Summary
מאמר זה מספק תיאור מפורט של איך לבנות מודל של בעלי חיים של השלב האנהפטי (איסכמיה בכבד) בחולדות כדי להקל על מחקר בסיסי לתוך פגיעה איסכמיה-reperfusion לאחר השתלת כבד.
Abstract
השתלת כבד אורתוטופית (OLT) בחולדות היא מודל חיה מנוסה ומוכח המשמש למחקרים טרום ניתוחיים, תוך ניתוחיים ולאחר הניתוח, כולל פגיעה בהשמדת איסכמיה (IRI) של איברים חוץ-רחמיים. מודל זה דורש ניסויים והתקנים רבים. משך השלב האנהפטי קשור קשר הדוק לזמן לפתח IRI לאחר ההשתלה. בניסוי זה, השתמשנו בשינויים המודינמיים כדי לגרום נזק לאיברים חוץ-פתטיים בחולדות וקבענו את זמן הסובלנות המרבי. הזמן עד לפגיעה החמורה ביותר באיברים השתנה עבור איברים שונים. שיטה זו יכולה בקלות להיות משוכפל והוא יכול לשמש גם כדי ללמוד IRI של איברים extrahepatic לאחר השתלת כבד.
Introduction
פגיעה בהפצרת איסכמיה (IRI) היא סיבוך נפוץ לאחר השתלת כבד. IRI כבד הוא תהליך פתולוגי מעורבים נזק לתאים בתיווך איסכמיה והידרדרות חריגה של רפרופורציה בכבד. IRI הכבד ואת התגובה החיסונית המולדת המקומית ניתן לחלק IRI חם וקר, על פי הבדלים בסביבה הקלינית1. IRI חם הוא המושרה על ידי פגיעה בתאי גזע, בדרך כלל כתוצאה של השתלת כבד, הלם, וטראומה2. קר IRI הוא סיבוך של השתלת כבד הנגרמת על ידי תאי אנדותל ומחזור הדם ההיקפי3. דוחות קליניים הראו כי IRI הכבד קשורה 10% של כשלים איברים מוקדמים ועלול להגביר את השכיחות של דחייה חריפה וכרונית4,5. בנוסף, IRI הכבד עשוי גם לגרום תסמונות תפקוד לקוי של איברים מרובים או תסמונת תגובה דלקתית מערכתית, עם תמותה גבוהה6. חולים עם מעורבות איברים extrahepatic נוטים להישאר זמן רב יותר בבית החולים, להוציא יותר כסף, ויש להם פרוגנוזה גרועה יותר7. התפתחות הסיבוכים קשורה קשר הדוק לאורך השלב האנהפטי של השתלת כבד8.
השתלת כבד אורתוטופית (OLT) בחולדות דווחה לראשונה על ידי הפרופסור האמריקאי לי בשנת 1973. הפעולה הניסיונית דימה את השלבים של השתלת כבד קלינית ואת anastomosis של כלי הדם ואת צינור המרה המשותף (CBD) באמצעות שיטת התפירה. ההליך קשה וגוזל זמן עם שיעור נמוך שלהצלחה 9. בשנת 1979, קמהדע ואח 'עשה שיפור משמעותי OLT בחולדות על ידי שימוש יצירתי "שתי חפתים שיטה" עבור anastomosis של וריד הפורטל כדי לשלוט בשלב האנהפטי בתוך 26 דקות10. באותה שנה הציע צימרמן את "שיטת סטנט המרה הבודדת". על בסיס עבודתו של לי, צימרמן השתמש בצינורות פוליאתילן כדי לאנוס ישירות את ה- CBD של התורם והמקבל, פישט את השחזור של CBD ושימר את תפקוד הסוגר, ושיטה זו הפכה לסטנדרט לשחזור מרה של דגמי OLT11. בשנת 1980, מיאטה ואח ' הציעו את 'שיטת שלושת החפתים' שבה וריד הפורטל (PV), וריד הווריד העל-חושי (SVC) והווריד הווריד התוך-הפטי (IVC) היו אנטומיים בשיטת האזיקים. עם זאת, קיים סיכון של עיוות של הצינורית עם שיטה זו, אשר יכול להוביל לחסימת רנודה נחותה12. בשנת 1983, "שיטת שני חפתים" הוצעה בשיטת האזיקים לאנסטומוזיס של PV ו- IVC, אך אימצה את שיטת התפר עבור SVC13. שיטה זו אומצה על ידי חוקרים ברחבי העולם כדי להקים מודלים OLT. מאז, צעדים anastomosis חפתים שופרו כדי לקצר את השלב האנהפטי ולשפר את שיעור ההישרדות של החולדות14. באופן דומה, שיטות משופרות משמשות בפרקטיקה קלינית כדי לקצר את השלב האנהפטי15. עם זאת, מחקר בסיסי לתוך IRI לאחר השתלת כבד הראה כי שיעור ההישרדות קשורה באופן הפוך למידת הפגיעה באיברים extrahepatic. לכן, דרוש מחקר נוסף, ויש צורך במודל פשוט וניתן לשחזור של בעלי חיים כדי לדמות IRI לאחר השתלת כבד.
