Summary
Här beskriver, jämför och kontrasterar vi två olika tekniker för noggrann follikelräkning av fasta mus äggstocksvävnader.
Abstract
Sexuellt reproducera kvinnliga däggdjur föds med hela sin livstid leverans av äggceller. Omogna, quiescenta äggceller finns i ursprungliga folliklar, lagringsenheten av den kvinnliga könscellen. De är icke-förnybara, vilket innebär att deras antal vid födseln och efterföljande förlusttal till stor del dikterar den kvinnliga bördiga livslängden. Noggrann kvantifiering av ursprungliga follikeltal hos kvinnor och djur är avgörande för att fastställa effekten av läkemedel och toxiska ämnen på äggstocksreserven. Det är också nödvändigt att utvärdera behovet av och framgången för befintliga och framväxande fertilitetsbevarande tekniker. För närvarande finns det inga metoder för att exakt mäta antalet ursprungliga folliklar som omfattar äggstocksreserven hos kvinnor. Dessutom är det ofta inte möjligt att få äggstocksvävnad från stora djur eller utrotningshotade arter för experiment. Således har möss blivit en viktig modell för sådana studier, och förmågan att utvärdera ursprungliga follikelnummer i hela musovaries är ett kritiskt verktyg. Rapporter om absoluta follikel tal i mus äggstockar i litteraturen är dock mycket varierande, vilket gör det svårt att jämföra och/eller replikera data. Detta beror på ett antal faktorer, inklusive stam, ålder, behandlingsgrupper, samt tekniska skillnader i metoder för att räkna anställda. I den här artikeln tillhandahåller vi en steg-för-steg-instruktionsguide för att förbereda histologiska sektioner och räkna ursprungliga folliklar i musstockar med två olika metoder: [1] stereologi, som förlitar sig på fraktioneraren / optisk dissector-teknik; och [2] den direkta räknetekniken. Några av de viktigaste fördelarna och nackdelarna med varje metod kommer att belysas så att reproducerbarheten kan förbättras på fältet och göra det möjligt för forskare att välja den lämpligaste metoden för sina studier.
Introduction
De omogna, meiotiskt arresterade äggcellerna lagras i ursprungliga folliklar i äggstocken är lagringsenheten för den kvinnliga könscellen och utgör en individs livstid äggstockscancer reserv. Primordial follikel antal minskar naturligt medålder 1, eller alternativt, kan vara för tidigt utarmat efter exponering för exogena kemikalier, inklusive vissa läkemedel och miljötoxiska ämnen i luft, mat och vatten2. Med tanke på att det ursprungliga follikelnumret är ändligt, bestämmer mängden och kvaliteten på folliklar som finns i äggstocken till stor del kvinnlig fertilitet och avkomma hälsa. Således är korrekt kvantifiering av primordial follikel nummer hos kvinnor avgörande för att utvärdera off-target effekter av exogena förolämpningar på äggstocksreserven.
Hos kvinnor är analys av hela äggstocken i allmänhet inte möjlig, därför måste icke-invasiva surrogatmått i äggstocksreserven användas i klinisk miljö. Anti-Mϋllerian hormon (AMH) är den mest använda surrogat biomarkören kliniskt3. Serum AMH nivåer mäts ofta hos kvinnor i avancerad moderns ålder, eller före och efter cancer behandling, såsom kemoterapi. Amh produceras dock av växande folliklar och inte av ursprungliga folliklar, och därmed serum nivåer inte informera om absoluta ursprungliga follikel nummer.
Med avsaknaden av metoder för att exakt bestämma ursprungliga follikelnummer hos kvinnor på plats, räknar äggstockssäckar i små djurmodeller, såsom gnagare, förblir ett viktigt forskningsverktyg för att bedöma graden genom vilken exogena förolämpningar påverkar ursprungliga folliklar och därmed fertilitet. Tyvärr är dock rapporter i litteraturen om ursprungliga follikelnummer i gnagaremodeller mycket varierande4. En viktig orsak till detta är allmänt rapporterade tekniska skillnader i den räknemetod som används. Övervägande finns det två olika tekniker som beskrivs i litteraturen för att räkna upp ursprungliga folliklar hos möss. Dessa inkluderar stereologi, som använder fraktioneringsoptisk dissector-metod och direkta follikelräkningar.
