Summary
Plusieurs méthodes ont été utilisées pour analyser les lipoprotéines plasmatiques; cependant, l’ultracentrifugation reste l’une des méthodes les plus populaires et fiables. Ici, nous décrivons une méthode concernant la façon d’isoler les lipoprotéines du plasma en utilisant l’ultracentrifugation séquentielle de densité et comment analyser les apolipoprotéines à des fins diagnostiques et de recherche.
Abstract
L’analyse des lipoprotéines et des apolipoprotéines de plasma est une partie essentielle pour le diagnostic de dyslipidémie et les études du métabolisme de lipide et de l’athérosclérose. Bien qu’il existe plusieurs méthodes pour analyser les lipoprotéines plasmatiques, l’ultracentrifugation reste l’une des méthodes les plus populaires et fiables. En raison de sa procédure intacte de séparation, les fractions de lipoprotéine isolées par cette méthode peuvent être employées pour l’analyse des lipoprotéines, des apolipoprotéines, des protéomes, et de l’étude fonctionnelle des lipoprotéines avec des cellules cultured in vitro. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour isoler sept fractions de lipoprotéine comprenant VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDLs (d=1.04 et 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1,10 et 1,21 g/mL) provenant du plasma de lapin à l’aide d’ultracentrifugation flottante séquentielle. En outre, nous présentons aux lecteurs comment analyser les apolipoprotéines telles que l’apoA-I, l’apoB et l’apoE par SDS-PAGE et le ballonnement occidental et montrer des résultats représentatifs des profils de lipoprotéine et d’apolipoprotéine utilisant des modèles hyperlipidémiques de lapin. Cette méthode peut devenir un protocole standard pour les cliniciens et les scientifiques de base pour analyser les fonctions lipoprotéines.
Introduction
La dyslipidémie est le principal facteur de risque de maladie athéroclérotique dans le monde. Des niveaux élevés de lipoprotéines de basse densité (LDL) et de faibles niveaux de lipoprotéines de haute densité (HDLs) sont étroitement associés à un risque élevé de maladie coronarienne (CHD)1,2. En milieu clinique, le cholestérol LDL (LDL-C) et le cholestérol HDL (HDL-C) sont régulièrement mesurés à l’aide d’un analyseur automatisé dans un laboratoireclinique 3,4. Malgré cela, il est essentiel d’analyser les profils de lipoprotéine dans les détails pour le diagnostic de la dyslipidémie et l’étude du métabolisme lipidique et de l’athérosclérose chez les animaux humains et expérimentaux. Plusieurs méthodes ont été rapportées pour analyser des lipoprotéines de plasma telles que l’ultracentrifugation, la chromatographie d’exclusion de taille [chromatographie liquide de protéine rapide (FPLC) et chromatographie liquide de haute performance (HPLC)], électrophoresis par gels d’agarose et de polyacrylamide, résonance magnétique nucléaire, et précipitation chimique sélective utilisant des polyanions et des cations divalentes ou d’autres produits chimiques. Dans les années 1950, le groupe de Havel a proposé pour la première fois le concept de lipoprotéines définies par densités utilisant l’ultracentrifugation et les a classées en chylomicrons (CM), lipoprotéines de très faible densité (VLDL), lipoprotéines de densité intermédiaire (IDL), LDL et HDL5 et plus tard, la méthode a été modifiée par d’autres groupes6,7. Jusqu’à présent, l’ultracentrifugation est la méthode la plus populaire et fiable alors que le protocole pratique n’est toujours pas disponible. Dans cet article, nous avons essayé de décrire un protocole facile à utiliser pour isoler une petite échelle de plasma utilisant l’ultracentrifugation flottante de densité séquentielle décrite à l’origineprécédemment 8. Isolement de sept fractions de lipoprotéine plasmatique [VLDL (d<1,006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDL (d=1,04 et 1,06 g/mL), HDLs (d=1,08, 1,10 et 1,21 g/mL)] permet aux chercheurs de faire une analyse approfondie des lipoprotéines et de leurs apolipoprotéines compositionnelles9,10,11. Les sept lipoprotéines intactes de densité consécutive peuvent être employées pour analyser des fonctions de lipoprotéine et également servir aux stratégies in vitro basées sur la cellule. Ce protocole devrait être utile pour le diagnostic clinique et la recherche fondamentale. Ici, nous avons utilisé le plasma de lapin comme exemple pour démontrer cette technique tandis que le plasma d’autres espèces peut être appliqué de la même manière.