בהתבסס על ההגדרה של השלב האנהפטי, הדמינו את השינויים המודינמיים בהשתלת כבד וכתוצאה מכך IRI של איברים extrahepatic בחולדות. בזאת, אנו מספקים תיאור מפורט של איך לבנות מודל בעלי חיים של השלב האנהפטי (איסכמיה בכבד) בחולדות כדי להקל על מחקר בסיסי לתוך IRI לאחר השתלת כבד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ועדת האתיקה של בעלי החיים אישרה את הניסוי של האוניברסיטה הרפואית גואנגשי (No20190920). כל בעלי החיים סופקו על ידי המרכז לניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית גואנגשי. השתמשנו בחולדות Sprague Dawley זכר SPF (200-250 גרם, 10-12 שבועות), נשמר תחת טמפרטורת החדר של 25 ± 2 מעלות צלזיוס ולחות של 50 ± 10%. האכלה הופסקה 24 שעות לפני הניתוח; עם זאת, סופקו מים.
הערה: מפעיל אחד יכול לבצע את כל הפעולות ללא בסיס מיקרוכירורגיה או מיקרוסקופ כירורגי.
1. מבצע
- לאחר שקילה, יש לה רדום את החולדות עם isoflurane (5%) באמצעות מכונת הרדמה לבעלי חיים.
- לאחר 1-2 דקות, בעדינות מהדקים את בהונות החולדה בפינצטה. אם החולדה אינה מגיבה לאחר צביטה, היא נכנסה למצב של הרדמה. השתמש משחה וטרינר על העיניים כדי למנוע יובש. השתמש מנורות חימום בעלי חיים כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החולדות ב 37-38 מעלות צלזיוס.
- לאחר חיטוי בטן (פתרון יוד povidone), לתקן את החולדה על שולחן ניתוח בעלי חיים. בצע חתך חציוני של 3 ס"מ מתחת לתהליך xiphoid באמצעות מלקחיים ומספריים.
- פתח את חלל הבטן, לחשוף את הכבד באמצעות מפשק, ולגייס את הרצועה hepatogastric. השתמש ספוגיות כותנה כדי להפוך את האונה האמצעית של הכבד בעדינות ולהפוך אותו כלפי מעלה כדי לחשוף את הפטיס פורטה. זהה את CBD, PV ו- HA.
- לדחוף את המעי הדק לכיוון חלל הבטן התחתון השמאלי באמצעות ספוגיות כותנה, לכסות אותו עם גזה רטובה, ולהעביר את הווריד הווריד התוך-הפטי לווריד הכליה הימני.
- לבודד את וריד הפורטל, עורק הכבד, ואת הווריד הווריד הווריד הנחות מעל וריד הכליה הימני עם עדשה תוך עינית ומלקחיים המסומנים בחוט משי 3-0, כל אחד עם קשר להחליק.
- חותכים לפתוח את העור השמאלי והימני בגפיים התחתונות ולחשוף את וריד הירך באמצעות מלקחיים עיניים. לאט להזריק הפרין משקל מולקולרי נמוך 625 IU/kg דרך וריד הירך כדי heparinize את כל הגוף.
- לייגייט וריד הפורטל, עורק הכבד, ו vena קאווה נחות מעל וריד הכליות הימני עם מספר 3-0 תפרים, שנמשך 45 דקות (איור 1). החלף את המעי הדק בחלל הבטן ולכסות אותו עם גזה. להפחית הרדמה שאיפה בתקופות אלה.
