Summary

Lesão por Isquemia-Reperfusão de Órgãos simulando alterações hemodinâmicas no modelo de transplante de fígado de rato

Published: March 06, 2021
doi:

Summary

Este artigo fornece uma descrição detalhada de como construir um modelo animal da fase anháptica (isquemia hepática) em ratos para facilitar a pesquisa básica sobre a lesão isquemia-reperfusão após o transplante hepático.

Abstract

O transplante hepático ortotópico (OLT) em ratos é um modelo animal testado e comprovado usado para estudos pré-operatórios, intraoperatórios e pós-operatórios, incluindo lesão isquemia-reperfusão (IRI) de órgãos extraháticos. Este modelo requer inúmeros experimentos e dispositivos. A duração da fase anháptica está intimamente relacionada com o tempo de desenvolvimento do IRI após o transplante. Neste experimento, usamos alterações hemodinâmicas para induzir danos extraháticos de órgãos em ratos e determinamos o tempo máximo de tolerância. O tempo até a lesão mais grave do órgão variou para diferentes órgãos. Este método pode ser facilmente replicado e também pode ser usado para estudar IRI dos órgãos extrahápticos após o transplante de fígado.

Introduction

A lesão por isquemia-reperfusão (IRI) é uma complicação comum após o transplante de fígado. Hepatic IRI é um processo patológico que envolve danos celulares mediados por isquemia e deterioração anormal da reperfusão hepática. O IRI hepático e a resposta imune inata local podem ser divididos em IRI quente e frio, de acordo com diferenças no ambiente clínico1. O IRI quente é induzido por lesão de células-tronco, geralmente como resultado de transplante de fígado, choque e trauma2. O IRI frio é uma complicação do transplante hepático causado por células endoteliais e circulação periférica3. Relatórios clínicos mostraram que o IRI hepático está associado a 10% das falências precoces de órgãos e pode aumentar a incidência de rejeição aguda e crônica4,5. Além disso, o IRI hepático também pode induzir síndromes de disfunção múltipla de órgãos ou síndrome de resposta inflamatória sistêmica, com alta mortalidade6. Pacientes com envolvimento extrahático de órgãos tendem a ficar mais tempo no hospital, gastar mais dinheiro e ter um prognóstico pior7. O desenvolvimento de complicações está intimamente relacionado com a duração da fase anháptica do transplante hepático8.

O transplante de fígado ortotópico (OLT) em ratos foi relatado pela primeira vez pelo professor americano Lee em 1973. A operação experimental simulou os passos do transplante clínico de fígado e a anastomose dos vasos sanguíneos e do ducto biliar comum (CBD) utilizando o método de sutura. O procedimento é difícil e demorado com uma baixa taxa de sucesso9. Em 1979, Kamada et al. fizeram uma melhoria significativa no OLT em ratos, usando criativamente o “método de duas algemas” para a anastomose da veia portal para controlar a fase anháptica dentro de 26 minutos10. No mesmo ano, Zimmermann propôs o “método único de stent biliar”. Com base no trabalho de Lee, Zimmermann usou tubos de polietileno para anastomosar diretamente o CBD do doador e do receptor, simplificou a reconstrução do CBD, e preservou a função do esfíncter, e este método tornou-se padrão para reconstrução biliar dos modelos OLT11. Em 1980, Miyata et al. propuseram o “método de três punhos” onde a veia portal (PV), vena cava suprahepática (SVC) e vena cava intraháptica (IVC) foram anastomosadas pelo método da braçadeira. No entanto, há risco de distorção da cânula com este método, o que pode levar à obstrução do refluxo inferior vena cava12. Em 1983, foi proposto o “método de duas algemas” utilizando o método de manguito para anastomose do PV e IVC, mas adotando o método de sutura para o SVC13. Esse método foi adotado por estudiosos globalmente para estabelecer modelos OLT. Desde então, as etapas de anastomose da braçadeira foram melhoradas para encurtar a fase anháptica e melhorar a taxa de sobrevivência dos ratos14. Da mesma forma, métodos aprimorados são utilizados na prática clínica para encurtar a fase anháptica15. No entanto, pesquisas básicas sobre o IRI após o transplante de fígado mostraram que a taxa de sobrevivência está inversamente relacionada ao grau de lesão a órgãos extrahepticos. Portanto, mais pesquisas são necessárias, e um modelo animal simples e reprodutível é necessário para simular IRI após o transplante de fígado.

Com base na definição da fase anháptica, simulamos as alterações hemodinâmicas no transplante hepático resultando em IRI de órgãos extrahêmáticos em ratos. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada de como construir um modelo animal da fase anhóptica (isquemia hepática) em ratos para facilitar a pesquisa básica sobre o IRI após o transplante de fígado.