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Protocol
Toutes les procédures d’études sur le lapin ont été effectuées avec l’approbation du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Yamanashi (numéro approuvé : A28-39).
1. Séparation de plasma du sang de lapin
- Préparer des microtubes de 1,5 mL contenant 15 μL de 0,5 M EDTA (pH 8,0) pour la collecte de sang.
- Mettez un lapin dans un restrainer et perforez une artère intermédiaire auriculaire à l’aide d’une aiguille de calibre 22 et recueillez le sang dans un tube. Mélanger le sang avec l’EDTA doucement et le mettre sur la glace.
- Centrifuger les tubes sanguins à 1 500 x g pendant 20 min à 4 °C et recueillir le plasma sur un nouveau microtube.
REMARQUE : 3 mL de sang suffisent pour recueillir 1 mL de plasma. Si vous collectez du sang auprès de souris ou d’autres petits animaux, vous devez les mettre en commun.
2. Isolement des lipoprotéines plasmatiques
REMARQUE : La procédure schématique est indiquée dans la figure 1. La méthode de préparation des solutions de densité de bromure de potassium (KBr) est indiquée dans le tableau 1.
- Transférer 1 mL de plasma dans un tube d’ultracentrifugeuse en polycarbonate(figure 2A).
- Chargez ces tubes dans un rotor à angle fixe et centrifuger le plasma à 356 000 x g pendant 2,5 h à 4 °C (figure 2B).
REMARQUE : Pour le rotor Beckman TLA 120,2, 356 000 x g (champ centrifuge relatif moyen, Av RCF) correspond à 100 000 rpm. - Couper les tubes à l’aide d’une trancheuse, puis recueillir la fraction supérieure [VLDL (d<1,006 g/mL)], environ 200 μL dans un nouveau microtube (Figure 2C). Recueillir la fraction inférieure restante dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse en polycarbonate pour la séparation suivante (Figure 2D). Mesurez le volume et faites le volume total à 800 μL en ajoutant la même solution de densité (d=1,006 g/mL).
REMARQUE : Installez une lame sur la trancheuse à tube. Ajustez la position de la lame à un niveau entre la fraction supérieure (200 μL) et la fraction inférieure (800 μL). Le précipité visqueux dans la fraction inférieure doit être recueilli soigneusement et complètement par pipetting dans toutes les étapes suivantes. Si vous faites une pause, faites-le après avoir séparé la fraction supérieure et inférieure dans toutes les étapes. Conserver l’échantillon à 4 °C jusqu’à la prochaine centrifugation. - Ajustez la fraction inférieure (total 800 μL) en d=1,02 g/mL en ajoutant 58,9 μL de solution d=1,21 g/mL et 141,1 μL de solution d=1,02 g/mL (le volume total est de 1 mL).
- Chargez ces tubes dans le rotor à angle fixe et la centrifugeuse à 356 000 x g pendant 2,5 h à 4 °C.
- Couper les tubes à l’aide d’une trancheuse, puis recueillir la fraction supérieure [IDL (d=1,02 g/mL)] environ 200 μL dans un nouveau microtube. Recueillir la fraction inférieure restante dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse en polycarbonate pour la séparation suivante. Mesurez le volume et faites le volume total à 800 μL en ajoutant la même solution de densité (d=1,02 g/mL).