- לאחר 45 דקות, לשחרר את וריד הפורטל, עורק הכבד, ואת הווריד הווריד נחות מעל וריד הכליה הימני.
- לתפור את השריר והעור, שכבה אחר שכבה, ולסיים את ההרדמה בשאיפה. לספק משכך כאבים לאחר הניתוח באמצעות מורפיום תת עורי של 5 מ"ג / קילוגרם כל 4 שעות.
- שימו לב לחולדה עד שהיא מתעוררת וניזונים בטמפרטורה של 25 ± 2 מעלות צלזיוס ולחות של 50 ± 10%. מנורות חימום בעלי חיים נחוצות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עמידות החולדות לאיסכמיה בכבד
במודל זה של בעלי חיים, האתרים שבהם כלי הדם היו קשורים במהלך ההפעלה מוצגים באיור 1. החולדות חולקו באופן אקראי ל-5 קבוצות עבור איסכמיה למשך 15 דקות (קבוצת I15), 30 דקות (קבוצת I30), 45 דקות (קבוצת I45), 60 דקות (I60) וקבוצת Sham, עם 10 חולדות בכל קבוצה. שיעור ההישרדות של כל קבוצה נצפה 14 ימים לאחר הניתוח. כל החולדות שרדו בקבוצת I15, קבוצת I30 וקבוצת זיוף. שמונה שרדו במשך 14 ימים בקבוצת I45, ורק 2 שרדו בקבוצת I60. תוצאות אלו מצביעות על כך שהחולדות יכולות לסבול את השלב האנהפטי למשך 45 דקות לכל היותר (טבלה 1).
ההשפעות של קשירה בכלי הדם על זרימת הדם בחולדות
במהלך הניסוי, מערכות ביולוגיות תיעדו את קצב הלב ולחץ הדם (צנרור עורק ראשי פנימי ימני) לפני ואחרי השלב האנהפטי. גילינו שקצב הלב ולחץ העורקים הממוצע (MAP) של חולדות השתנו באופן דרמטי לאחר קשירת כלי הדם (איור 2).
השפעות על איברים חוץ-פתטיים
גודש איסכמיה כבד ובצקת נמצאו במעיים, דליות קיבה, ו splenomegaly לאחר קשירה. שמונים חולדות חולקו באופן אקראי ל-8 קבוצות לאיסכמיה למשך 45 דקות (T0), רפרופוזיה למשך 6 שעות (T6), 12 שעות (T12), 24 שעות (T24), 48 שעות (T48), 72 שעות (T72), 7 ימים (D7) ו-14 ימים (D14). לאחר שהחולדות הוקרבו, נלקחו רקמה מהכליה, הלבלב, המעי הדק, הלב והריאה והוכתמו בהמטוקסילין-אאוסין (HE). תהליך הכתם כולו מורכב מחמישה שלבים: גמילה, כתמים, התייבשות, שקיפות ואיטום. למעט הלב, ציונים פתולוגיים הוקצו כפי שתואר קודם לכן16,17,18,19.
הזמן עד לפגיעה מקסימלית באיברים החוץ-פתטיים השתנה; זה היה 6-24 שעות לאחר הניתוח ללבלב ו24-48 שעות לריאות. מערכת העיכול והכליות נפצעו בצורה הקשה ביותר לאחר 45 דקות של איסכמיה. לא הייתה חריגה ברורה של רירית המעי 24 שעות לאחר הניתוח, והכליות התאוששו לאחר 48 שעות. לאחר רפרוזיס, נמק תאי שריר הלב המקומי, פיצול תאים והתפרקות, חדירת תאים דלקתיים, ו vasodilation מקומי וגודש נמצאו בלב על ידי 24-48 שעות לאחר הניתוח (איור 3).
ריאות
חדירת נויטרופילים נמצאה ברקמת הריאה לאחר איסכמיה. עם הגידול של זמן ההשלכות (T0,T6), ריר של לומן הסימפונות ניתן היה לראות גם ברקמת הריאה. חדירת תאים דלקתיים התרחשה בקיר מכתש, אשר הפך מעובה קשות. התמוטטות מכתשים והיעלמות של חלל מכתשים ניתן למצוא גם ברקמה מסוימת. לא הייתה בצקת מכתוש משמעותית או גודש נימי בקירות מכתוש. הם נפצעו קשה ביותר 24-48 שעות לאחר הניתוח, עם כמה חולדות מראה קוצר נשימה וביטויים אחרים 7 ימים לאחר הניתוח. הוא הכתים את התוצאות והציע לימפדניטיס בדרכי הנשימה, חדירת תאים דלקתית קלה בקיר מכתשי ודימום מקומי(איור 3A, איור 4).
