Summary
ここでは、固定マウス卵巣組織の正確な卵胞数を計算するための2つの異なる技術について説明し、比較し、対比する。
Abstract
性的に再生する女性の哺乳類は、卵母細胞の生涯供給で生まれます。未熟な静止卵母細胞は、原始卵胞、女性生殖細胞の貯蔵単位内で発見される。彼らは再生不可能であるため、出生時の数とその後の損失率は、主に女性の肥沃な寿命を決定します。女性および動物における原始卵数の正確な定量は、卵巣予備軍に対する医薬品および毒性物質の影響を決定するために不可欠である。また、既存および新興の不妊治療保存技術の必要性と成功を評価する必要があります。現在、女性における卵巣予備を含む原胞の数を正確に測定する方法は存在しない。さらに、実験のために大型動物や絶滅危惧種から卵巣組織を得ることは、しばしば実現不可能である。このように、マウスはこのような研究に不可欠なモデルとなっており、マウスの卵巣全体で原胞数を評価する能力は重要なツールです。しかし、文献中のマウス卵巣の絶対卵胞数の報告は非常に変動するため、データの比較や複製が困難です。これは、株、年齢、治療群、および採用されたカウント方法の技術的な違いを含む多くの要因によるものです。本稿では、分数/光学解離技術に依存する[1]ステレロジーという2つの異なる方法を用いて、組織学的セクションを準備し、マウス卵巣の原始卵胞を数えるステップバイステップの指導ガイドを提供します。そして[2]直接カウント技術。各方法の主な利点と欠点のいくつかは、現場で再現性を向上させ、研究者が研究に最も適した方法を選択できるように強調されます。
Introduction
卵巣の原始卵胞内に貯蔵された未熟で、機始的に逮捕された卵母細胞は、女性生殖細胞系列の貯蔵単位であり、個人の生涯卵巣予備軍を構成する。原胞の数は、1歳とともに自然に減少し、あるいはあるいは、空気中のいくつかの医薬品および環境毒性物質を含む外因性化学物質への暴露後に早期に枯渇する可能性がある2。原始卵胞数が有限であることを考えると、卵巣内に存在する卵胞の量と質は、主に女性の生殖能力と子孫の健康を決定する。したがって、女性における原始卵胞数の正確な定量化は、卵巣予備軍に対する外因性侮辱のオフターゲットの影響を評価するために不可欠である。
女性では、卵巣全体の分析は一般的に不可能であり、したがって卵巣予備の非侵襲的代理手段は臨床現場で利用されなければならない。抗Mϋllerianホルモン(AMH)は、臨床的に最も広く使用されている代理バイオマーカーです。血清AMHレベルは、多くの場合、進行した母親の年齢の女性、または化学療法などの癌治療の前後に測定されます。しかし、AMHは原始卵胞ではなく卵胞を成長させることによって産生され、したがって、血清レベルは絶対的な原始卵胞数では知らない。
げっ歯類などの小動物モデルの卵巣卵胞を数える その場の女性の原始卵胞数を正確に決定する方法がないため、外因性の侮辱が原始卵胞に与える程度を評価し、生殖能力を評価するために不可欠な研究ツールであり続ける。残念ながら、げっ歯類モデルにおける原始卵胞数の文献全体の報告は非常に可変的です 4.この主な理由は、採用されたカウント方法の技術的な違いが広く報告されている。主に、マウスの原胞を列挙するための文献に記載されている2つの異なる技術がある。これらには、分数光学解質法を採用するステレロジー、および直接卵胞数が含まれる。
ステレロジーは、体系的な均一なランダムサンプリング5を使用し、マウス全体で原始卵数を定量する最も正確な方法、またはラット卵巣4、6、7を使用するため、金本位制と広く考えられている。ステレロジーは、対象物8の立体構造を占めているため、公平である。光学脱離/分化法を用いて、3段階のサンプリングを適用して、マウス総卵巣の既知の分数内で厚い組織切片(例えば20μm)を使用して原胞を定量化する。まず、サンプリング間隔がランダムな開始(サンプリング分1、f1)4で選択されます(例えば、3番目のセクションごと)。その後、セクションは、この時点から卵巣全体を通して体系的で均一な方法でサンプリングされる。