ביו-ריאקטור רב-שלבי להערכת היכולת הדלקתית וההתחדשותית של ביו-חומרים תחת זרימה ומתיחות

Summary

מטרת הפרוטוקול הזה היא לבצע תרבות משותפת דינמית של מקרופאגים אנושיים ומיופיברובלסטים בפיגומי אלקטרו-ספון צינוריים כדי לחקור התחדשות רקמות מונחית חומרים, באמצעות ביו-ריאה המאפשרת ניתוק של לחץ גיסת ומתיחות מחזוריות.

Abstract

השימוש בביו-חומרים הניתנים למיחזור כדי לגרום להתחדשות ישירות בגוף הוא אסטרטגיה אטרקטיבית מנקודת מבט תרגומית. חומרים כאלה גורמים לתגובה דלקתית עם ההשתלה, שהיא המניע לספיגה מחדש של החומר והתחדשות של רקמה חדשה. אסטרטגיה זו, הידועה גם בשם הנדסת רקמות situ, הוא נרדף כדי להשיג תחליפי לב וכלי דם כגון שתלים וסקולריים מהונדסים רקמות. הן התהליכים הדלקתיים והן התהליכים המתחדשים נקבעים על ידי רמזים ביומכניים מקומיים על הפיגומים (כלומר, מתח מתיחה וגיסת). כאן, אנו מתארים בפירוט את השימוש בביורומטר שפותח בהתאמה אישית המאפשר באופן ייחודי ניתוק של מתח מתיחה וגימה על פיגום צינורי. זה מאפשר הערכה שיטתית ומתוקננת של היכולת הדלקתית וההתחדשותית של פיגומים צינוריים בהשפעת עומסים מכניים מבוקרים היטב, אשר אנו מדגימים על בסיס ניסוי דינמי של תרבות משותפת באמצעות מקרופאגים אנושיים ומיופיברובלסטים. הצעדים המעשיים העיקריים בגישה זו – בנייתו והקמתו של הביו-רהקטור, הכנת הפיגומים וזריעת התאים, היישום והתחזוקה של זרימת המתיחה וההגשה וקצירת הדגימה לניתוח – נדונים בפירוט.

Introduction

הנדסת רקמות לב וכלי דם (TE) נרדפת כאפשרות טיפול חלופית לתותבות הלב וכלי הדם הקבועות הנמצאות בשימוש כיום (למשל, שתלי כלי דם, תחליפי שסתום לב), שהן תת-אופטימליות עבור קבוצות גדולות של^{חולים 1,2,3,4}. יישומים מבוקשים רבים כוללים שתלים וסקולריים מהונדסים רקמה (TEVGs)^5,6 ושסתומי לב (TEHVs)^7,8. לרוב, מתודולוגיות TE לב וכלי דם לעשות שימוש ביו-חומרים הניתנים למיחזור (טבעי או סינתטי) המשמשים פיגום מאלף עבור הרקמה החדשה להיווצר. היווצרות של רקמה חדשה יכולה להיות מהונדסת לחלוטין במבחנה, על ידי זריעת הפיגומים עם תאים ו culturing ב bioreactor לפני ההשתלה (במבחנה TE)^9,10,11, או ישירות במקום, שבו הפיגומים הסינתטי מושתל ללא פולחן מראש על מנת לגרום להיווצרות של רקמה חדשה ישירות בגוף (במקום TE)^12,13,14. הן במבחנה והן בגישות TE לב וכלי דם במקום, התחדשות תפקודית מוצלחת תלויה באופן דומיננטי הן בתגובה החיסונית המארחת למבנה המושתל והן בטעינה ביומכנית מתאימה.

