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Biochemistry

जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली पर आणविक प्रसार के विश्लेषण के लिए स्पॉट भिन्नता प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी

Published: November 12, 2020 doi: 10.3791/61823
Automatic Translation
*1, *2, *1, 3, 4, 2, 1, 2
1CNRS, Inserm, Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Univ, 2Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw, 3Faculty of Biological Sciences, University of Wroclaw, 4CNRS, Centrale Marseille, Institut Fresnel, Aix Marseille Univ
* These authors contributed equally

Summary

इस लेख का उद्देश्य जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली पर आणविक प्रसार को मापने के लिए एक स्पॉट भिन्नता प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एसवीएफसीएस) माइक्रोस्कोप बनाने के तरीके पर एक प्रोटोकॉल पेश करना है।

Abstract

प्लाज्मा झिल्ली संगठन से जुड़े लोगों सहित जीवित कोशिकाओं में गतिशील जैविक प्रक्रियाएं क्रमशः नैनोमीटर से माइक्रोमीटर और माइक्रोसेकंड से मिनटतक विभिन्न स्थानिक और लौकिक तराजू पर होती हैं। जैविक प्रक्रियाओं की इस तरह की एक विस्तृत श्रृंखला पारंपरिक माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण को चुनौती देती है। यहां, हम एक शास्त्रीय प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्पॉट भिन्नता प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एसवीएफसीएस) माप को लागू करने की प्रक्रिया का विस्तार करते हैं जिसे अनुकूलित किया गया है। प्रोटोकॉल में एसवीएफसीएस सेटअप की एक विशिष्ट प्रदर्शन जांच और शारीरिक स्थितियों के तहत जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली पर एसवीएफसीएस द्वारा आणविक प्रसार माप के लिए दिशानिर्देश शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, हम कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडेज उपचार द्वारा प्लाज्मा झिल्ली बेड़ा नैनोडोमेन को बाधित करने के लिए एक प्रक्रिया प्रदान करते हैं और प्रदर्शित करते हैं कि प्लाज्मा झिल्ली के पार्श्व संगठन में इन परिवर्तनों को एसवीएफसीएस विश्लेषण द्वारा कैसे प्रकट किया जा सकता है। अंत में, यह प्रतिदीप्ति-आधारित विधि उपयुक्त स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ प्लाज्मा झिल्ली के पार्श्व संगठन पर अभूतपूर्व विवरण प्रदान कर सकती है।

Introduction

प्लाज्मा झिल्ली संगठन की जटिलता
कोशिका झिल्ली संगठन की वर्तमान समझ को कई पहलुओं को ध्यान में रखना होगा1. सबसे पहले, एक जटिल लिपिड संरचना न केवल कोशिका प्रकारों के बीच भिन्न होती है, बल्कि एक एकल कोशिका (झिल्ली ऑर्गेनेल / इसके अलावा, संबद्ध या आंतरिक झिल्ली प्रोटीन ज्यादातर गतिशील मल्टीमेरिक परिसरों में व्यवस्थित होते हैं, झिल्ली के बाहर फैले बड़े डोमेन के साथ, अकेले ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन की तुलना में काफी बड़े क्षेत्र के लिए लेखांकन। इसके अलावा, झिल्ली से जुड़े प्रोटीन विशिष्ट लिपिड-बाइंडिंग या लिपिड-इंटरैक्टिंग क्षमताओं का प्रदर्शन करते हैं जो प्रोटीन फ़ंक्शन को विनियमित करने में भूमिका निभाते हैं। ये सीधे लिपिड की स्थानीय संरचना और पहुंच पर निर्भर करते हैं2.

अंत में, झिल्ली प्रोटीन की आंतरिक असममित संरचना और लिपिड के वितरण के कारण दो झिल्ली पत्रकों के बीच विषमता का एक महत्वपूर्ण स्तर देखा जाता है। दरअसल, संश्लेषण और हाइड्रोलिसिस के बीच एक लिपिड चयापचय संतुलन, पत्रक के बीच लिपिड फ्लिप-फ्लॉप के साथ संयुक्त, इस तरह के असममित वितरण उत्पन्न करता है। चूंकि बाइलेयर में कोई भी परिवहन झिल्ली के हाइड्रोफोबिक इंटीरियर के माध्यम से ध्रुवीय सिर समूह को स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक मुक्त ऊर्जा से विवश होता है, इसलिए इसे आमतौर पर चयनात्मक ट्रांसपोर्टरों द्वारा सहायता प्रदान की जाती है। प्रत्येक सेल प्रकार के लिए, विषमता को दृढ़ता से बनाए रखा जाता है। कुल मिलाकर, ये कारक प्लाज्मा झिल्ली 3,4 के पार्श्व विषमता या विभाजन में योगदान करते हैं।

हम प्लाज्मा झिल्ली के इस प्रतिनिधित्व को बाइलेयर के भीतर और पार आंतरिक आणविक प्रसार को ध्यान में रखते हुए समृद्ध करते हैं, जो दसवें से सैकड़ों नैनोमीटर और माइक्रोसेकंड से सेकंड के पैमाने पर गतिशील पार्श्व विषमता में योगदान देता है। उदाहरण के लिए, लिपिड-निर्भर झिल्ली नैनोडोमेन-तथाकथित लिपिड राफ्ट, कोलेस्ट्रॉल के रूप में परिभाषित, और स्फिंगोलिपिड-समृद्ध सिग्नलिंग प्लेटफॉर्म-प्लाज्मा झिल्ली 5,6 के विभाजन में योगदान करते हैं। हालांकि, झिल्ली संगठन का वर्तमान दृश्य अकेले लिपिड राफ्ट तक सीमित नहीं है। झिल्ली नैनोडोमेन संरचना, उत्पत्ति और कार्य में अधिक जटिल और विषम हैं। फिर भी, प्लाज्मा झिल्ली में उनकी उपस्थिति को कसकर समन्वित किया जाना चाहिए, और प्रोटीन और लिपिड के बीच गतिशील बातचीत झिल्ली नैनोडोमेन 1,3,7,8 के स्थानिक वितरण और रासायनिक संशोधन में महत्वपूर्ण प्रतीत होती है।

प्लाज्मा झिल्ली के संगठन की जांच करने के लिए एसवीएफसीएस सिद्धांत और इसका अनुप्रयोग
यद्यपि झिल्ली डोमेन के विश्लेषण में बहुत प्रगति हुई है, मुख्य रूप से बायोफिजिकल तकनीकों के माध्यम से, प्लाज्मा झिल्ली के स्थानीय संगठन को निर्देशित करने वाले निर्धारकों को उचित स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ परिष्कृत करने की आवश्यकता है। व्यक्तिगत अणुओं पर नज़र रखने के आधार पर निर्धारक उत्कृष्ट स्थानिक परिशुद्धता प्रदान करते हैं और गति 9,10,11,12 के विभिन्न तरीकों के लक्षण वर्णन की अनुमति देते हैं, लेकिन शास्त्रीय कम कैमरा फ्रेम दरों के साथ एक सीमित अस्थायी रिज़ॉल्यूशन होता है और प्रक्षेपवक्र की एक महत्वपूर्ण संख्या को रिकॉर्ड करने के लिए अधिक प्रयोगात्मक प्रयास की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक रूप से, झिल्ली घटकों के प्रसार गुणांक का मूल्यांकन फोटोब्लीचिंग (एफआरएपी) 13 या प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) 14 के बाद प्रतिदीप्ति वसूली द्वारा किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध को अधिक ध्यान दिया गया है, मुख्य रूप से इसकी उच्च संवेदनशीलता और चयनात्मकता, सूक्ष्म पहचान की मात्रा, कम आक्रामकता और विस्तृत गतिशील रेंज15 के कारण।

