Korrekt follikeluppräkning i vuxna musstockar
Summary
Här beskriver, jämför och kontrasterar vi två olika tekniker för noggrann follikelräkning av fasta mus äggstocksvävnader.
Abstract
Sexuellt reproducera kvinnliga däggdjur föds med hela sin livstid leverans av äggceller. Omogna, quiescenta äggceller finns i ursprungliga folliklar, lagringsenheten av den kvinnliga könscellen. De är icke-förnybara, vilket innebär att deras antal vid födseln och efterföljande förlusttal till stor del dikterar den kvinnliga bördiga livslängden. Noggrann kvantifiering av ursprungliga follikeltal hos kvinnor och djur är avgörande för att fastställa effekten av läkemedel och toxiska ämnen på äggstocksreserven. Det är också nödvändigt att utvärdera behovet av och framgången för befintliga och framväxande fertilitetsbevarande tekniker. För närvarande finns det inga metoder för att exakt mäta antalet ursprungliga folliklar som omfattar äggstocksreserven hos kvinnor. Dessutom är det ofta inte möjligt att få äggstocksvävnad från stora djur eller utrotningshotade arter för experiment. Således har möss blivit en viktig modell för sådana studier, och förmågan att utvärdera ursprungliga follikelnummer i hela musovaries är ett kritiskt verktyg. Rapporter om absoluta follikel tal i mus äggstockar i litteraturen är dock mycket varierande, vilket gör det svårt att jämföra och/eller replikera data. Detta beror på ett antal faktorer, inklusive stam, ålder, behandlingsgrupper, samt tekniska skillnader i metoder för att räkna anställda. I den här artikeln tillhandahåller vi en steg-för-steg-instruktionsguide för att förbereda histologiska sektioner och räkna ursprungliga folliklar i musstockar med två olika metoder: [1] stereologi, som förlitar sig på fraktioneraren / optisk dissector-teknik; och [2] den direkta räknetekniken. Några av de viktigaste fördelarna och nackdelarna med varje metod kommer att belysas så att reproducerbarheten kan förbättras på fältet och göra det möjligt för forskare att välja den lämpligaste metoden för sina studier.
Introduction
De omogna, meiotiskt arresterade äggcellerna lagras i ursprungliga folliklar i äggstocken är lagringsenheten för den kvinnliga könscellen och utgör en individs livstid äggstockscancer reserv. Primordial follikel antal minskar naturligt medålder 1, eller alternativt, kan vara för tidigt utarmat efter exponering för exogena kemikalier, inklusive vissa läkemedel och miljötoxiska ämnen i luft, mat och vatten2. Med tanke på att det ursprungliga follikelnumret är ändligt, bestämmer mängden och kvaliteten på folliklar som finns i äggstocken till stor del kvinnlig fertilitet och avkomma hälsa. Således är korrekt kvantifiering av primordial follikel nummer hos kvinnor avgörande för att utvärdera off-target effekter av exogena förolämpningar på äggstocksreserven.
Hos kvinnor är analys av hela äggstocken i allmänhet inte möjlig, därför måste icke-invasiva surrogatmått i äggstocksreserven användas i klinisk miljö. Anti-Mϋllerian hormon (AMH) är den mest använda surrogat biomarkören kliniskt3. Serum AMH nivåer mäts ofta hos kvinnor i avancerad moderns ålder, eller före och efter cancer behandling, såsom kemoterapi. Amh produceras dock av växande folliklar och inte av ursprungliga folliklar, och därmed serum nivåer inte informera om absoluta ursprungliga follikel nummer.
Med avsaknaden av metoder för att exakt bestämma ursprungliga follikelnummer hos kvinnor på plats, räknar äggstockssäckar i små djurmodeller, såsom gnagare, förblir ett viktigt forskningsverktyg för att bedöma graden genom vilken exogena förolämpningar påverkar ursprungliga folliklar och därmed fertilitet. Tyvärr är dock rapporter i litteraturen om ursprungliga follikelnummer i gnagaremodeller mycket varierande4. En viktig orsak till detta är allmänt rapporterade tekniska skillnader i den räknemetod som används. Övervägande finns det två olika tekniker som beskrivs i litteraturen för att räkna upp ursprungliga folliklar hos möss. Dessa inkluderar stereologi, som använder fraktioneringsoptisk dissector-metod och direkta follikelräkningar.
Stereologi anses allmänt guldstandarden eftersom den använder systematisk enhetlig slumpmässig provtagning5, vilket gör det till den mest exakta metoden för att kvantifiera ursprungliga follikelnummer i hela musen eller råttstockar4,6,7. Stereologi är opartisk, eftersom den står för den tredimensionella strukturen hos föremålet för intresse8. Med hjälp av en optisk dissekator/fraktioneringsmetod tillämpas tre provtagningsnivåer för att kvantifiera ursprungliga folliklar med tjocka vävnadssektioner (t.ex. 20 μm) inom en känd bråkdel av den totala musens äggstock. För det första väljs provtagningsintervallet (t.ex. var tredje rd-sektion) vid en slumpmässig start (provtagningsfraktion 1, f1)4. Avsnitten provtas sedan på ett systematiskt och enhetligt sätt från denna punkt genom hela äggstocken. Sedan läggs en opartisk räkneram över äggstockssektionen och flyttas gradvis längs ett definierat, randomiserat räknenät (samplingsfraktion 2, f2)8. Slutligen provtas en känd del av sektionstjockleken optiskt (t.ex. 10 μm) och folliklar inom detta område räknas (provtagningsfraktion 3, f3)4. Det råa follikelnumret multipliceras med inversen av dessa provtagningsfraktioner för att erhålla det slutliga värdet. Denna metod kräver expertutbildning och utrustning, inklusive ett mikroskop med ett motoriserat stadium som drivs av stereologisk programvara. Vävnader bör bevaras i en specialiserad Bouins fixativ och bäddas in i glykolmetakrylatharts för att möjliggöra att tjocka vävnadssektioner skärs med hjälp av en glykolmetakrylathartsmikrotom med en glaskniv. Denna metod är utformad för att ta hänsyn till vävnad krympning och deformation, för att bäst bevara den tredimensionella morfologiska strukturen hos äggstocken och folliklar9.