次に、バイアスされない計数フレームが卵巣セクションの上に重ね合わされ、定義されたランダム化されたカウントグリッド(サンプリング分数2、f2)8に沿って徐々に移動する。最後に、断面厚さの既知の分率は光学的にサンプリングされ(例えば、10μm)、この領域内の卵胞は計数される(サンプリング分画3、f3)4。生の卵胞数は、最終的な値を得るために、これらのサンプリング分数の逆数で乗算されます。この方法では、ステレオロジーソフトウェアによって駆動される電動ステージを備えた顕微鏡を含む専門家の訓練と機器が必要です。組織は特殊なブインの固定液に保存し、グリコールメタクリレート樹脂に埋め込まれ、ガラスナイフを用いたグリコールメタクリレート樹脂ミクロトームを使用して厚い組織切片を切断できるようにする必要があります。この方法は、組織の収縮および変形を考慮して設計されており、卵巣および卵胞9の三次元形態構造を最もよく保存する。
直接卵胞カウントは、卵胞10を数える最も頻繁に使用される方法です。より一般的な固定剤(すなわち、ホルマリン)を使用することができ、その後に4〜6μmの厚さの標準ミクロトームを使用してパラフィンワックス埋め込みおよび網羅的なシリアル切除が行われる。卵胞は、定義された間隔で組織セクション全体で体系的にカウントされ、次にサンプリング間隔の逆数を掛けて全卵胞の推定値を得る。この方法は、迅速かつ容易に、アーカイブされた組織を使用して行うことができる、および標準的な組織学的手法を使用して調製される。それは標準的なイメージ投射機能の軽い顕微鏡だけ要求する。しかし、これらの利点にもかかわらず、直接卵胞カウントはステレロジーの精度と厳格なカウントパラメータを欠いているため、研究者の偏見が強くなります。さらに、組織は処理中に収縮および変形を受け、卵巣の完全性および形態を破壊し、卵胞の分類および定量化を困難にする。
この記事の目的は、マウス卵巣の原始卵胞数を定量的に評価するために一般的に使用される2つの方法を説明することです: 生殖器と直接卵胞の数え。我々は、これらの2つの方法の詳細なプロトコルを提供し、我々の分野で再現性を高め、研究者が彼らの研究のための最も適切なカウント方法の情報に基づいた決定を行うことを可能にするために、それらの長所と短所のいくつかを強調する。
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Protocol
卵巣は雌のC57BL6Jマウスから採取した。すべての動物の手順と実験は、動物のケアと使用のためのNHMRCオーストラリアの行動規範に従って行われ、モナッシュ動物研究プラットフォーム動物倫理委員会によって承認されました。
注:原始卵胞卵母細胞を枯渇させることが示された化学療法剤は、ステテロロジー11および直接カウント12、13を使用して決定されたように、同じ動物の2つの計数方法を比較するためにこの報告書で使用された。雌の8週齢(若年成人)マウスは、シクロホスファミド(n=5/群)の75mg/kg/体重の腹腔内注射の前に体重を量った。この用量は、原胞のおよそ50%の枯渇を引き起こすことが示されているが、マウス14において罹患率または死亡率を引き起こすことは報告されていない。卵巣は治療後48時間後に収穫された。各動物からの1つの卵巣は、24時間、24時間、もう一方はブインの溶液中に24時間、中性緩衝ホルマリン溶液に10%(v/v)で固定された。その後、組織をグリコールメタクリレート樹脂に包埋し、20μmで連続的に切断するか、またはパラフィンで5μmで連続的に切り離した。全ての組織を周期酸シフおよびヘマトキシリンで染色した。
1. 組織学的準備:マウス卵巣の固定、処理、埋め込み、切除
- 卵巣自体を損傷または切断することなく、卵管および周囲のすべての脂肪をトリミングすることによってマウス卵巣を解剖する。必要に応じて、このステップに解剖顕微鏡と細かい刃を使用します(図1A)。
- 70%エタノールに組織を移す前に、24時間(図1B)のブイン固定(ステテロロジー)、またはホルマリン固定剤(直接カウント)のいずれかを含む小さなラベル付きチューブに入れることで、組織を直ちに固定化します。