एफसीएस का वैचारिक आधार लगभग 50 साल पहले16,17 साल पहले मैगडे और सहयोगियों द्वारा पेश किया गया था। यह एक उच्च अस्थायी संकल्प (μs से s) 18 के साथ प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के उतार-चढ़ाव को रिकॉर्ड करने पर आधारित है। इसके आधुनिक संस्करण में, जीवित कोशिकाओं में माप ब्याज के क्षेत्र (जैसे, प्लाज्मा झिल्ली पर) के भीतर स्थित एक छोटे से कॉन्फोकल उत्तेजना मात्रा (~ 0.3 फेम्टोलीटर) द्वारा किया जाता है; अवलोकन मात्रा के अंदर और बाहर जाने वाले फ्लोरोसेंट अणुओं को फैलाने से उत्पन्न प्रतिदीप्ति संकेत बहुत उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन (यानी, डिटेक्टर पर प्रत्येक फोटॉन के आगमन का समय) के साथ एकत्र किया जाता है। फिर, सिग्नल की गणना ऑटोकोरिलेशन फ़ंक्शन (एसीएफ) उत्पन्न करने के लिए की जाती है, जिसमें से औसत समयटी डी (प्रसार समय) जिसके लिए एक अणु फोकल वॉल्यूम के भीतर रहता है, साथ में कणों की औसत संख्या, (एन), अवलोकन मात्रा में मौजूद है, जो एसीएफ के आयाम के विपरीत आनुपातिक है। यह अंतिम पैरामीटर अवलोकन मात्रा के भीतर अणु एकाग्रता पर उपयोगी जानकारी हो सकती है।

तब से, एफसीएस तौर-तरीकों की बढ़ती संख्या को बायोफोटोनिक्स में तेजी से विकसित इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए धन्यवाद लागू किया गया है, जिससे जीवित प्रणालियों में होने वाली गतिशील घटनाओं का वर्णन हो सकता है। फिर भी, एक आणविक प्रजाति प्रसार गुणांक मूल्यों के अधिक अतिव्यापी वितरण का अनुभव करेगी, जो आमतौर पर एक विषम प्रसार विशेषता द्वारा परिलक्षित होती है, जिसमें अणु समय19 में एक गैर-रेखीय संबंध के साथ फैलते हैं, और इस विषम उपविभाजन के जैविक अर्थ की पहचान करने में कठिनाई होती है। अतीत में, इस कठिनाई को केवल एक क्षेत्र के बजाय विभिन्न आकारों के क्षेत्रों से एफआरएपी द्वारा आणविक प्रसार को रिकॉर्ड करके कुछ हद तक दूर किया गया है, जिससे अतिरिक्त स्थानिक जानकारी प्रदान की जाती है। इसने सक्षम किया, उदाहरण के लिए, झिल्ली माइक्रोडोमेन20,21,22 की अवधारणा।

एफसीएस माप (यानी, तथाकथित स्पॉट भिन्नता प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एसवीएफसीएस)) के लिए इस रणनीति का अनुवाद अवलोकन की फोकल मात्रा के आकार को बदलकर स्थापित किया गया था, जिससे प्रतिदीप्ति में उतार-चढ़ाव को विभिन्न स्थानिक तराजू23 पर दर्ज किया जा सकता है। इस प्रकार, एसवीएफसीएस दृष्टिकोण अप्रत्यक्ष स्थानिक जानकारी प्रदान करता है जो आणविक प्रसार मोड और झिल्ली विभाजन के प्रकार (पृथक बनाम सन्निहित डोमेन24) अध्ययन किए गए अणुओं की पहचान और निर्धारण की अनुमति देता है। कमर (ω) मूल्य द्वारा परिभाषित विभिन्न स्थानिक तराजू के एक समारोह के रूप में प्रसार समयटी डी की साजिश रचकर, जो इस मामले में पता लगाने वाले बीम त्रिज्या आकार से मेल खाती है23,25, कोई किसी दिए गए शारीरिक स्थिति में किसी दिए गए अणु के प्रसार कानून को चिह्नित कर सकता है। इसलिए, एसवीएफसीएस समय डोमेन26 में एकल-कण ट्रैकिंग के लिए एक आदर्श एनालॉग है। ब्राउनियन प्रसार बाधा के तहत, किसी को प्रसार समयटी डी और कमर ω (चित्रा 1)23,25 के बीच कड़ाई से रैखिक संबंध की उम्मीद करनी चाहिए। इस योजना से प्रसार कानून के विचलन की उत्पत्ति को गैर-अनन्य कारणों से जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, जैसे साइटोस्केलेटन जालवर्क, आणविक भीड़, नैनोडोमेन में गतिशील विभाजन, या इन और अन्य प्रभावों के किसी भी संयोजन (चित्रा 1), और प्रयोगात्मक रूप से परीक्षण करने की आवश्यकता है25.

यहां हम स्क्रैच से निर्मित कस्टम-निर्मित एसवीएफसीएस ऑप्टिकल सिस्टम के दैनिक उपयोग के लिए सभी आवश्यक नियंत्रण चौकियां प्रदान करते हैं, जो उस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण पर हमारे पिछले प्रोटोकॉल समीक्षा27,28 का पूरक है। इसके अलावा, अवधारणा के प्रमाण के रूप में, हम सेटअप के अंशांकन, कोशिकाओं की तैयारी, डेटा अधिग्रहण और थाइ 1-जीएफपी के लिए एसवीएफसीएस प्रसार कानून (डीएल) की स्थापना के लिए विश्लेषण के बारे में दिशानिर्देश देते हैं, एक प्लाज्मा झिल्ली ग्लाइकोसिलफॉस्फेटिडिलिनोसिटोल-लंगर प्रोटीन, जिसे लिपिड-बेड़ा नैनोडोमेन29 में स्थानीयकृत करने के लिए जाना जाता है। अंत में, हम प्रदर्शित करते हैं कि कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडेज उपचार द्वारा लिपिड-राफ्ट नैनोडोमेन का आंशिक अस्थिरता थाइ 1-जीएफपी के प्रसार गुणों को कैसे प्रभावित करता है। इसके अतिरिक्त, स्क्रैच से एसवीएफसीएस सेटअप बनाने का एक विस्तृत विवरण पूरक सामग्री में प्रदान किया गया है।

Protocol

1. कस्टम-निर्मित एसवीएफसीएस सेटअप को इकट्ठा करने के लिए विनिर्देश सेट करना

नोट: प्रस्तावित एसवीएफसीएस सेटअप की सादगी फोटॉन वसूली में दक्षता सुनिश्चित करते हुए कम लागत पर आसान स्थापना, संचालन और रखरखाव की अनुमति देती है। अधिक जानकारी के लिए, अनुपूरक सामग्री देखें।

  1. प्रायोगिक कक्ष और सुरक्षा
    1. लगभग 21 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर कमरे में सिस्टम स्थापित करें।
    2. निष्क्रिय (या सक्रिय) ऑप्टिकल तालिका पर प्रत्यक्ष एयरफ्लो से बचें और ऑप्टिकल संरेखण के लिए लेजर सुरक्षा नियमों का पालन करें।
  2. हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर
    नोट: पूरक सामग्री चित्रा 2 में दर्शाए गए स्थापना चरणों का विवरण देती है।
    1. एक राज्य मशीन और घटना संरचना वास्तुकला का उपयोग करके लैबव्यू में मुख्य अधिग्रहण और नियंत्रण सॉफ़्टवेयर लिखें जहां एक बहुक्रिया अधिग्रहण बोर्ड अधिकांश नियंत्रकों को चलाता है।
      नोट: कोरिलेटर, लेजर और पावर मीटर को अपने स्वयं के सॉफ़्टवेयर द्वारा नियंत्रित या मॉनिटर किया जाता है।
    2. उपयोग किए गए हार्डवेयर के अनुसार हार्डवेयर और सॉफ़्टवेयर स्थापना प्रक्रियाओं को अनुकूलित करें।
  3. ऑप्टिकल सेटअप
    नोट: चित्रा 3 ऑप्टिकल संरेखण की गुणवत्ता को नियंत्रित करने के लिए निम्नलिखित वर्गों में उपयोग किए जाने वाले ऑप्टिकल बेंच मॉड्यूल को दर्शाता है। ऑप्टिकल तत्व विनिर्देशों के सभी सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं। सेटअप बनाने की प्रक्रिया पूरक सामग्री में व्यापक रूप से विस्तृत है। इस प्रणाली में एक निरंतर तरंग लेजर, एक मोटर चालित उलटा माइक्रोस्कोप शामिल है जो एक विसर्जन जल उद्देश्य से लैस है, एक हिमस्खलन फोटोडायोड डिटेक्टर एक एकल फोटॉन गिनती मॉड्यूल के साथ युग्मित है, और एक हार्डवेयर कोरलेटर। कंपन मुक्त हीटर के साथ एक माइक्रोस्कोप इनक्यूबेशन कक्ष विशेष रूप से जीवित कोशिकाओं पर प्रयोगों के लिए तापमान को नियंत्रित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। सम्मेलन द्वारा, एक्सवाई अक्ष ऑप्टिकल पथ के लंबवत विमान से मेल खाता है, और जेड-अक्ष ऑप्टिकल पथ से मेल खाता है।