- Ajustez la fraction inférieure (total 800 μL) en d=1,04 g/mL en ajoutant 94,1 μL de solution d=1,21 g/mL et 105,9 μL de solution d=1,04 g/mL (le volume total est de 1 mL).
- Chargez ces tubes dans un rotor à angle fixe et une centrifugeuse à 356 000 x g pendant 2,5 h à 4 °C.
- Couper les tubes à l’aide d’une trancheuse, puis recueillir la fraction supérieure [LDL (d=1,04 g/mL)] d’environ 200 μL dans un nouveau microtube. Recueillir la fraction inférieure restante dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse en polycarbonate pour la séparation suivante. Mesurez le volume et faites le total à 800 μL en ajoutant la même solution de densité (d=1,04 g/mL).
- Ajustez la fraction inférieure (total 800 μL) en d=1,06 g/mL en ajoutant 106,7 μL de solution d=1,21 g/mL et 93,3 μL de solution d=1,06 g/mL (le volume total est de 1 mL).
- Chargez ces tubes dans un rotor à angle fixe et une centrifugeuse à 356 000 x g pendant 2,5 h à 4 °C.
- Couper les tubes à l’aide d’une trancheuse, puis recueillir la fraction supérieure [LDL (d=1,06 g/mL)] d’environ 200 μL dans un nouveau microtube. Recueillir la fraction inférieure restante dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse en polycarbonate pour la séparation suivante. Mesurez le volume et faites le total à 800 μL en ajoutant la même solution de densité (d=1,06 g/mL).
- Ajustez la fraction inférieure (total 800 μL) à d=1,08 g/mL en ajoutant 123,1 μL de solution d=1,21 g/mL et 76,9 μL de solution d=1,08 g/mL (le volume total est de 1 mL).
- Chargez ces tubes dans un rotor à angle fixe et une centrifugeuse à 356 000 x g pendant 2,5 h à 4 °C.
- Couper les tubes à l’aide d’une trancheuse, puis recueillir la fraction supérieure [HDL2 (d=1,08 g/mL)] environ 200 μL dans un nouveau microtube. Recueillir la fraction inférieure restante dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse en polycarbonate pour la séparation suivante. Mesurez le volume et faites le total à 800 μL en ajoutant la même solution de densité (d=1,08 g/mL).
- Ajustez la fraction inférieure (total 800 μL) à d=1,10 g/mL en ajoutant 145,5 μL de solution d=1,21 g/mL et 54,5 μL de solution d=1,10 g/mL (le volume total est de 1 mL).
- Chargez ces tubes dans un rotor à angle fixe et une centrifugeuse à 356 000 x g pendant 2,5 h à 4 °C.
- Couper les tubes à l’aide d’une trancheuse, puis recueillir la fraction supérieure [HDL2 (d=1,10 g/mL)] environ 200 μL dans un nouveau microtube. Recueillir la fraction inférieure restante dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse en polycarbonate pour la séparation suivante. Mesurez le volume et faites le total à 800 μL en ajoutant la même solution de densité (d=1,10 g/mL).
- Ajuster la fraction inférieure (total 800 μL) en d=1,21 g/mL en ajoutant 0,140 g de bromure de potassium (KBr) en poudre et la dissoudre complètement. Mesurez le volume et faites-les jusqu’à 1 mL en ajoutant la solution d=1,21 g/mL.
- Chargez ces tubes dans le rotor à angle fixe et la centrifugeuse à 513 000 x g pendant 4 h à 4 °C.
REMARQUE : Pour le rotor Beckman TLA 120.2, 513 000 x g (Av RCF) correspond à 120 000 rpm. - Couper les tubes à l’aide d’une trancheuse, puis recueillir la fraction supérieure [HDL3 (d=1,21 g/mL)] environ 200 μL dans un nouveau microtube. C’est la dernière étape de l’ultracentrifugation.
3. Dialyse
REMARQUE : Étant donné que les fractions de densité (à l’exception de la fraction d<1,006 g/mL) contiennent des concentrations élevées de KBr, il est nécessaire de les enlever par dialyse.