הכליות
כמות קטנה של חומר אאוזינופילי נמצאה בצינורות כליות לאחר איסכמיה בשלב T0, אך לא נראתה חדירת תאים דלקתית וחריגות אחרות. עם זאת, תאי אפיתל צינורי כליות נפוחים, ציטופלסמה נקבובית או vacuolated, תאים נמקיים לומן מעטים, karyopyknosis, פיצול, אובדן גבול מברשת, וקבוצה חומצית בצורת צינור לומן רבים נראו 6-48 שעות לאחר הניתוח. בנוסף, מספר קטן של תאי אפיתל צינורי כליות נראו עם ניוון פרטני, וציטופלסמה נקבובית ומוכתמת קלות לראות 48 שעות לאחר הניתוח. טלנגיקטזיה ביניים משמעותית, אך לא נמצאה חדירה חמורה לתאים דלקתיים (איור 3B, איור 5).
המעי הדק
המעי הדק נפצע בצורה הקשה ביותר לאחר איסכמיה (T0). הייתה חדירת תאים דלקתית חמורה, שפיכת אפיתל רירית, וטלנגיקטזיה. עם העלייה בזמן ההידבקות, הפציעה החלימה במהירות. האפיתל הרירית שוחזר לחלוטין 24 שעות לאחר הניתוח, ורק חדירת תאים דלקתיים קלה נראתה (איור 3C, איור 6).
הלבלב
תאים דלקתיים חמורים הסתננו סביב רקמת הלבלב בשלב T0. עם זאת, נגעי הלבלב לא היו אחידים. שישה מתוך 10 היו נמק בלבלב וחדירה דלקתית 24 שעות לאחר הניתוח, ואת 4 האחרים לא היו חריגות לכאורה. עשרים וארבע שעות לאחר הניתוח, בנוסף לחדירת תאים דלקתיים, הייתה בצקת, הרחבת המרחב הבין-תאי, דימום, נמק של מספר קטן של תאי אצנר, תיחום לא ברור של התאים, פיצול גרעיני ופירוק, וחדירת תאים דלקתיים קלה בשדה הראייה. לאחר מכן, הדלקת נעלמה לאט (איור 3D, איור 7 ).
הלב
בשלב T0, מיוציטים לב היו מסודרים באופן קבוע עם תיחום ברור, מורפולוגיה של תאים נורמליים, גודש ביניים מקומי, ותצהיר פיגמנט חום-צהוב מתון. יתר על כן, חדירת תאים דלקתיים נצפתה באזורים ביניים שריר הלב ו perivascular. עם העלייה בזמן reperfusion, נמק תא שריר הלב המקומי, פיצול התא והתפרקות, חדירת תאים דלקתיים, vasodilation המקומי, וגודש נמצאו ברקמות 24-48 שעות לאחר הניתוח. חלוקה חדרית, מבנה נקבובי, אינטרסטיציום שריר הלב מוגבר, חדירת תאים דלקתית קלה נראו בכמה דגימות. לאחר 48 שעות, קרדיומיוציטים מקומיים נעלמו והוחלפו בכמות קטנה של רקמת חיבור סיבית עם חדירת תאים דלקתית קלה. עד אז לא נראו חריגות ברורות אחרות (איור 8).
ההשפעות של שינויים המודינמיים על אינדקסים סרולוגיים בכבד, בכליות, בלבלב ובלב
סרום נאסף, ואת רמות של אלנין aminotransferase(ALT), אספרטט aminotransferase(AST), קריאטינין, עמילאז זוהו על ידי מנתח ביוכימי אוטומטי. כל המדדים הגיעו לשיא של 24-48 שעות, בניגוד לשינויים הפתולוגיים. למרות שרמות אלה היו נורמליות 48 שעות לאחר הניתוח, הנזק הפתולוגי נמשך (איור 9).