2. प्रयोग चलाने से पहले दैनिक चेकपॉइंट

  1. उत्तेजना पथ को नियंत्रित करें (चित्रा 3, Equation 3 और Equation 4)।
    1. सभी आईरिस डायाफ्राम खोलें।
    2. पावर मीटर के साथ लेजर पावर को मापें, पहले आईरिस को पूरी तरह से खुला रखें।
    3. अधिकतम शक्ति खोजने के लिए अर्ध-तरंग प्लेट (एचडब्ल्यूपी) को चालू करें।
    4. यदि लेजर शक्ति सामान्य से कम है, तो आईरिसेस का उपयोग करके संरेखण की जांच करें, और यदि आवश्यक हो तो एल 1 और एम 1 को वैकल्पिक रूप से स्थानांतरित करें।
    5. प्रयोग प्रयोगशाला नोटबुक में शक्ति मूल्य नोट करें।
  2. पता लगाने पथ को नियंत्रित करें (चित्रा 3, Equation 5 & Equation 6)।
    1. उद्देश्य पर पानी, एक कवरस्लिप, और 2 एनएम रोडामाइन 6 जी (आरएच 6 जी) समाधान की एक बूंद रखें।
    2. यदि प्रतिदीप्ति संकेत (लैबव्यू सॉफ्टवेयर के साथ दर्ज एपीडी पर गिनती संख्या) सामान्य से कम है, तो आरएच 6 जी समाधान को रीमेक करें, उद्देश्य लेंस पर स्थिति और कवरस्लिप की संख्या की जांच करें, या बुलबुले को खत्म करें, यदि कोई हो।
      1. यदि प्रतिदीप्ति संकेत अभी भी सामान्य से कम है, तो बीम को अवरुद्ध करने के लिए ऑप्टिकल पथ के अंदर पावर मीटर रखें।
      2. एपीडी को बंद करें (इसके बाद, एपीडी एपीडी और एकल फोटॉन गिनती मॉड्यूल को संदर्भित करता है)।
      3. नमूना निकालें।
      4. एक चिंतनशील लक्ष्य के साथ उद्देश्य लेंस को साफ और प्रतिस्थापित करें।
      5. प्रकाश पथ से बिजली मीटर को हटाकर चिंतनशील लक्ष्य पर लेजर बीम की जांच करें। सुनिश्चित करें कि लक्ष्य की बीम केंद्रित है, और पीछे प्रतिबिंब लाइन Equation 4 (चित्रा 3) पर पहले आईरिस तक पहुंचता है।
      6. यदि नहीं, तो एम 2 के साथ केंद्र की स्थिति या डाइक्रोइक दर्पण के साथ पीछे के प्रतिबिंब को समायोजित करें।
      7. यदि माइक्रोस्कोप युग्मन सही है, तो उद्देश्य लेंस को पीछे धकेलें, पानी की एक बूंद, एक कवरस्लिप, और अधिक केंद्रित आरएच 6 जी समाधान (यानी, 200 एनएम) की एक बूंद जोड़ें, और शास्त्रीय माप (कुछ μW) की तुलना में कम लेजर शक्ति सेट करें।
      8. तीव्रता संकेत (लैबव्यू सॉफ्टवेयर) की निगरानी करते समय एपीडी को चालू करें और वैकल्पिक रूप से, अपने संबंधित एक्सवाईजेड समायोजन शिकंजा के साथ एपीडी और पिनहोल संरेखण का अनुकूलन करें।
      9. कवरस्लिप बदलें और आरएच 6 जी (2 एनएम) की कम एकाग्रता जोड़ें। एक ऐसी स्थिति खोजने के लिए जेड-अक्ष के साथ पिनहोल को स्थानांतरित करें जहां आणविक चमक अनुपात बढ़ता है, और कमर न्यूनतम होती है।
      10. आईरिस को तब तक बंद करें जब तक कि सिग्नल नीचे न गिर जाए: लेजर बीम आकार उद्देश्य के पीछे के एपर्चर आकार तक पहुंच जाता है (यानी, न्यूनतम कमर का आकार, पूरक सामग्री देखें)।
      11. कोरिलेटर सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें और डेटा रिकॉर्ड करें (डेटा रिकॉर्डिंग के लिए अनुभाग 7 देखें)।
      12. एसीएफ की जांच करें, जिसे कम मात्रा में शोर प्रदर्शित करना चाहिए, एक छोटा कमर का आकार देना चाहिए, और प्रति सेकंड प्रति अणु एक उच्च गिनती-दर (डेटा विश्लेषण और कमर आकार मूल्यांकन के लिए अनुभाग 7 देखें)।

3. एसवीएफसीएस डेटा रिकॉर्डिंग और विश्लेषण के लिए सामान्य विचार

  1. इस सामान्य योजना के बाद प्रतिदीप्ति डेटा रिकॉर्ड और विश्लेषण करें (अनुभाग 7, 8 और 9 देखें): (1) प्रतिदीप्ति रिकॉर्डिंग और एसीएफ पीढ़ी (कोरिलेटर सॉफ्टवेयर), (2) डेटा का अप्रत्याशित त्याग, बनाए रखा डेटा का औसत, उपयुक्त मॉडल (होममेड इगोर प्रो सॉफ्टवेयर के साथ), (3) प्रसार कानून प्लॉट (होममेड मैटलैब सॉफ्टवेयर 1), और (4) वैकल्पिक प्रसार कानून तुलना (होममेड एमएटीएलएबी सॉफ्टवेयर 2)। विभिन्न सॉफ्टवेयर प्रोग्राम अनुरोध पर उपलब्ध हैं।
    नोट: हार्डवेयर कोरिलेटर में 12.5 एनएस (यानी, 80 मेगाहर्ट्ज की नमूना आवृत्ति) का न्यूनतम नमूना समय है। यह एक अस्थायी रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है जो समाधान में स्वतंत्र रूप से फैलाने वाले छोटे अणु के विशिष्ट निवासी समय से कम से कम 1,000 कम है और एक कॉन्फोकल अवलोकन मात्रा के भीतर झिल्ली प्रोटीन के प्रसार समय से 106 छोटा है।

4. सेल संस्कृति और अभिकर्मक

  1. 5% भ्रूण गोजातीय सीरम, पेनिसिलिन (100 यू / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 यू / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 यू / एमएल), और एल-ग्लूटामाइन (1 एमएम) के साथ पूरक पूर्ण डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) का उपयोग करके 10,000 कोशिकाओं के घनत्व पर # 1.0 बोरोसिलिकेट ग्लास तल के साथ 8-अच्छी तरह से चैंबर वाले कवरग्लास में कॉस 7 कोशिकाओं को बीज दें।
  2. 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 युक्त आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की संस्कृति।
  3. माध्यम निकालें, अच्छी तरह से प्रति ताजा पूर्ण संस्कृति माध्यम के 300 μL जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को पूर्वनिर्मित।
  4. सीरम मुक्त डीएमईएम के 50 μL में ईजीएफपी25 के साथ जुड़े थाय -1 प्रोटीन एन्कोडिंग प्लास्मिड डीएनए के 0.5 μg पतला। भंवर संक्षेप में मिश्रण करने के लिए।
  5. सीरम मुक्त डीएमईएम के 50 μL में डीएनए अभिकर्मक अभिकर्मक के 1.5 μL पतला, और समाधान अच्छी तरह से मिश्रण।
  6. पतला अभिकर्मक अभिकर्मक सीधे तैयार डीएनए समाधान में जोड़ें, और यौगिकों को तुरंत मिलाएं।
  7. कमरे के तापमान पर 10 से 15 मिनट के लिए तैयार मिश्रण सेते हैं।
  8. अभिकर्मक अभिकर्मक परिसरों के 10 μL प्रत्येक कुएं में माध्यम पर ड्रॉपवाइज जोड़ें, और धीरे-धीरे प्लेट को घुमाकर होमोजेनाइज करें।
  9. 3 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं।
  10. इनक्यूबेशन अभिकर्मक अभिकर्मक परिसरों युक्त माध्यम को ताजा पूर्ण डीएमईएम के 400 μL के साथ बदलें, और एसवीएफसीएस प्रयोग से पहले 16 घंटे के लिए कोशिकाओं को संस्कृति दें।