- Transférez les fractions de densité dans un tube de dialyse et coupez les deux extrémités avec des fermetures.
- Dialyz contre 2 L de tampon de dialyse tels que PBS/ 1 mM EDTA pendant 6 h à 4 °C avec agitation à l’aide d’un agitateur magnétique.
- Remplacer par un nouveau tampon et dialyser à nouveau pendant encore 6 h à 4 °C.
- Recueillir les fractions de densité et mesurer le volume. Ajustez toutes les fractions de densité au même volume (p. ex., 250 μL).
REMARQUE : Vous pouvez calculer le facteur concentré à partir de 1 mL de plasma d’origine (p. ex., 250 μL de fraction de densité correspond à quatre fois la concentration).
4. Analyse des lipoprotéines
REMARQUE : Après dialyse, ces lipoprotéines sont prêtes pour différentes analyses. Les lipoprotéines peuvent être évaluées en mesurant les lipides ou les apolipoprotéines ou les deux. Pour mesurer la teneur en lipides tels que le cholestérol total (TC), les triglycérides (TG), les phospholipides (PL) et le cholestérol libre (FC) dans chaque fraction, nous utilisons des kits d’analyse colorimétrique enzymatique commerciale. Pour l’analyse des apolipoprotéines, nous utilisons SDS-PAGE visualisé avec des taches CBB ou des ballonnements occidentaux.
- Analyse lipidique
REMARQUE : Les lipides tels que TC, TG, PL et FC dans la fraction de lipoprotéine peuvent être mesurés à l’aide de kits de mesure disponibles dans le commerce. Les procédures dépendent des reagents utilisés, alors suivez les instructions de chaque kit utilisé. Ici, nous montrons un test de microplaque typique à l’aide d’un kit d’analyse enzymatique commerciale.- Appliquer 8 μL d’échantillon de lipoprotéine et de substance d’étalonnage standard sur une microplaque de 96 puits.
- Ajouter 240 μL de reagent d’analyse et mélanger au pipetage.
- Incuber à 37 °C pendant 10 min.
- Mesurez l’OD à l’aide d’un lecteur de microplaque et calculez les concentrations lipidiques.
- Analyse de l’apolipoprotéine
- Coloration SDS-PAGE et CBB
- Préparation de l’échantillon : Ajouter 10 μL de tampon échantillon 2x à 10 μL de fraction de lipoprotéine. Chauffer le mélange à 80 °C pendant 5 min à l’aide d’un bloc thermique sec.
- Préparer 4-20% gradient SDS-gel polyacrylamide et mettre en place le gel sur la chambre d’électrophoresis rempli de tampon en cours d’exécution.
- Chargez l’échantillon de lipoprotéine (10 μL/lane) et les normes protéiques (5 μL/lane) sur le gel d’empilage.
REMARQUE : Si les échantillons sont deux fois concentrés, une quantité équivalente de plasma de 20 μL sera analysée par voie.] - Exécuter l’électrophoresis à 20-40 mA courant constant.
- Coloration CBB: Tremper le gel deux fois dans la solution de fixation avec une secousse douce pendant 10 min. Tacher le gel avec la solution de coloration CBB pendant 30 min. Rincer le gel à l’eau distillée pour enlever l’excès de taches. Le gel est prêt pour la photographie.
- Ballonnement occidental
- Effectuez l’électrophorèse dans la même procédure que décrite ci-dessus.
REMARQUE : Le volume de lipoprotéines chargées pour le ballonnement occidental est inférieur à celui des taches CBB décrites ci-dessus (p. ex. 1 à 5 μL). - Placez le gel et la membrane PVDF entre le papier filtre imbibé de tampon de transfert et le tampon de forme. Installez le sandwich dans une cassette de support et placez-le dans un réservoir rempli de tampon de transfert.
- Effectuer l’électroblotting à 100 mA courant constant pendant 3 h à 4 °C.