איור 1: מיקום הקשירה: PV, HA, IVC העליון של וריד הכליה הימנית.
| קבוצה | N | הישרדות ב 24 שעות, n (%) | הישרדות ב 7 d, n (%) | הישרדות ב 14 d, n (%) |
| שאם | 10 | 10 | — | — |
| אני 15 דקות | 10 | 10/10 | 10 (100) | 10 (100) |
| אני 30 דקות | 10 | 10/10 | 10 (100) | 10 (100) |
| אני 45 דקות | 10 | 8/10 | 8/10 (80) | 8/10 (80) |
| אני 60 דקות | 10 | 2/10 | 2/10 (20) | 2/10 (20) |
טבלה 1: עמידות החולדות לאיסכמיה בכבד
איור 2: שינויים המודינמיים בקבוצת I45 דקות.
איור 3: עשרות היסטולוגיה של איברים; (B) כליה; (C) מעי; (D)לבלב; *מובהק סטטיסטית בהשוואה לקבוצת הזיוף (P < 0.05). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: שינויים פתולוגיים בריאות לאחר הניתוח. (A)קבוצת שאם; (B)קבוצת איסכמיה (קבוצת T0); (C)רפרופוזיה 6 שעות (T6) קבוצה; (ד)רפרופוזיה 12 שעות (T12) קבוצה; (ה)רפרופוזיה 12 שעות (T12) קבוצה; (ו)רפרופוזיה 24 שעות ביממה (T24) קבוצה; (ז)רפרופוזיה 48 שעות (T48) קבוצה; (H) רפרופוזיה 7 ימים (D7) קבוצה; (I)רפרופוזיה 14 ימים (D14) קבוצה (סולם 50 מיקרומטר). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: שינויים פתולוגיים בכליות לאחר הניתוח. (א)קבוצת שאם; (B)קבוצת איסכמיה (קבוצת T0); (C)רפרופוזיה 6 שעות (T6) קבוצה; (ד)רפרופוזיה 12 שעות (T12) קבוצה; (ה)רפרופוזיה 12 שעות (T12) קבוצה; (ו)רפרופוזיה 24 שעות ביממה (T24) קבוצה; (ז)רפרופוזיה 48 שעות (T48) קבוצה; (H) רפרופוזיה 7 ימים (D7) קבוצה; (I)רפרופוזיה 14 ימים (D14) קבוצה (סולם 50 מיקרומטר). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: שינויים פתולוגיים במעי הדק לאחר הניתוח. (B)קבוצת איסכמיה (קבוצת T0); (C)רפרופוזיה 6 שעות (T6) קבוצה; (ד)רפרופוזיה 12 שעות (T12) קבוצה; (ה)רפרופוזיה 12 שעות (T12) קבוצה; (ו)רפרופוזיה 24 שעות ביממה (T24) קבוצה; (ז)רפרופוזיה 48 שעות (T48) קבוצה; (H) רפרופוזיה 7 ימים (D7) קבוצה; (I)רפרופוזיה 14 ימים (D14) קבוצה (סולם 50 מיקרומטר). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: שינויים פתולוגיים בלבלב לאחר הניתוח. (B)קבוצת איסכמיה (קבוצת T0); (C)רפרופוזיה 6 שעות (T6) קבוצה; (ד)רפרופוזיה 12 שעות (T12) קבוצה; (ה)רפרופוזיה 12 שעות (T12) קבוצה; (ו)רפרופוזיה 24 שעות ביממה (T24) קבוצה; (ז)רפרופוזיה 48 שעות (T48) קבוצה; (H) רפרופוזיה 7 ימים (D7) קבוצה; (I)רפרופוזיה 14 ימים (D14) קבוצה (A ו- D סולם 50 מיקרומטר; סולם BCEFGHI 50 מיקרומטר). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: שינויים פתולוגיים בלב לאחר הניתוח. (A)קבוצת שאם; (B)קבוצת איסכמיה (קבוצת T0); (C)רפרופוזיה 6 שעות (T6) קבוצה; (ד)רפרופוזיה 12 שעות (T12) קבוצה; (ה)רפרופוזיה 12 שעות (T12) קבוצה; (ו)רפרופוזיה 24 שעות ביממה (T24) קבוצה; (ז)רפרופוזיה 48 שעות (T48) קבוצה; (H) רפרופוזיה 7 ימים (D7) קבוצה; (I)רפרופוזיה 14 ימים (D14) קבוצה(סולם 50 מיקרומטר; סולם BCDEFGHI 100 מיקרומטר). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: שינויים של ALT, AST, קריאטינין (Cr) ועמילאז בכל קבוצה; *מובהק סטטיסטית בהשוואה לקבוצת הזיוף (P<0.05). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OLT בחולדות הוא מודל אידיאלי לחקר שימור איברים בהשתלת כבד, IRI, דחיית השתלות, סובלנות חיסונית, פתולוגיה ופרמקולוגיה של השתלות, הומוטרנספלנטציה ושנאת זרים. כיום, הוא נמצא בשימוש נרחב במחקר הניסיוני של השתלת כבד.