5. एसवीएफसीएस माप के लिए कोशिकाओं की तैयारी

  1. संस्कृति माध्यम को हटा दें।
  2. सीरम मुक्त हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) बफर के साथ कोशिकाओं को धीरे-धीरे दो से तीन बार धोएं जिसमें सीए2 + और एमजी2 + 10 एमएम (4- (2-हाइड्रॉक्सीथाइल) -1-पिपराज़ीनिथेनेसल्फोनिक एसिड) (एचईपीईएस), पीएच 7.4 (एचबीएसएस /
  3. सभी एसवीएफसीएस अधिग्रहण के दौरान एचबीएसएस / एचईपीईएस बफर में कोशिकाओं को बनाए रखें।

6. औषधीय उपचार

  1. संस्कृति माध्यम निकालें, और 10 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.4 (एचबीएसएस / एचईपीईएस) के साथ पूरक सीरम मुक्त एचबीएसएस के साथ कोशिकाओं को दो से तीन बार धोएं।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एचबीएसएस / एचईपीईएस बफर में कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडेज (सीओएएस) समाधान के 1 यू / एमएल के साथ कोशिकाओं सेते हैं।
  3. समाधान निकालें, और एसवीएफसीएस माप करते समय एचबीएसएस / एचईपीईएस बफर में सीओएएस के 0.1 यू / एमएल की उपस्थिति में कोशिकाओं को बनाए रखें।

7. स्पॉट आकार अंशांकन

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोस्कोप कक्ष को प्रीवॉर्म करें।
  2. धारावाहिक कमजोर पड़ने से आरएच 6 जी का एक मानक 2 एनएम समाधान तैयार करें।
  3. पानी-विसर्जन उद्देश्य पर रखे गए ग्लास कवरस्लिप पर 2 एनएम आरएच 6 जी समाधान के 200 μL ड्रॉप करें।
  4. सभी हार्डवेयर और सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें।
  5. उपयोग की जाने वाली फ्लोरोसेंट जांच की चमक और फोटो-स्थिरता के आधार पर, इस शक्ति को (1) प्रतिदीप्ति तीव्रता (लैबव्यू सॉफ्टवेयर पर) के अनुसार अनुकूलित करें, जो स्थिर होना चाहिए, (2) एसीएफ आकार (कोरिलेटर सॉफ्टवेयर पर), जिसका समय के साथ निरंतर आकार होना चाहिए, और (3) फिटिंग पैरामीटर एक छोटे कमर के आकार और प्रति अणु एक उच्च गिनती दर (फोटॉन प्रति अणु प्रति सेकंड, आमतौर पर प्रति सेकंड प्रति अणु कुछ दसियों से सैकड़ों फोटॉन) देते हैं।
    नोट: एसीएफ का आयाम (जिसे जी (0) कहा जाता है) अणु की संख्या (यानी, फ्लोरोसेंट जांच की एकाग्रता) के विपरीत आनुपातिक है। कमर आकार अंशांकन के लिए, यह एक अच्छी गुणवत्ता नियंत्रण उम्मीदवार पैरामीटर है। इसलिए, जी (0) दिन-प्रतिदिन एक ही एकाग्रता के लिए समान होना चाहिए क्योंकि यह कमर के आकार और एकाग्रता को जोड़ता है। सेल माप के लिए, जैसा कि एफसीएस कम एकाग्रता के लिए अधिक सटीक है, जी (0) उचित पैरामीटर फिटिंग निष्कर्षण के लिए उच्च होना चाहिए।
  6. लैबव्यू सॉफ्टवेयर के साथ एसवीएफसीएस रोशनी /डिटेक्शन माइक्रोस्कोप पोर्ट सेट करें।
  7. एपीडी चालू करें।
  8. आईरिस को तब तक बंद करें जब तक कि सिग्नल न्यूनतम कमर के आकार को प्राप्त करने के लिए नीचे न गिर जाए, या इसे बड़े कमर के आकार के लिए बंद कर दें।
  9. सांख्यिकीय प्रजनन क्षमता में सुधार करने के लिए चयनित अवधि (अर्थात् एक रन) के कई एसीएफ रिकॉर्ड करें, आमतौर पर कोरिलेटर सॉफ़्टवेयर के साथ प्रत्येक 20 एस के लिए 10 रन चलते हैं।
  10. एपीडी बंद करें।
  11. आणविक समुच्चय के कारण मजबूत उतार-चढ़ाव के साथ रनों की जांच और त्यागने के लिए इगोर प्रो सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। इस चरण को मैन्युअल रूप से निष्पादित करें- उपयोगकर्ताओं को प्रशिक्षित करने के बाद यह उपयोगकर्ता-स्वतंत्र होना चाहिए।
  12. 3 डी प्रसार मॉडल के साथ बनाए रखा एसीएफ के औसत फिट करें।
  13. फिटिंग मापदंडों से औसत प्रसार समय Equation 2 निकालें और इसे ".txt" फ़ाइल में सहेजें (फ़ाइल प्रारूप इगोर प्रो सॉफ़्टवेयर द्वारा निर्धारित किया जाता है)।
  14. अणुओं की संख्या (एसीएफ से निकाले गए) से औसत तीव्रता (प्रतिदीप्ति ट्रेस से निकाले गए) को विभाजित करके प्रति अणु प्रति अणु (एक अच्छा प्रदर्शन संकेतक) गिनती-दर की जांच करें।
    नोट:: सुनिश्चित करें कि यह मान उच्च और एक ही अधिग्रहण पैरामीटर के लिए दिन-प्रतिदिन स्थिर है।
  15. 37 डिग्री सेल्सियस (डी) पर जलीय घोल में आरएच 6 जी के प्रसार गुणांक को जानना और Equation 2 (7.13 देखें), प्रयोगात्मक कमर के आकार की गणना करें : Equation 1।
  16. एफसीएस प्रसार कानून की साजिश रचने के लिए और एसवीएफसीएस डेटा अधिग्रहण की किसी भी नई प्रयोगात्मक श्रृंखला से पहले आवश्यक प्रत्येक कमर आकार संशोधन के लिए प्रक्रिया लागू करें।

8. कोशिकाओं पर एसवीएफसीएस डेटा अधिग्रहण

  1. 2 और 4 μW के बीच 488 एनएम बीम पावर को मापें और समायोजित करें फ्लोरोसेंट जांच की चमक और फोटोस्टेबिलिटी के आधार पर, फोटोब्लीचिंग को कम रखते हुए प्रति अणु उच्च गिनती दर (आमतौर पर प्रति अणु प्रति अणु कई हजार फोटॉन) की अनुमति देने के लिए इस शक्ति को अनुकूलित करें (यानी, लैबव्यू सॉफ्टवेयर पर एक स्थिर तीव्रता ट्रेस)।
  2. माप शुरू करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए संतुलित नमूने।
  3. लैबव्यू सॉफ्टवेयर के साथ एपीआई प्रतिदीप्ति रोशनी माइक्रोस्कोप सेट करें।
  4. एक उपयुक्त फ्लोरोसेंट जांच स्थान और (कम) प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता के साथ एक सेल चुनें।
    नोट: प्रतिदीप्ति जितना कम होगा, एफसीएस माप उतना ही बेहतर होगा (चरण 8.1 देखें)।
  5. लैबव्यू सॉफ्टवेयर के साथ एसवीएफसीएस रोशनी /डिटेक्शन माइक्रोस्कोप पोर्ट सेट करें।
  6. एपीडी चालू करें।
  7. लैबव्यू सॉफ़्टवेयर के साथ चयनित सेल का एक्सवाई-स्कैन करें।
  8. एक जेड-स्कैन करें और शीर्ष पर प्लाज्मा झिल्ली का चयन करके अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता पर कॉन्फोकल स्पॉट का पता लगाएं और डेटा अधिग्रहण शुरू करें। दो झिल्ली के बीच पृथक्करण को अधिकतम करने के लिए, अधिमानतः सेल के परमाणु क्षेत्र में स्कैन करें।
  9. कोरिलेटर सॉफ्टवेयर के साथ प्रत्येक 5 एस के लिए चलने वाले 20 रनों की एक श्रृंखला रिकॉर्ड करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि प्रत्येक रन की अवधि कम शोर के साथ एसीएफ प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है। लंबे अधिग्रहण फोटोब्लीचिंग या अप्रत्याशित पर्याप्त विविधताओं (जैसे, समुच्चय) के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। रनों की संख्या, उनकी अवधि और नमूनों के लिए श्रृंखला की संख्या को अनुकूलित करें, लेकिन सुनिश्चित करें कि वे प्रजनन क्षमता के लिए प्रयोगों के एक ही थोक के भीतर स्थिर रहें।
  10. एपीडी बंद करें।
  11. इगोर प्रो सॉफ़्टवेयर के साथ अप्रत्याशित रन छोड़ें।
  12. 2-प्रजाति 2 डी प्रसार मॉडल के साथ औसत एसीएफ फिट करें। लक्ष्य अणु के प्रसार व्यवहार के प्रकार के लिए इस मॉडल को अनुकूलित करें।
  13. फिटिंग पैरामीटर को पिछली फ़ाइल में सहेजें (चरण 7.13 देखें)।
  14. कम से कम 10 विभिन्न कोशिकाओं पर रिकॉर्डिंग की 10 से 15 श्रृंखला करें, और चरण 8.3 से 8.13 को पुन: उत्पन्न करें। जांचें कि प्राप्त एकल फ़ाइल में कमर के आकार की जानकारी और 10-15 रिकॉर्डिंग के फिटिंग पैरामीटर शामिल हैं।
  15. एक एकल प्रसार कानून स्थापित करने के लिए, 200 और 400 एनएम के बीच भिन्न कम से कम चार कमर के आकार का विश्लेषण करें। इस सीमा को विवर्तन ऑप्टिकल सीमा द्वारा परिभाषित किया गया है, लेकिन उद्देश्य- (संख्यात्मक एपर्चर) और लेजर (तरंग दैर्ध्य) -निर्भर है।
    नोट: कमर का आकार अंशांकन निरपेक्ष नहीं है और अनिश्चितता की कुछ डिग्री है, एक समर्पित MATLAB सॉफ्टवेयर28 एक्स और y त्रुटि के लिए लेखांकन (अर्थात् ω2 औरटी डी) प्रसार कानून फिट करने के लिए बनाया गया था।
  16. MATLAB सॉफ़्टवेयर 1 शुरू करें और कम से कम चार कमर आकार प्रयोगों के अनुरूप सभी ".txt" फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर का चयन करें।
  17. प्लॉट < डी> बनाम <ω2>, अर्थात् प्रसार कानून। दो प्रमुख मापदंडों को निकाला जा सकता है: वाई-अक्ष अवरोधन (टी0) और प्रभावी प्रसार गुणांक (डीईएफएफ, ढलान के विपरीत आनुपातिक)।