注:卵胞形態は、ブアンの固定卵巣組織内で最もよく保存され、グリコールメタクリレート樹脂に埋め込まれています(図2)。 - 全体の固定卵巣を処理し、ステテロ学のためのグリコールメタクリレート樹脂に埋め込む (補助ファイル 1), またはパラフィンワックス直接カウント用標準組織学的プロトコルを使用します。
注意:樹脂は有毒であるため、すべての組織処理手順がヒュームフードで実行され、手袋が常に着用されていることを確認してください。 - ガラスナイフ(図1D)を取り付けた特殊樹脂メタクリル酸ミクロトーム(図1C)を使用して、厚いグリコールメタクリレート樹脂切片(例えば、20μm)を徹底的に切断します。滅菌のためにガラス顕微鏡スライドに一定の間隔(例えば、3番目のセクションごと)でセクションを収集します。
- 標準的なミクロトームを使用して、薄いパラフィンセクション(例えば、4〜6 μm)を切断してください。直接卵胞数のためにガラス顕微鏡スライドに一定の間隔(例えば、9番目 のセクションごと)で組織切片を収集します。
- 周期酸シッフおよびヘマトキシリン(補足ファイル2)でスライドを染色する。
- パラフィン切片用の標準DPX、グリコールメタクリレート樹脂切片用の厚いDPXを含むカバースリップ(図1E)。
注意:グリコールメタクリル樹脂DPXは危険であるため、フームフードにこのステップを実行します。
注:グリコールメタクリレート樹脂DPXは非常に粘性です。ガラスカバースリップは、DPXが均等かつ薄く分散され、カバースリップの下に気泡がないことを確認するために、スパチュラで押し下げてしっかりと接着する必要があります(図1F)。
2. 光学分光器を用いた原始卵数の立体的推定
- コンピュータ、マルチコントロールユニット、カメラ、およびステローロジー内の光源をオンにし、顕微鏡の目的を低倍率(例えば、10倍)に設定します。
- ステオロジーソフトウェアを開きます。
- 最初のスライドを顕微鏡のステージにしっかりと置きます。
- カメラ設定パネル (補足図 1A)の[露出]の下の[自動]をオンにして、光の露出を調整します。または、光の露出を手動で調整します。
- ジョイスティックを使用して最初の組織サンプルを見つけ、サンプルを焦点にします。
- [カメラ設定] パネルの右下にある[その他の設定]をクリックしてホワイトバランスを調整し、[ホワイトバランス] をクリックして [自動] をクリックします (補足図 1B)。または、[その他の設定]ボタン (または [その他の設定] の領域を選択) の横にある[ホワイト バランス] ボタンをクリックして、セクションの白い領域を選択してホワイト バランスを手動で設定します。
- [プローブ] ドロップダウン メニューに移動し、[光学分数のワークフロー] をクリックします。次に、[新しいプロジェクトの開始] をクリックし、[OK]をクリックします。
- 既存のサンプリング構成が保存されている場合は、[ サンプリング パラメータ] で [ はい ] をクリック| .. をクリックし、目的のサンプリング構成を選択します。
- ない場合は、[ いいえ ]をクリックし、シリアルセクション情報(補足図1C)を手動で入力し、ステップ2.13でプローブ構成を定義します。
- [次へ]をクリックし、顕微鏡を低倍率に設定し、ドロップダウンメニューから10倍の倍率を選択します。
- [次へ] をクリックし、卵巣セクション全体をトレースします - セクションの周りを左クリックして開始し、最後に[輪郭を閉じる]を選択します。
- [次へ]をクリックし、顕微鏡を「高倍率」に設定し、ドロップダウンメニューから100倍のオイル倍率を選択します。
- スライド上の組織部に油を一滴置き、顕微鏡の目的を100倍の倍率に移動します。
- ライト露出を調整し(手順 2.4)、[ 次へ]をクリックします。
- サンプリング パラメータを設定して、プローブの構成を定義します。ここで、計数フレームを47.5 μm x 47.5 μm(2,256.25 μm2)に設定し、ステップ長を100 μm x 100 μm(10,000 μm2)に設定した(補足図2)。サンプリング パラメータが確立されたら、テンプレートを保存し、ステップ 2.7 で以降の分析セッション中に再度開きます。