Protocol

O Comitê de Ética Animal aprovou o experimento da Universidade Médica de Guangxi (No20190920). Todos os animais foram fornecidos pelo Centro de Experimentos Animais da Universidade Médica de Guangxi. Usamos ratos sprague dawley macho sprague (200-250 g, 10-12 semanas), mantidos sob a temperatura ambiente de 25 ± 2°C e umidade de 50 ± 10%. A alimentação foi interrompida 24 horas antes da operação; no entanto, a água foi fornecida. NOTA: Um operador pode realizar todas as operações…

Representative Results

Tolerância dos ratos à isquemia hepáticaNeste modelo animal, os locais em que os vasos sanguíneos foram ligados durante a operação são mostrados na Figura 1. Os ratos foram divididos aleatoriamente em 5 grupos para isquemia por 15 minutos (grupo I15), 30 minutos (grupo I30), 45 minutos (grupo I45), 60 minutos (I60) e grupo falso, com 10 ratos em cada grupo. A taxa de sobrevivência de cada grupo foi observada 14 dias após a operação. Todos os ratos sobreviveram…

Discussion

OLT em ratos é um modelo ideal para estudar a preservação de órgãos em transplante hepático, IRI, rejeição de transplantes, tolerância imunológica, patologia de transplante e farmacologia, homotransplantação e xenotransplante. Atualmente, é amplamente utilizado na pesquisa experimental de transplante de fígado.

Durante os estudos-piloto, primeiro administramos anestesia intraperitoneal de sódio pentobarbital e descobrimos que isso levou à alta mortalidade pós-operatória e à …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de reconhecer as sugestões úteis dadas pelo Dr. Wen-tao Li e pelo Dr. Ji-hua Wu do Segundo Hospital Afiliado da Universidade Médica de Guangxi. Os autores gostariam de agradecer aos nossos companheiros de equipe por comentários e discussões úteis. Os autores também gostariam de agradecer aos revisores anônimos e editores do JoVE por seus comentários. Um agradecimento especial deve ir aos pais do Dr. Yuan por seu apoio contínuo e encorajamento. O trabalho contou com o apoio da Fundação Ningbo de Ciências Naturais (2014A610248).

Materials

4% paraformaldehyde solution Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd P804536
air drying oven Shanghai Binglin Electronic Technology Co., Ltd. BPG
Alanine aminotransferase (ALT)Kit Elabscience Biotechnology Co.,Ltd E-BC-K235-S
ammonia Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd 10002118
amylase Kit Elabscience Biotechnology Co.,Ltd E-BC-K005-M
anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd 100092183
Animal anesthesia machine Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd R640
aspartate aminotransferase (AST)kit Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. S03040
automatic biochemical analyzer. SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd. 2400
Biosystems (when nessary) Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd. BL-420F
Centrifuge Baiyang Medical Instrument Co., Ltd. BY-600A
cover glass Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co. Ltd 10212432C
creatinine Kit Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. S03076
dewatering machine Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd Donatello Series 2
embedding machine Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd. KH-BL1
frozen machine Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd JB-L5
hematoxylin-eosin dye solution Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd G1005
high-efficiency paraffin wax Shanghai huayong paraffin wax co., Ltd Q/YSQN40-91
hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd 10011018
intraocular lens (IOL)forceps Guangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd. JTZRN
Isoflurane Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd
micro Scissors(when nessary) Shanghai Surgical Instrument Factory WA1010
needle holders Shanghai Surgical Instrument Factory J32010
neutral gum Shanghai Huashen Healing Equipment Co.,Ltd.
normal optical microscope Nikon Instrument Shanghai Co., Ltd Nikon Eclipse CI
ophthalmic forceps Shanghai Surgical Instrument Factory J3CO30 straight
ophthalmic forceps Shanghai Surgical Instrument Factory JD1060 bending
ophthalmic Scissors Shanghai Surgical Instrument Factory J1E0
pathological slicer Shanghai Leica Instrument Co., Ltd RM2016
pipettes Dragon Laboratory Instruments Co., Ltd. 7010101008
retractors Beijing Jinuotai Technology Development Co.,Ltd. JNT-KXQ
scanner Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd Pannoramic 250
slide Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd G6004
xylene Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd 1330-20-7

References

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Yuan, Y., Chen, M., Huang, J., Tian, Y., Qin, K., Yuan, Z., Wang, W., Wu, Z., Tian, X., Zhang, Y. Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model. J. Vis. Exp. (169), e61779, doi:10.3791/61779 (2021).

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