9. विभिन्न प्रयोगात्मक स्थिति तुलना के प्रसार कानून

नोट: यदि आवश्यक हो, तो विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए धारा 7 और 8 को पुन: पेश करें। एक समर्पित सॉफ्टवेयर (मैटलैब सॉफ्टवेयर 2) यह निर्धारित करने के लिए विकसित किया गया था कि ये प्रसार कानून टी 0 और डीईएफएफ मान28 के अनुसार समान हैं या नहीं। यह दो परिकल्पनाओं का परीक्षण करता है: दो मान अलग-अलग हैं, या दो मान झूठे अलार्म (पीएफए) की संभावना के ऊपर सेट थ्रेसहोल्ड पर अलग नहीं हैं। 5% (टी = 3.8) के एक मनमाने ढंग से पीएफए मान को दो मापदंडों (टी 0 या डीएफएफ) के बीच महत्व की ऊपरी सीमा माना जाता है, यह दर्शाता है कि केवल 5% संभावना है कि दो मान समान हैं।

  1. तुलना करने के लिए प्रत्येक स्थिति के विशेषता प्रसार कानून मानों वाली एक ".xls" फ़ाइल बनाएं (यानी, गैर-उपचारित (एनटी) के लिए टी 0, टी 0 त्रुटि, डीईएफएफ और डीईएफएफ त्रुटि युक्त एक फ़ाइल और तालिका के रूप में इलाज (सीओएएसई) शर्तें)।
    1. मैटलैब सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें 2.
    2. ".xls" फ़ाइल का चयन करें।
    3. उत्पन्न रंग-कोडित 2 डी प्लॉट का विश्लेषण करें, जहां टी 0 और डीईएफएफ सांख्यिकीय परीक्षणों को क्रमशः एक्स- और वाई-अक्षों पर प्लॉट किया जाना है (चित्रा 4)। टी जितना अधिक होगा, तुलनात्मक मूल्यों के बीच का अंतर उतना ही अधिक होगा।

10. कोलेस्ट्रॉल एकाग्रता माप

  1. सेल उपचार और लसीका
    1. अच्छी तरह से 6-अच्छी तरह से प्लेटों में सीओएस 7कोशिकाओं को बीज करें और कोशिकाओं × को प्लेट से संलग्न करने की अनुमति देने के लिए रात भर 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्ण डीएमईएम के2 एमएल में सेते हैं।
    2. संस्कृति माध्यम निकालें और फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ तीन बार कोशिकाओं को धो लें।
    3. एचईपीईएस बफर के 1 एमएल जोड़ें जिसमें (या नहीं, नियंत्रण के लिए) कोसे के 1 यू / एमएल, और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    4. कोसे के 0.1 यू / एमएल युक्त एचबीएसएस / एचईपीईएस के 1 एमएल के साथ माध्यम को बदलें, और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    5. समाधान निकालें और कोशिकाओं की कटाई।
    6. पीबीएस के साथ तीन बार कोशिकाओं को धो लें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
    7. बर्फ पर 30 मिनट के लिए रेडियोइम्यूनोप्रेसिपिटेशन परख बफर (25 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.4, 150 एमएम एनएसीएल, 1% एनपी 40, 10 एमएम, एमजीसीएल2, 1 एमएम एथिलीनडियामाइन टेट्राएसेटिक एसिड, 2% ग्लिसरॉल, प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल) के साथ कोशिकाओं को लाइसे।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10000 × ग्राम पर लाइसेट्स अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
  2. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार काम करने वाले समाधान का उपयोग करके संशोधित ब्रैडफोर्ड के प्रोटीन परख द्वारा प्रत्येक नमूने के लिए कुल प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें।
  3. कोलेस्ट्रॉल एकाग्रता माप
    1. एंजाइमेटिक रूप से कुल सेलुलर कोलेस्ट्रॉल स्तर निर्धारित करने के लिए, निर्माता की सिफारिशों के अनुसार उपयुक्त किट (जैसे, एम्पलेक्स रेड कोलेस्ट्रॉल परख किट) का उपयोग करें।
    2. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, एम्पलेक्स रेड अभिकर्मक/हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज/कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडेज/कोलेस्ट्रॉल एस्टरेज़ वर्किंग सॉल्यूशन के साथ 5 μg प्रोटीन युक्त नमूने को मिलाएं, और अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    3. 520 एनएम की उत्तेजना का उपयोग करके प्रतिदीप्ति को मापें, और माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 560-590 एनएम पर उत्सर्जन का पता लगाएं।
    4. अंतिम मूल्य से पृष्ठभूमि घटाएं, और एक मानक वक्र का उपयोग करके कोलेस्ट्रॉल एकाग्रता निर्धारित करें।
    5. प्रोटीन के प्रति μg कोलेस्ट्रॉल के एनजी में अंतिम कोलेस्ट्रॉल सामग्री की गणना करें।

Representative Results

हमने कॉस -7 कोशिकाओं (चित्रा 4, काले वर्गों) में व्यक्त थाइ 1-जीएफपी के लिए एक डीएल उत्पन्न किया। प्रसार कानून में एक सकारात्मक टी0 मान (19.47 एमएस ± 2 एमएस) है, यह दर्शाता है कि थाइ1-जीएफपी प्लाज्मा झिल्ली के नैनोडोमेन संरचनाओं में सीमित है। थाय 1-जीएफपी को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडेज उपचार के परिणामस्वरूप डीएल टी0 मान को 7.36 ± 1.34 एमएस (चित्रा 4, ग्रे वर्ग) में स्थानांतरित कर दिया गया। यह अवलोकन पुष्टि करता है कि थाइ1-जीएफपी कारावास की प्रकृति कोलेस्ट्रॉल सामग्री पर निर्भर करती है और लिपिड बेड़ा नैनोडोमेन से जुड़ी होती है। इन दो प्रसार कानूनों को ऊपर वर्णित सांख्यिकीय परीक्षण के अनुसार अलग-अलग दिखाया गया है (चरण 9.1.3 देखें) टी 0 और डीईएफएफ मानों के संदर्भ में। इसके अलावा, हमने गैर-उपचारित कॉस -7 कोशिकाओं में कुल सेलुलर कोलेस्ट्रॉल की एकाग्रता का आकलन किया, बनाम सीओएएस के साथ इलाज की गई कोशिकाएं। कुल कोलेस्ट्रॉल सामग्री में एक छोटी, लेकिन महत्वपूर्ण कमी कोओज़ उपचार (चित्रा 5) पर मनाया जाता है। चूंकि यह एंजाइम केवल प्लाज्मा झिल्ली के बाहरी पत्रक पर सुलभ कोलेस्ट्रॉल पूल पर कार्य करता है, इसलिए हम मानते हैं कि कोलेस्ट्रॉल में देखी गई कमी केवल प्लाज्मा झिल्ली से जुड़ी होती है और इसके परिणामस्वरूप लिपिड बेड़ा नैनोडोमेन का अस्थिरीकरण होता है।