Stereologi anses allmänt guldstandarden eftersom den använder systematisk enhetlig slumpmässig provtagning5, vilket gör det till den mest exakta metoden för att kvantifiera ursprungliga follikelnummer i hela musen eller råttstockar4,6,7. Stereologi är opartisk, eftersom den står för den tredimensionella strukturen hos föremålet för intresse8. Med hjälp av en optisk dissekator/fraktioneringsmetod tillämpas tre provtagningsnivåer för att kvantifiera ursprungliga folliklar med tjocka vävnadssektioner (t.ex. 20 μm) inom en känd bråkdel av den totala musens äggstock. För det första väljs provtagningsintervallet (t.ex. var tredje rd-sektion) vid en slumpmässig start (provtagningsfraktion 1, f1)4. Avsnitten provtas sedan på ett systematiskt och enhetligt sätt från denna punkt genom hela äggstocken. Sedan läggs en opartisk räkneram över äggstockssektionen och flyttas gradvis längs ett definierat, randomiserat räknenät (samplingsfraktion 2, f2)8. Slutligen provtas en känd del av sektionstjockleken optiskt (t.ex. 10 μm) och folliklar inom detta område räknas (provtagningsfraktion 3, f3)4. Det råa follikelnumret multipliceras med inversen av dessa provtagningsfraktioner för att erhålla det slutliga värdet. Denna metod kräver expertutbildning och utrustning, inklusive ett mikroskop med ett motoriserat stadium som drivs av stereologisk programvara. Vävnader bör bevaras i en specialiserad Bouins fixativ och bäddas in i glykolmetakrylatharts för att möjliggöra att tjocka vävnadssektioner skärs med hjälp av en glykolmetakrylathartsmikrotom med en glaskniv. Denna metod är utformad för att ta hänsyn till vävnad krympning och deformation, för att bäst bevara den tredimensionella morfologiska strukturen hos äggstocken och folliklar9.
Direkt follikelräkning är den vanligaste metoden för att räkna folliklar10. Vanligare fixativ (dvs. formalin) kan användas, följt av paraffinvaxinbäddning och uttömmande seriesektionering med en standardmikrotom med en tjocklek av mellan 4-6 μm. Folliklar räknas systematiskt i hela vävnadsavsnittet med ett definierat intervall och multipliceras sedan med inversen av provtagningsintervallet för att erhålla den totala follikeluppskattningen. Denna metod är snabb, enkel, kan utföras med arkiverade vävnader och förberedas med hjälp av standard histologiska tekniker. Det kräver bara ett ljusmikroskop med standard avbildningskapacitet. Men trots dessa fördelar saknar direkt follikelräkning noggrannheten och strikta räkneparametrar för stereologi, vilket gör den mer benägen att pröva partiskhet. Dessutom kan vävnader genomgå krympning och deformation under bearbetningen, störa äggstockens integritet och morfologi och därmed göra follikelklassificering och kvantifiering svårt.
Syftet med denna artikel är att beskriva två vanliga metoder för att kvantitativt bedöma primordial follikel nummer i mus äggstockar: stereologi och direkt follikelräkning. Vi kommer att tillhandahålla detaljerade protokoll för dessa två metoder och lyfta fram några av deras styrkor och svagheter, för att öka reproducerbarheten inom vårt område och göra det möjligt för forskare att fatta ett välgrundat beslut om den lämpligaste räknemetoden för sina studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Äggstockar samlades in från kvinnliga C57BL6J möss. Alla djurförsök och experiment utfördes i enlighet med NHMRC Australian Code of Practice for the Care and Use of Animals och godkändes av Monash Animal Research Platform Animal Ethics Committee.
OBS: Ett kemoterapi agent visat sig tömma primordial follikel oocyter, som bestäms medstereologi 11 och direktaräkningar 12,13 användes i denna rapport för att jämföra de två räkningsmetoderna i samma djur. Kvinnliga, 8 veckor gamla möss (unga vuxna) vägdes före en enda intraperitoneal injektion på 75 mg/kg/kroppsvikt av cyklofosfamid eller kontroll av saltlösningsfordon (n=5/grupp). Denna dos har visat sig orsaka en ungefärlig 50% utarmning av ursprungliga folliklar, men rapporteras inte orsaka sjuklighet eller dödlighet hos möss14. Äggstockarna skördades 48 timmar efter behandlingen. En äggstock från varje djur fastställdes i 10% (v/v) neutral buffrad formalinlösning i 24 timmar och den andra fast i Bouins lösning i 24 timmar. Vävnaden inbäddades sedan i antingen glykolmetakrylatharts och sektionerades seriellt vid 20 μm, eller i paraffin och seriellt sektionerade vid 5 μm. Alla vävnader var färgade med periodiska syra Schiff och hematoxylin.
1. Histologisk beredning: fixering, bearbetning, inbäddning och sektionering av musovaries
- Dissekera musstockarna genom att trimma äggledaren och allt omgivande fett, utan att skada eller skära äggstocken själv. Använd vid behov ett dissekerande mikroskop och fint blad för detta steg (figur 1A).
- Fixera vävnader omedelbart genom att placera i ett litet märkt rör som innehåller antingen Bouins fixativ (stereologi) eller formalinfixerande (direkta räkningar) i 24 timmar (figur 1B), innan vävnaderna överförs till 70 % etanol.
