Nøyaktig follikkelopplisting i voksenmusovaries

Summary

Her beskriver, sammenligner og kontrasterer vi to forskjellige teknikker for nøyaktig follikkeltelling av fast musovarisk vev.

Abstract

Seksuelt reproduserende kvinnelige pattedyr er født med hele livet tilførsel av oocytter. Umodne, quiescent oocytter finnes i primordiale follikler, lagringsenheten til den kvinnelige bakterien. De er ikke-fornybare, og dermed deres antall ved fødselen og påfølgende tapsrate dikterer i stor grad den kvinnelige fruktbare levetiden. Nøyaktig kvantifisering av opprinnelige follikkeltall hos kvinner og dyr er avgjørende for å bestemme virkningen av medisiner og toksiske stoffer på eggstokkreservatet. Det er også nødvendig for å evaluere behovet for, og suksess av, eksisterende og fremvoksende fruktbarhet bevaring teknikker. For tiden finnes det ingen metoder for å nøyaktig måle antall primordiale follikler som består av eggstokkreservatet hos kvinner. Videre er det ofte ikke mulig å skaffe eggstokkvev fra store dyr eller truede arter for eksperimentering. Dermed har mus blitt en viktig modell for slike studier, og evnen til å evaluere opprinnelige follikkeltall i hele museovaries er et kritisk verktøy. Rapporter om absolutte follikkeltall i museovaries i litteraturen er imidlertid svært variable, noe som gjør det vanskelig å sammenligne og / eller replikere data. Dette skyldes en rekke faktorer, inkludert belastning, alder, behandlingsgrupper, samt tekniske forskjeller i metodene for telling ansatt. I denne artikkelen gir vi en trinnvis instruksjonsveiledning for å forberede histologiske seksjoner og telle primordiale follikler i museovaries ved hjelp av to forskjellige metoder: [1] stereologi, som er avhengig av fraksjonator / optisk dissektorteknikk; og [2] den direkte telleteknikken. Noen av de viktigste fordelene og ulempene ved hver metode vil bli fremhevet slik at reproduserbarhet kan forbedres på feltet og for å gjøre det mulig for forskere å velge den mest hensiktsmessige metoden for studiene.

Introduction

De umodne, meiotisk arresterte oocyttene som er lagret i primordiale follikler i eggstokken, er lagringsenheten for den kvinnelige bakterien og utgjør en persons livstids eggstokkreservat. Primordial follikkel tall avtar naturlig med alder¹, eller alternativt, kan være for tidlig utarmet etter eksponering for eksogene kjemikalier, inkludert noen legemidler og miljøgifter i luft, mat og vann². Gitt at det opprinnelige follikkelnummeret er begrenset, bestemmer mengden og kvaliteten på follikler som er tilstede i eggstokken i stor grad kvinnelig fruktbarhet og avkom helse. Dermed er nøyaktig kvantifisering av primordial follikkeltall hos kvinner avgjørende for å evaluere off-target virkningene av eksogene fornærmelser på eggstokkreservatet.

Hos kvinner er analyse av hele eggstokken generelt ikke mulig, og dermed må ikke-invasive surrogatmål av eggstokkreservatet brukes i en klinisk setting. Anti-Mϋllerian hormon (AMH) er den mest brukte surrogat biomarkør klinisk³. Serum AMH nivåer måles ofte hos kvinner i avansert mors alder, eller før og etter kreft behandling, for eksempel kjemoterapi. AMH produseres imidlertid av voksende follikler og ikke av primordiale follikler, og dermed informerer serumnivåer ikke om absolutt primordial follikkelnummer.

Med fravær av metoder for å nøyaktig bestemme primordial follikkel nummer hos kvinner in situ, teller ovarie follikler i små dyremodeller, som gnagere, er fortsatt et viktig forskningsverktøy for å vurdere i hvilken grad eksogene fornærmelser påvirker primordiale follikler og dermed fruktbarhet. Dessverre er rapporter gjennom hele litteraturen av primordiale follikkeltall i gnagermodeller svært variable⁴. En viktig årsak til dette er mye rapporterte tekniske forskjeller i tellemetoden som benyttes. Overveiende er det to forskjellige teknikker beskrevet i litteraturen for opplisting av primordiale follikler hos mus. Disse inkluderer stereologi, som benytter fraksjonator optisk dissektormetode, og direkte follikkel teller.

Stereologi er allment ansett gullstandarden som den bruker systematisk ensartet tilfeldig prøvetaking⁵, noe som gjør den til den mest nøyaktige metoden for å kvantifisere primordial follikkel nummer i hel mus, eller rotte eggstokkene^4,6,7. Stereologi er objektiv, da den står for den tredimensjonale strukturen til objektet av interesse⁸. Ved hjelp av en optisk dissektor/fraksjonatormetode påføres tre nivåer av prøvetaking for å kvantifisere primordiale follikler ved hjelp av tykke vevsseksjoner (f.eks. 20 μm) innenfor en kjent brøkdel av den totale museovalogen. For det første velges prøvetakingsintervallet (f.eks. hver^{3. seksjon)} ved en tilfeldig start (prøvetakingsfraksjon 1, f₁)⁴. Seksjoner prøves deretter på en systematisk, ensartet måte fra dette punktet gjennom hele eggstokken. Deretter legges en objektiv telleramme over eggstokkdelen og flyttes gradvis langs et definert, randomisert tellerutenett (prøvetakingsbrøk 2, f₂)⁸. Til slutt blir en kjent brøkdel av seksjonstykkelsen optisk samplet (f.eks. 10 μm) og follikler innenfor dette området telles (prøvetakingsfraksjon 3, f₃)⁴. Råfosikknummeret multipliseres med det motsatte av disse prøvetakingsfraksjonene for å oppnå den endelige verdien. Denne metoden krever ekspertopplæring og utstyr, inkludert et mikroskop med et motorisert stadium drevet av stereologisk programvare. Vev bør bevares i en spesialisert Bouins fixative, og innebygd i glykolmethacrylate harpiks for å tillate tykke vevsseksjoner å bli kuttet ved hjelp av en glykolmethacrylate harpiksmikrotom med en glasskniv. Denne metoden er designet for å ta hensyn til vevskrymping og deformasjon, for best å bevare den tredimensjonale morfologiske strukturen til eggstokken og folliklene⁹.