- [カウント開始] をクリックします (補助図 1D)。サンプルの先頭にフォーカスし、[OK]をクリックしてカウントを開始します。
- 焦点を合わせるノブを使用して、10 μmのサンプリング深度を移動し、卵母細胞核が焦点を合わせる原胞を数えます。[ 次へ ] をクリックして次の領域に移動します。
- 卵母細胞が扁平上皮(平坦化)顆粒球細胞に囲まれている場合、卵胞を原始子として分類するが、立方腺細胞はない(図2A)。
注意:原始卵胞は、立方体および扁平上皮顆粒細胞(図2B)と主に立方体顆粒細胞に囲まれた原発卵胞の組み合わせからなる中間/移行卵胞とは異なる(図2C)。これらの卵胞クラスは別々に定量化する必要があります。 - 卵母細胞の核が見える卵胞のみを数えます。卵母細胞核は、計数フレーム内に現れるか、または計数フレームの緑色の包含線に触れている必要があります(補助図1E、F)。
- 卵母細胞核が計数フレーム(補助図1G)の外に落ちる場合、またはカウントフレームの赤い除外線に触れた場合は、この卵胞をカウントしないでください。
- 外因性の化学物質(例えば、化学療法)に応答して原始卵胞の枯渇を評価する場合、数えられるすべての卵胞が健康であり、したがって正常な形態を有していることを確認する(図2)。異常な卵胞や食痛卵胞を別々に数えます。しばしば、卵胞死は化学療法などの侮辱によって誘発され、そして、健康な卵胞と不死菌の卵胞を区別するために、卵胞の定量は、卵巣予備軍15を含むだけであるように、別々に得られるべきである。
- 卵母細胞が扁平上皮(平坦化)顆粒球細胞に囲まれている場合、卵胞を原始子として分類するが、立方腺細胞はない(図2A)。
- そのセクションでカウントが完了したら、次のいずれかの操作を行います。
- [ 新しいセクションの追加] をクリックし、手順 2.3 に戻って次のセクションをカウントするように設定します。
- [ カウントが終了しました ] をクリックしてセッションを終了します。目的を10倍に戻し、ステロジーソフトウェアを終了し、光源、カメラ、マルチコントロールユニット、コンピュータをオフにします。
- 卵巣全体からサンプリングした各組織セクションから生卵数(Q)の合計を求め、次にスプレッドシートを使用して、以下の式を用いて各複製動物(N)4から最終的な値を得る。
どこ：
N = 卵巣内の卵胞の総推定数。
Q = 原始毛の数。
f1 = サンプリング間隔。3番目のセクションはすべて、このようにサンプリングされました
。
f2 = カウントフレーム (サンプル領域) とステッパーの関係を、 として計算
します。サンプル面積は2256μm2(47.5 μm x 47.5 μm)で、ステッパー面積は10000 μm2(100 μm x 100 μm) 
であった。
f3 = サンプリングされた卵巣セクションの画分。20μmのセクションの10μmをサンプリングしたので、
.
したがって、
.
注:このプロトコルは、広く引用されたステロジーソフトウェア(資料文献)を使用して、これらの原理の立体分析を適用する方法を説明しています。ただし、他のステレオロジーソフトウェアも利用できます。卵巣卵胞の立体的分析中に適用される原理は、パラメータを設定するために使用されるソフトウェアに関係なく、同じです。ステレロジーは、10%以下の推定値の誤差係数を与えるため、100個以上の物体が成体マウス卵巣4に数えられると最も正確である。ここで概説するサンプリングパラメータは、約100個の物体(すなわち、原始、過渡期および原発性卵胞)を制御成人型C57BL6J卵巣で数えられるように最適化されている。試験的研究は、分析する区間およびセクション数、およびサンプリングされたセクション17内の光学崩壊セクタの数などの最適なサンプリングパラメータを確立するための小さなサンプルサイズを含めて実施することができる。
どこ：
。
します。サンプル面積は2256μm2(47.5 μm x 47.5 μm)で、ステッパー面積は10000 μm2(100 μm x 100 μm) 
であった。
.