- Blocage : Incuber la membrane en bloquant le tampon pendant 1 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 °C.
- Réaction ab primaire : Incuber les membranes dans les abdos primaires diluées avec tampon de blocage pendant 1 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 °C avec des secousses légères.
REMARQUE : La dilution primaire suggérée d’Ab est montrée dans le tableau des matériaux. Trois types d’abs primaires contre les apolipoprotéines peuvent être utilisés uniquement ou dans les cocktails. - Laver la membrane trois fois dans le tampon de lavage avec agitation, 5 min par lavage.
- Réaction secondaire d’Ab : Incuber la membrane dans les abs secondaires dilués avec le tampon de blocage pendant 1 h à la température ambiante avec l’agitation.
REMARQUE : La dilution secondaire suggérée d’Ab est indiquée dans le tableau des matériaux. - Laver la membrane trois fois dans le tampon de lavage avec agitation, 5 min par lavage.
- Détection ecl: Placer la membrane sur une pellicule plastique. Ajouter les réagenants de détection ECL et incuber pendant 1 min. Égoutter l’excès de liquide et sceller la membrane dans un sac.
- Visualisez les signaux à l’aide d’un analyseur d’images.
- Effectuez l’électrophorèse dans la même procédure que décrite ci-dessus.
- Coloration SDS-PAGE et CBB
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Representative Results
En utilisant ce protocole, nous avons isolé des lipoprotéines de lapin utilisant 1 mL de plasma et avons obtenu sept fractions de densité. Fractions de densité isolées sont suffisants pour mesurer les lipides et les apolipoprotéines comme décrit ci-dessus pour la plupart des fins de recherche. La même procédure peut également être utilisée pour isoler les lipoprotéines plasmatiques de l’homme et d’autres espèces. Pour les animaux de petite taille comme les souris, un plasma mis en commun est nécessaire. La figure 3 montre les profils de lipoprotéines des lapins de type sauvage (WT) nourris soit par un régime alimentaire normal standard (NS) soit par un régime riche en cholestérol (HC). Les lapins sont des animaux herbivores de sorte que leurs niveaux de plasma TC, TG et PL sont généralement inférieurs à ceux des humains et des souris. Chez les lapins nourris au régime alimentaire en NS, tc est principalement distribué en HDL3 (d=1,21 g/mL) et suivi de LDL (d=1,04 g/mL) (Figure 3A). Selon un régime NS, 39 % des TG plasmatiques sont distribués dans les VLDL, tandis que 57 % du plasma PL est contenu dans hdl3 (figure 3A). Quand les lapins ont été contestés avec un régime complété avec le cholestérol élevé, ils se sont rapidement développés dans l’hypercholestérolémie. Comme le montre la figure 3B, les profils lipoprotéines se caractérisent par une élévation marquée des VLDL (165 fois↑ en VLDL-TC, 1,5 fois↑ en VLDL-TG, et 30 fois↑ en VLDL-PL par rapport aux lapins nourris à la NS). Puisque les VLDLs isolés des lapins cholestérol-alimentés sont riches en esters de cholesteryl et se déplacent à la position de β sur l’électrophoresis de gel d’agarose, ils sont souvent appelés β-VLDLs pour les distinguer des VLDLs normaux qui se déplacent à la position pré-β.