Direkt follikelräkning är den vanligaste metoden för att räkna folliklar10. Vanligare fixativ (dvs. formalin) kan användas, följt av paraffinvaxinbäddning och uttömmande seriesektionering med en standardmikrotom med en tjocklek av mellan 4-6 μm. Folliklar räknas systematiskt i hela vävnadsavsnittet med ett definierat intervall och multipliceras sedan med inversen av provtagningsintervallet för att erhålla den totala follikeluppskattningen. Denna metod är snabb, enkel, kan utföras med arkiverade vävnader och förberedas med hjälp av standard histologiska tekniker. Det kräver bara ett ljusmikroskop med standard avbildningskapacitet. Men trots dessa fördelar saknar direkt follikelräkning noggrannheten och strikta räkneparametrar för stereologi, vilket gör den mer benägen att pröva partiskhet. Dessutom kan vävnader genomgå krympning och deformation under bearbetningen, störa äggstockens integritet och morfologi och därmed göra follikelklassificering och kvantifiering svårt.
Syftet med denna artikel är att beskriva två vanliga metoder för att kvantitativt bedöma primordial follikel nummer i mus äggstockar: stereologi och direkt follikelräkning. Vi kommer att tillhandahålla detaljerade protokoll för dessa två metoder och lyfta fram några av deras styrkor och svagheter, för att öka reproducerbarheten inom vårt område och göra det möjligt för forskare att fatta ett välgrundat beslut om den lämpligaste räknemetoden för sina studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den här artikeln ger ett steg-för-steg-protokoll för guldstandardtekniken för att räkna upp musens ursprungliga folliklar, stereologi och den vanligare metoden för direkt follikelräkning. Kemoterapi behandling användes för att jämföra och kontrastera resultaten från dessa två olika metoder inom vänster och höger äggstock från samma djur. Båda metoderna visade hög inter-animal variabilitet i ursprungliga follikel nummer. En betydande utarmning av äggstocksreserven registrerades med stereologi, men dire…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete möjliggjordes genom Victorian State Government Operational Infrastructure Support och Australian Government NHMRC IRIISS och stöddes av finansiering från National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) och Australian Research Council (KJH #FT190100265). Författarna vill erkänna det tekniska stödet från Monash Animal Research Platform, Monash Histology Platform och Monash Micro Imaging facility.
Materials
| 1-Butanol (HPLC) | Fisher Chemical | #A383-1 | |
| Acid alcohol | Amber Scientific | #ACDL | |
| Bouin’s fixative | Sigma-Aldrich | #HT10132 | Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v) |
| Cyclophosphamide | Sigma-Aldrich | #C0768-5G | |
| Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX) | Sigma-Aldrich | #06522 | |
| Ethanol | Amber Scientific | #ETH | Ethanol 100% |
| Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle | Designs for Vision | #FEA-745-SR | Feather blade for dissections (seen in Figure 1) |
| Formalin fixative | Australian Biostain | #ANBFC | |
| Glass coverslip | Thermo Scientific | #MENCS22501GP | 22 mm x 50 mm |
| Glycomethacrylate resin RM2165 microtome | Leica Microsystems | #RM2165 | |
| Glycolmethacrylate DPX | *made in house | *Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks | |
| Histolene | Trajan | #11031 | |
| Mayer’s haematoxylin | Amber Scientific | #MH | |
| Olympus BX50 microscope | Olympus | #BX50 | Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3) |
| Olympus immersion oil type-F | Olympus | #IMMOIL-F30CC | |
| Olympus TH4-200 light source | Olympus | #TH4-200 | |
| Paraffin wax | Sigma-Aldrich | #03987 | |
| Periodic acid | Trajan | #PERI1% | Periodic acid 1% |
| Rotary Microtome CUT 4060 | MicroTec | #4060R/F | Used to cut paraffin sections |
| Schiff’s reagent | Trajan | #SCHF | |
| Scott's tap water | Amber Scientific | #SCOT | Potassium carbonate, magnesium sulphate, water |
| StereoInvestigator Stereological System | MBF Bioscience | Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick | |
| Superfrost microscope slides | Thermo Scientific | #MENSF41296SP | 1 mm, 72 pcs |
| Technovit 7100 Plastic embedding system | Emgrid Australia | #64709003 | 500 mL/5 x 1 g/40 mL |
| Technovit 3040 yellow | Emgrid Australia | #64708805 | 100 g/80 mL |
References
- Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. The capacity of oocytes for DNA repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).
- Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing. Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).
- Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications. Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).
- Ristic, N., et al. Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring. Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).
- Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary. International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).
- Brown, D. L. Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology. Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).
- Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design. Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts–not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Nguyen, Q. N., et al. Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility. Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).
- Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice. Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).
- Winship, A. L., et al. The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation. Human Reproduction. , (2020).
- Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool. Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).
- Nguyen, Q. N., et al. Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes. Molecular Human Reproduction. , (2019).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. Journal of Microscopy. 147, 229-263 (1987).
- Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy. Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).
- Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
- Omari, S., et al. Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve. Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).
- Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age. Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary. Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age. Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).
- Charleston, J. S., et al. Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem. Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).
- Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system. Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).
- Hansen, K. R., et al. A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause. Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).
- Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
- McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
- Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).