.3. 直接卵巣卵胞数による原始卵胞数の推定
- 顕微鏡スライドを標準的な軽顕微鏡の下にしっかりと置き、直接カウントを行い、生の原始卵胞数を得る。
- 卵母細胞がはっきりと見え、扁平上皮(平坦化された)顆粒球細胞に囲まれている場合、卵胞を原始子として分類するが、立方体顆粒球細胞はない(図2D)。
注意:原始卵胞は、立方体および扁平上皮顆粒細胞(図2E)と主に立方体顆粒細胞に囲まれた原発卵胞の組み合わせからなる中間/移行卵胞とは異なる(図2F)。これらの卵胞クラスは別々に定量化する必要があります。 - カウントされたすべての卵胞が正常であり、したがって正常な形態を有することを確認する(図2)。健康な卵胞だけが卵巣予備軍を構成するので、異常な卵胞または食前包を別々に数える。
- 卵母細胞がはっきりと見え、扁平上皮(平坦化された)顆粒球細胞に囲まれている場合、卵胞を原始子として分類するが、立方体顆粒球細胞はない(図2D)。
- あるいは、複数の、または、画像ファイルを開くことによってカウントを実行するために、卵巣組織セクション全体の高出力(例えば、20倍)のマイクロ顕微鏡写真を取る。これは手動で行うか、自動スライドスキャナーを使用して行うことができます。
- 所定の間隔で卵巣全体からサンプリングした各組織部分から生卵数(Q)の合計を求める。この数値にサンプリング分数の逆数を掛けて、以下の式を使用して各複製動物(N)の最終値を求めます。
どこ：
N = 卵巣内の卵胞の総推定数。
Q = 生の卵胞数(個々のタイプの、別々に計算)。
f1 = サンプリング間隔。9番目のセクションごとにサンプリングされた
.
したがって、
.
どこ：
.
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Representative Results
卵胞枯渇の特徴のあるモデルが使用され、若年成人雌マウスにシクロホスファミド化学療法の単回投与、または生理的車両制御(n=5/群)を投与し、両方の卵巣を48時間後に各動物から採取した。動物ごとに1つの卵巣を、ステテロロジーまたは直接カウントの2つの方法のそれぞれについてステップ1で説明したように調製した。各動物からの左右の卵巣を各群にランダムに割り当てた。これらのデータは、ステテロロジーを使用する場合、化学療法治療(387±11卵胞)、対照(1043±149;p=0.0024)に対して、マウス原始卵胞の有意な枯渇を検出できることを示している(図3)。対照的に、同じ動物からの対側卵巣を用いて、直接卵胞数は化学療法後の卵巣予備軍の有意な減少を検出することができなかった(490±40)、対照と比較した場合(752±139;p=0.1063)(図3)。なお、若年成成成型の野生型動物における原始卵胞数は可変であることは明らかであり、生理食動物の分布が広いため、シクロホスファミド群と比較して、ステロジーを用いてカウントを行った場合でも(図3)。
図1:図解分析用にブイン固定のグリケルメタクリレート樹脂埋め込み卵巣の組織学的調製A)成体マウス卵巣(円、矢印)は、羽根ブレードを使用してマウス卵巣からすべての脂肪と卵管を密接にトリミングした。 B)同じ女性成人の逆側マウス卵巣(円、矢)を解剖、トリミングし、その後、ブーインの固定剤(左)でステテロ学に固定するか、直接カウント(右)のホルマリンに固定した。 C)ガラスナイフ(矢印)を取り付けた特殊樹脂メタクリル酸ミクロトーム D)を用いて、グリケルメタクリレート樹脂ブロックを20μmの部分に徹底的に切断し、ガラス顕微鏡スライドに集めた。 E)ガラス顕微鏡スライド上の周期酸シッフ染色卵巣組織切片(矢印)をヒュームフードに新鮮なヒスウィール(緑色の容器)に浸し、次にGMA DPXの滴の上にガラスカバースリップを加えた。スパチュラは、過剰なDPXと気泡を除去するために使用されました。スライドは、一晩煙のフードで空気乾燥した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:原始卵胞分類グリコールメタクリレート樹脂埋め込み(A-C)およびパラフィン埋め込み(D-F)卵巣切片における原始、過渡および原発性卵胞の代表的な画像。 A: 扁平上皮顆粒球細胞(矢印)に囲まれた原始卵胞。Bar = 10 μm. B: 扁平上皮(矢印)と立方体(矢印)顆粒細胞に囲まれた移行卵胞。Bar = 10 μm. C: 立方体(矢印頭)顆粒細胞に囲まれた初代卵胞。Bar = 25 μm D: 扁平上皮顆粒球細胞(矢印)に囲まれた原始卵胞。Bar = 10 μm. E: 扁平上皮(矢印)と立方体(矢印)顆粒細胞に囲まれた移行卵胞。Bar = 10 μm. F: 立方体(矢印頭)顆粒細胞に囲まれた初代卵胞。バー = 25 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウス原始卵胞を評価するための光学分量と直接計数方法の比較。卵胞枯渇の確立されたモデルは、8週齢の雌のC57BL6Jマウスが生理学で腹腔内で治療されたモデル、または化学療法、シクロホスファミド(n=6/群)の75mg/kg/体重用量で治療されたモデルとして使用された。これにより、卵巣予備軍の変化を検出するための2つの卵胞計数法の比較が可能になった。動物の同じコホートでは、卵巣予備軍のより大きく有意な枯渇を検出した生殖器とは対照的に、総卵胞推定値は有意な卵胞枯渇を検出できなかった。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 強み | 弱点 | |