OBS: Follikelmorfologi bevaras bäst i Bouins fasta äggstocksvävnad, inbäddad i glykolmetakrylatharts (Figur 2). - Bearbeta hela fasta äggstockar och bädda sedan in i glykolmetakrylatharts för stereologi (kompletterande fil 1), eller paraffinvax för direkta räkningar med hjälp av ett standard histologiskt protokoll.
VARNING: Harts är giftigt, så se till att alla vävnadsbehandlingssteg utförs i en rökhuv och att handskar alltid bärs. - Använd en specialiserad hartsmetatakrylatmikrotom(figur 1C)utrustad med en glaskniv (figur 1D) för att uttömmande skära tjocka glykolmetakrylathartssektioner (t.ex. 20 μm). Samla sektionerna med jämna mellanrum (t.ex. var tredjesektion) på glasmikroskopsbilder för stereologi.
- Använd en standardmikrotom för att skära tunna paraffinsektioner (t.ex. 4-6 μm). Samla vävnadssektioner med jämna mellanrum (t.ex. var9:e sektion) på en glasmikroskoprutschbana för direkta follikelantal.
- Färga rutschkanorna med periodsyra Schiff och hematoxylin(kompletterande fil 2).
- Täckglas med standard DPX för paraffinsektioner eller tjock DPX för glykolmetakrylathartssektioner(figur 1E).
VARNING: Glykolmetakrylatharts DPX är farligt, så utför detta steg in i rökhuven.
OBS: Glycolmethacrylate harts DPX är extremt trögflytande. Glaslocket måste fästas ordentligt genom att trycka ner det med en spatel för att säkerställa att DPX är jämnt och tunt spridda, och det finns inga luftbubblor under täcket (Figur 1F).
2. Stereologisk uppskattning av det ursprungliga follikelnumret med hjälp av den optiska fraktioneraren
- Slå på datorn, multistyrenheten, kameran och ljuskällan i stereologiinstallationen och ställ in mikroskopmålet på en låg förstoring (t.ex. 10x).
- Öppna stereologiprogramvaran.
- Sätt den första bilden säkert på mikroskopstadiet.
- Justera ljusexponeringen genom att kontrollera Automatisk under Exponering på kamerainställningar (kompletterande figur 1A). Alternativt justera ljusexponeringen manuellt.
- Använd joysticken för att hitta det första vävnadsprovet och få provet i fokus.
- Justera vitbalansen, antingen genom att klicka på Fler inställningar (längst ner till höger på panelen Kamerainställningar) och klicka sedan på Vitbalans och klicka på Automatisk ( Kompletterandebild 1B). Du kan också klicka på vitbalansknappen intill knappen Fler inställningar (eller Välj område i fler inställningar) för att ställa in vitbalansen manuellt genom att välja ett vitt område i avsnittet .
- Gå till rullgardinsmenyn Sonder och klicka på Arbetsflöde för optisk fraktionerare. Klicka sedan på Starta nytt projekt och klicka på OK.
- Om en befintlig samplingskonfiguration har sparats klickar du på Ja under | ... jag är en av och välj önskad samplingskonfiguration.
- Om inte, klicka på Nej och ange den seriella avsnittsinformationen manuellt(kompletterande figur 1C)och definiera avsökningskonfigurationen i steg 2.13.
- Klicka på Nästa, ställ in mikroskopet på Låg förstoring och välj 10x förstoring på rullgardinsmenyn.
- Klicka på Nästaoch spåra sedan runt hela äggstocksavsnittet – börja med att klicka vänster om avsnittet och högerklicka i slutet och välj Stäng kontur.
- Klicka på Nästa, ställ in mikroskopet på Hög förstoring och välj 100x oljeförstoring på rullgardinsmenyn.
- Placera en droppe olja på vävnadsdelen på diabilden och flytta mikroskopmålet till 100x förstoring.
- Justera ljusexponeringen (som i steg 2.4) och klicka på Nästa.
- Ställ in samplingsparametrarna för att definiera avsökningskonfigurationen. Här var räkneramen inställd på 47,5 μm x 47,5 μm (2 256,25 μm2) och steglängden var inställd på 100 μm x 100 μm (10 000 μm2) (Kompletterande figur 2). När provtagningsparametrarna har fastställts sparar du mallen och öppnar igen under efterföljande analyssessioner i steg 2.7.
- Klicka på Börja räkna ( kompletterandefigur 1D). Fokusera högst upp i exemplet, klicka på OK och börja räkna.
- Använd fokuseringsratten för att röra dig genom provtagningsdjupet på 10 μm och räkna eventuella ursprungliga folliklar vars oocytkärna kommer i fokus. Klicka på Nästa om du vill flytta till nästa område.