En plus des lipides, les apolipoprotéines peuvent simplement être analysées par SDS-PAGE soit par coloration CBB, soit par ballonnement occidental (figure 4). Sept fractions de lipoprotéine provenant de lapins WT nourris soit d’un régime NS, soit d’un régime HC, ont été gérées sur un gel SDS-polyacrylamide de 4 à 20 % et visualisées avec des taches CBB(figure 4A). Sur un régime de HC, le contenu d’apoB-100 et d’apoE dans VLDLs (d<1.006 g/mL), IDLs (d=1.02 g/mL), et LDLs (d=1.04 g/mL) ont été nettement élevés comparés aux lapins sur un régime de NS. En outre, nous avons également comparé les profils d’apolipoprotéine et de lipoprotéine de trois lapins hyperlipidémiques différents : lapins WT nourris au régime HC, lapins apoE KNOCKOUT (KO) et lapins hyperlipidémiques héréditaires watanabe (WHHL) avec déficience des récepteurs LDL par ballonnement occidental (figure 4B). Les lipoprotéines de plasma ont été fractionnées par 4-20% SDS-PAGE et suivies du ballonnement occidental avec des anticorps contre l’apoE, l’apoB, et l’apoA-I. Les particules contenant de l’apoB (VLDLs, IDLs et LDL) des lapins WT nourris au régime HC se caractérisent par une augmentation du contenu de l’apoB-100 et de l’apoE, tandis que les lapins KO apoE ont montré une augmentation marquée de l’apoB-48 ainsi que l’apparition de l’apoA-I. Lapins WHHL sont génétiquement déficients dans les fonctions des récepteurs LDL il ya donc une augmentation marquée de l’apoB-100 dans les LDL accompagnés d’apoA-I réduit dans les HDLs, qui est similaire à l’hypercholestérolémie familiale humaine.
Figure 1 : Illustration schématique de l’ultracentrifugation flottante séquentielle. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Images représentatives de l’isolement des lipoprotéines plasmatiques. (A) Plasma de lapins normolipidémiques et hyperlipidémiques. (B) VLDL supérieur flotté (d<1.006 g/mL) et fraction inférieure (d>1.006 g/mL) après ultracentrifugation. (C) Tranchage du tube et collecte de la fraction supérieure par une pipette. (D) Collection de la fraction inférieure. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Quantitation du contenu lipidique dans chaque fraction de lipoprotéine isolée des lapins normaux (A) et des lapins nourris au cholestérol (B). Les lipoprotéines plasmatiques ont été séparées par ultracentrifugation flottante séquentielle du plasma des lapins sauvages sur un régime standard normal (A) ou un régime riche en cholestérol (B). Le cholestérol total (TC), les triglycérides (TG) et les phospholipides (PL) ont été mesurés. Les données sont exprimées en ± SEM (n=6). Ce chiffre a été modifié à partir de Yan H et coll.12. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Comparaison de la distribution de l’apolipoprotéine à l’aide de taches CBB (A) et de ballonnements occidentaux (B). Le plasma a été isolé par ultracentrifugation et lipoprotéines ont été fractionnées par 4-20% SDS-PAGE. (A) Les profils d’apolipoprotéine du lapin de type sauvage (WT) nourris selon un régime normal standard (NS) et un régime riche en cholestérol (HC) ont été visualisés par coloration CBB. Par rapport aux lapins nourris au régime alimentaire en Nouvelle- Galles (à gauche), les lapins nourris au régime HC (à droite) ont montré une augmentation du contenu de l’apoB-100 et de l’apoE dans les VLDL, les IDL et les LLD. (B) Comparaison des caractéristiques de l’apolipoprotéine des lapins WT sur un régime NS ou un régime HC, apoE KO (KNOCKOUT) lapins sur un régime HC, et lapins WHHL sur un régime NS. Le ballonnement occidental a été exécuté avec des « anticorps de cocktail » contre l’apoE, l’apoB, et l’apoA-I. Comparés aux lapins normolipidémiques (lapins de WT sur un régime de NS, d’abord à gauche), d’autres trois lapins hyperlipidémiques présentent des profils uniques et différents d’apolipoprotéine. Les particules contenant de l’apoB (VLDLs, IDLs et LDL) des lapins WT nourris au HC se caractérisent par une augmentation du contenu de l’apoB-100 et de l’apoE, tandis que les lapins KO apoE ont montré une augmentation marquée de l’apoB-48 ainsi que l’apparition de l’apoA-I. WHHL a montré l’augmentation marquée de l’apoB-100 dans les LDLs accompagnés de l’apoA-I réduit dans HDLs. Ce chiffre a été modifié à partir de Niimi M et coll.10. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Solution de densité (g/mL) | KBr (g) | Eau distillée (mL) |
| d=1,006 | 8.404 | 1000 |
| d=1,02 | 28.271 | 1000 |
| d=1,04 | 57.261 | 1000 |
| d=1,06 | 86.958 | 1000 |
| d=1,08 | 117.365 | 1000 |
| d=1,10 | 148.490 | 1000 |
| d=1,21 | 333.394 | 1000 |
Tableau 1 : Préparation aux solutions de densité de bromure de potassium(KBr). Le poids (g) de KBr ajouter à 1000 mL d’eau distillée est montré.