Direkte follikkeltelling er den mest brukte metoden for å telle follikler¹⁰. Mer vanlige fikseringer (dvs. formalin) kan brukes, etterfulgt av parafinvoksinnbygging og uttømmende seriell seksjonering ved hjelp av en standard mikrotom med en tykkelse på mellom 4-6 μm. Follikler telles systematisk i hele vevsdelen med et definert intervall, og multipliseres deretter med det motsatte av prøvetakingsintervallet for å oppnå det totale follikkelestimatet. Denne metoden er rask, enkel, kan utføres ved hjelp av arkivert vev, og fremstilles ved hjelp av standard histologiske teknikker. Det krever bare et lett mikroskop med standard bildebehandlingsfunksjoner. Til tross for disse fordelene mangler imidlertid direkte follikkeltelling nøyaktigheten og strenge telleparametere for stereologi, noe som gjør den mer utsatt for undersøkerbias. I tillegg kan vev gjennomgå krymping og deformasjon under behandling, forstyrre integriteten og morfologien til eggstokken og dermed gjøre follikkelklassifisering og kvantifisering vanskelig.

Målet med denne artikkelen er å beskrive to ofte brukte metoder for kvantitativt å vurdere primordial follikkelnummer i museovaries: stereologi og direkte follikkeltelling. Vi vil gi detaljerte protokoller for disse to metodene og fremheve noen av deres styrker og svakheter, for å forbedre reproduserbarheten på vårt felt og la forskere ta en informert beslutning om den mest hensiktsmessige tellemetoden for studiene.

Protocol

Eggstokkene ble samlet inn fra kvinnelige C57BL6J-mus. Alle dyreprosedyrer og eksperimenter ble utført i samsvar med NHMRC Australian Code of Practice for Care and Use of Animals og godkjent av Monash Animal Research Platform Animal Ethics Committee. MERK: Et kjemoterapimiddel vist å tømme primordiale follikkel oocytter, som bestemt ved hjelp av stereologi11 og direkte teller12,13 ble brukt i denne rapporten …

Representative Results

En godt karakterisert modell av follikkeluttømming ble brukt, hvorved unge voksne kvinnelige mus ble administrert en enkelt dose cyklofosfamid kjemoterapi, eller saltvannsbilkontroll (n = 5 / gruppe) og begge eggstokkene ble høstet fra hvert dyr etter 48 timer. En eggstokk per dyr ble utarbeidet som beskrevet i trinn 1 for hver av de to metodene: stereologi eller direkte teller. Venstre og høyre eggstokk fra hvert dyr ble tilfeldig tildelt hver gruppe. Disse dataene viser at ved bruk av stereologi kan en betydelig utt…

Discussion

Denne artikkelen inneholder en trinnvis protokoll for gullstandardteknikken for opplisting av musprimordiale follikler, stereologi og den mer brukte metoden for direkte follikkeltelling. Kjemoterapi behandling ble brukt til å sammenligne og kontrast resultatene oppnådd fra disse to forskjellige metoder innenfor venstre og høyre eggstokk fra samme dyr. Begge metodene avdekket høy variasjon mellom dyr i opprinnelige follikkeltall. En betydelig uttømming av ovariereservatet ble registrert ved hjelp av stereologi, men d…

Materials

1-Butanol (HPLC)	Fisher Chemical	#A383-1
Acid alcohol	Amber Scientific	#ACDL
Bouin’s fixative	Sigma-Aldrich	#HT10132	Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)
Cyclophosphamide	Sigma-Aldrich	#C0768-5G
Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)	Sigma-Aldrich	#06522
Ethanol	Amber Scientific	#ETH	Ethanol 100%
Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle	Designs for Vision	#FEA-745-SR	Feather blade for dissections (seen in Figure 1)
Formalin fixative	Australian Biostain	#ANBFC
Glass coverslip	Thermo Scientific	#MENCS22501GP	22 mm x 50 mm
Glycomethacrylate resin RM2165 microtome	Leica Microsystems	#RM2165
Glycolmethacrylate DPX	*made in house		*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks
Histolene	Trajan	#11031
Mayer’s haematoxylin	Amber Scientific	#MH
Olympus BX50 microscope	Olympus	#BX50	Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)
Olympus immersion oil type-F	Olympus	#IMMOIL-F30CC
Olympus TH4-200 light source	Olympus	#TH4-200
Paraffin wax	Sigma-Aldrich	#03987
Periodic acid	Trajan	#PERI1%	Periodic acid 1%
Rotary Microtome CUT 4060	MicroTec	#4060R/F	Used to cut paraffin sections
Schiff’s reagent	Trajan	#SCHF
Scott's tap water	Amber Scientific	#SCOT	Potassium carbonate, magnesium sulphate, water
StereoInvestigator Stereological System	MBF Bioscience		Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick
Superfrost microscope slides	Thermo Scientific	#MENSF41296SP	1 mm, 72 pcs
Technovit 7100 Plastic embedding system	Emgrid Australia	#64709003	500 mL/5 x 1 g/40 mL
Technovit 3040 yellow	Emgrid Australia	#64708805	100 g/80 mL