- Klassificera folliklar som en primordial om äggoiden är omgiven av skivekuta (tillplattade) granulosaceller, men inga kuboidala granulosaceller (figur 2A).
OBS: Primordial folliklar skiljer sig från mellanliggande/övergångssäckar, som består av en kombination av kuboidala och skivekutelceller (figur 2B) och primära folliklar, som huvudsakligen omges av kuboida granulosaceller (figur 2C). Dessa follikelklasser bör kvantifieras separat. - Räkna endast folliklar där oocytkärnan är synlig. Oocytkärnan skall finnas inom räkneramen eller vidröra de gröna inklusionslinjerna i räkneramen(tilläggsfigur 1E,F).
- Om oocytkärnan faller utanför räkneramen(tilläggsfigur 1G)eller vidrör de röda uteslutningslinjerna i räkneramen ska du inte räkna follikeln.
- Vid bedömning av urledsutarmning som svar på en exogen kemikalie (t.ex. kemoterapi), se till att alla folliklar som räknas är friska och därmed har normal morfologi (figur 2). Räkna eventuella onormala eller atretiska folliklar separat. Ofta induceras follikeldöd av förolämpningar som kemoterapi, och kvantifiering av atretiska folliklar bör erhållas separat för att skilja mellan friska och atretiska folliklar, eftersom endast friska folliklar utgör äggstocksreserven15.
- Klassificera folliklar som en primordial om äggoiden är omgiven av skivekuta (tillplattade) granulosaceller, men inga kuboidala granulosaceller (figur 2A).
- När räkningen är klar i det avsnittet gör du något av följande:
- Klicka på Lägg till nyttavsnitt och återgå sedan till steg 2.3 för att ställa in nästa avsnitt för inventering.
- Klicka på Jag har räknat klart för att avsluta sessionen. Sätt tillbaka målet till 10x, avsluta stereologiprogramvaran och stäng av ljuskällan, kameran, multikontrollenheten och datorn.
- Hämta det råa follikelnumret (Q) från varje vävnadssektion som provtas från hela äggstocken och använd sedan ett kalkylblad, använd ekvationen nedan för att erhålla det slutliga värdet från varje replikatdjur (N)4.
var:
N = Totalt uppskattat antal folliklar i äggstocken.
Q = Rå urringningstid.
f1 = Provtagningsintervall. Varje 3rd avsnitt provtogs således
.
f2 = Förhållandet mellan räkneramen (exempelområdet) och stegaren, beräknad som
. Eftersom provområdet var 2256 μm2 (47,5 μm x 47,5 μm) och stegarealen var 10000 μm2 (100 μm x 100 μm), 
.
f3 = Fraktion av äggstocksavsnitt som provtagits. Sedan 10 μm av 20 μm-sektionen
provtogs.
Därför,
.
OBS: Detta protokoll beskriver hur man tillämpar dessa principer för stereologiska analyser med hjälp av en allmänt citerad stereologiprogramvara (Table of Materials); Det finns dock annan stereologisk programvara tillgänglig. De principer som tillämpas vid stereologiska analyser av äggstockssäckar är desamma, oavsett vilken programvara som används för att ställa in parametrarna. Stereologi är mest exakt när 100 eller fler objekt räknas i en vuxen musäggstock 4, eftersom detta ger en felkoefficient för uppskattningen under 10%16. Provtagningsparametrarna som beskrivs här har optimerats för att säkerställa att minst cirka 100 objekt (dvs. urtida, övergångs- och primära folliklar) kan räknas i kontroll av vuxna vilda C57BL6J äggstockar. En pilotstudie kan genomföras med en liten provstorlek för att fastställa optimala provtagningsparametrar, såsom intervall och antal avsnitt som ska analyseras och antalet optiska dissekatorer i de provspladeavsnitten 17.
var:
.
. Eftersom provområdet var 2256 μm2 (47,5 μm x 47,5 μm) och stegarealen var 10000 μm2 (100 μm x 100 μm), 
.
provtogs.
.3. Uppskattning av ursprungliga follikelnummer med direkta antal äggstockssäckar
- Placera mikroskopet säkert under ett vanligt ljusmikroskop och utför direkta räkningar för att få råa ursprungliga follikelnummer.
- Klassificera folliklar som en primordial om äggoiden är tydligt synlig och är omgiven av skivekuta (tillplattade) granulosaceller, men inga kuboidala granulosaceller (Figur 2D).
OBS: Primordial folliklar skiljer sig från mellanliggande/övergångssäckar, som består av en kombination av kuboidala och skivekuta granulosaceller (figur 2E) och primära folliklar, som huvudsakligen omges av kuboida granulosaceller (figur 2F). Dessa follikelklasser bör kvantifieras separat. - Se till att alla folliklar som räknas är friska och därmed har normal morfologi (figur 2). Räkna eventuella onormala eller atretiska folliklar separat, eftersom endast friska folliklar utgör äggstocksreserven.