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Discussion
L’hyperlipidémie est l’un des facteurs de risque les plus importants de la maladie athérosclérostique. Ainsi, l’analyse des lipoprotéines de plasma est non seulement essentielle pour le diagnostic des patients de dyslipidémie mais également importante pour l’investigation des mécanismes moléculaires du métabolisme de lipoprotéine et de l’athérosclérose. Dans cette étude, nous avons décrit le protocole d’isolement et d’analyse des lipoprotéines plasmatiques qui peuvent être appliquées dans les laboratoires où l’ultracentrifugation est disponible. L’information obtenue par cette méthode est complète et directe, c’est pourquoi elle est recommandée pour les scientifiques de la recherche clinique et fondamentale. Lipoprotéines isolées peuvent également être utilisés pour étudier de nombreuses autres facettes des fonctions lipoprotéines telles que la microscopie électronique à tachesnégatives 13,14, oxydabilité9,15, protéomique16, la culture cellulaire basée sur l’étude in vitro comme le cholestérol efflux essai9 et l’absorption de lipoprotéine assay17.
Il convient de le souligner; cependant, il y a plusieurs points faibles qui doivent prendre en considération. Premièrement, cette méthode prend relativement beaucoup de temps (au moins trois jours) par rapport à d’autres méthodes. Si vous utilisez la dernière ultracentrifugeuse de table, la rotation à grande vitesse (150 000 tours) peut raccourcir le temps de séparation de 50 à 140 min pour chaque fraction de lipoprotéine18. Deuxièmement, la perte d’échantillon peut se produire pendant l’isolement. Pour minimiser la perte d’échantillon, le précipité visqueux de la fraction inférieure doit être dissous et recueilli soigneusement par pipetting. Les tubes de centrifugeuse doivent se fixer hermétiquement à l’intérieur d’une trancheuse pour éviter les fuites de la fraction supérieure. De plus, les échantillons doivent être récupérés soigneusement dans des sacs de dialyse. La récupération peut être calculée en comparant le cholestérol total de lipoprotéine avec le cholestérol plasmatique original. Selon notre expérience, le taux général de récupération sera ≈ 80%19. Troisièmement, ce protocole est limité pour un petit nombre d’échantillons parce qu’un rotor ne peut exécuter que douze tubes à la fois. Pour effectuer un grand nombre d’échantillons, il peut être approprié d’employer d’autres méthodes telles que la méthode de précipitation pour la préparation de HDL4 et l’analyse automatisée de lipoprotéine de HPLC20.
En résumé, ce protocole fournit un guide aux chercheurs pour isoler les lipoprotéines plasmatiques à l’aide de l’ultracentrifugation séquentielle de densité et de l’analyse des lipides et des apolipoprotéines.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus en partie par une subvention de recherche du numéro de subvention JP 20K08858 de JSPS KAKENHI, de la National Natural Science Foundation of China (no 81941001 et 81770457), du JSPS-CAS dans le cadre du Programme de coopération de recherche Japon-Chine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
- Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), London, England. 1267-1278 (2005).
- Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
- Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
- Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
- Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
- Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
- Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
- Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
- Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
- Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
- Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
- Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
- Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
- von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
- Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
- Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
- De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
- Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).