Figure 1
चित्रा 1: झिल्ली संगठन के विभिन्न रूपों के लिए स्पॉट-भिन्नता एफसीएस द्वारा स्थापित नकली प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) प्रसार कानून। (ऊपरी पैनल) झिल्ली संगठन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व- (ए) मुक्त प्रसार, (बी) जालवर्क बाधाएं, और (सी) जाल / डोमेन कारावास - एक एकल अणु (लाल) के लिए खींचे गए प्रक्षेपवक्र के साथ। नीले वृत्त झिल्ली के प्रतिच्छेदन और कमर ω के लेजर बीम को दर्शाते हैं। (निचले पैनल) एफसीएस प्रसार कानून प्रसार समय की साजिश रचकर दर्शाया गया है टीघ वर्ग त्रिज्या के एक समारोह के रूप में ω2. प्रसार कानून प्रक्षेपण (हरी धराशायी रेखा) मुक्त प्रसार के मामले में (ए) मूल (टी 0 = 0) पर समय अक्ष को रोकता है; (बी) नकारात्मक अक्ष (टी 0 < 0) में जब जालवर्क बाधाएं होती हैं, या (सी) सकारात्मक अक्ष में (टी 0 > 0) जब जाल और डोमेन (लिपिड राफ्ट) होते हैं। डी ब्राउनियन गति के लिए पार्श्व प्रसार गुणांक है; डीईएफएफ, प्रभावी प्रसार गुणांक; डीमाइक्रो, मेषवर्क जाल के अंदर सूक्ष्म प्रसार गुणांक; डीमें, डोमेन के अंदर प्रसार गुणांक; डीआउट, डोमेन के बाहर प्रसार गुणांक; एल, एक वर्ग डोमेन के पक्ष का आकार; और आरडी, एक परिपत्र डोमेन की त्रिज्या। इस आंकड़े को हे और मार्गुएट 6 से संशोधित किया गयाहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एसवीएफसीएस हार्डवेयर नियंत्रण का योजनाबद्ध दृश्य। कंप्यूटर विभिन्न संचार प्रोटोकॉल के माध्यम से सभी उपकरणों को नियंत्रित करता है: धारावाहिक (माइक्रोस्कोप, बाहरी शटर), यूएसबी (एक्सवाईजेड पीजोइलेक्ट्रिक चरण, कोरिलेटर), और पीसीआई (अधिग्रहण बोर्ड)। डीएक्यू: डेटा अधिग्रहण बोर्ड, एपीडी: हिमस्खलन फोटोडायोड, एसपीसीएम: एकल-फोटॉन गिनती मॉड्यूल, डीओ: डिजिटल आउटपुट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एसवीएफसीएस सेटअप के उत्तेजना और उत्सर्जन ऑप्टिकल पथ का योजनाबद्ध दृश्य। एसवीएफसीएस सेटअप में चार मॉड्यूल होते हैं: (1) एक फाइबर वाले 488 एनएम लेजर का आउटपुट कोलिमेट किया जाता है, (2) आधा-तरंग प्लेट और ध्रुवीकरण बीम-स्प्लिटर का संयोजन ऑप्टिकल पावर सेट करता है, (3) लेजर बीम ट्यूब-लेंस मुक्त मोटर चालित माइक्रोस्कोप के माध्यम से यात्रा करने के बाद नमूने पर केंद्रित होता है, और (4) प्रतिदीप्ति का पता लगाया जाता है एक हिमस्खलन फोटोडायोड पर एक कंफोकल-जैसे पता लगाने के पथ के माध्यम से युग्मित जो एक हार्डवेयर कोरिलेटर को सिग्नल देता है। सादगी प्रणाली को इसकी संवेदनशीलता, मजबूती और उपयोग में आसानी देती है ( पूरक सामग्री में व्यापक रूप से टिप्पणी की गई)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: सीओएस -7 में व्यक्त थाइ 1-जीएफपी के प्रसार विश्लेषण से उत्पन्न एसवीएफसीएस प्रसार कानून। उपचार के बिना कॉस -7 कोशिकाओं के एसवीएफसीएस प्रसार कानून (एनटी, काले वर्ग) और कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडेज उपचार (सीओएएस, ग्रे सर्कल) के बाद। ग्राफ में सम्मिलित दो प्रस्तुत एसवीएफसीएस प्रसार कानूनों (मेलफर्ट एट अल 28 के अनुसार) के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर के सांख्यिकीय परीक्षण का प्रतिनिधित्व करता है। परीक्षण मूल्य (टी) 3.8 पर सेट थ्रेसहोल्ड से ऊपर होना चाहिए जब दोनों प्रसार कानून अलग-अलग होते हैं। यह जितना अधिक होगा, प्रसार कानूनों के बीच का अंतर उतना ही अधिक होगा। टी का मान रंग-कोडित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: कॉस -7 कोशिकाओं में कुल कोलेस्ट्रॉल सामग्री की तुलना। सीओएस -7 कोशिकाओं को या तो गैर-इलाज (एनटी) किया गया था या 1 घंटे के लिए कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडेज (सीओएएस) के 1 यू / डेटा ट्रिप्लिकेट में एक प्रयोग के एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है। सांख्यिकीय अंतर (α = 0.05) का आकलन करने के लिए एक दो-पूंछ, अप्रकाशित टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सामग्री की तालिका: एसवीएफसीएस सेटअप के लिए आवश्यक ऑप्टिकल तत्वों की सूची।

अनुपूरक सामग्री: यह दस्तावेज़ स्क्रैच से एसवीएफसीएस सेटअप के निर्माण का वर्णन करता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहां, हमने एक मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर एसवीएफसीएस मॉड्यूल के कार्यान्वयन का वर्णन किया है, एफसीएस प्रसार कानून विश्लेषण के लिए जीवित कोशिकाओं में प्लाज्मा झिल्ली संगठन की गतिशीलता को समझने के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक दृष्टिकोण। वैचारिक रूप से, एसवीएफसीएस एक सरल सिद्धांत पर आधारित है: रोशनी क्षेत्र23 के आकार को बदलते हुए समय डोमेन में प्रतिदीप्ति का सहसंबंध माप। यह रणनीति सूक्ष्म माप से नैनोस्कोपिक जानकारी को कम करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, जो स्थिर अवस्था 25 और शारीरिक प्रक्रियाओं 30,31,32,33 में प्लाज्मा झिल्ली संगठन में योगदान देने वाले मुख्य भौतिक रासायनिक तत्वों को समझने में मदद करती है। कुल मिलाकर, ये एसवीएफसीएस विश्लेषण विभिन्न सेल प्रकारों में लिपिड-निर्भर नैनोडोमेन के अस्तित्व और विभिन्न सिग्नलिंग घटनाओं को ट्यून करने में उनके प्रत्यक्ष निहितार्थ को स्पष्ट रूप से प्रदर्शित करते हैं।

इस ढांचे के भीतर, फोटॉन बजट को अनुकूलित करने और ऑप्टिकल विपथन को कम करने के लिए एसवीएफसीएस सेटअप का निर्माण करते समय कुछ ऑप्टिकल पहलुओं पर विचार करने की आवश्यकता है। इस प्रकार, हम एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करने की सलाह देते हैं जिसमें से एसवीएफसीएस माप किए जाने पर ट्यूब लेंस को हटाया जा सकता है। इसके अलावा, एक एकल आईरिस एसवीएफसीएस सेटअप में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है: यह उद्देश्य के पीछे के एपर्चर पर बीम आकार को बदलता है, इस प्रकार सीधे प्रभावी कमर के आकार (यानी, प्रभावी उत्तेजना मात्रा) को बदलता है। बीम व्यास को सबसे छोटे कमर आकार34 प्राप्त करने के लिए उद्देश्य वापस पुतली को फिट करना चाहिए। यह विकल्प, जो कमर के आकार को ट्यून करने में मदद करता है, फोटॉन बजट का अनुकूलन सुनिश्चित करता है और इसे लागू करना आसान है। अंत में, प्रकाश पथ के साथ ऑप्टिकल भागों की एक न्यूनतम संख्या का उपयोग किया जाता है; सिस्टम जितना कम जटिल होगा, फोटॉन उतने ही कम खो जाएंगे। ये सभी विकल्प एसवीएफसीएस प्रयोगों की मजबूती में काफी सुधार करते हैं।