- Klassificera folliklar som en primordial om äggoiden är tydligt synlig och är omgiven av skivekuta (tillplattade) granulosaceller, men inga kuboidala granulosaceller (Figur 2D).
- Alternativt kan du ta flera eller sydda högeffektsfotomikrografer (t.ex. 20x) av hela äggstocksvävnadssektionen för att utföra räkningar genom att öppna bildfilerna. Detta kan göras manuellt eller med hjälp av en automatiserad bildskanner.
- Erhåll det totala råa follikelnumret (Q) från varje vävnadsdel som provtagits från hela äggstocken med det förutbestämda intervallet. Multiplicera detta tal med inversen av provtagningsfraktionen för att erhålla det slutliga värdet för varje replikatdjur (N), med hjälp av ekvationen nedan.
var:
N = Totalt uppskattat antal folliklar i äggstocken.
Q = Antalet råa folliklar (av varje enskild typ, beräknat separat).
f1 = Provtagningsintervall. Var9: e sektion provtogs på detta sätt
.
Därför,
.
var:
.
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En väl karakteriserad modell av follikel utarmning användes, varigenom unga vuxna kvinnliga möss administrerades en enda dos av cyclophosphamide kemoterapi, eller saltlösning fordon kontroll (n=5/grupp) och båda äggstockarna skördades från varje djur efter 48 timmar. En äggstock per djur förbereddes enligt beskrivningen i steg 1 för var och en av de två metoderna: stereologi eller direkta räkningar. Den vänstra och högra äggstocken från varje djur tilldelades slumpmässigt till varje grupp. Dessa data visar att vid användning av stereologi kan en betydande utarmning av musens ursprungliga folliklar detekteras efter kemoterapibehandling (387 ± 11 folliklar), jämfört med kontroll (1043 ± 149; p=0, 0024) (Figur 3). Med hjälp av kontralaterala äggstockar från samma djur kunde däremot direkta follikelantal inte påvisa en signifikant minskning av äggstocksreserven efter kemoterapi (490 ± 40), jämfört med kontroll (752 ± 139; p=0,1063) (figur 3). Det är uppenbart att det ursprungliga follikelnumret hos unga vuxna vilda djur varierar, eftersom fördelningen av de salthaltiga behandlade djuren är bredare jämfört med cyklofosfamidgrupperna, även när antalet utfördes med stereologi (figur 3).
Figur 1: Histologisk beredning av Bouins fasta, glykolmetakrylathartsinbäddade äggstockar för stereologisk analys. A) En vuxen mus äggstock (cirkel, pil) var nära trimmad av allt fett och ovidukten från mus äggstocken med hjälp av ett fjäderblad. B) Kontralaterala mus äggstockar (cirkel, pil) från samma kvinnliga vuxna dissekerades, trimmades, sedan antingen fast i Bouins fixativ (vänster) för stereologi, eller formalin för direkta räkningar (höger). C) En specialiserad hartsmetakroktatmikrum D) utrustad med en glaskniv (pil) användes för att uttömmande skära glykolmetakrylathartsblock i 20 μm sektioner, samlade på glasmikroskoprutschbanor. E) Periodisk syra Schiff-färgade äggstocksvävnad avsnitt på glas mikroskop diabilder (pilar) doppades i färsk histolen (grön behållare) i en rök huva, sedan en glaslock lades ovanpå droppar av GMA DPX. En spatel användes för att ta bort överflödiga DPX och luftbubblor. Rutschkanorna lufttorkades i rökhuven över natten. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Klassificering av urringningskallikel. Representativa bilder av ursprungliga, övergångs- och primärsäckar i glykolmetakrylatharts-inbäddade (A-C) och paraffin-inbäddade (D-F) äggstockssektioner. A: Primordial follikel omgiven av skivekutel granulosa celler (pil). Bar = 10 μm. B: Övergångsfollikel omgiven av både skivekuta (pil) och kubformade (pilspets) granulosaceller. Bar = 10 μm. C: Primär follikel omgiven av kuboidala (pilspets) granulosaceller. Bar = 25 μm. D: Urringad follikel omgiven av skivekuterie granulosaceller (pil). Bar = 10 μm. E: Övergångsfollikel omgiven av både skivekuta (pil) och kubformade (pilspets) granulosaceller. Bar = 10 μm. F: Primär follikel omgiven av kuboidala (pilspets) granulosaceller. Bar = 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Jämförelse av den optiska fraktioneraren och metoder för direkträkning för att utvärdera musens ursprungliga folliklar. En väletablerad modell av follikel utarmning användes som modell, där 8 veckor gamla kvinnliga C57BL6J möss behandlades intraperitoneally med saltlösning, eller en 75 mg/kg/kroppsvikt dos av kemoterapeutiska, cyclophosphamide (n=6/grupp). Detta möjliggjorde jämförelse av de två follikelräkningsmetoderna för att upptäcka förändringar i äggstocksreserven. I samma kohort av djur kunde totala follikeluppskattningar inte påvisa signifikant utarmning av follikeln, i motsats till stereologi som upptäckte en större och betydande utarmning av äggstocksreserven. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Styrkor | Svagheter | |