החשיבות של טעינה ביומכנית עבור TE לב וכלי דם הוא מוכר היטב¹⁵. במקרה של שתלים לב וכלי דם, התאים המאכלסים את הפיגומים חשופים למתיחות מחזוריות וללחצי גיסת המתעוררים כתוצאה מהסביבה המודינמית. מחקרים רבים דיווחו על ההשפעה הממריצת של מתיחה (מחזורית) על היווצרות רכיבי מטריצה, כגון קולגן^16,17,18,19, גליקוזאמינוגליקאנים (GAGs)²⁰, ואלסטין^21,22, על ידי סוגי תאים שונים. לדוגמה, הואנג ואח ‘ הוכיח כי מתיחה biaxial העלה את התצהיר ואת הארגון של קולגן ואלסטין במבחנה TEVGs באמצעות bioreactor כלי דם²³. בעוד הדגש טמון בדרך כלל על מתיחה כמו עומס דומיננטי, מחקרים אלה לעתים קרובות לעשות שימוש ביו-קטרקטורים מונחה זרימה שבו המדגם חשוף גם לזרימת גיסת. למרות מעט יחסית ידוע על ההשפעה המבודדת של לחצי גיזה על היווצרות רקמות ודלקת בתלת ממד, כמה נתונים זמינים. לדוגמה, Hinderer et al. ו Eoh ואח ‘ הוכיח כי זרימת הגלד, בנוסף מיקרו פיגומים 3D, היה חשוב להיווצרות של אלסטין בוגר על ידי תאי שריר חלקים כלי דם אנושיים במערכת מודל במבחנה^24,25. בסך הכל, ממצאים אלה ממחישים את הרלוונטיות של מתיחות מחזוריות ומתח גיסת עבור TE לב וכלי דם.

גורם חשוב נוסף להצלחה או לכישלון של שתלי TE הוא התגובה החיסונית של הפונדקאי לשתל המושתל²⁶. זה חשוב במיוחד עבור חומרים מונעים באסטרטגיות TE situ, אשר למעשה מסתמכים על התגובה הדלקתית החריפה לפיגומים כדי להתחיל את התהליכים הבאים של זרם הסלולר היווצרות רקמות אנדוגני ושיפוץ²⁷. המקרופאג ‘ הוא יוזם קריטי של^{התחדשות רקמות}פונקציונלית, אשר הוכח על ידי מחקרים מרובים 28^,29,30. מקביל לריפוי פצעים, התחדשות הרקמה נשלטת על ידי איתות פרקרינית בין מקרופאגים ותאים המייצרים רקמות כגון פיברובלסטים ומיופיברובלסטים^31,32,33. בנוסף לתיאום תצהיר רקמות חדש, מקרופאגים מעורבים בספיגה פעילה של חומר פיגומים^{זרים 34,35}. ככזה, תגובת המקרופאג’ במבחנה לביו-חומרים זוהתה כפרמטר חזוי להצלחת in vivo של שתלים^36,37,38.

תגובת המקרופאג’ לפיגומים מושתלים תלויה בתכונות עיצוב פיגומים כגון הרכב חומרים ומיקרו מבנה^35,39,40. בנוסף לתכונות הפיגומים, תגובת המקרופאג’ לפיגומים וההצלבה שלהם עם מיופיברובלסטים מושפעת גם מעומסים המודינמיים. לדוגמה, מתיחה מחזורית הוצגה כמאפנן חשוב של פנוטיפ מקרופאג^{’41,42,43,44} והפרשת ציטוקינים^43,44,45,46 בפיגומי אלקטרוזופון תלת-ממדיים. באמצעות מערכת תרבית משותפת של מקרופאגים ותאי שריר חלקים וסקולריים, Battiston et al. הוכיח כי נוכחות של מקרופאגים הובילה לרמות גבוהות יותר של אלסטין ו GAGs וכי רמות מתונות של מתיחה מחזורית (1.07-1.10) עוררו את התצהיר של קולגן אני ואלסטין⁴⁷. בעבודות קודמות, הוכחנו כי מתח גיזה הוא דטרמיננטה חשובה לגיוס מונוציטים לתוך פיגומי אלקטרו-ספון תלת מימדיים^48,49, וכי הן מתח גיסת ומתיחה מחזורית משפיעות על האיתות הפרקריני בין מונוציטים אנושיים ותאי סטרומה מזנכימליים⁵⁰. Fahy et al. הראה כי זרימת הגלד הגדילה את הפרשת ציטוקינים פרו דלקתיים על ידי מונוציטים אנושיים⁵¹.