| ステレロジー | 卵胞を推定する最も正確な方法 | 時間とコストがかかる |
| 複数のサンプリングパラメータを使用し、統計的に堅牢 | 専門の機器とソフトウェアが必要 | |
| 感度が高く、原始卵胞数の小さな変化を検出できる | サンプルは、特殊な特殊な組織学的手法を使用して準備する必要があります。 | |
| 卵胞構造は組織処理中により良く保存される | ||
| 異なる調査員が適用できる統一されたルールにより、バイアスを低減 | ||
| 直接カウント | 時間とコスト効果 | ステレロジーよりも精度が低く、感度が低い |
| 標準的な実験室用機器、例えば軽い顕微鏡を要求する | 使用されるサンプリングパラメータは1つだけで、卵胞数の小さな変化を検出する際の効果が低下する | |
| 免疫物質化学的または他の分析に使用できる卵巣切片の保持 | 組織は、処理中の体積および卵胞構造の変化に対してより影響を受けやすい | |
| 適用できる規則の統一セットがないため、調査官から偏見を持ちやすい |
表1:卵胞計数法の長所と短所の比較:ステレロジーと直接カウント
補足図 1: ステリーロジー ソフトウェア プロトコルのスクリーンショットA)カメラ設定パネル(白いボックス)の露出の下で自動(赤いボックス)をチェックして露出を調整します。B)ホワイトバランスを設定するには、まずカメラ設定パネルの「その他」の下にある「その他」アイコンをクリックします。次に、[ホワイトバランス] を選択し、[自動 (赤)] をクリックします。C)既存のサンプリング構成が設定されていない場合は、[いいえ] (赤いボックス) をクリックし、シリアル セクション情報 (緑色のボックス) を入力します。D)カウントを開始するには、[カウントの開始] をクリックします (白い矢印)。E)原始卵胞の核が計数フレーム内に見える場合、この卵胞は数えられる(白い点線の円)。F)原始卵胞の核が計数フレームの緑色の封入線に触れている場合、この卵胞もカウントされる(白い点線の円)。G)原始卵胞の核が計数フレーム内に見えないか、または計数フレームの赤い除外線に接触している場合、この卵胞はカウントされません(白い点線の円)。こちらをダウンロードしてください。
補足図 2: サンプリング パラメータの設定 左側のパネルで順次手順に従って、プローブ構成を定義します。 A)取り付けられた厚さを測定します。「各グリッドサイトのセクションの上に再フォーカスを再設定する」のチェックがオフになっていることを確認します(赤色のボックス)。[マウントされた平均の厚さを手動で入力](緑色のボックス)にチェックマークを付けます。平均マウント厚さを 20.00 μm (青いボックス) と入力します。 B)カウントフレームサイズを定義します。[カウント フレーム表示] で、[カウント フレームの表示を四角形にする] と [ライブ イメージの中心] (赤いボックス) にチェックマークを付けます。[フレームサイズをカウント]で、XとY(緑のボックス)に47.5 μmと入力します。 C)SRS グリッド レイアウトを定義します。X と Y (赤いボックス) のグリッド サイズを 110 として手動で入力します。 D) デセクタ・オプションを定義します。トップガードゾーンの高さについては、1.00 μm(赤いボックス)と入力します。光ディスセクターの高さの場合は、10 μm(緑のボックス)と入力します。[フォーカス方法] で、[手動フォーカス] (青いボックス) を選択します。 E)サンプリング パラメータを保存します。これらの設定を保存するには、[名前とコメント] を入力し、[現在の設定を保存する] (白い矢印) をクリックします。 F)[現在のサンプリング パラメータ設定] の下で、表示されている設定と一致していることを確認します。 こちらをダウンロードしてください。
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補足ファイル 2.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この記事では、マウスの原始卵胞、ステテロロジー、および直接卵胞の数え方がより一般的に採用される方法を列挙するためのゴールドスタンダード技術のステップバイステッププロトコルを提供します。化学療法治療は、同じ動物から左右の卵巣内のこれら2つの異なる方法から得られた結果を比較対照するために使用した。どちらの方法も、原始卵胞数における高い動物間変動性を明らかにした。卵巣予備軍の著しい枯渇は、ステテロロジーを用いて記録されたが、直接カウントは化学療法投与対対照後の原始卵胞数の有意な減少を検出できなかった。