| STEREOLOGI | Mest exakta sättet att uppskatta folliklar | Tidskrävande och kostsamt |
| Använder flera provtagningsparametrar, vilket gör den statistiskt robust | Kräver expertutrustning och programvara | |
| Mycket känslig, kan upptäcka mindre förändringar i ursprungliga follikelnummer | Proverna skall beredas med hjälp av särskilda, specialiserade histologiska tekniker | |
| Follikelstrukturen bevaras bättre under vävnadsbehandling | ||
| Enhetliga regler som kan tillämpas av olika utredare, vilket minskar partiskheten | ||
| DIREKTA RÄKNINGAR | Tid och kostnadseffektivt | Mindre exakt och känslig än stereologi |
| Kräver standard laboratorieutrustning, t.ex. ljusmikroskop | Endast en provtagningsparameter som används, vilket gör den mindre effektiv när det gäller att upptäcka små förändringar i follikeltal | |
| Retention av äggstockssektioner som kan användas för immunohistokemiska eller andra analyser | Vävnad är mer mottaglig för volymförändringar och follikelstruktur under bearbetningen | |
| Ingen enhetlig uppsättning regler som kan tillämpas, vilket är mer benägna att partiskhet från prövaren |
Tabell 1: Jämförelse av follikelräkningsmetodernas styrkor och svagheter: stereologi kontra direkta räkningar.
Kompletterande bild 1: Skärmbilder av stereologiprotokollet. A) Justera exponeringen genom att kryssa i Automatisk (röd ruta) under Exponering på panelen Kamerainställningar (vit ruta). B) Ställ in vitbalansen genom att först klicka på ikonen Fler inställningar under Annat på panelen Kamerainställningar. Välj sedan Vitbalans och klicka på Automatisk (röd ruta). C) Om en befintlig samplingskonfiguration inte har angetts klickar du på Nej (röd ruta) och anger serieavsnittsinformationen (grön ruta). D) Om du vill börja räkna klickar du på Börja räkna (vit pil). E) Om kärnan i en urringad follikel är synlig inom räkneramen räknas denna follikel (vit prickad cirkel). F) Om kärnan i en urringningsfollikel vidrör de gröna inklusionslinjerna i räkneramen räknas även denna follikel (vit prickad cirkel). G) Om kärnan i en urringningsfollikel inte är synlig inom räkneramen eller vidrör de röda uteslutningslinjerna i räkneramen räknas inte denna follikel (vit prickad cirkel). Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande figur 2: Ställa in provtagningsparametrarna. Följ sekventiella steg på vänster panel för att definiera avsöknings konfigurationen. A) Mät monterad tjocklek. Se till att "Fokusera om till toppen av sektionen på varje rutnätsplats" är oplockad (röd ruta). Markera "Ange den genomsnittliga monterade tjockleken manuellt" (grön ruta). Ange genomsnittlig monterad tjocklek som 20,00 μm (blå låda). B) Definiera storleken på räkneramen. Markera "Tvinga inventeringsramvisningen att vara fyrkantig" och Centrera på livebild under Inventeringsramvisning (röd ruta). Under Räkna ramstorlek anger du 47,5 μm för X och Y (grön ruta). C) Definiera SRS-rutnätslayout. Ange rutnätets storlek manuellt som 110 för X och Y (röd ruta). D) Definiera desesectoralternativ. För höjd på toppskyddszonen anger du 1,00 μm (röd låda). För optisk dissekatorhöjd anger du 10 μm (grön låda). Under Fokusmetod väljer du "Manuell fokus" (blå ruta). E) Spara provtagningsparametrar. Om du vill spara dessa inställningar anger du ett namn och en kommentar och klickar sedan på Spara dina aktuella inställningar (vit pil). F) Under Aktuella inställningar för samplingsparameter kontrollerar du att inställningarna matchar de som visas. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Kompletterande akt 1. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande akt 2. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den här artikeln ger ett steg-för-steg-protokoll för guldstandardtekniken för att räkna upp musens ursprungliga folliklar, stereologi och den vanligare metoden för direkt follikelräkning. Kemoterapi behandling användes för att jämföra och kontrastera resultaten från dessa två olika metoder inom vänster och höger äggstock från samma djur. Båda metoderna visade hög inter-animal variabilitet i ursprungliga follikel nummer. En betydande utarmning av äggstocksreserven registrerades med stereologi, men direkträkning misslyckades med att upptäcka en betydande minskning av ursprungliga follikel nummer efter kemoterapi administration kontra kontroll.