יחד, הראיות לעיל מראות כי הבנה נאותה ושליטה על עומסים hemodynamic הוא חיוני עבור TE לב וכלי דם, וכי חשוב לשקול את התגובה הדלקתית כדי להשיג זאת. ביו-רקטורים רבים תוארו בעבר עבור במבחנה^{52,53,54,55,56,57,58} או ex vivo^59,60,61 תרבות של רקמות לב וכלי דם. עם זאת, כל המערכות הללו נועדו לחקות את תנאי הטעינה ההמודינמית הפיזיולוגיים ככל האפשר. אמנם זה בעל ערך רב לצורך יצירת רקמות לב וכלי דם במבחנה או שמירה על תרביות ex vivo, מערכות כאלה אינן מאפשרות מחקרים שיטתיים לתוך ההשפעות האישיות של רמזים בודדים. הסיבה לכך היא היישום של מתח מחזורי ומתח גיסת אלה מונע על ידי אותה זרימה בלחץ, אשר באופן מהותי מקשר אותם. בעוד מיקרו-מערכות המאפשרות מניפולציה מכנית רב-מדומה מדויקת תוארו עבור מצעים דו-ממדיים⁶² או 3D הגדרות הידרוג’ל^63,64, הגדרות כאלה אינן מאפשרות שילוב של פיגומים ביו-חומריים תלת-חומריים אלסטומרים.

כאן, אנו מציגים את היישום של מערכת bioreactor צינורית המאפשרת באופן ייחודי ניתוק של מתח גיסת ומתיחה מחזורית ומסייעת לחקור באופן מכני את ההשפעות האישיות והמשולבים שלהם. מערכת זו מאפשרת בדיקה של מגוון רחב של שתלי כלי דם מהונדסים רקמה (למשל, מקור סינתטי או טבעי, מיקרו-ארכיטקטורה שונה, נקבוביות שונות). כדי לנתק ביעילות את היישום של מתח הגיה ומתיחה, מושגי המפתח שבהם משתמש הביו-ריאקטור הם (1) הפרדה של השליטה בלחץ הגיסה ומתיחה באמצעות מערכות משאבה נפרדות ו-(2) גירוי של הפיגומים באופן ‘מבפנים החוצה’ עם ממדים מונעים חישובית. הזרימה מוחלת על פני השטח החיצוניים של הפיגומים הצינוריים באמצעות משאבת זרימה, ואילו מתיחה היקפית של הפיגומים מושרה על ידי הרחבת צינור סיליקון שעליו מותקן הפיגומים באמצעות משאבת מאמץ נפרדת. הממדים של צינור הסיליקון וצינור הזכוכית המכיל את המבנה נבחרים בקפידה ומאומתים באמצעות סימולציות דינמיקה של נוזלים חישוביים, כדי להבטיח כי לחץ הגיזה על הפיגומים (עקב זרימה) והמתיחת ההיקפית (עקב הרחבת הצינור) אינם משפיעים באופן משמעותי זה על זה. לעיצוב מבפנים החוצה זה יש כמה רציונלים מעשיים. אם המתיחה מוחלת על ידי לחץ הנוזלים הזוהרים (בדומה לטעינה פיזיולוגית), היא דורשת מטבעה שעיצוב המדגם יהיה נטול דליפות. בנוסף, הלחץ הנדרש כדי למתוח את המדגם ייקבע לחלוטין על ידי נוקשות המדגם, אשר עשוי להשתנות בין דגימות בתוך מדגם לאורך זמן, מה שמקשה על השליטה במתיחה. ביו-ריקטור זה מרכיב את השתל המהונדס על הרקמה סביב צינור סיליקון ומאפשר ליישום מתח גזיזת קיר (WSS) על הקיר החיצוני של השתל ולוחץ על השתל מבפנים. בדרך זו, תנאי טעינה שווים בין דגימות ובתוך דגימות לאורך זמן ניתן להבטיח, יתר על כן, הדגימות מותר להיות דולף, כמקובל עבור פיגומים כלי דם נקבובי¹⁹. ביו-ריאקטור מבפנים החוצה זה מיועד במיוחד למחקרים שיטתיים על ההשפעות של גיזום ו/או מתיחה, ולא ההנדסה של כלי דם דמוי יליד במבחנה, שעבורו תצורות ביו-ריאקטור כלי דם מסורתיות מתאימות יותר. ראה איור 1A-B עבור ציורי העיצוב של הביו-ריאקטור, ואת הטבלה המתאימה 1 לתיאור פונקציונלי ורציונל מאחורי המרכיבים העיקריים של הביו-ריאקטור.