特に、C57BL6Jのようなマウスの近交株においても、ヒトの場合と同様に、若年成人野生型(対照)雌における卵巣予備軍が広く分布していることは明らかである。これに影響を与え、卵巣予備軍の設立に寄与する要因は、調査中のままである18.マウス卵巣機能の研究の中で高い変動性は、データを比較または複製し、卵母細胞の数と品質を保護するための新しい治療薬の臨床翻訳を進めるために、フィールドのための多くの課題を提起する4.この変動は、使用されるカウント方法だけでなく、動物株と年齢の違いなどの追加要因を含む多くの要因が原因である可能性があります。投与量やタイミングなどの治療レジメンと同様に。これらの要因は、異なる研究のデータを比較する際に考慮する必要があります。いずれにせよ、この研究で採用された卵胞枯渇モデルは、ステテロ学プロトコルの正確で敏感な性質を強調する一方で、広く報告されている直接カウント法が既知の重要な原始卵胞枯渇を検出できないことを示している。
この記事で詳しく説明する各カウント方法の長所と制限があります (表 1) 。ステレロジーは、様々な器官5の細胞数を決定するために使用される場合の精度のために、ゴールドスタンダード法とみなされている。ただし、この手法の欠点には、関連する時間とコスト、および特殊な機器と専門知識の要件が含まれます。これにより、最も機密性の高いデータを取得するためのこの手順の広範な使用が制限されています。
対照的に、直接カウント法は、迅速かつ容易に、アーカイブされた組織を使用して行うことができる、および標準的な組織学的手法を使用して調製される。それは標準的なイメージ投射機能の軽い顕微鏡だけ要求する。しかし、組織学的処理によって引き起こされる体積変化は考慮されず、卵巣の三次元構造を破壊する可能性がある。その結果、卵胞形態は必ずしも十分に保存されておらず、特に経験の浅い研究者にとって識別と計数の精度が困難になります。ホルマリンは、この研究で直接カウントに使用される固定剤であったが、ブインの固定組織はパラフィンに埋め込まれることができ、これはより良い形態を提供し、研究者がより簡単に原始卵胞を識別するのに役立つかもしれない。さらに、文献内では、ダイレクトカウント法のサンプリング画分は、3rd ごとに、10番目 の5μmパラフィンセクション19に至るまで、大きく異なり、研究間の卵胞数の大きな不一致に寄与する可能性がある。パラフィンワックスセクションが非常に薄いことを考えると、9番目 のセクションごとに数えることは、オーバーサンプリングと不必要なカウントを防ぐのに役立ちます。
このガイドでは概説されていない他の方法は、一般的に文献で報告されているが、卵巣全体から1つの中央部にのみカウントされ、これが卵巣全体、または卵胞密度の代表であると考えている。原始卵胞は卵巣に均等に分布しておらず、クラスター内に見られるため、この最初の方法は非常に問題です。これは、単一の、あるいは卵巣の数セクションが器官全体を代表していないことを意味し、体系的なサンプリングは、任意のカウント方法に不可欠な成分となる。卵胞密度は、卵巣組織サンプル中の卵胞を数え、その後、組織の領域あたりの数を発現することを含む。初代ヒト組織を得る限界を考えると、卵胞密度はヒト卵巣の絶対卵胞数の代理尺度としてよく使用されるが、マウスの報告も一般的である。しかし、この定量法は、卵巣全体の卵胞の不均一な分布、または卵巣内分泌(黄体)サイクル全体で日常的に起こる卵巣体積の変動を考慮していない。サンプル間の密度の正確な尺度は保存された組織面積に依存するので、これは重要です。さらに、この方法は、ヒト組織を分析する際に小さな生検または卵巣の一部のみをサンプリングする場合が多く、したがって卵巣全体を代表するものではありません。卵胞密度は、ステレロジーで達成可能な精度を欠いている。同じ卵巣全体を用いても、前立体解析後の卵胞定量の比較尺度は、卵胞密度を有する、マウス卵巣20では対応しなかった。
最も一般的に使用される実験動物であるが、マウスは1つのモデル種に過ぎない。家畜または非ヒト霊長類を含むより大きな種から卵巣を得ることは可能であり、したがって卵巣標本全体からの卵胞数は、改変された立体論議定書21,22を用いて達成することができる。最後に、全ヒト卵巣の卵胞数を分析する能力は確かに非常に困難であるが、それにもかかわらず、改変された立体論議定書23、24、25を使用して、標本が利用可能なときに行うことができる。
今後の分野の方向性としては、新しい技術の拡張と取り込みが挙げられる。例えば、原根卵子の自動検出と計数の新しい方法論が26に記載されている。このメソッドは、ラベル付きデータセットによって駆動される畳み込みニューラル ネットワークとスライディング ウィンドウ アルゴリズムを使用してテスト データを選択します。しかし、このアルゴリズムは2つの卵巣でしかテストされず、広範囲にわたる取り込みは決定されたままである。あるいは、最近の光学組織のクリアリングおよびライトシート顕微鏡の進歩により、無傷組織の包括的な分析が可能となり、いくつかの研究は、マウス卵巣27、28における卵胞列挙についてこれを調査している。