Det är uppenbart att även i en inavlad stam av möss, såsom C57BL6J, är äggstocksreserven hos unga vuxna vilda typ (kontroll) kvinnor utbredd, som är fallet hos människor. Faktorer som påverkar detta och bidrar till upprättandet av äggstocksreserven är fortfarande under utredning18. Hög variation bland studier av mus äggstocksfunktionen innebär många utmaningar för fältet att jämföra, eller replikera data och att främja klinisk översättning av nya terapier för att skydda oocyt antal och kvalitet4. Denna variabilitet beror sannolikt på ett antal faktorer, bland annat inte bara de räknemetoder som används, utan även ytterligare faktorer såsom skillnader mellan djurstam och ålder. behandlingsregimer, såsom dos och timing. Dessa faktorer måste alla beaktas när man jämför data från olika studier. Oavsett, follikel utarmning modell används i denna studie övergripande belyser den exakta och känsliga karaktären av stereologi protokollet, samtidigt som visar att den allmänt rapporterade direkträkning metoden inte kan upptäcka en känd betydande primordial follikel utarmning.
Det finns styrkor och begränsningar för varje inventeringsmetod som beskrivs i den här artikeln (tabell 1). Stereologi betraktas som guldstandardmetoden på grund av dess noggrannhet när den används för att bestämma cellnummer i en mängd olika organ5. Nackdelar med denna teknik inkluderar dock tid och kostnad, liksom kravet på specialiserad utrustning och expertis. Tillsammans har detta begränsat den omfattande användningen av detta förfarande för att få fram de känsligaste uppgifterna.
Däremot är metoden för direkta räkningar snabb, enkel, kan göras med arkiverade vävnader och förberedas med hjälp av vanliga histologiska tekniker. Det kräver bara ett ljusmikroskop med standard avbildningskapacitet. Det tar dock inte hänsyn till volymförändringar som induceras av histologisk bearbetning, vilket kan störa äggstockens tredimensionella struktur. Följaktligen är follikelmorfologi inte alltid tillräckligt bevarad, vilket gör identifiering och räkning noggrannhet utmanande, särskilt för oerfarna utredare. Medan formalin var det fixativa som användes för direkta räkningar i denna studie, kan Bouins fasta vävnader bäddas in i paraffin och detta kan ge bättre morfologi och hjälpa forskare att lättare identifiera ursprungliga folliklar. Dessutom varierar samplingsfraktioner för metoden för direkta räkningar inom litteraturen mycket, allt från var 3rd till var 10:e 5 μm paraffinavsnitt 19, vilket kan bidra till stora skillnader i follikelantal mellan studier. Med tanke på att paraffinvaxsektioner är så tunna hjälper räkning var9: e sektion till att förhindra översampling och onödigt räkna.
Ytterligare metoder som inte beskrivs i denna guide, men som ofta rapporteras i litteraturen, räknar i endast ett centralt avsnitt från hela äggstocken och anser att detta är representativt för hela äggstocken eller follikeltätheten. Denna första metod är mycket problematisk, eftersom ursprungliga folliklar inte är jämnt fördelade i äggstocken och finns i kluster. Detta innebär att en enda, eller till och med några delar av äggstocken, inte är representativa för hela organet, vilket gör systematisk provtagning till en väsentlig komponent till någon räknemetod. Follikeltäthet innebär att man räknar folliklar i ett äggstocksvävnadsprov och sedan uttrycker räkningar per vävnadsområde. Med tanke på begränsningarna för att erhålla primär mänsklig vävnad används follikeltäthet ofta som surrogatmått för absolut follikelnummer i människans äggstock, även om rapporter hos möss också är vanliga. Denna kvantifieringsmetod tar dock inte hänsyn till den ojämna fördelningen av folliklar i hela äggstocken, eller fluktuationer i äggstocksvolymen, som förekommer rutinmässigt under hela den äggstockscancer endokrina (luteala) cykeln. Detta är viktigt eftersom ett korrekt mått på densitet bland proverna är beroende av bevarat vävnadsområde. Dessutom tar denna metod ofta bara prov på en liten biopsi eller en bråkdel av äggstocken när man analyserar mänskliga vävnader, vilket inte är representativt för hela äggstocken. Follikeltätheten saknar den noggrannhet som kan uppnås med stereologi. Även med samma hela äggstock motsvarade jämförande mått på follikel kvantifiering efter stereologiska analys, med follikel densitet, inte i mus äggstockar20.