במהלך מחקרי פיילוט ניהלנו לראשונה הרדמה תוך-פרטית של נתרן פנטוברביטל ומצאנו כי הדבר הוביל לתמותה גבוהה לאחר הניתוח ולסובלנות קצרה לשינויים המודינמיים. לכן, השתמשנו בהרדמה בשאיפה בניסויים הבאים להתחלה מהירה של פעולה והדרה מהירה של מאפייני במבחנה. המעבר להרדמה בשאיפה שיפר באופן משמעותי את זמן הסובלנות ואת ההישרדות לאחר הניתוח של חולדות. החוקרים צריכים לשים לב לנשימה ולקצב הלב של החולדה כדי למנוע מנת יתר של ההרדמה. ניתן להשתמש במערכות ביולוגיות כדי לפקח על קצב הלב ולחץ הדם. ראינו גם את ההשפעה של עובי תפר כירורגי על קשירה של כלי דם. למרות קווים קטנים יותר 3-0 יכול בהחלט ligate כלי הדם, הם היו קשים להשתחרר ועלול להוביל לקרע של כלי הדם. להיפך, קווים גדולים מ 3-0 עלול לגרום חסימת כלי דם לא שלם, אשר מונע שינויים המודינמיים. בעיות חומר אלה ישופרו בניסויים עתידיים. יש כמה מגבלות לפרוטוקול שלנו. מנורות חום אינן מומלצות לתחזוקת טמפרטורה בשל הפוטנציאל שלהן להתחממות יתר; הצעות חימום חלופיות, כגון שמיכות מים חוזרות, מומלצות לטובת החיה.
ישנן סיבות רבות לפגיעה באיברים דיסטליים לאחר OLT. ראשית, פציעה יכולה להיגרם על ידי שימור קר של הכבד התורם במבחנה20. שנית, IRI יכול להתרחש ולגרום נזק לרקמות כאשר אספקת הדם חוזרת לרקמות (reperfusion) לאחר תקופה ארוכה של איסכמיה. איסכמיה היא הגורם המוביל לפציעה, ורפרופוזיה היא התהליך שבו מתרחשת הפציעה. לאחר חסימה בו זמנית של IVC ו- PV במהלך השלב האנהפטי, כמות גדולה של קיפאון בדם התרחשה בגפיים התחתונות ובאיברים הפנימיים. נפח ההפצה האפקטיבי (ECV) ירד בחדות, והמפה ירדה. עם זאת, בשל גירוי עצבי vagus, לא הייתה עלייה מפצה בקצב הלב בחולדות. בניסוי זה, מצאנו כי חולדות עברו שינויים המודינמיים משמעותיים בתוך 5 דקות של קשירת ושחרור כלי, אשר עמדו בהגדרה של תסמונת איסכמיה-reperfusion.
איסכמיה התרחשה בכמה רקמות מחוץ לכבד. לאחר השלב האנהפטי, ECV גדל. MAP חזר לקדמותו לאחר IVC ו PV בוטלו החסימה, עם פציעה המתרחשת מחוץ לכבד לאחר reperfusion. יתר על כן, IRI של הכבד של התורם הפיק מתווכים דלקתיים (TNF-α, interleukin-1, interleukin-6, interleukin-8) שתקפו את האיברים הדיסטליים21. בניסוי זה, המודינמיקה במהלך השלב האנהפטי היו מדומים, מה שגרם לגודש פסיבי של IVC וכליות, נזק למחסום במערכת העיכול, טרנסלוקציה חיידקית, איסכמיה של האיברים (למשל, ריאות, לב, לבלב, כליות וכו ') שבו SVC ממוקם, ו IRI לאיברים extrahepatic.