प्रोटोकॉल के बारे में ही, कुछ महत्वपूर्ण कदमों पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे महत्वपूर्ण ऑप्टिकल पथों का एक उपयुक्त संरेखण है जो सफल एसवीएफसीएस माप (प्रोटोकॉल, अनुभाग 2) के लिए महत्वपूर्ण है। यह 2 एनएम आरएच 6 जी समाधान से प्रतिदीप्ति संकेत का विश्लेषण करके जांचना आसान है, जो 300 μW लेजर रोशनी के तहत ~ 200 किलोहर्ट्ज़ होना चाहिए। सभी इरिस खोले जाने चाहिए, और एसीएफ में एक महत्वपूर्ण आयाम होना चाहिए (आमतौर पर जी0 ~ 1.5–2.0)। एक और महत्वपूर्ण बिंदु कोशिकाओं और एसवीएफसीएस विश्लेषण (प्रोटोकॉल, धारा 4-8) के लिए उनकी तैयारी की चिंता करता है। उनके घनत्व को अनुकूलित किया जाना चाहिए ताकि देखी जाने वाली पृथक कोशिकाएं विश्लेषण के लिए उपलब्ध हों। गैर-अनुयायी कोशिकाओं को पॉली-एल-लाइसिन समाधान का उपयोग करके एक कक्षीय कवरग्लास पर स्थिर किया जाना चाहिए। सेल लेबलिंग से प्रतिदीप्ति संकेत बहुत मजबूत नहीं होना चाहिए, या इसके परिणामस्वरूप बहुत सपाट एसीएफ होंगे जो फिट करना मुश्किल है, और फिट पैरामीटर एक महत्वपूर्ण त्रुटि के साथ बोझ हैं। इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं में गैर-सजातीय लेबलिंग और प्रतिदीप्ति समुच्चय एसवीएफसीएस माप की व्याख्या करना बेहद मुश्किल बनाते हैं। अंत में, कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडेज उपचार सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करता है, और एसवीएफसीएस विश्लेषण उपचार के एक घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए। ऊपरी प्लाज्मा झिल्ली से प्रतिदीप्ति में उतार-चढ़ाव को रिकॉर्ड करना भी बेहतर है क्योंकि यह समर्थन से जुड़ा नहीं है, और समर्थन के साथ शारीरिक बातचीत के कारण अणुओं के बाधित प्रसार का कोई खतरा नहीं है।

पता लगाने की मात्रा को समायोजित करने के लिए तौर-तरीकों की विविधता के कारण विभिन्न दृष्टिकोणों में इसके उपयोग के लिए एसवीएफसीएस तकनीक में पर्याप्त प्रगति हुई है, जिससे जीवित कोशिकाओं में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करना संभव हो गया है। उत्तेजना मात्रा के आकार को समायोजित करने का एक विकल्प एक चर बीम विस्तारक35 का उपयोग करना है। जेड दिशा36 के साथ प्लाज्मा झिल्ली के अवरोधन से फ्लोरोसेंट सिग्नल रिकॉर्ड करके रोशनी क्षेत्र के आकार को संशोधित करना भी संभव है। यह एक मानक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर किया जा सकता है जिसके लिए प्रसार कानून37,38 प्राप्त करने के लिए एक सैद्धांतिक ढांचा विकसित किया गया है।

यद्यपि एसवीएफसीएस विधि स्थानिक-लौकिक संकल्प प्रदान करती है, जो प्लाज्मा झिल्ली के असजातीय पार्श्व संगठन के लक्षण वर्णन के लिए आवश्यक है, कारावास के ज्यामितीय तरीके पारस्परिक रूप से अनन्य नहीं हैं। एक दिशा या दूसरे में टी 0 का विचलन विशेष रूप से कारावास25 के एक प्रमुख मोड को प्रकट करता है। इसके अलावा, वर्तमान एसवीएफसीएस विधि की एक और महत्वपूर्ण सीमा शास्त्रीय ऑप्टिकल विवर्तन सीमा (~ 200 एनएम) से उत्पन्न होती है। यह निर्विवाद रूप से कोशिका प्लाज्मा झिल्ली के भीतर अणुओं को सीमित करने वाले डोमेन से अधिक है। इसलिए, कारावास का विश्लेषण टी 0 मान से अनुमान लगाया जाता है, जो प्रसार कानून से एक्सट्रपलेशन किया जाता है।

वैकल्पिक तरीकों को लागू कर इस कमी को दूर किया गया है। प्रारंभ में, नैनोएपर्चर के साथ ड्रिल की गई धातु फिल्मों का उपयोग करके एक बहुत छोटे झिल्ली क्षेत्र को रोशन करने की संभावना की पेशकश की गई (यानी, 75 और 250 एनएम के बीच भिन्न त्रिज्या के एकल नैनोमेट्रिक एपर्चर की ऑप्टिकल विवर्तन सीमा से नीचे)39। पृथक डोमेन संगठन के लिए सैद्धांतिक प्रसार कानून से भविष्यवाणी की गई संक्रमण शासन इस प्रकार रिपोर्ट की गई थी, और इसने नैनोमेट्रिक झिल्ली विषमताओं के विशिष्ट आकार के शोधन और लिपिड-निर्भर नैनोडोमेन39 द्वारा कब्जा किए गए सतह क्षेत्र के मात्रात्मक अनुमान की अनुमति दी। वैकल्पिक रूप से, नैनोमेट्रिक रोशनी को निकट-क्षेत्र स्कैनिंग ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी40 या प्लानर ऑप्टिकल नैनोएंटेनास41 का उपयोग करके भी विकसित किया गया है। हाल ही में, उत्तेजित उत्सर्जन की कमी (एसटीईडी) और एफसीएस के संयोजन ने बहुत अधिक स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के साथ प्रसार कानून का दस्तावेजीकरण करने के लिए एक शक्तिशाली और संवेदनशील उपकरण प्रदान किया है। यह एसटीईडी-एफसीएस थोड़े समय के भीतर होने वाले नैनोस्केल पर आणविक प्रसार विशेषताओं तक पहुंच प्रदान करता है, जिससे प्लाज्मा झिल्ली42,43 पर लिपिड जांच के गतिशील संगठन के अध्ययन की अनुमति मिलती है। हालांकि, एसटीईडी प्रक्रिया में प्रतिदीप्ति का अधूरा दमन एफसीएस में ऑटो-सहसंबंध घटता के विश्लेषण को चुनौती देता है।

इस कठिनाई को दूर करने के लिए एक नया फिटिंग मॉडल विकसित किया गया है, प्रसार समय की सटीकता में सुधार और औसत अणु संख्या माप44. अंत में, प्लाज्मा झिल्ली पर धीमी आणविक प्रसार के लिए, एसवीएफसीएस सिद्धांत को छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी45 द्वारा दर्ज डेटा पर लागू किया जा सकता है। हाल ही में, यह प्रदर्शित किया गया है कि इमेजिंग कुल आंतरिक प्रतिबिंब-एफसीएस (आईटीआईआर-एफसीएस) के साथ परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) का संयोजन प्लाज्मा झिल्ली पर आणविक प्रसार में बाधा डालने वाले तंत्र की प्रकृति के शोधन में योगदान देता है, विशेष रूप से नैनोडोमेन46 के उच्च घनत्व के कारण परकोलेशन थ्रेशोल्ड झिल्ली कॉन्फ़िगरेशन के पास।