השימוש bioreactor הוא הודגם על בסיס סדרה של מחקרים אחרונים על ידי הקבוצה שלנו שבו חקרנו את ההשפעות הפרט והשילוב של מתח גזוז ומתיחה מחזורית על דלקת היווצרות רקמות פיגומי אלקטרו-ספון resorbable עבור רקמת לב וכלי דם במקום^19,43,44. כדי לכך, השתמשנו במקרופלגות אנושיות ובמיאופיברובלסטים במונו או בתרבות משותפת כדי לדמות את השלבים השונים של מפל ההתחדשות במקום. הוכחנו כי הפרשת ציטוקינים על ידי מקרופאגים אנושיים מושפעת באופן מובהק הן על ידי מתח מתיחה מחזורית והן על ידי לחץ גיסת, המשפיעים על תצהיר המטריצה וארגון על ידי מיופיברובלסטים אנושיים בפיגומים אלה, הן באמצעות איתות פרקרין והן על מגע ישיר^19,43,44. ראוי לציין, מחקרים אלה גילו כי במקרה של יישום משולב של מתח גיסת ומתיחה, ההשפעות על היווצרות רקמות ודלקת נשלטים על ידי אחד משני העומסים, או שיש השפעות סינרגטיות של שני העומסים. ממצאים אלה ממחישים את הרלוונטיות של ניתוק שני העומסים כדי להבין טוב יותר את תרומת הסביבה המכנית בתהליכי TE. הבנה זו יכולה להיות מיושמת כדי לייעל באופן שיטתי את הפרמטרים של עיצוב פיגומים במשטרי טעינה המונמיים רלוונטיים. בנוסף, הנתונים המכניסטיים מסביבות מבוקרות כגון עשויים לשמש קלט עבור מודלים מספריים המפותחים כדי לחזות את מהלך שיפוץ רקמת situ, כפי שדווח לאחרונה עבור TEVGs⁶⁵ או TEHVs⁶⁶, כדי לשפר עוד יותר את יכולת החיזוי.

Protocol

במחקרים המתוארים בפרוטוקול זה, מקרופאגים אנושיים ראשוניים מבודדים מעילי דם היקפיים ומיופיברובלסטים אנושיים מבודדים מן הווריד saphenous לאחר ניתוח עובר כלילי שימשו44. מעילי באפי התקבלו ממתנדבים בריאים, אנונימיים שסיפקו הסכמה מדעת בכתב, שאושרה על ידי ועדת האתיקה הרפואית המוסדית ש…

Representative Results

bioreactor זה פותח כדי לחקור את ההשפעות הפרטניות והמשולבים של מתח גיסת ומתיחות מחזוריות על צמיחת רקמת כלי הדם ושיפוץ פיגומים ביו-חומרים תלת-ממדיים. העיצוב של הביו-ריאקטור מאפשר פולחן של עד שמונה מבני כלי דם בתנאי טעינה שונים(איור 1A). מבני כלי הדם ממוקמים בתא תרבות זרימה (<strong class="…

Discussion

הביו-ריאקטור המתואר כאן מאפשר הערכה שיטתית של תרומתו של האדם וההשפעות המשולבות של לחץ גזוז ומתיחות מחזוריות על דלקת והתחדשות רקמות בפיגומים צינוריים הניתנים לשחזור. גישה זו מאפשרת גם לבצע מגוון רחב של ניתוחים על מבנים וסקולריים, כפי שמדגים בסעיף התוצאות הייצוגיות. תוצאות אלה מראות את ההש…