結論として、直接卵胞のカウントは卵巣内の原始卵胞を列挙するための簡単で迅速かつ費用対効果の高い方法であるが、この技術は感受性、正確さ、および研究者の偏見を起こしやすいかもしれない。したがって、その欠点にもかかわらず、ステテロロジーは、原胞数を正確かつ再現的に定義するための最良の技術のままです。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この作業は、ビクトリア州政府の運用インフラ支援とオーストラリア政府NHMRC IRIISSを通じて可能となり、国民保健医療研究評議会(ALW#1120300)とオーストラリア研究評議会(KJH#FT190100265)からの資金提供によって支援されました。著者らは、モナッシュ動物研究プラットフォーム、モナッシュ菌学プラットフォーム、モナッシュマイクロイメージング施設の技術サポートを認めたい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol (HPLC) | Fisher Chemical | #A383-1 | |
| Acid alcohol | Amber Scientific | #ACDL | |
| Bouin’s fixative | Sigma-Aldrich | #HT10132 | Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v) |
| Cyclophosphamide | Sigma-Aldrich | #C0768-5G | |
| Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX) | Sigma-Aldrich | #06522 | |
| Ethanol | Amber Scientific | #ETH | Ethanol 100% |
| Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle | Designs for Vision | #FEA-745-SR | Feather blade for dissections (seen in Figure 1) |
| Formalin fixative | Australian Biostain | #ANBFC | |
| Glass coverslip | Thermo Scientific | #MENCS22501GP | 22 mm x 50 mm |
| Glycomethacrylate resin RM2165 microtome | Leica Microsystems | #RM2165 | |
| Glycolmethacrylate DPX | *made in house | *Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks | |
| Histolene | Trajan | #11031 | |
| Mayer’s haematoxylin | Amber Scientific | #MH | |
| Olympus BX50 microscope | Olympus | #BX50 | Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3) |
| Olympus immersion oil type-F | Olympus | #IMMOIL-F30CC | |
| Olympus TH4-200 light source | Olympus | #TH4-200 | |
| Paraffin wax | Sigma-Aldrich | #03987 | |
| Periodic acid | Trajan | #PERI1% | Periodic acid 1% |
| Rotary Microtome CUT 4060 | MicroTec | #4060R/F | Used to cut paraffin sections |
| Schiff’s reagent | Trajan | #SCHF | |
| Scott's tap water | Amber Scientific | #SCOT | Potassium carbonate, magnesium sulphate, water |
| StereoInvestigator Stereological System | MBF Bioscience | Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick | |
| Superfrost microscope slides | Thermo Scientific | #MENSF41296SP | 1 mm, 72 pcs |
| Technovit 7100 Plastic embedding system | Emgrid Australia | #64709003 | 500 mL/5 x 1 g/40 mL |
| Technovit 3040 yellow | Emgrid Australia | #64708805 | 100 g/80 mL |
References
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