הממצאים הפתולוגיים הראו כי שיא הפגיעה איסכמית וזמן ההחלמה היו שונים בכל איבר. למרות אחסון קר ונזק שנגרם על ידי גורמים חיסוניים לא ניתן לדמות במחקר זה, IRI anhepatic ניתן לשכפל בהשוואה למודלים אחרים של בעלי חיים לחקור פגיעה איברים extrahepatic. המודל שלנו מודל OLT ניתן להשוות ולצפות כדי לספק בסיס למחקר על פגיעה באיברים extrahepatic. יתר על כן, המודל שלנו דומה כמה פעולות כבד קליניות, כגון זה עבור הילאר cholangiocarcinoma. הילאר cholangiocarcinoma הוא גידול ממאיר כי לעתים קרובות פולש PV או IVC ולעתים קרובות דורש הידוק PV במהלך ניתוח22. בוצע שחזור פורטל בכבד; כאשר הגידול פולש IVC, הידוק תוך ניתוחי של IVC נדרש גם, ואת השינויים המודינמיים וכתוצאה מכך עולים בקנה אחד עם המודל שלנו.
לסיכום, המודל שלנו בחולדות הוא קל לשימוש וישיר, ללא מיקרוכירורגיה, ומספק את הבסיס למחקר בסיסי לתוך IRI של איברים extrahepatic לאחר איסכמיה הכבד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברי כתב היד הזה אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להכיר בהצעות השימושיות שניתנו על ידי ד"ר וון-טאו לי וד"ר ג'י-הואה וו מבית החולים השני המסונפים של האוניברסיטה הרפואית גואנגשי. המחברים רוצים להודות לחברי הצוות שלנו על הערות ודיונים שימושיים. המחברים גם רוצים להודות לסוקרים ולעורכים האנונימיים של JoVE על הערותיהם. תודה מיוחדת צריכה ללכת להוריו של ד"ר יואן על תמיכתם המתמשכת ועידודם. העבודה נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע Ningbo (2014A610248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde solution | Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd | P804536 | |
| air drying oven | Shanghai Binglin Electronic Technology Co., Ltd. | BPG | |
| Alanine aminotransferase (ALT)Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | E-BC-K235-S | |
| ammonia | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 10002118 | |
| amylase Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | E-BC-K005-M | |
| anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 100092183 | |
| Animal anesthesia machine | Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd | R640 | |
| aspartate aminotransferase (AST)kit | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | S03040 | |
| automatic biochemical analyzer. | SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd. | 2400 | |
| Biosystems (when nessary) | Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd. | BL-420F | |
| Centrifuge | Baiyang Medical Instrument Co., Ltd. | BY-600A | |
| cover glass | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co. Ltd | 10212432C | |
| creatinine Kit | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | S03076 | |
| dewatering machine | Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd | Donatello Series 2 | |
| embedding machine | Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd. | KH-BL1 | |
| frozen machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| hematoxylin-eosin dye solution | Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd | G1005 | |
| high-efficiency paraffin wax | Shanghai huayong paraffin wax co., Ltd | Q/YSQN40-91 | |
| hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 10011018 | |
| intraocular lens (IOL)forceps | Guangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd. | JTZRN | |
| Isoflurane | Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd | — | |
| micro Scissors(when nessary) | Shanghai Surgical Instrument Factory | WA1010 | |
| needle holders | Shanghai Surgical Instrument Factory | J32010 | |
| neutral gum | Shanghai Huashen Healing Equipment Co.,Ltd. | — | |
| normal optical microscope | Nikon Instrument Shanghai Co., Ltd | Nikon Eclipse CI | |
| ophthalmic forceps | Shanghai Surgical Instrument Factory | J3CO30 | straight |
| ophthalmic forceps | Shanghai Surgical Instrument Factory | JD1060 | bending |
| ophthalmic Scissors | Shanghai Surgical Instrument Factory | J1E0 | |
| pathological slicer | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | |
| pipettes | Dragon Laboratory Instruments Co., Ltd. | 7010101008 | |
| retractors | Beijing Jinuotai Technology Development Co.,Ltd. | JNT-KXQ | |
| scanner | Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd | Pannoramic 250 | |
| slide | Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd | G6004 | |
| xylene | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 1330-20-7 |
References
- Dar, W. A., Sullivan, E., Byon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
- Qiao, P. F., Yao, L., Zhang, X. C., Li, G. D., Wu, D. Q. Heat shock pretreatment improves stem cell repair following ischemia-reperfusion injury via autophagy. World Journal of Gastroenterology. 21 (45), 12822-12834 (2015).