अंत में, एसवीएफसीएस द्वारा प्रसार कानून की स्थापना ने गतिशील सामूहिक लिपिड और झिल्ली प्रोटीन के संघों द्वारा बनाई गई स्थानीय विषमता का अनुमान लगाने के लिए प्रयोगात्मक साक्ष्य प्रदान किए हैं। जैसा कि वोलैंड और सहकर्मियों46 द्वारा कहा गया है, "एफसीएस प्रसार कानून विश्लेषण गतिशील जानकारी से संकल्प सीमा से नीचे संरचनात्मक और संगठनात्मक सुविधाओं का अनुमान लगाने के लिए एक मूल्यवान उपकरण बना हुआ है"। फिर भी, हमें प्रसार कानून की व्याख्या को परिष्कृत करने के लिए नए मॉडल विकसित करने की आवश्यकता है जो प्लाज्मा झिल्ली पर होने वाली आणविक घटनाओं की गतिशीलता की बेहतर समझ की अनुमति देनी चाहिए।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

एसबी, एसएम और डीएम को सीएनआरएस, इंसर्म और ऐक्स-मार्सिले विश्वविद्यालय से संस्थागत वित्त पोषण और फ्रेंच नेशनल रिसर्च एजेंसी (एएनआर -17-सीई 15-0032-01 और एएनआर -18-सीई 15-0021-02) और फ्रांसीसी "इन्वेस्टिसमेंट डी'एवेनिर" (एएनआर -10-आईएनबीएस -04 फ्रांस-बायोइमेजिंग, एएनआर -11) से कार्यक्रम अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। किलोवाट जैव प्रौद्योगिकी और नैनो टेक्नोलॉजी के क्षेत्र में अंतःविषय पर्यावरण डॉक्टरेट अध्ययन ों का एक कार्यक्रम "बायोटेक्नान" स्वीकार करता है। ईबी परियोजना संख्या 2016/21/डी/एनजेड1/00285 के तहत पोलैंड के राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र (एनसीएन) के साथ-साथ फ्रांसीसी सरकार और पोलैंड में फ्रांस के दूतावास की वित्तीय सहायता को स्वीकार करता है। एमओ पोलिश विकास मंत्रालय (सीबीआर पीओआईआर.02.01.00-00-0159/15-00/19) और नेशनल सेंटर फॉर रिसर्च एंड डेवलपमेंट (इनोकेम पीओआईआर.01.02.00-00-0064/17) से वित्तीय सहायता को स्वीकार करता है। टीटी परियोजना संख्या 2016/21/बी/एनजेड3/00343 के तहत पोलैंड के राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र (एनसीएन) और व्रोकला जैव प्रौद्योगिकी केंद्र (जीओएन) से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aligment tool Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings Thorlabs SPW602
Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM) Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode Excelitas SPCM-AQRH-15
BNC 50 Ω plug to 50 Ω plug lead 2 m RS Components 742-4315
Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 Ω With connector, 1.22 m, RoHS2 RS Components 885-8172
Tee 50Ω RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 → 1GHz RS Components 546-4948
Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E – French Extension Lead, 230 V RS Components 768-5500
Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C RS Components 452-8394
Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter RS Components 792-4079
Fluorescence filtering 535/70 ET Bandpass, AOI 0° Chroma Diameter 25 mm AHF filter F47-539
Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45° Chroma 25.5 x 36 x 1 mm AHF filter F43-088
496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0° Chroma Diameter 25 AHF filter F37-496
Hardware correlator 80 MHz Digital Correlator Correlator.com Flex02-12D
Laser LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW Lasos BLD-XT 488100
Laser safety High-Performance Black Masking Tape, 1" x 180' (25 mm x 55 m) Roll Thorlabs T743-2.0
Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets Thorlabs MC-5
Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission Thorlabs LG3B
Microscope Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope
Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters		 Carl Zeiss
C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS
(D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR		 Carl Zeiss 421767-9971-711
Adapter W0.8 / M27x0.75 H "5" Carl Zeiss 000000-1698-345
Middle ring W0.8 - W0.8 H "5" Carl Zeiss 000000-1698-347
Optical path D25.4mm Mirror, Protected Silver Thorlabs PF10-03-P01
D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat Thorlabs AC254-060-A
D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat Thorlabs AC254-035-A
25 µm mounted pinhole Thorlabs P25S I
25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm Thorlabs WPH10M-488 (HWP)
20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm Thorlabs PBS201
Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID Thorlabs RSP1/M
52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount Thorlabs KM100B/M
Adjustable Prism Clamp Thorlabs PM3/M
Beam block - active area 19 mm x 38 mm Thorlabs LB1/M
Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture Thorlabs ID25/M
Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount Thorlabs KM100CL
1" Optic Holder, M4 Tap Thorlabs MFF101/M
1" Stackable Lens Tube Thorlabs SM1L03
Stackable Lens Mount for 1" optic-usable depth ½ Thorlabs SM1L05
Stackable Lens Mount For 1"Optic-usable Depth 2" Thorlabs SM1L20
Small Optical Rails 600mm, metric Thorlabs RLA600/M
Small Optical Rails 75mm, metric Thorlabs RLA075/M
Small Optical Rails 150mm, metric Thorlabs RLA150/M
Rail Carrier, Counterbored Hole 1"x 1" Thorlabs RC1
Rail Carrier, Perpendicular Dovetail Thorlabs RC3
High Precision Translating Lens Mount for 1 inch Thorlabs LM1XY/M
½ " (12mm) Dovetail Translation Stage Thorlabs DT12/M
Rail Clamps Thorlabs CL6
Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102) Thorlabs PT3/M
Black Rubberized Fabric Thorlabs BK5
Ball Driver kit/ 6 tools Thorlabs BD-KIT/M
Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads Thorlabs AP6M4M
Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack Thorlabs BA1S/M-P5
Lens Mount for 25.4mm optic Thorlabs LMR1/M
SM1 FC/APC Adapter Thorlabs SM1FCA
Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics Thorlabs KM100
Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW Thorlabs S120C
12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew,
L=50 mm, 5 Pack		 Thorlabs PH50/M-P5
Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm Thorlabs PH20/M
12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole, 5 Pack		 Thorlabs TR50/M-P5
12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole, 5 Pack		 Thorlabs TR75/M-P5
USB Power and Energy Meter Interface Thorlabs PM100USB
12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole		 Thorlabs TR30/M
12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole		 Thorlabs TR20/M
750 mm long Structural Rail (detection box) Thorlabs XE25L750/M
350 mm long Structural Rail (detection box) Thorlabs XE25L350/M
Quick Corner Cube for 25 mm Rails Thorlabs XE25W3
Right-Angle Bracket for 25 mm Rails Thorlabs XE25A90
Black posterboard 20" x 30" (508 mm x 762 mm), 1/16" (1.6 mm) Thick, 5 Sheets Thorlabs TB5
Hinge for 25 mm Rail Enclosures Thorlabs XE25H
Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures Thorlabs XE25LS
M4 Cap Screw Kit Thorlabs HW-KIT1/M
M6 Cap Screw Kit and Hardware kit Thorlabs HW-KIT2/M
Table Clamp, L-Shape, 5 Pack Thorlabs CL5-P5
SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (Ø0.8 - Ø12 mm) Thorlabs SM1D12D
Ø1" SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/Ø1 mm Hole Thorlabs DG10-1500-H1-MD
Honeycomb Optical Table Top, Standa Standa 1HB10-15-12
Optical Table support, Standa Standa 1TS05-12-06-AR
Sample nano-positionning Precision XYZ Nanopositioning Physik Instrumente PI P527-3.CD
Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V
Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors,		 Physik Instrumente PI E727-3.CD
Temperature chamber Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK Digital Pixel
Dual Channel Microprocessor Temperature Controller Digital Pixel DP_MTC_2000_DUO
Two Vibration Free Heater Modules Digital Pixel DP_150_VF
PT100 Temperature Sensor Digital Pixel DP_P100_TS
Biological Reagents and Materials
Cell culture and transfection Cos7 cells ATCC® CRL-1651™
8- well Lab-Tek chambers Thermo Fisher Scientific 155411PK
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 16000044
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
PBS buffer Thermo Fisher Scientific 14190144
PenStrep Thermo Fisher Scientific 15140122
PolyJet Transfection Reagent SignaGen Laboratories SL100688
Cholesterol content measurement Amplex Red Cholesterol Assay Kit Thermo Fisher Scientific A12216
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 87786
Phosphatase Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 78420
ROTI Nanoquant Working Solution Roth K880
GloMax Discover Microplate Reader Promega GM3000
svFCS measurements HBSS buffer Thermo Fisher Scientific 14025092
Hepes buffer Thermo Fisher Scientific 15630080
Cholesterol oxidase Sigma-Aldrich C8868
Rhodamine 6G Sigma-Aldrich 83697-1G

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References

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