटरैक्शन के लिए प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से मानव न्यूरॉन्स और ओलिगोडेंड्रोसाइट्स की पीढ़ी
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Assetta, B., Tang, C., Bian, J.,… More

Assetta, B., Tang, C., Bian, J., O'Rourke, R., Connolly, K., Brickler, T., Chetty, S., Huang, Y. W. A. Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions. J. Vis. Exp. (165), e61778, doi:10.3791/61778 (2020).

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