- Liu, Y., et al. Activation of YAP attenuates hepatic damage and fibrosis in liver ischemia-reperfusion injury. Journal of Hepatology. 71 (4), 719-730 (2019).
- Hirao, H., Dery, K. J., Kageyama, S., Nakamura, K., Kupiec-Weglinski, J. W. Heme Oxygenase-1 in liver transplant ischemia-reperfusion injury: From bench-to-bedside. Free Radical Biology and Medicine. 157, 75-82 (2020).
- Motiño, O., et al. Protective role of hepatocyte cyclooxygenase-2 expression against liver ischemia-reperfusion injury in mice. Hepatology. 70 (2), 650-665 (2019).
- Guo, W. A. The search for a magic bullet to fight multiple organ failure secondary to ischemia/reperfusion injury and abdominal compartment syndrome. Journal of Surgical Research. 184 (2), 792-793 (2013).
- Elham, M., Mahmoudi, M., Nassiri-Toosi, M., Baghfalaki, T., Zeraati, H. Post liver transplantation survival and related prognostic factors among adult recipients in tehran liver transplant center; 2002-2019. Archives of Iranian Medicine. 1 (23), 326-334 (2020).
- Kim, E. H., Ko, J. S., Gwak, M. S., Lee, S. K., Kim, G. S. Incidence and clinical significance of hyperfibrinolysis during living donor liver transplantation. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 29 (3), 322-326 (2018).
- Czigány, Z. Improving research practice in rat orthotopic and partial orthotopic liver transplantation: a review, recommendation, and publication guide. European Surgical Research. 55 (1-2), 119-138 (2015).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28 (1), 47-50 (1979).
- Zimmermann, F. A., et al. Techniques for orthotopic liver transplantation in the rat and some studies of the immunologic responses to fully allogeneic liver grafts. Transplantation Proceedings. 11 (1), 571-577 (1979).
- Miyata, M., Fischer, J. H., Fuhs, M., Isselhard, W., Kasai, Y. A simple method for orthotopic liver transplantation in the rat. Cuff technique for three vascular anastomoses. Transplantation. 30 (5), 335-338 (1980).
- Kamada, N. A., Calne, R. Y. Surgical experience with five hundred thirty liver transplants in the rat. Surgery. 93 (1), 64-69 (1983).
- Yang, L. F., et al. A rat model of orthotopic liver transplantation using a novel magnetic anastomosis technique for suprahepatic vena cava reconstruction. Journal of Visualized Experiments. 19 (133), e56933 (2018).
- Liu, L. X., He, C., Huang, T., Gu, J. Development of a new technique for reconstruction of hepatic artery during liver transplantation in sprague-dawley rat. PLoS One. 10 (12), 0145662 (2015).
- Paller, M. S., Hoidal, J. R., Ferris, T. F. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure In the rat. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1156-1164 (1984).
- Schmidt, J., Lewandrowsi, K., Warshaw, A. L., Compton, C. C., Rattner, D. W. Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat. International Journal of Pancreatology. 12 (1), 41-51 (1992).
- Chui, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Archives of Surgery. 101 (4), 478-483 (1970).
- Kozian, A., et al. One-lung ventilation induces hyperfusion and alveolar damage in the ventilated lung:an experimental study. British Journal of Anaesthesia. 100 (4), 549-559 (2008).
- Shimada, S., et al. Heavy water (D2O) containing preservation solution reduces hepatic cold preservation and reperfusion injury in an isolated perfused rat liver (IPRL) model. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1818 (2019).
- Nakamura, K. Sirtuin 1 attenuates inflammation and hepatocellular damage in liver transplant ischemia/reperfusion: from mouse to human. Liver Transplantation. 23 (10), 1282-1293 (2017).
- Blaire, A., et al. Surgical Considerations of Hilar Cholangiocarcinoma. Surgical Oncology Clinics of North America. 28 (4), 601-617 (2019).