Även om det är det vanligaste experimentella djuret, är musen bara en modellart. Att få äggstockar från större arter, inklusive husdjur eller icke-mänskliga primater, är möjligt, vilket innebär att follikelantal från hela äggstocksprover kan åstadkommas med hjälp av ett modifierat stereologisktprotokoll 21,22. Slutligen, medan förmågan att analysera follikel räknas i hela mänskliga äggstockar är verkligen mycket svårt, kan det ändå göras när prover är tillgängliga, med hjälp av ett modifierat stereologisktprotokoll 23,24,25.
Framtida riktlinjer på fältet kan omfatta expansion och användning av nya tekniker. Till exempel har en ny metod för automatiserad detektion och räkning för ursprungliga follikeloocyter beskrivits26. Den här metoden använder convolutional neurala nätverk som drivs av märkta data uppsättningar och en glidande fönster algoritm för att välja test data. Denna algoritm testades dock bara över två äggstockar och omfattande upptag återstår att bestämma. Alternativt har de senaste framstegen inom optisk vävnadsrensning och ljusplåtmikroskopi tillåtit omfattande analys av intakta vävnader och vissa studier har undersökt detta för follikeluppräkning i musenäggstocken 27,28.
Sammanfattningsvis, medan direkt follikelräkning är en enkel, snabb och kostnadseffektiv metod för att räkna upp ursprungliga folliklar inom äggstocken, kan denna teknik sakna känslighet, noggrannhet och vara benägna att prövarens partiskhet. Därför, trots dess nackdelar, är stereologi fortfarande den bästa tillgängliga tekniken för att exakt och reproducerbart definiera ursprungliga follikelnummer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete möjliggjordes genom Victorian State Government Operational Infrastructure Support och Australian Government NHMRC IRIISS och stöddes av finansiering från National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) och Australian Research Council (KJH #FT190100265). Författarna vill erkänna det tekniska stödet från Monash Animal Research Platform, Monash Histology Platform och Monash Micro Imaging facility.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Butanol (HPLC) | Fisher Chemical | #A383-1 | |
| Acid alcohol | Amber Scientific | #ACDL | |
| Bouin’s fixative | Sigma-Aldrich | #HT10132 | Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v) |
| Cyclophosphamide | Sigma-Aldrich | #C0768-5G | |
| Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX) | Sigma-Aldrich | #06522 | |
| Ethanol | Amber Scientific | #ETH | Ethanol 100% |
| Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle | Designs for Vision | #FEA-745-SR | Feather blade for dissections (seen in Figure 1) |
| Formalin fixative | Australian Biostain | #ANBFC | |
| Glass coverslip | Thermo Scientific | #MENCS22501GP | 22 mm x 50 mm |
| Glycomethacrylate resin RM2165 microtome | Leica Microsystems | #RM2165 | |
| Glycolmethacrylate DPX | *made in house | *Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks | |
| Histolene | Trajan | #11031 | |
| Mayer’s haematoxylin | Amber Scientific | #MH | |
| Olympus BX50 microscope | Olympus | #BX50 | Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3) |
| Olympus immersion oil type-F | Olympus | #IMMOIL-F30CC | |
| Olympus TH4-200 light source | Olympus | #TH4-200 | |
| Paraffin wax | Sigma-Aldrich | #03987 | |
| Periodic acid | Trajan | #PERI1% | Periodic acid 1% |
| Rotary Microtome CUT 4060 | MicroTec | #4060R/F | Used to cut paraffin sections |
| Schiff’s reagent | Trajan | #SCHF | |
| Scott's tap water | Amber Scientific | #SCOT | Potassium carbonate, magnesium sulphate, water |
| StereoInvestigator Stereological System | MBF Bioscience | Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick | |
| Superfrost microscope slides | Thermo Scientific | #MENSF41296SP | 1 mm, 72 pcs |
| Technovit 7100 Plastic embedding system | Emgrid Australia | #64709003 | 500 mL/5 x 1 g/40 mL |
| Technovit 3040 yellow | Emgrid Australia | #64708805 | 100 g/80 mL |
References
- Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. The capacity of oocytes for DNA repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).
- Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing. Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).
- Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications. Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).
- Ristic, N., et al. Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring. Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).
- Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary. International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).
- Brown, D. L. Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology. Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).
- Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design. Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Nguyen, Q. N., et al. Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility. Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).
- Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice. Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).
- Winship, A. L., et al. The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation. Human Reproduction. , (2020).
- Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool. Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).
- Nguyen, Q. N., et al. Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes. Molecular Human Reproduction. , (2019).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. Journal of Microscopy. 147, Pt 3 229-263 (1987).
- Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy. Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).
- Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
- Omari, S., et al. Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve. Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).
- Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age. Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary. Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age. Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).
- Charleston, J. S., et al. Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem. Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).
- Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system. Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).
- Hansen, K. R., et al. A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause. Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).
- Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
- McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
- Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).