Materials

advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM)	Gibco	12491-015	cell culture medium for fibroblasts
Aqua Stabil	Julabo	8940012	prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir
Bovine fibrinogen	Sigma	F8630	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Bovine thrombin	Sigma	T4648	to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Centrifuge	Eppendorf	5804	to spin down cells and conditioned medium
Clamp scissor – "kelly forceps"	Almedic	P-422	clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)
CO2 cell culture incubators	Sanyo	MCO-170AIC-PE	for cell culturing
Compressed air reservoir	Festo	CRVZS-5	smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up
Custom Matlab script to calculate the maximum stretches	Matlab	R2017. The Mathworks, Natick, MA	calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold
Data acquisition board	National Instruments	BNC-2090	data processing in between amplifier system and computer
Ethanol	VWR	VWRK4096-9005	to keep sterile working conditions
Fetal bovine calf serum (FBS)	Greiner	758087	cell culture medium supplement; serum-supplement
Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)
Glass Pasteur pipet	Assistant	HE40567002	apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)
Glass tubes of the flow culture chamber	Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology	n.a.	part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)
GlutaMax	Gibco	35050061	cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up
High speed camera	MotionScope	M-5	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
High speed camera lens – Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 – lens	Nikon	JAA616AB	to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
Hose clip	ibidi GmbH	10821	block medium flow (autoclave at step 1, step 7)
Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)
Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads	ibidi GmbH	10902	set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.
Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)	Swann Morton	0301; 0933	to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material
LabVIEW Software	National Instruments	version 2018	to control the stretch applied to the scaffolds
Laminar flow biosafety cabinet with UV light	Labconco	302310001	to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving
Large and small petri dishes	Greiner	664-160	for sterile working conditions
L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)	Sigma	A8960	cell culture medium supplement, important for collagen production
LED light cold source KL2500	Zeiss	Schott AG	to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch
Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps	ibidi GmbH	various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)	to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)
Measuring amplifier (PICAS)	PEEKEL instruments B.V.	n.a.	to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView
Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders	ibidi GmbH	10974	medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)
Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter	Rubber BV	1805	to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing
Motion Studio Software	Idtvision	2.15.00	to make the high speed time lapse images for stretch monitoring
Needle (19G)	BD Microlance	301700	together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles
Needle driver	Adson	2429218	to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)
Paper tissues	Kleenex	38044001	for cleaning of the equipment with 70% ethanol
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	quick fix if leakage occurs
Penicillin/streptomycin (P/S)	Lonza	DE17-602E	cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P4417-100TAB	for storage and washing steps (autoclave at step 1)
Plastic containers (60 mL) with red screw caps	Greiner	206202	to prepare the fibrinogen solution
Pneumatic cylinder	Festo	AEVC-20-10-I-P	to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length)	SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands	n.a.	produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details
Pressure conduit without holes (for static control)	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)
Pressure sensor and transducer	BD	TC-XX and P 10 EZ	the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure
Proportional air pressure control valve and pressure sensor	Festo	MPPES-3-1/8-2-010, 159596	provides compressed air to the pneumatic actuated pump
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)	Gibco	A1049101	cell culture medium for monocyte/macrophage
Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)	Eppendorf	30120086	multiple applications (autoclave at step 1)
Sodium dodecyl sulfate solution 20%	Sigma	5030	Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.
Silicone O-rings	Technirub	1250S	to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)
Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)	Rubber BV	1805	to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)
Sterile tube (15 mL)	Falcon	352095	multiple applications
Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle	Ethicon, Johnson&Johnson	EH7404H	Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)
Syringe (24 mL)	B. Braun Melsungen AG	2057932	to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber
Syringe filter (0.2 µm)	Satorius	17597-K	to filter the fibrinogen solution
T150 cell culture flask with filter cap	Nunc	178983	to degas culture medium
T75 Cell culture flask with filter cap	Nunc	156499	to culture static control samples
Teflon bellow	Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology	n.a.	to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Tray (stainless steel)	PolarWare	15-248	for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)
Tweezers	Wironit	4910	sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)
Ultrapure water	Stakpure	Omniapure UV 18200002	to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)
UV light	Philips	TUV 30W/G30 T8	for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding